СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ЦИАНОБАКТЕРИЙ РОДА LEPTOLYNGBYA В ВИХРЕВОМ ФОТОБИОРЕАКТОРЕ Российский патент 2023 года по МПК C12N1/12 C12N11/02 C12R1/89 

Предлагаемый способ относится к биотехнологии и может быть использован в медицине, фармацевтической, пищевой и косметической промышленности для получения медицинских препаратов и продуктов с высоким содержанием биологически активных соединений.

Морские нитчатые бентосные цианобактерии из рода Leptolyngbya являются ценным сырьем для получения биологически активных веществ, способны к накоплению микроэлементов в органической форме, содержат ценные полиненасыщенные жирные кислоты, фикобилипротеины и каротиноиды подобно другим представителям нитчатых бентосных цианобактерий [Ecology of cyanobacteria II: Their diversity in space and time / Ed. Whitton B.A. Berlin Heidelberg: SpringerScience+Business Media B.V., 2012. 760 p.; Kumar, J.; Singh, D.; Tyagi, M.B.; Kumar, A. Cyanobacteria: Applications in Biotechnology. In Cyanobacteria; Mishra, A.K., Tiwari, D.N., Rai, A.N., Eds.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2019; Chapter 16; pp. 327–346. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-814667-5.00016-7; Pigments from Microalgae Handbook / Eds. Jacob-Lopes, E., Queiroz, V.I., Zepka, L.Q. Springer Nature Switzerland AG, 2020. 653 p. https://doi.org/10.1007/978-3-030-50971-2]. Поэтому их изучение и разработка промышленных технологий интенсивного культивирования является актуальной задачей. Являясь представителями бентоса, Leptolyngbya обладает способностью расти при пониженной освещенности и температуре, что предполагает возможность ее интенсивного культивирования в промышленных масштабах на территории РФ. На сегодняшний день существуют проблемы интенсивного культивирования Leptolyngbya, возникающие по причине оседания клеток на дно и обрастания стенок фотобиореактора.

Известен способ выращивания бентосных микроводорослей (МВ) с использованием вертикальной установки для их культивирования (патент РФ №155631, A01G33/02, 2015). Способ заключается в культивировании МВ в отдельных лотках, расположенных в вертикальной общей емкости для подачи питательной среды и освещения лотков. Недостатком способа является то, что в случае с бентосными МВ, ведущими прикрепленный образ жизни, итогом будет обрастание освещаемой поверхности емкости и лотков клетками МВ, что сделает невозможным их интенсивное культивирование вследствие затенения слоем клеток глубинных слоёв рабочего объёма. Также предложенный способ характеризуется достаточно высокой трудоемкостью при масштабировании процесса культивирования.

Известен способ использования иммобилизованных клеток МВ, который позволяет удалять металлы, азот и фосфор из сточных вод [Mallick N. Biotechnological potential of immobilized algae for wastewater N, P and metаl removal: A review // Biometals. 2002. Vol. 15. N4. P. 377–390]. Способ основан на использовании фотобиореактора с различными носителями, позволяет выращивать водоросли, как в накопительном, так и в проточном режиме. Предложенный способ обладает рядом недостатков: характеризуется сложностью конструкции фотобиореактора, сопряжен с высокими энергозатратами, практически неприменим в промышленных масштабах. Конструкция фотобиореактора не предназначена для интенсивного культивирования нитчатых цианобактерий.

Известен способ выращивания и получения биомассы МВ с помощью сорбентов на основе полиэтиленамина [Howard A. Toxic cyanobacterial blooms // Environmental toxicology: current developments / Ed. J. Rose. London: Gordon & Breach Science Publishers, 1998. P. 345–357]. Способ включает получение серии пористых и нерастворимых полимерных материалов путем сшивания полиэтиленимина эпихлоргидрином и культивирование с их помощью Chlorella vulgaris. Недостатком способа является его трудоемкость, а также неприменимость в пищу получаемых продуктов, например, при производстве БАД, основанных на биомассе.

