КОМПЛЕКСЫ ТЕТРАЦИКЛИНА С УСТОЙЧИВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2023 года по МПК C07C237/24 C07C237/26 A61K9/00 A61K9/14 A61K31/65 A61K47/34 A61P31/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в целом относится к контролируемому высвобождению тетрациклиновых антибиотиков. В частности, оно относится к комплексу, содержащему соединение тетрациклина (TC) или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват и карбоксилат двухвалентного металла; фармацевтическому препарату, содержащему комплекс, способам изготовления комплекса и фармацевтического препарата и комплексу или фармацевтическому препарату для применения в способе лечения организма человека или животного, в частности для терапии и/или профилактики бактериальной инфекции; и/или в котором антибиотическая активность сохраняется в течение продолжительного периода времени; и/или для терапии и/или профилактики острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта.

Уровень техники

Соединения тетрациклина представляют собой класс антибиотиков, которые ингибируют синтез белка, предотвращая прикрепление аминоацил-тРНК к сайту рибосомного акцептора (A). Тетрациклины представляют собой агенты широкого спектра действия, проявляющие активность в отношении широкого диапазона грамположительных и грамотрицательных бактерий, атипичных организмов, таких как хламидии, микоплазмы и риккетсии и простейших паразитов. Благоприятные антимикробные свойства этих агентов и отсутствие серьезных побочных эффектов привели к их широкому использованию в терапии инфекций человека и животных, например, заболеваний пародонта (Chopra et al., Microbiol Mol Biol Rev. 2001, June 65(2):232-60). Молекулы тетрациклина содержат линейное конденсированное тетрациклическое ядро (кольца, обозначенные A, B, C и D), к которому присоединены различные функциональные группы. Простейший тетрациклин, проявляющий обнаруживаемую антибактериальную активность, представляет собой 6-дезокси-6-деметилтетрациклин, и поэтому эту структуру можно рассматривать как минимальный фармакофор (Mitscher, L. A. 1978. The chemistry of the tetracycline antibiotics. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y):

Тетрациклиновые антибиотики, которые широко используются в клинической практике, включают доксициклин, миноциклин и тетрациклин. Обзор наиболее часто используемых антибиотиков тетрациклинового ряда представлен ниже:

Среди них особенно доксициклин и миноциклин использовались для лечения заболеваний пародонта. Однако существуют проблемы с терапевтическим применением этих активных веществ вследствие их относительно короткого времени удерживания и их нестабильности в водной среде.

Заболевания пародонта широко распространены. Приблизительно 30% населения во всем мире поражено. Они оказывают значительное влияние на людей и общество, и лечение требует значительных затрат. Стоимость стоматологической помощи занимает четвертое место среди всех заболеваний и требует от 5 до 10% всех ресурсов здравоохранения (Batchelor, P. British Dental Journal 2014, 217, 405-409). Репрезентативные популяционные исследования показывают, что заболевания пародонта широко распространены, и их распространенность растет с 1997 года (Micheelis, W. et al. Vierte Deutsche Mundgesundheitsstudie (DMS IV), Deutscher Ärzte-Verlag, Köln, 2006). Было обнаружено, что среди взрослого населения Германии 52,7% страдают пародонтитом умеренной степени тяжести и 20,5% тяжелыми формами пародонтита. Расходы на медицинское страхование в Германии на прямое лечение пародонтита составили приблизительно 1,1 миллиарда евро (Statistisches Bundesamt, 2008), не включая затраты на вторичные заболевания.

Пародонтит представляет собой общий термин, описывающий воспалительное состояние пародонта, которое вызвано мультибактериальной индукцией и тесно связано с различными системными заболеваниями, такими как сердечно-сосудистые заболевания, ревматоидный артрит, хроническая обструктивная болезнь легких и болезнь Альцгеймера.

В соответствии с рекомендациями Немецкого общества стоматологических, оральных и краниомандибулярных наук применяемая в настоящее время терапия пародонтита обычно проводится путем ручной наддесневой и поддесневой обработки (удаление бактериальных бляшек) вместе с применением антисептических средств (ежедневная дезинфекция жидкостями для полоскания рта), которая разрушает всю биопленку полости рта и предоставляет возможность для повторного заселения потенциальными патогенами (Sanz, I. et al. J Evid Based Dent Practice 2012, 12(3), 76-86). Кроме того, адъювантная системная терапия антибиотиками широкого спектра действия применяется при запущенных формах заболевания, таких как постоянные или рецидивирующие локализованные глубокие участки (Jepsen, K. et al. Periodontol 2000 2016, 71(1), 812-112). Последняя также приводит к неселективному разрушению биопленки и должна вводиться в высоких дозах и в течение длительного периода времени для достижения достаточных терапевтических уровней в конкретном месте действия, то есть в пародонтальном кармане. Стандартная адъювантная терапия пародонтита включает, например, системное введение доксициклина (п/о) 1 × 200 мг/штамп в течение 1 дня и 2 × 100 мг/штамп в течение дополнительных 18 дней (Wissenschaftliche Stellungnahme: Adjuvante Antibiotika in der Parodontitistherapie, Deutsche Gesellschaft für Zahn- Mund- und Kieferheilkunde, DZZ 2003). В результате наблюдается развитие резистентности к патогенам полости рта. Кроме того, микробиом в кишечнике пациента разрушается, что приводит к потере метаболической поддержки, иммунной модуляции и делает возможным повторное заселение потенциальными патогенами. Целенаправленная и таргетная терапия будет означать значительное улучшение лечения пародонтита и связанных с ним состояний. Систематический обзор показал значительное влияние составов тетрациклина на уменьшение глубины пародонтального кармана (Matesanz-Pérez, P. et al. J Clin Periodontol 2013, 40(3), 227-241).

Наличие пародонтопатогенных бактерий варьируется среди пациентов с пародонтитом. Тем не менее, обнаружение определенных видов бактерий в поддесневых бляшках было тесно связано с этиологией заболеваний пародонта (Socransky et al., Journal of Clinical Periodontology, 1998, 25, 134-144). Первым шагом к развитию пародонтита является колонизация бактерий «желтого комплекса», «зеленого комплекса» и «пурпурного комплекса» в здоровых участках пародонта. Виды Actinomyces тесно связаны с членами «желтого комплекса» (Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis, Streptococcus gordonii и Streptococcus intermedius), «зеленого комплекса» (Eikenella corrodens, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga sputigena) и «пурпурного комплекса» (Veillonella parvula, Actinomyces odontolyticus). Эти комплексы сопровождаются колонизацией членами бактерий так называемого «оранжевого комплекса», включая членов подвидов Fusobacterium nucleatum/periodonticum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens и Parvimonas micra (ранее известного как Peptostreptococcus micros или Micromonas micros). Было обнаружено, что колонизация здоровых участков пародонта членами «оранжевого комплекса» коррелирует с возникновением гингивита. Бактерии «оранжевого комплекса» кроме того способствуют колонизации бактериями так называемого «красного комплекса», которые, в свою очередь, связаны с глубокими карманами и хроническим пародонтитом. «Красный комплекс», состоящий из тесно связанной группы Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis и Treponema denticola, в значительной степени относится к клиническим показателям заболевания пародонта и в частности к глубине кармана и кровоточивости при зондировании. Кроме того, Lamont et al. (Microbiology 2002, 148, 1627-1636) и Daep et al. (Infect. Immun. 2006, 74, 5756-5762) продемонстрировали, что S. gordonii играет роль при колонизации Porphyromonas gingivalis.

Применение антибиотиков или антисептиков в адгезивной форме введения с замедленным высвобождением для местного применения является с технической точки зрения сложной задачей. Слизистая оболочка рта покрыта жидкой пленкой и частично заселена бактериями. Кроме того, она подвержена механическим нагрузкам вследствие разговора, глотания и жевания. Хотя данные источники напряжения не присутствуют в пародонтальном кармане непосредственно, наличие десневой жидкости (скорость потока которой сильно увеличивается в случае пародонтита) приводит к усиленному вымыванию активных веществ из кармана.

Ввиду этой сложной исходной ситуации ни один из существующих продуктов или местной антибиотикотерапии, или антисептической терапии не смог решить существующие проблемы соответствующим образом. Например, Актисит® представляет собой содержащее тетрациклин волокно для размещения в пародонтальном кармане, требующее сложного нанесения квалифицированным стоматологом в пародонтальный карман и дальнейшего вмешательства для удаления через 10 дней. Этот продукт больше не присутствует на немецком рынке. Элизол®, гель, содержащий метронидазол, не соответствует ожиданиям по высвобождению активного ингредиента более двух дней вследствие недостаточной адгезии геля. Этот продукт также больше не присутствует на немецком рынке. Атридокс®, продукт, содержащий доксициклин с контролируемым высвобождением, состоящий из системы смешивания с двумя шприцами, также был снят с реализации на немецком рынке.

Лигосан®, который представляет собой систему нанесения, содержащую доксициклин, и Периочип®, который представляет собой биоразлагаемый чип, содержащий хлоргексидин, являются единственными продуктами для местного применения, которые все еще доступны на рынке. Лигосан® представляет собой систему нанесения, содержащую 14% доксициклина в биоразлагаемой гелевой матрице для нанесения в пародонтальный карман с помощью специальной системы локализации, которая обеспечивает непрерывное высвобождение в течение 12 дней и приводит к улучшению состояния пародонтальных карманов. Однако обращение с гелем и его управляемость затруднены и нанесение соответствующего количества во всех частях кармана затруднено, особенно когда речь идет о невидимых непосредственно межзубных промежутках в области боковых зубов. Гель нужно вводить с помощью специальной системы нанесения. Кроме того, хотя доказано, что он является эффективным в отношении бактерий в глубоких пародонтальных карманах, он не подходит для полноценной терапии и не заменяет классические методы лечения (Eickholz, P et al.; J Clin Periodontol 2002; 108-117; Ratka-Krüger, P. et al., J Periodontol. 2005/1,76: 66-74). Кроме того, вследствие высокой стоимости и низкой мотивации для стоматологов общее применение этой терапии, по-видимому, является затруднительным (см. https://www.parodontitis.com/ligosan-slow-releaseR-zur-behandlung-von-zahnfleischtaschen.html). Периочип® содержит 2,5 мг хлоргексидина в биоразлагаемом желатиновом чипе, который можно вставить в пародонтальные карманы с помощью пинцета. Чип остается в кармане в течение 7-10 дней и со временем лекарственное средство непрерывно высвобождается. Однако было обнаружено, что он не является эффективным в отношении бактериальной композиции в качестве местных антибиотиков. Кроме того, медицинское страхование не оплачивает расходы (см. https://www.parodontitis.com/lokale-behandlung-der-zahnfleischtaschen-mit-periochip-ec40-chxhtml.html). Таким образом, хотя с помощью этих систем было достигнуто некоторое улучшение параметров пародонтита (глубины кармана и параметров воспаления), они требуют сложного применения и, кроме того, не возмещаются компаниями государственного медицинского страхования в Германии, так что они вызывают огромные расходы, которые приходится оплачивать пациентам.

Также использовалось системное применение низких доз доксициклина (Периостат®) в качестве долгосрочной терапии. Однако ожидаемый фармакологический эффект не всегда коррелирует с успешным клиническим результатом. Например, терапия, по-видимому, имеет пониженную эффективность у курильщиков. Кроме того, требуется высокий уровень соблюдения режима терапии со стороны пациента; и результаты научных исследований относительно наличия клинического улучшения являются спорными. Таким образом, нельзя дать никаких общих рекомендаций относительно этой терапии (G. Greenstein, Efficacy of submicrobial-dose doxycycline in the treatment of periodontal diseases: a critical evaluation, The international journal of Periodontics & Restorative Dentistry, 2004, 24(6):528-543; I. Needleman et al., A randomized-controlled trial of low-dose doxycycline for periodontitis in smokers, Journal of clinical Periodontology, 2007, 34(4):325-333).

Наконец, Арестин® представляет собой поддесневой продукт с замедленным высвобождением, состоящий из микросфер, содержащих антибиотик миноциклина гидрохлорид, включенный в биорезорбируемый полимер поли(гликолид-ко-DL-лактид) или PGLA, для профессионального субгингивального введения в пародонтальные карманы. Каждая карпула с однократной дозой доставляет миноциклина гидрохлорид, эквивалентный 1 мг свободного основания миноциклина. Описано, что непрерывное высвобождение лекарственного средства составляет 14 дней. Тем не менее, продукт больше не доступен на немецком рынке (см. https://www.parodontitis.com/vom-markt-genommen-atridoxR-actisiteR-arestinR-und-elyzolR.html). Консистенция материала (микросферы) требует применения с использованием специальных карпул и делает обращение с ним и размещение в пародонтальном кармане трудным и не очень надежным.

Как представлено в настоящем описании, существует несколько эффективных терапевтических вариантов, но все они предполагают возможности для улучшения. Таким образом, существует большая потребность в разработке новых, улучшенных форм введения тетрациклиновых антибиотиков с устойчивой активностью, в частности, для лечения пародонтита и связанных состояний. Идеальная система доставки лекарственных средств для лечения пародонтита должна сочетать простое изготовление, легкое применение, отсутствие растворителей и контролируемое высвобождение в течение длительного периода с высокой биологической активностью.

Проблемы, решаемые изобретением

С учетом вышеизложенного настоящее изобретение направлено на предоставление формы для введения соединений тетрациклина, обладающих повышенной стабильностью; и/или длительной активностью; и/или более простым, легким и/или более надежным применением и обращением. В частности, настоящее изобретение направлено на создание форм для местного применения, позволяющих стоматологу применять антибиотик простым, надежным и максимально безболезненным способом. Кроме того, нацелено на значительно пролонгированное и равномерное высвобождение, чтобы требуемый уровень активности поддерживался в течение длительного периода времени (т. е. свыше 14 дней). Наконец, было бы желательно, чтобы новые формы для введения были предпочтительно безопасными, надежными и достаточно дешевыми, чтобы расходы возмещались государственным медицинским страхованием.

Дополнительными целями настоящего изобретения являются создание способа изготовления таких форм для введения; предоставление способа лечения организма человека или животного и/или соединения или фармацевтического препарата для применения в таком способе; предоставление способа терапии или профилактики бактериальной инфекции и/или соединения или фармацевтического препарата для применения в таком способе; предоставление способа терапии или профилактики острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта и/или соединения или соединения фармацевтического препарата для применения в таком способе.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предоставляет комплекс, содержащий соединение тетрациклина (TC) или его фармацевтически приемлемую соль и карбоксилат двухвалентного металла (MA₂), в котором: молярное соотношение TC:MA₂ находится в диапазоне 1:0,8-3,0; катион двухвалентного металла М представляет собой катион щелочноземельного металла и A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из C₈-C₂₄карбоновой кислоты.

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет фармацевтический препарат, содержащий комплекс в соответствии с любым одним из аспектов 1-4 и необязательно один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, предпочтительно в форме нитевидного экструдата.

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет способ изготовления указанного комплекса, включающий следующие стадии: (a) смешивание соединения тетрациклина (TC) или его фармацевтически приемлемой соли и карбоксилата двухвалентного металла (MA₂) в молярном соотношении 1:0,8-3,0 с органическим растворителем для получения дисперсии, в которой катион двухвалентного металла M представляет собой катион щелочноземельного металла и A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из C₈-C₂₄карбоновой кислоты; (b) нагревание указанной дисперсии с образованием комплекса; (c) удаление растворителя для получения комплекса. Настоящее изобретение дополнительно предоставляет способ изготовления фармацевтического препарата в форме нитевидного экструдата, включающий следующие стадии: (d) измельчение указанного комплекса и, если присутствует, одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов для получения экструзионного прекурсора; (e) экструзия указанного экструзионного прекурсора при температуре выше комнатной температуры; (f) охлаждение продукта стадии (е) для получения фармацевтического препарата в форме нитевидного экструдата.

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет комплекс, как определено выше, и/или фармацевтический препарат, как определено выше, для применения в способе лечения организма человека или животного; и/или для применения в способе терапии и/или профилактики бактериальной инфекции, предпочтительно вызванной одной или более бактериями, выбранными из группы, состоящей из Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Streptococcus gordonii, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces naeslundii и Parvimonas micra; и/или в котором антибиотическая активность сохраняется в течение периода, по меньшей мере, 21 дня; и/или для применения в способе терапии и/или профилактики острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта.

ЭФФЕКТЫ, ДОСТИГАЕМЫЕ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что комплексы соединений тетрациклина в соответствии с настоящим изобретением разлагаются в водных средах медленнее, чем соответствующие соединения тетрациклина. Кроме того, было обнаружено, что эти комплексы имеют более низкую растворимость в воде и обеспечивают более отсроченное и замедленное высвобождение по сравнению с соответствующими соединениями тетрациклина или даже с системами замедленного высвобождения, такими как Арестин®. Хотя хелатные комплексы соединений тетрациклина с ионами магния или кальция в соотношении 1:0,5 были ранее описаны, настоящие комплексы отличаются по своей стехиометрии. Комплексообразование в соответствии с настоящим изобретением приводит к измененным химическим свойствам соединений. В частности, благоприятное влияние оказывается на растворимость, фотометрические характеристики и реакционную способность. Активное вещество остается биологически активным в течение продолжительного периода времени и высвобождается замедленным образом вследствие более низкой растворимости в воде, повышенной устойчивости к разложению в водном растворе и липофильных свойств карбоксилат-аниона. Кроме того, образование комплекса, по-видимому, предотвращает превращение соединений тетрациклина в менее активные эпимеры и таким образом способствует поддержанию биологической активности активных веществ в течение более длительного периода времени. Эти эффекты могут сохраняться, когда комплексы в соответствии с настоящим изобретением вводят или отдельно, или в комбинации с одним или более фармацевтическими эксципиентами в фармацевтическом препарате, например, препарате для местного введения.