Известен способ культивирования микроводорослей путем иммобилизации в объеме носителя [Васильева С.Г., Лобакова Е.С., Лукьянов А.А., Соловченко А.Е. Применение иммобилизованных микроводорослей в биотехнологии. Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. 2016, № 3. С. 65-72]. В качестве природного носителя используются гранулы альгината кальция. Для создания гранул культуру МВ сгущают путем центрифугирования или фильтрования. Смешивают с альгинатом натрия и формируют гранулы. Для создания полупроницаемой мембраны используют хлорид кальция. Рост МВ в составе гранул не лимитирован интенсивностью света. Гранулы не токсичны для клеток МВ. Недостатком способа является разрушение гранул в морской воде и сточных водах, а также трудности при создании гранул для нитчатых цианобактерий.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения биокатализатора для синтеза водорода на основе клеток фототрофных бактерий, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта (патент РФ №2323975, C12N11/04, C12N1/20, 2006). Способ представляет собой биокатализатор на основе иммобилизованных клеток фототрофных бактерий Rhodospirillum rubrum 2R, включённых в матрицу гелевого носителя, с помощью которых осуществляют микробиологическое получение водорода. Способ реализуется следующим образом: биомассу клеток фототрофных бактерий Rhodospirillum rubrum 2R смешивают с раствором поливинилового спирта, затем проводят гранулирование, замораживая по 0,2 мл суспензии в лунках иммунологических при -22°С с экспозицией в замороженном состоянии 17 ч и оттаиванием при +2°С. Получают биокатализатор с цилиндрической формой гранул, имеющий следующий состав (% мас.): биомасса клеток бактерий - 0,48 (по сух. массе); ПВС - 7,6; водная фаза - до 100. Недостатком способа является его высокая энергоёмкость, трудоемкость, трудность реализации в промышленных масштабах, а также невозможность применения для получения интенсивной культуры нитчатых бентосных цианобактерий.

Задачей изобретения является расширение возможностей культивирования и сбора биомассы морских нитчатых цианобактерий рода Leptolyngbya, ведущих прикрепленный образ жизни.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения биомассы цианобактерий рода Leptolyngbya, при котором процесс культивирования проводят в фотобиореакторе с использованием химически инертных носителей, к которым прикрепляются клетки цианобактерий и формируют микроколонии, согласно изобретению, в качестве носителя используют полиамидные оптически прозрачные частицы размером до 100 мкм, при этом в фотобиореакторе осуществляют активное перемешивание биомассы за счёт создания внутри вихревого потока,

согласно изобретению, для культивирования морских нитчатых бентосных цианобактерий рода Leptolyngbya, ведущих прикрепленный образ жизни, могут использовать химически инертный носитель – безопасный мелкодисперсный сорбент фармакологический "Полисорб МП".

При этом используемый материал носителя должен быть индифферентным для клеток цианобактерий, а также клетки цианобактерий не должны использовать его в качестве пищевого субстрата. Клетки Leptolyngbya в процессе роста прикрепляются к частицам и формируют микроколонии, свободно переносящиеся потоком среды в вихревом фотобиореакторе. Трение образованных микроколоний о поверхности фотобиореактора внутри рабочего объёма препятствует обрастанию рабочих поверхностей. В результате растущие микроколонии цианобактерии Leptolyngbya находятся во взвеси, активно перемешиваются, тем самым обеспечиваются оптимальные для роста условия освещения и обеспечения биогенными веществами. Образование микроколоний позволяет осуществлять сбор урожая путем осаждения или фильтрования микроколоний с малыми затратами времени и энергии.

Примеры осуществления заявляемого способа.

Пример 1

Культуру морских нитчатых бентосных цианобактерии из рода Leptolyngbya выращивали в накопительном режиме на люминостате в колбах объемом 1 л при температуре 22-25°С и освещённости 4 клк на модифицированной питательной среде BG11, приготовленной на стерильной морской воде. Модификация среды BG11 заключалась в увеличении концентрации основных биогенных элементов, а также исключении из питательной среды MgSO₄ и CaCl₂, так как данные элементы присутствует в достаточном количестве в морской воде (см. табл. 1).

Таблица 1. Состав модифицированной питательной среды BG11

Наименование навеска, г/л NaNO₃ 3 K₂HPO₄ 0,2 Na₂CO₃ 0,2 Лимонная кислота 0,006 Na₂EDTA 0,001 FeC₆H5O₇ 0,006 Раствор микроэлементов 1 мл/л Микроэлементы: г/л H₃BO₃ 2,86 MnCl₂ × 4H₂O 1,81 ZnSO₄ × 7H₂O 0,22 Na₂MoO₄ × 2H₂O 0,4 CuSO₄ × 5H₂O 0,08 Co(NO3)₂ × 7H₂O 0,05