Более того, когда комплекс предоставлен в фармацевтическом препарате, таком как экструдат (или в виде чистого вещества, или вместе с эксципиентом, например, биоразлагаемым полимером), можно достичь еще более длительного высвобождения и активности. Такие экструдаты можно легко формировать и обрабатывать (например, для помещения в пародонтальный карман), что дополнительно приводит к еще большей задержке высвобождения лекарственного средства. Наконец, они демонстрируют хорошую адгезию к слизистой оболочке полости рта и таким образом превосходную надежность нанесения.

Способ изготовления, описанный в настоящей заявке, приводит к образованию новых комплексов соединений тетрациклина с неожиданно выраженным замедленным высвобождением лекарственного средства, что является терапевтически желательным. Кроме того, комплексы, полученные в соответствии со способом изготовления настоящего изобретения, имеют повышенную растворимость в органических растворителях и пониженную растворимость в воде. Способы изготовления комплексов и препаратов в соответствии с настоящим изобретением являются простыми, универсальными, не требуют применения токсичных органических растворителей и могут быть основаны исключительно на использовании хорошо известных, надежных и безопасных фармацевтических ингредиентов. Кроме того, комплексы в соответствии с настоящим изобретением являются легко формуемыми и могут обрабатываться экструзией или отдельно, или вместе с одним или более эксципиентами для превращения в экструдат, имеющий подходящую желательную геометрию, например, подходящий для более легкого размещения в пародонтальном кармане.

Было показано, что комплексы и препараты превосходят по характеристикам высвобождения и устойчивой антибактериальной активности, особенно в отношении патогенов полости рта, связанных с возникновением и прогрессированием пародонтита. Это может способствовать повышенной эффективности безоперационной терапии пародонтита и, следовательно, уменьшению объема необходимого хирургического лечения, а также значительному снижению затрат. Кроме того, нагрузка на пациента, вызванная лечением системно вводимыми антибиотиками, может быть уменьшена путем замены вместо нее эффективной местной терапевтической формы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 представлены стеклянные виалы с высушенными комплексами миноциклина/стеарата магния в различных молярных соотношениях. Слева направо: гидрохлорид миноциклина/стеарат магния в молярных соотношениях 1:1, 1:2; свободное основание миноциклина/стеарат магния в соотношениях 1:1 и 1:2 (согласно Примерам 4, 3, 2 и 1 соответственно).

На Фиг. 2 представлены микрофотографии высушенного миноциклина/стеарата магния, имеющего молярное соотношение миноциклин/стеарат магния 1:1 (слева, Пример 2) и 1:2 (справа, Пример 1).

На Фиг. 3 представлены микрофотографии высушенного доксициклина-стеарата магния, имеющего молярное соотношение доксициклин/стеарат магния 1:1 (слева, Пример 6) и 1:2 (справа, Пример 5).

На Фиг. 4 представлены хроматограммы миноциклина (слева) и комплекса в соответствии с Примером 1 (справа) во время инкубации в буфере при pH 7,1 (вверху) и 2,3 (внизу) при 37°C с течением времени (нулевой день всегда является верхней кривой).

На Фиг. 5 представлены спектры поглощения в УФ/видимой области миноциклина и комплекса миноциклина в соответствии с Примером 1 в этаноле до (слева) и после (справа) добавления хлористоводородной кислоты.

На Фиг. 6 представлены спектры FTIR-ATR миноциклина, стеарата магния и комплекса в соответствии с Примером 1 в области 680-4000 см^-1.

На Фиг. 7 представлены кривые высвобождения экструдата Примера 9, состоящего из комплекса чистого миноциклина/стеарата магния 1:2, также как вместе с различными полимерами PLGA при экструзии (Примеры 10-13).

На Фиг. 8 представлены диаграммы «нагрузка-перемещение» при деформации экструдатов на анализаторе текстуры, снабженном ножом с острым лезвием.

На Фиг. 9 представлена фотография экструдатов, полученных в соответствии с настоящим изобретением, содержащих Resomer 502 RG (вверху) и Resomer 503 RG (внизу), содержащих 11,5% миноциклина. Оба экструдата экструдировали с помощью экструзионного устройства 600 мкм. Больший диаметр экструдата 503 RG указывает на вязкоупругие свойства полимера.

На Фиг. 10 представлена экспериментальная установка для оценки силы адгезии к мембранам слизистой оболочки (A) и геометрия проточного канала, специально используемого для измерений (B).

На Фиг. 11 представлены минимальные ингибирующие концентрации элюатов (разведений) по сравнению с Streptococcus gordonii ATCC 10558 и Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 до 42 дней.

На Фиг. 12 представлено ингибирующее действие элюатов, полученных через 24 часа, 2 дня, 7 дней, 14 дней и 28 дней по сравнению с образованием биопленки.

На Фиг. 13 представлены УФ/видимой области спектры (230-450 нм) миноциклина и доксициклина в сочетании со стеаратом магния и кальция и их комплексов после добавления HCl. Соотношения представляют собой молярные соотношения.

На Фиг. 14 представлены FTIR-ATR-спектры миноциклина, стеарата магния и кальция и их комплексов; 680-4000 см^-1. Миноциклин: а - ʋ O-H; b - ʋ N-Н; c - ʋ C-H; d - ʋ CONH₂; е - ʋ C=C (ароматический); f - ʋ C-N.

Стеарат магния/стеарат кальция: g - ʋ C-H; h - ʋ_as COO^-; i - δ C-H; j - CH₂ качание-колебание.

На Фиг. 15 представлены FTIR-ATR-спектры доксициклина, стеарата магния и кальция и их комплексов; 680-4000 см^-1. Доксициклин: а - ʋ O-H/ʋ N-H; b - ʋ С-Н; c - ʋ CONH₂; d - ʋ C=C (ароматический); f - ʋ C-N.

Стеарат магния/стеарат кальция: e - ʋ C-H; f - ʋ_as COO^-; g - δ С-Н; h - CH₂ качание-колебание.

На Фиг. 16 представлены чашки с агаром, инкубированные с S. aureus ATCC 29213. Левая чашка: диски, заполненные этанолом; средняя чашка: диски, заполненные этанольным раствором комплекса миноциклина; правая чашка: диски, заполненные этанольным раствором миноциклина.

На Фиг. 17 представлен профиль высвобождения нескольких композиций PLGA с комплексом миноциклина в ФСБ pH 7,0 при 37°C.

На Фиг. 18 представлены хроматограммы миноциклина и комплекса миноциклина при pH 7,0 и pH 2,3 при 37°C.

На Фиг. 19 представлены 5 масс.% суспензия миноциклина HCl (слева) и 5 масс.% раствор динатрия фосфата (справа).

На Фиг. 20 представлен смешанный раствор миноциклина HCl и динатрия фосфата (2,5 масс.% миноциклина HCl, 2,5 масс.% динатрия фосфата).

На Фиг. 21 представлены 1 масс.% раствор миноциклина HCl (слева) и 1 масс.% раствор динатрия фосфата (справа).

На Фиг. 22 представлен смешанный раствор миноциклина HCl и динатрия фосфата (0,5 масс.% миноциклина HCl, 0,5 масс.% динатрия фосфата).

На Фиг. 23 представлен смешанный раствор миноциклина HCl и динатрия фосфата (0,5 масс.% миноциклина HCl, 0,5 масс.% динатрия фосфата, но с добавлением 400 мкл 0,1 М HCl).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Комплексы

Настоящее изобретение предоставляет комплекс, содержащий соединение тетрациклина (TC) или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват и карбоксилат двухвалентного металла (MA₂), в котором: молярное соотношение TC:MA₂ находится в диапазоне 1:0,8-3,0; катион двухвалентного металла М представляет собой катион щелочноземельного металла и A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из C₈-C₂₄карбоновой кислоты.

Основная проблема с контролируемым высвобождением тетрациклинов заключается в их химической нестабильности в воде. Например, миноциклин проявляет реакции эпимеризации с потерей активности. Также доксициклин разлагается в водной среде. Следовательно, следует избегать разложения лекарственного средства перед высвобождением. Авторы изобретения установили гипотезу, что образование липофильного комплекса может увеличить стабильность лекарственного средства и привести к увеличенному времени высвобождения.

Соединения тетрациклина

Используемый в настоящем описании термин «соединение тетрациклина» (ТС) относится к любому соединению, принадлежащему к семейству тетрациклиновых антибиотиков, то есть основанному на минимальной фармакофорной структуре 6-дезокси-6-деметилтетрациклина:

Предпочтительно, соединение тетрациклина (ТС) выбрано из миноциклина, доксициклина, тетрациклина, хлортетрациклина, окситетрациклина, ролитетрациклина, тигециклина, демеклоциклина, лимециклина, меклоциклина, метациклина, омадациклина, сарециклина и эравациклина. Предпочтительные соединения тетрациклина также выбраны из группы, состоящей из 7-хлортетрациклина, 5-гидрокситетрациклина, тетрациклина, 6-деметил-7-хлортетрациклина, 2-N-пирролидинометилтетрациклина, 2-N-лизинометилтетрациклина, N-метилол-7-хлортетрациклина, 6-метилен-5-гидрокситетрациклина (метациклина), 6-дезокси-5-гидрокситетрациклина (доксициклина), 7-диметиламино-6-деметил-6-дезокситетрациклина (миноциклина), 9-(N, N-диметилглициламидо)-6-деметил-6-дезокситетрациклина, 9-(N, N-диметилглициламидо)миноциклина, 9-(трет-бутилглициламидо)миноциклина (тигециклина), как дополнительно описано в Таблице 2 Chopra et al., Microbiol Mol Biol Rev. 2001, June 65(2):232-60. Дополнительные предпочтительные соединения тетрациклина включают кломоциклин (N-метилол-7-хлортетрациклин), 9-(N, N-диметилглициламидо)-6-деметил-6-дезокситетрациклин и 9-(N, N-диметилглициламидо)миноциклин.

Следует отметить, что используемый в настоящем описании термин «соединение тетрациклина» или «ТС» означает общий класс соединений, а именно любое соединение, принадлежащее к семейству тетрациклиновых антибиотиков, тогда как термин «тетрациклин» означает только конкретное предпочтительное соединение (4S,4aS,5aS,12aS)-4-(диметиламино)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-октагидро-3,6,10,12,12a-пентагидрокси-6-метил-1,11-диоксо-2-нафтаценкарбоксамид:

тетрациклин

Предпочтительно, соединение тетрациклина (ТС) выбрано из миноциклина, доксициклина, тетрациклина, хлортетрациклина, окситетрациклина, ролитетрациклина, тигециклина, демеклоциклина, лимециклина, меклоциклина, метациклина, омадациклина, сарециклина, эравациклина, кломоциклина, 9-(N, N-диметилглициламидо)-6-деметил-6-дезокситетрациклина и 9-(N, N-диметилглициламидо)миноциклина. Эти антибиотики обладают преимуществом в том, что являются безопасными, клинически подтвержденными и таким образом надежными и, вероятно, подходят для различных терапевтических применений, как описано в настоящей заявке.

Наиболее предпочтительно, соединение тетрациклина представляет собой миноциклин (7-диметиламино-6-деметил-6-дезокситетрациклин или (4S,4aS,5aR,12aR)-4,7-бис(диметиламино)-1,10,11,12a-тетрагидрокси-3,12-диоксо-4a,5,5a,6-тетрагидро-4H-тетрацен-2-карбоксамид) или доксициклин (6-дезокси-5-гидрокситетрациклин или (4S,4aR,5S,5aR,6R,12aR)-4-(диметиламино)-1,5,10,11,12a-пентагидрокси-6-метил-3,12-диоксо-4a,5,5a,6-тетрагидро-4H-тетрацен-2-карбоксамид) и еще более предпочтительно миноциклин.

Эти антибиотики обладают дополнительным преимуществом, заключающимся в том, что их применимость для лечения заболеваний пародонта доказана клинически.

Молярное соотношение

Молярное соотношение TC:MA₂ предпочтительно находится в диапазоне 1:0,8-3,0. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что преобладающими видами, полученными при приготовлении комплексов в соответствии с настоящим изобретением, являются те, в которых TC:MA₂ составляет 1:1 или 1:2. Таким образом, предполагается, что также смеси, в которых молярное соотношение TC:MA₂ составляет от 1:1 до 1:2, также входят в объем настоящего изобретения. Незначительный избыток TC, например, при котором TC:MA₂=1:0,8, также входит в объем настоящего изобретения. Аналогичным образом, избыток MA₂, например, сверх соотношения TC:MA₂, равного 1:2 или даже 1:3, также считается находящимся в объеме настоящего изобретения, независимо от того, скоординированы ли избыточные катионы металлов с TC. Таким образом, также предполагается, что такие смеси, содержащие комплексы с определенным соотношением TC:MA₂ вместе с определенным избытком одного из компонентов, также охватываются определением комплекса в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно TC:MA₂ составляет 1:1 или 1:2; более предпочтительно TC:MA₂ составляет 1:2. Дополнительные предпочтительные диапазоны для молярного соотношения TC:MA₂ представляют собой, например, 1:0,7-1:1,2, 1:0,7-1:1,1, 1:0,8-1:1,1, 1:0,9-1:1,2, 1:0,9-1:1,1, 1:1,1-1:2,9, 1:1,4-2,5 и 1:1,8-1:2,2; более предпочтительно 1:0,9-1:1,1 и/или 1:1,9-1:2,1.

Карбоксилат-анион

А представляет собой карбоксилат-анион, полученный из C₈-C₂₄карбоновой кислоты. Липофильная природа карбоксилат-аниона способствует улучшению замедленного высвобождения тетрациклинового антибиотика из комплексов и препаратов в соответствии с настоящим изобретением.

Карбоновая кислота может быть насыщенной или ненасыщенной. Предпочтительно, A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из карбоновой кислоты, выбранной из арахиновой кислоты (C₂₀), стеариновой кислоты (C₁₈), пальмитиновой кислоты (C₁₆), миристиновой кислоты (C₁₄), лауриновой кислоты (C₁₂), каприновой кислоты (C₁₀), каприловой кислоты (C₈), гидроксистеариновой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, линоленовой кислоты и рицинолевой кислоты. Гидроксистеариновая кислота предпочтительно может представлять собой 10-гидроксистеариновую кислоту или 12-гидроксистеариновую кислоту. Наиболее предпочтительно карбоксилат-анион представляет собой стеарат (C₁₈).

Фармацевтически приемлемые соли, гидраты и сольваты

Используемый в настоящем описании термин «фармацевтически приемлемый» охватывает как медицинское, так и ветеринарное применение. Например, термин «фармацевтически приемлемый» охватывает соединение, приемлемое для ветеринарии, или соединение, приемлемое для медицины и здравоохранения. Соли, гидраты и сольваты соединений тетрациклина представляют собой соединения, в которых противоион или связанный с ним растворитель являются фармацевтически приемлемыми. Однако соли, гидраты и сольваты, содержащие фармацевтически неприемлемые противоионы или связанные с ними растворители, входят в объем настоящего изобретения, например, для использования в качестве интермедиатов при получении других соединений и их фармацевтически приемлемых солей, гидратов и сольватов. Подходящие соли включают соли, образованные как с органическими, так и с неорганическими кислотами или основаниями. Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли включают соли, образованные из хлористоводородной, бромистоводородной, серной, азотной, лимонной, винной, фосфорной, молочной, пировиноградной, уксусной, трифторуксусной, трифенилуксусной, сульфаминовой, сульфаниловой, янтарной, щавелевой, фумаровой, малеиновой, яблочной, миндальной, глутаминовой, аспарагиновой, щавелевоуксусной, метансульфоновой, этансульфоновой, арилсульфоновой (например, п-толуолсульфоновой, бензолсульфоновой, нафталинсульфоновой или нафталиндисульфоновой), салициловой, глутаровой, глюконовой, трикарбаллиловой, коричной, замещенной коричной (например, фенил-, метил-, метокси- или галогензамещенной коричной, включая 4-метил- и 4-метоксикоричную кислоту), аскорбиновой, олеиновой, нафтойной, гидроксинафтойной (например, 1- или 3-гидрокси-2-нафтойной), нафталинакриловой, бензойной, 4-метоксибензойной, 2-или 4-гидроксибензойной, 4-хлорбензойной, 4-фенилбензойной, бензолакриловой (например, 1,4-бензолдиакриловой), изэтионовой кислот, хлорной, пропионовой, гликолевой, гидроксиэтансульфоновой, памовой, циклогексансульфаминовой, салициловой, сахариновой и трифторуксусной кислоты. Наиболее предпочтительные кислотно-аддитивные соли представляют собой гидрохлорид, гиклат (гидрохлорида гемиэтанолята гемигидрат, HCl⋅½EtOH⋅½H2O) и кислотно-аддитивные соли, образованные из малеиновой или щавелевой кислоты. Фармацевтически приемлемые основные соли включают соли аммония, соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия, соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и магния и соли с органическими основаниями, такими как дициклогексиламин и N-метил-D-глюкамин. Предполагается, что все фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные формы солей соединений настоящего изобретения охватываются объемом настоящего изобретения.

Комплекс образован из соединения тетрациклина (TC) или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата и карбоксилата двухвалентного металла (MA₂). В предпочтительном варианте осуществления соотношение TC:MA₂ составляет 1:2; и/или M выбран из Mg²⁺ и Ca²⁺; и/или A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из карбоновой кислоты, выбранной из арахиновой кислоты (C₂₀), стеариновой кислоты (C₁₈), пальмитиновой кислоты (C₁₆), миристиновой кислоты (C₁₄), лауриновой кислоты (C₁₂), каприновой кислоты (C₁₀), каприловой кислоты (C₈), гидроксистеариновой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, линоленовой кислоты и рицинолевой кислоты. Предпочтительно, комплекс состоит из указанного соединения тетрациклина (TC) или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата и карбоксилата двухвалентного металла (MA₂).