Культуру адаптировали к экспериментальным условиям в течение 7 суток. Адаптированную культуру использовали в качестве инокулята для дальнейших экспериментов. Интенсивное культивирование клеток Leptolyngbya осуществляли в колбе объёмом 0,5 л с добавлением полиамидных частиц 50 мкм (1 г/л) в начале эксперимента. Суспензию клеток Leptolyngbya вносили в рабочий объём из такого расчета, чтобы начальная плотность культур составляла 0,01 г сухого вещества на 1 л культуры и продолжали выращивать в течение 22 суток при освещении 8 клк при непрерывном барботаже воздухом со скоростью 0,5 л в минуту на 1 л культуры, при температуре 22-25°С до плотности 2,175 г сухой биомассы на литр (стационарная фаза роста). Таким образом за 22 суток было получена культура с плотностью 2,175 г/л и средней продуктивностью 0,1 г/(л*сут).

Пример 2

Культуру морских нитчатых бентосных цианобактерий из рода Leptolyngbya адаптировали к модифицированной питательной среде BG11 (см. табл. 1) на люминостате при постоянной температуре 25-28°С и круглосуточном освещении люминесцентными лампами ЛБ-40. После адаптации культуру использовали в качестве инокулята для накопительного культивирования в газовихревом фотобиореакторе и продолжали выращивать на модифицированной питательной среде BG11 в течение 12 суток до плотности 1,35 г сухой биомассы на 1 л культуры. Рабочий объём суспензии составлял 10 л, рабочий слой - 0,05 м, освещаемая поверхность - 1 кв.м. В качестве источника освещения использовались светодиоды, которые давали среднюю освещённость на поверхности культуры 9,1 клк. В начале эксперимента в питательную среду вносили полиамидные частицы 50 мкм (1 г/л). На 12 сутки эксперимента плотность культуры достигла 1,35 г/л, таким образом, средняя продуктивность составила 0,1 г/(л*сут).

Пример 3

Адаптацию культуры Leptolyngbya осуществляли в соответствии с описанием в примере №1. Эксперимент проводили в газовихревом фотобиореакторе объемом 10 л с рабочей площадью 1 кв.м, рабочим слоем 0,05 м при освещении рабочей поверхности светодиодами. Освещенность рабочей поверхности составляла 4 клк. Культуру выращивали при температуре 25-28°С на модифицированной питательной среде BG11 (см. табл. 1).

В начале эксперимента в питательную среду был добавлен химически инертный мелкодисперсный фармакологический сорбент "Полисорб МП" (0,25 г/л), после чего в среду вносили инокулят культуры цианобактерий. На 21 сутки эксперимента плотность культуры в газовихревом фотобиореакторе достигла 1,3 г/л, таким образом, средняя продуктивность составила 0,06 г/(л*сут).

Техническим результатом заявляемого способа является возможность получения биомассы морских нитчатых цианобактерий рода Leptolyngbya в результате сведения к минимуму процесса обрастания цианобактериями поверхностей фотобиореактора. Изобретение позволяет обеспечить пищевую и фармацевтическую промышленность биологически активными соединениями, входящими в состав биомассы цианобактерий рода Leptolyngbya, путём интенсивного культивирования в промышленных фотобиореакторах газовихревого типа с использованием инертных носителей.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения биомассы цианобактерий рода Leptolyngbya, включающий культивирование в фотобиореакторе с использованием химически инертных носителей, к которым прикрепляются клетки цианобактерий и формируют микроколонии. В качестве носителя используют полиамидные оптически прозрачные частицы размером 50 мкм в количестве 1 г/л питательной среды или мелкодисперсный сорбент фармакологический "Полисорб МП" в количестве 0,25 г/л питательной среды, при этом в фотобиореакторе осуществляют активное перемешивание биомассы. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов культивирования морских нитчатых цианобактерий рода Leptolyngbya, ведущих прикрепленный образ жизни в оптимальных для роста условиях. 1 табл., 3 пр.

Способ получения биомассы цианобактерий, при котором процесс культивирования проводят в фотобиореакторе с использованием химически инертных носителей, к которым прикрепляются клетки цианобактерий и формируют микроколонии, отличающийся тем, что получают биомассу цианобактерий рода Leptolyngbya, в качестве носителя используют полиамидные оптически прозрачные частицы размером 50 мкм в количестве 1 г/л питательной среды или мелкодисперсный сорбент фармакологический "Полисорб МП" в количестве 0,25 г/л питательной среды, при этом в фотобиореакторе осуществляют активное перемешивание биомассы.