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления комплекс имеет формулу [(TC)⋅2(MgA₂)], в которой соединение тетрациклина (TC) представляет собой миноциклин или его фармацевтически приемлемую соль. Предпочтительно, TC представляет собой свободное основание миноциклина или гидрохлорид миноциклина и A представляет собой стеарат.

Фармацевтические препараты

Настоящее изобретение предоставляет фармацевтический препарат, содержащий комплекс, как описано выше, и необязательно один или более фармацевтически приемлемых эксципиент(ов).

Используемый в настоящем описании термин «фармацевтический препарат» предназначен для охвата продукта, содержащего заявленные соединения в терапевтически эффективных количествах, также как любого продукта, который является прямым или косвенным результатом комбинаций заявленных соединений.

В фармацевтическом препарате в соответствии с настоящим изобретением общее содержание соединения тетрациклина (ТС) предпочтительно находится в диапазоне 5-30 масс.%, 30-50 масс.%, более предпочтительно 8-28 масс.%, 32-48 масс.%, еще более предпочтительно 10-20 масс.%, еще более предпочтительно 11-15 масс.%, еще более предпочтительно 11,5±5 масс.%, 27,9±5 масс.%, 11,5±2 масс.%, 27,9±2 масс.%, 11,7-14,75 масс.%, 15,25-19,75 масс.% и наиболее предпочтительно 11,5 масс.% или 27,9 масс.%. Кроме того, общее содержание комплекса тетрациклина (предпочтительно, комплекса, имеющего формулу [(TC)⋅2(MgA₂)]) в фармацевтическом препарате находится в диапазоне 5-95 масс.%, более предпочтительно 10-80 масс.%, еще более предпочтительно 15-75 масс.%, еще более предпочтительно 20-60 масс.%, еще более предпочтительно 30-50 масс.% и наиболее предпочтительно 41,2 масс.%.

Эксципиенты

Используемый в настоящем описании термин «эксципиент» относится к носителю, связующему веществу, дезинтегратору и/или другой подходящей добавке для галенового состава, такого как экструдат, крем, гель, эмульсия, суспензия, линимент, мазь, порошок, паста, бальзам, лосьон, глазные капли, спрей, аэрозоль для местного применения, раствор для местного применения, суспензия для местного применения, пластырь для кожи и нетканый материал. Носители, которые могут быть добавлены в смесь, включают необходимые и инертные фармацевтические эксципиенты, включая, но не ограничиваясь ими, подходящие замедлители высвобождения, суспендирующие агенты, скользящие вещества, ароматизаторы, подсластители, консерванты, покрытия, гранулирующие агенты, красители и красящие средства.

Наиболее предпочтительным классом эксципиентов являются биоразлагаемые полимеры, которые будут обсуждаться более подробно ниже.

Дополнительными предпочтительными типами эксципиентов являются эмульгаторы, такие как моностеарат глицерина, который может присутствовать предпочтительно в количестве от 5 до 15 масс.%, более предпочтительно от 8 до 12 масс.%, наиболее предпочтительно 10 масс.%. Путем добавления таких эксципиентов можно регулировать (например, ускорять) характер высвобождения препаратов, в частности экструдатов.

Дополнительными предпочтительными типами эксципиентов являются пластификаторы, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), который может присутствовать предпочтительно в количестве от 5 до 15 масс.%, более предпочтительно от 8 до 12 масс.%, наиболее предпочтительно 10 масс.%. Предпочтительный тип пластификатора представляет собой ПЭГ 1500. Путем добавления таких эксципиентов можно регулировать (например, можно уменьшить хрупкость и/или тенденцию к затвердеванию с течением времени) механическое поведение препаратов, в частности экструдатов.

Пути введения и виды препаратов

Предпочтительно, фармацевтический препарат в соответствии с настоящим изобретением предназначен для местного введения. Местное введение означает нанесение на поверхности тела, такие как кожа или мембраны слизистых оболочек для лечения заболеваний с помощью широкого диапазона классов, включая кремы, пены, гели, лосьоны и мази. Многие лекарственные препараты для местного применения являются накожными, то есть их наносят непосредственно на кожу. Лекарственные препараты для местного применения также могут быть ингаляционными, такими как лекарственные препараты от астмы или наноситься на поверхность тканей, отличных от кожи, таких как глазные капли, наносимые на конъюнктиву, или ушные капли, помещаемые в ухо, или лекарственные препараты, наносимые на поверхность зуба, десны или пародонтального кармана.

Еще более предпочтительно, фармацевтический препарат выбран из группы, состоящей из экструдата, частицы, гранулы, порошка, пленки, стрипа, прессованного порошка, чипа, пасты, крема, геля, эмульсии, суспензии, линимента, мази, бальзама, лосьона, глазных капель, спрея, аэрозоля для местного применения, раствора для местного применения, суспензии для местного применения, кожного пластыря и нетканого материала. Еще более предпочтительно, фармацевтический препарат обеспечивает возможность применения в пародонтальном кармане.

Экструдаты

Авторы изобретения стремились разработать термоплавкие экструдаты, которые воспроизводят оптимальные варианты, согласно которым идеальная система доставки лекарственного средства для лечения пародонтита должна сочетать простое производство, удобное применение, отсутствие растворителей и контролируемое высвобождение в течение длительного периода с высокой биологической активностью. Экструзия горячего расплава является подходящей технологией, поскольку это непрерывный и хорошо зарекомендовавший себя процесс в фармацевтической промышленности. Размеры и формы могут быть изменены параметрами экструзии. Кроме того, гибкость и поведение при набухании можно изменить путем соответствующего выбора эксципиентов. Экструдаты можно обрезать до соответствующей длины. Установка экструдатов представляет собой простой и быстрый процесс. Для этого не требуется никакого специального устройства в отличие от нанесения микрочастиц и высоковязких гелей.

Используемый в настоящем описании термин «экструдат» относится к любому материалу, который был экструдирован через фильеру. В частности, экструдаты относятся к дозированным формам, полученным формованием прекурсора путем экструзии в стержни, которые можно или разрезать на части, или использовать как таковые, например, как лекарственная форма с замедленным высвобождением для местного или другого пути введения. Предпочтительно, фармацевтический препарат находится в форме нитевидного экструдата, например, как показано на Фиг. 9. Нитевидный экструдат предпочтительно имеет по существу круглое или по существу эллиптическое поперечное сечение и/или максимальный диаметр поперечного сечения в диапазоне 0,1-10 мм, 0,2-5 мм, 0,3-1 мм, 0,4-0,8 мм, 0,3-0,6 мм, более предпочтительно 0,2-5 мм, еще более предпочтительно 0,3-1 мм, еще более предпочтительно 0,4-0,8 мм, наиболее предпочтительно 0,3-0,6 мм, 0,3, 0,4, 0,5 или 0,6 мм. Подходящий диаметр можно легко, безболезненно и надежно поместить в пародонтальный карман заданного размера.

Биоразлагаемые полимеры

Фармацевтический препарат в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно содержит в качестве возможного эксципиента один или более биоразлагаемых полимер(ов). Они могут быть выбраны из биоразлагаемых полиэфиров, таких как поли(гликолевая кислота) (PGA), поли(молочная кислота) (PLA), поли(молочная-со-гликолевая кислота) (PLGA), полигидроксимасляная кислота (PHB) или поликапролактон (PCL); смешанных биоразлагаемых полиэфиров, таких как PLA-PCL и PLGA-PCL; биоразлагаемых ПЭГилированных диблочных (AB) или триблочных (ABA или BAB) сополимеров, таких как ПЭГ-PLA, ПЭГ-PLGA, ПЭГ-PCL и ПЭГ-PCL-PLGA; и пектинов.

Поли(гликолевая кислота) (PGA), поли(молочная кислота) (PLA) и их сополимеры представляют собой биоразлагаемые полиэфиры, подходящие для использования в настоящем изобретении. Они разлагаются в организме путем простого гидролиза сложноэфирной цепи до безвредных и нетоксичных соединений. Продукты распада или выводятся почками, или выделяются в виде углекислого газа и воды хорошо известными биохимическими путями. Поскольку полимеры PLA/PGA считаются безопасными, нетоксичными и биосовместимыми регулирующими органами практически во всех развитых странах, дополнительные применения этих материалов могут быть выведены на рынок раньше и являются более рентабельными, чем те, в которых используются новые полимеры с недоказанной биосовместимостью. Примеры полимеров PLA/PGA, подходящих для использования в настоящем изобретении, представляют собой, например, полимеры RESOMER, производимые Evonik Röhm Pharma GmbH, показанные в Таблице 1 ниже (RESOMER® Biodegradable Polymers for Medical Device Applications Research. RESOMER® Materials by Evonik Röhm GmbH, https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/materials-science/polymer-science/resomer.html, найдено 25.10.2018).

Поли(гликолевая кислота) (PGA)

PGA представляет собой высококристаллический материал с высокой температурой плавления (225-230°C) и переменной растворимостью в органических растворителях, которая является обычно низкой и зависит от молекулярной массы полимера. Он все еще подвержен гидролизу вследствие сложноэфирной связи в основной цепи полимера. Несмотря на его низкую растворимость, из этого полимера изготавливали различные формы и структуры. Методики, используемые для разработки структур на основе PGA, включают экструзию, литье под давлением и прессование в форме, также как выщелачивание твердых частиц и формование окунанием в раствор. Волокна PGA обладают высокой прочностью и модулем упругости и являются особенно жесткими.

Поли(молочная кислота) (PLA)

В отличие от гликолида лактид представляет собой хиральную молекулу и существует в двух различных оптически активных формах - L-лактиде и D-лактиде. Когда каждый из этих мономеров полимеризуется, полученный полимер является полукристаллическим. Полимеризация рацемической смеси L- и D-лактидов приводит к образованию поли-D, L-лактида (PDLLA), который является аморфным и имеет температуру стеклования 55-60°C. Степень кристалличности можно регулировать, изменяя соотношение D- и L-энантиомеров в полимере. Выбор стереохимии PLA может иметь большое влияние на свойства, технологичность и биоразлагаемость полимера. Поли(L-лактид) или PLLA часто является предпочтительным полимером для литых/экструдированных биомедицинских устройств, потому что он распадается на звенья L(+)-молочной кислоты, которые являются встречающимся в природе стереоизомерами и поэтому выводятся с минимальной токсичностью.

Сополимеры поли(лактид-со-гликолид) (PLGA)

Как L-, так и DL-лактиды использовались для сополимеризации. Соотношение гликолида и лактида в различных композициях позволяет контролировать степень кристалличности полимеров. Когда кристаллический PGA сополимеризуется с PLA, степень кристалличности снижается, и в результате это приводит к увеличению скорости гидратации и гидролиза. Таким образом, можно сделать вывод, что время деструкции сополимера связано с соотношением мономеров, используемых в синтезе. Как правило, чем выше содержание гликолида, тем быстрее скорость деструкции. Однако исключением из этого правила является соотношение PGA:PLA 50:50, которое демонстрирует самую быструю деструкцию.

В качестве концевых групп предпочтительными являются три типа функциональных концевых групп: (i) группа свободной карбоновой кислоты, (ii) сложноэфирная концевая группа, (iii) алкилэфирная группа. Полимеры, закрытые эфирными концевыми и алкилэфирными группами обычно демонстрируют более длительные периоды деструкции, чем свободные карбоксильные аналоги.

Таблица 1 : Биоразлагаемые полимеры RESOMER®

Продукт No. Тип RESOMER Название продукта Молекулярная масса диапазон Вязкость [дл/г] Применение Tg [°C] Tm [°C] Концевая группа 719854 RESOMER L 206 S Поли(L-лактид) -- 0,8-1,2 Медицинское изделие 60-65 180-185 эфирная концевая 719951 RESOMER R 202 S Поли(D, L-лактид) 10000-18000 0,16-0,24 Контролируемое высвобождение 38-42 аморфный эфирная концевая 719978 RESOMER R 202 H Поли(D, L-лактид) 10000-18000 0,16-0,24 Контролируемое высвобождение 44-48 аморфный свободная карбоновая кислота 719935 RESOMER R 203 S Поли(D, L-лактид) 18000-28000 0,25-0,35 Контролируемое высвобождение 46-50 аморфный эфирная концевая 719943 RESOMER R 203 H Поли(D, L-лактид) 18000-28000 0,25-0,35 Контролируемое высвобождение 48-52 аморфный свободная карбоновая кислота 719889 RESOMER RG 502 Поли(D, L-лактид-со-гликолид) 50:50 7000-17000 0,16-0,24 Контролируемое высвобождение 42-46 аморфный алкилэфирная 719897 RESOMER RG 502 H Поли(D, L-лактид-co-гликолид) 50:50 7000-17000 0,16-0,24 Контролируемое высвобождение 42-46 аморфный свободная карбоновая кислота 739952 RESOMER RG 503 Поли(D, L-лактид-co-гликолид) 50:50 24000-38000 0,32-0,44 Контролируемое высвобождение 44-48 аморфный эфирная 719870 RESOMER RG 503 H Поли(D, L-лактид-co-гликолид) 50:50 24000-38000 0,32-0,44 Контролируемое высвобождение 44-48 аморфный свободная карбоновая кислота 739944 RESOMER RG 504 Поли(D, L-лактид-co-гликолид) 50:50 38000-54000 0,45-0,60 Контролируемое высвобождение 46-50 аморфный эфирная 719900 RESOMER RG 504 H Поли(D, L-лактид-co-гликолид) 50:50 38000-54000 0,45-0,60 Контролируемое высвобождение 46-50 аморфный свободная карбоновая кислота 739960 RESOMER RG 505 Поли(D, L-лактид-co-гликолид) 50:50 54000-69000 0,61-0,74 Контролируемое высвобождение 48-52 аморфный эфирная 719862 RESOMER RG 653 H Поли(D, L-лактид-co-гликолид) 65:35 24000-38000 0,32-0,44 Контролируемое высвобождение 46-50 аморфный свободная карбоновая кислота 719919 RESOMER RG 752 H Поли(D, L-лактид-co-гликолид) 75:25 4000-15000 0,14-0,22 Контролируемое высвобождение 42-46 аморфный свободная карбоновая кислота 719927 RESOMER RG 756 S Поли(D, L-лактид-co-гликолид) 75:25 76000-116000 0,71-1,0 Контролируемое высвобождение 49-55 аморфный эфирная концевая 739979 RESOMER RG 858 S Поли(D, L-лактид-co-гликолид) 85:15 190000-240000 1,3-1,7 Контролируемое высвобождение - аморфный алкилэфирная 719846 RESOMER X Полидиоксанон -- 1,5-2,2 (0,1% в ГФИП, 30ºC) медицинское изделие (-10)-(-5) 110-115 -- ⃰Удельная вязкость [дл/г], (0,1% в CHCl₃, 25°C, за исключением случаев, когда отмечено)

Дополнительные подходящие биоразлагаемые полимеры для применения в настоящем изобретении доступны под названием EXPANSORB® от Merck KGaA (PLA & PLGA Polymer Portfolio for Peptide & Small Molecule Formulation http://www.merckmillipore.com/INTERSHOP/web/WFS/Merck-DE-Site/de_DE/-/EUR/ShowDocument-Pronet?id=201604.101, найдено 25.10.2018):

Таблица 2 : Биоразлагаемые полимеры EXPANSORB®

Продукт Порядковый номер Поли (D, L-молочная кислота) (PLA) Соотношение L/DL Концевая группа В.В. диапазон (дл/г, CHCl₃, 25°C) MW (ориентировочный диапазон, кДа) EXPANSORB® DL 100-1A 5,43108 PDLLA 0/100 COOH 0,05-0,20 6-20 EXPANSORB® DL 100-2A 5,43109 PDLLA 0/100 COOH 0,15-0,30 10-25 EXPANSORB® DL 100-5A 5,43110 PDLLA 0/100 COOH 0,40-0,60 45-80 EXPANSORB® DL 100-7A 5,43111 PDLLA 0/100 COOH 0,60-0,80 70-120 EXPANSORB® DLL 10-15A 5,43112 P(L/DL)LA 90/10 COOH 1,30-1,70 200-250 EXPANSORB® DL 100-2E 5,43113 PDLLA 0/100 ЭФИР 0,15-0,30 10-25 Продукт Порядковый номер Поли (D, L-молочная-со-гликолевая кислота) (PLGA) Соотношение L/G Концевая группа В.В. диапазон (дл/г, CHCl₃, 25°C) MW (ориентировочный диапазон, кДа) EXPANSORB® DLG 45-2A 5,43114 PLGA 45/55 COOH 0,15-0,30 15-30 EXPANSORB® DLG 50-2A 5,43115 PLGA 50/50 COOH 0,15-0,25 5-20 EXPANSORB® DLG 50-3A 5,43116 PLGA 50/50 COOH 0,25-0,40 15-40 EXPANSORB® DLG 50-5A 5,43117 PLGA 50/50 COOH 0,40-0,55 42-65 EXPANSORB® DLG 50-6A 5,43118 PLGA 50/50 COOH 0,55-0,65 60-85 EXPANSORB® DLG 50-8A 5,43119 PLGA 50/50 COOH 0,65-0,90 80-130 EXPANSORB® DLG 55-5A 5,43120 PLGA 55/45 COOH 0,40-0,50 42-65 EXPANSORB® DLG 65-3A 5,43121 PLGA 65/35 COOH 0,25-0,35 15-40 EXPANSORB® DLG 65-6A 5,43122 PLGA 65/35 COOH 0,50-0,65 45-85 EXPANSORB® DLG 75-2A 5,43124 PLGA 75/25 COOH 0,08-0,21 5-20 EXPANSORB® DLG 75-5A 5,43125 PLGA 75/25 COOH 0,38-0,64 37-84 EXPANSORB® DLG 75-7A 5,43126 PLGA 75/25 COOH 0,60-0,70 65-85 EXPANSORB® DLG 75-8A 5,43127 PLGA 75/25 COOH 0,70-0,90 76-130 EXPANSORB® DLG 75-10A 5,43123 PLGA 75/25 COOH 0,80-1,10 110-166 EXPANSORB® DLG 85-2A 5,43129 PLGA 85/15 COOH 0,15-0,25 10-15 EXPANSORB® DLG 85-7A 5,43128 PLGA 85/15 COOH 0,55-0,75 65-95 EXPANSORB® DLG 90-5A 5,43130 PLGA 90/10 COOH 0,35-0,55 30-70 EXPANSORB® DLG 90-7A 5,43131 PLGA 90/10 COOH 0,60-0,75 50-95 EXPANSORB® DLG 95-2A 5,43132 PLGA 95/5 COOH 0,15-0,25 5-20 EXPANSORB® DLG 95-4A 5,43133 PLGA 95/5 COOH 0,25-0,50 35-60 EXPANSORB® DLG 50-2E 5,43134 PLGA 50/50 ЭФИР 0,15-0,25 5-20 EXPANSORB® DLG 50-6E 5,43135 PLGA 50/50 ЭФИР 0,55-0,65 60-85 EXPANSORB® DLG 50-7E 5,43136 PLGA 50/50 ЭФИР 0,60-0,70 70-100 EXPANSORB® DLG 65-6E 5,43137 PLGA 65/35 ЭФИР 0,50-0,65 45-85 EXPANSORB® DLG 75-2E 5,43138 PLGA 75/25 ЭФИР 0,15-0,30 10-25 EXPANSORB® DLG 75-4E 5,43139 PLGA 75/25 ЭФИР 0,30-0,50 25-60 EXPANSORB® DLG 75-7E 5,43140 PLGA 75/25 ЭФИР 0,66-0,80 80-115 EXPANSORB® DLG 75-9E 5,43141 PLGA 75/25 ЭФИР 0,75-1,00 100-160 EXPANSORB® DLG 85-7E 5,43142 PLGA 85/15 ЭФИР 0,55-0,75 65-95 EXPANSORB® DLG 85-12E 5,45583 PLGA 85/15 ЭФИР 1,00-1,30 185-210 EXPANSORB® DLG 50-6P 5,43143 PLGA-ПЭГ 50/50 ПЭГ 0,45-0,65 30-60 EXPANSORB® DLG 50-7P 5,43144 PLGA-ПЭГ 50/50 ПЭГ 0,65-0,80 60-85 EXPANSORB® DLG 75-4A 5,45223 PLGA 75/25 COOH 0,30-0,50 25-60

Биоразлагаемые полимеры, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно имеют диапазон средневесовой молекулярной массы (кДа) 4-250, 4-240, 4-15, 5-210, 5-90, 5-20, 7-17, 10-25, 10-18, 10-15, 15-40, 15-30, 18-28, 24-38, 25-60, 30-70, 30-60, 35-60, 37-84, 42-65, 45-85, 50-95, 60-85, 65-95, 65-85, 70-100, 76-130, 76-116, 80-130, 80-115, 100-160, 110-166, 185-210, 190-240, более предпочтительно 7-85, 8-16, 25-37, 0,45-0,80, 0,46-0,64, 0,66-0,79, наиболее предпочтительно 7-17, 24-38, 45-65 и/или 65-80. Биоразлагаемые полимеры, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно имеют температуру стеклования 42-48°C, более предпочтительно 43-47°C, еще более предпочтительно 42-46 или 44-48°C. Биоразлагаемые полимеры, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно имеют характеристическую (истинную) вязкость [дл/г] (0,1% в CHCl₃ при 25°C) 0,03-1,70, 0,03-1,75, 0,05-1,60, 0,05-0,20, 0,06-1,60, 0,08-0,21, 0,13-1,32, 0,16-1,28, 0,12-0,46, 0,14-0,22, 0,14-1,70, 0,15-0,21, 0,15-0,25, 0,15-0,30, 0,15-0,43, 0,16-0,24, 0,18-0,22, 0,25-0,35, 0,25-0,35, 0,25-0,40, 0,25-0,50, 0,30-0,46, 0,30-0,50, 0,32-0,44, 0,35-0,42, 0,35-0,55, 0,38-0,64, 0,40-0,50, 0,40-0,55, 0,40-0,60, 0,42-0,67, 0,42-0,82, 0,45-0,60, 0,45-0,65, 0,47-0,63, 0,47-0,78, 0,50-0,65, 0,55-0,65, 0,55-0,75, 0,61-0,74, 0,60-0,70, 0,60-0,75, 0,60-0,80, 0,63-0,82, 0,65-0,80, 0,67-0,78, 0,66-0,80, 0,65-0,90, 0,70-0,90, 0,71-1,00, 0,75-1,00, 0,80-1,10, 0,80-1,20, 1,00-1,30, 1,30-1,70. Полимеры с концевыми (блокированными) группами сложного эфира, алкилового эфира и/или ПЭГ являются предпочтительными.

Биоразлагаемые полимеры, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно представляют собой сополимеры PLGA (поли(D, L-лактид-со-гликолиды)), имеющие соотношение L/G 5/95-95/5, 10/90-90/10, 15/85-85/15, 25/75-75/25, 35/65-65/35, 45/55-55/45, 45/55-50/50, 50/50-55/45, 55/45-65/35, 65/35-75/25, 75/25-85/15, 85/15-90/10, 90/10-95/5, более предпочтительно 25/75, 45/55, 50/50, 55/45, 65/35, 75/25, 75/25, 85/15, 90/10, 95/5, 95/5, наиболее предпочтительно 50/50.

Предпочтительные биоразлагаемые полимеры представляют собой сополимеры PLGA, имеющие соотношение L/G 25/75-75/25, предпочтительно 35/65-65/35, более предпочтительно 45/55-55/45, наиболее предпочтительно 50/50; и имеющие диапазон средневесовой молекулярной массы (кДа) 5-90, предпочтительно 7-85, более предпочтительно 7-17, 24-38, 30-60, 60-85, еще более предпочтительно 8-18, 25-37, 31-59, 61-84; и имеющие характеристическую (истинную) вязкость [дл/г] (0,1% в CHCl₃ при 25°C) 0,14-0,82, предпочтительно 0,16-0,80, более предпочтительно 0,16-0,24, 0,32-0,44, 0,45-0,65, 0,65-0,85, еще более предпочтительно 0,17-0,23, 0,323-0,43, 0,46-0,64, 0,66-0,84; и которые заканчиваются группами сложного эфира, алкилового эфира и/или ПЭГ; необязательно имеющие температуру стеклования 42-48°C, предпочтительно 42-46 или 44-48°C, еще более предпочтительно 43-45 или 45-47°C.

Предпочтительные биоразлагаемые полимеры представляют собой поли(D, L-лактид-со-гликолиды) с соотношением PLA/PGA 50:50; предпочтительно имеющие диапазон средневесовой молекулярной массы 7000-38000, более предпочтительно 7000-17000 или 24000-38000; и/или характеристическую вязкость 0,16-0,44, более предпочтительно 0,16-0,24 или 0,32-0,44; и/или температуру стеклования 42-48°C, более предпочтительно 42-46 или 44-48°C. Еще более предпочтительно, чтобы биоразлагаемый полимер был выбран из Resomer® RG 502 («Resomer 502»), Resomer® RG 503 («Resomer 503») или их смесей.

Предпочтительные биоразлагаемые полимеры представляют собой также поли(D, L-лактид-со-гликолиды) с соотношением PLA/PGA 50:50 и концевой группой ПЭГ (PLGA-ПЭГ); предпочтительно имеющие диапазон средневесовой молекулярной массы 30-85, более предпочтительно 30-60 кДа; и/или предпочтительно имеющие характеристическую вязкость 0,45-0,80, более предпочтительно 0,45-0,65. Еще более предпочтительно, биоразлагаемый полимер представляет собой EXPANSORB® DLG 50-6P.

Способы изготовления

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет способ изготовления комплекса, как описано выше, причем способ включает следующие стадии: (а) смешивание соединения тетрациклина (ТС) или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата и карбоксилата двухвалентного металла (МА₂) в молярном соотношении 1:0,8-3,0 с органическим растворителем для получения дисперсии, в которой катион двухвалентного металла M представляет собой катион щелочноземельного металла и A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из C₈-C₂₄карбоновой кислоты; (b) нагревание указанной дисперсии с образованием комплекса; (c) удаление растворителя для получения комплекса. Предпочтительные соединения тетрациклина, молярные соотношения, карбоксилат-анионы, фармацевтически приемлемые соли, гидраты и сольваты представляют собой, как описано в разделе «Комплексы» выше. В предпочтительном варианте осуществления комплекс в соответствии с настоящим изобретением получают/можно получить с помощью способа изготовления, как описано в настоящей заявке.

На стадии смешивания (а) предпочтительный растворитель представляет собой, например, спирт, такой как метанол, этанол или их смеси в присутствии или в отсутствие воды. Предпочтительно, может быть использовано массовое/объемное соотношение ТС и растворителя от 1:100 до 1:300, предпочтительно 1:200.

Нагревание дисперсии (b) ускоряет образование комплекса предпочтительно при температуре 50°C или более, более предпочтительно 60°C или наиболее предпочтительно 70°C или более и вплоть до точки кипения растворителя. В зависимости от выбранного растворителя, температуры и массового/объемного соотношения ТС и растворителя полное растворение может происходить во время стадии (b), в результате чего получается раствор комплекса.

На стадии (с) растворитель может быть удален подходящим способом, известным в данной области техники. Предпочтительно, растворитель может быть испарен при комнатной или повышенной температуре; и/или в шейкере, сушильном шкафу или на/в пленке; и/или при атмосферном или предпочтительно пониженном давлении.

Фармацевтические препараты в соответствии с настоящим изобретением, если не указано иначе, могут быть получены подходящим способом, известным в данной области техники. Однако когда фармацевтические препараты находятся в форме нитевидных экструдатов, последние предпочтительно получают в соответствии со способом, включающим следующие стадии: (d) измельчение указанного комплекса и, если присутствует, одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов для получения экструзионного прекурсора; (e) экструзия указанного экструзионного прекурсора при температуре выше комнатной температуры; (f) охлаждение продукта стадии (е) для получения фармацевтического препарата в форме нитевидного экструдата. Предпочтительные эксципиенты, пути введения и типы препаратов, экструдатов и биоразлагаемых полимеров описаны в разделе «Фармацевтические препараты» выше. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтический препарат в соответствии с настоящим изобретением получают/можно получить с помощью способа изготовления, как описано в настоящей заявке.

На стадии измельчения (d) комплекс смешивают, измельчают и гомогенизируют вместе с одним или более фармацевтически приемлемым(и) эксципиентом(ами) (как описано выше и если они присутствуют) для получения экструзионного прекурсора. Предпочтительно, один или более биоразлагаемых полимер(ов), эмульгатор(ов) и/или пластификатор(ов), как описано выше, могут быть добавлены в качестве эксципиентов. Еще более предпочтительно, чтобы содержание добавленного соединения тетрациклина (TC) находилось в диапазоне 5-30 масс.%, более предпочтительно 8-28 масс.%, еще более предпочтительно 10-20 масс.%, еще более предпочтительно 11-15 масс.% и наиболее предпочтительно 11,5 масс.% или 27,9 масс.% по отношению к общему количеству смешанных компонентов. Измельчение предпочтительно проводится путем измельчения или растирания, предпочтительно в мельнице или измельчителе, более предпочтительно при низкой температуре, например, в криомельнице при -196°C. При использовании криомельницы проведение 6, предпочтительно 5 циклов измельчения с частотой 30 Гц в течение 150 с при промежуточном охлаждении (30 с) с частотой 5 Гц между циклами является наиболее предпочтительным для получения экструзионного прекурсора.

Стадия экструзии (е) проводится путем экструзии экструзионного прекурсора через фильеру. Предпочтительно, можно использовать двухшнековый экструдер. Экструзию проводят при подходящей температуре выше комнатной, которая является достаточной для обеспечения пластической деформируемости материала экструзионного прекурсора. В зависимости от композиции прекурсора, это предпочтительно температура, приблизительно равная или выше температуры размягчения (в случае чистого комплекса без полимерных ингредиентов); или до или выше температуры стеклования (в случае присутствия полимерного ингредиента, такого как биоразлагаемые полимеры). Как правило, температура экструзии может находиться предпочтительно в диапазоне от 48 до 56°C, более предпочтительно от 49 до 55°C, еще более предпочтительно, выбранная из 49, 52, 53 и 55°C.

Форма поперечного сечения экструдата в основном определяется фильерой на выходе экструдера, которая может быть предпочтительно по существу круглым или по существу эллиптическим поперечным сечением и/или максимальным диаметром поперечного сечения в диапазоне 0,1-10 мм, более предпочтительно 0,2-5 мм, еще более предпочтительно 0,3-1 мм, еще более предпочтительно 0,4-0,8 мм, наиболее предпочтительно 0,6 мм. Гринштейн и Тонетти (Greenstein, G. et al. J Periodontol 2000, 76, 1237-1247) продемонстрировали в своей работе трудности, связанные с зубной бороздкой как целевым местом нанесения. Воспаленный десневой карман имеет глубину, по меньшей мере, приблизительно 5 мм, ширину 3 мм и толщину 1 мм. Объем бороздки зуба 15 мкл обновляется приблизительно 40 раз в час. Этот ограниченный объем обеспечивает высокие местные концентрации АФИ. Следовательно, диаметр менее 1 мм и/или длина менее 5 мм, предпочтительно менее 3 мм является предпочтительной для удобного применения. Предпочтительные диаметры экструдатов представляют собой, например, 125-975 мкм, 425-575 мкм, 625-775 мкм. Предпочтительно, на стадии экструзии получают гомогенные экструдаты с диаметром от 600 до 900 мкм, например, 620-880 мкм. Использование различных диаметров, адаптированных к размеру кармана, и одновременное применение различных диаметров (например, 600 мкм в окружении 300 мкм) представляется весьма перспективным. Диаметр и форму экструдатов можно адаптировать. Например, фильеру экструдера можно при желании заменить на пластину с различными диаметрами или геометрическими формами.

После охлаждения (f) экструдированного продукта стадии (e) получают фармацевтический препарат в форме нитевидного экструдата, как показано, например, на Фиг. 9. Полученную таким образом нитевидную форму можно дополнительно разрезать на более мелкие части или деформированные по желанию, например, для помещения в пародонтальный карман определенного размера или формы.

Терапевтическое применение

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет комплекс и/или фармацевтический препарат, как определено выше, для применения в способе лечения организма человека или животного. Настоящее раскрытие также предоставляет способ лечения организма человека или животного, в котором способ включает введение терапевтически эффективного количества комплекса и/или фармацевтического препарата, как определено выше, объекту, нуждающемуся в таком лечении.

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет комплекс и/или фармацевтический препарат, как определено выше, для применения в способе терапии и/или профилактики бактериальной инфекции, предпочтительно вызванной одной или более бактериями, выбранными из группы, состоящей из Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Streptococcus gordonii, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces naeslundii и Parvimonas micra; и/или в котором антибиотическая активность сохраняется в течение периода, по меньшей мере, 21 дня, предпочтительно, по меньшей мере, 25, более предпочтительно, по меньшей мере, 28, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 35 дней, наиболее предпочтительно 42 дней; и/или для применения в способе терапии и/или профилактики острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта. Раскрытие дополнительно предоставляет способ терапии и/или профилактики бактериальной инфекции, предпочтительно вызванной одной или более бактериями, выбранными из группы, состоящей из Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Streptococcus gordonii, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces naeslundii и Parvimonas micra; и/или в котором антибиотическая активность сохраняется в течение периода, по меньшей мере, 21 дня, предпочтительно, по меньшей мере, 25, более предпочтительно, по меньшей мере, 28, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 35 дней, наиболее предпочтительно 42 дней; и/или способ терапии и/или профилактики острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта, каждый из которых включает введение терапевтически эффективного количества комплекса и/или фармацевтического препарата, как описано выше, объекту, нуждающемуся в таком лечении, соответственно.

В настоящее время считается, что P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia, F. nucleatum и P. micros представляют собой патогены, наиболее связанные с пародонтитом. Кроме того, A. naeslundii и S. gordonii, принадлежащие к так называемым «ранним колонизаторам», считаются необходимыми для образования биопленки (например, пероральной периопатогенной биопленки) и также присутствуют в случае заболеваний пародонта.

Основные категории заболеваний и состояний пародонта подразделяются на группы заболеваний десен, вызванных зубным налетом, хронического пародонтита, агрессивного пародонтита, пародонтита как проявления системных заболеваний, некротических заболеваний пародонта, абсцессов пародонта, пародонтита, связанного с эндодонтическими поражениями, периимплантного мукозита, периимплантита и эндодонтических инфекций. В настоящем изобретении острое, хроническое или рецидивирующее заболевание пародонта предпочтительно выбрано из группы, состоящей из заболеваний десен, вызванных зубным налетом, пародонтита, хронического пародонтита, агрессивного пародонтита, пародонтита как проявления системных заболеваний, некротических заболеваний пародонта, абсцессов пародонта, пародонтита, связанного с эндодонтическими поражениями, периимплантного мукозита, периимплантита и эндодонтических инфекций. Настоящее раскрытие также предоставляет способ терапии или профилактики острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта, которое предпочтительно выбрано из группы, состоящей из заболеваний десен, вызванных зубным налетом, пародонтита, хронического пародонтита, агрессивного пародонтита, пародонтита как проявления системных заболеваний, некротических заболеваний пародонта, абсцессов пародонта, пародонтита, связанного с эндодонтическими поражениями, периимплантного мукозита, периимплантита и эндодонтических инфекций, в котором способ включает введение терапевтически эффективного количества комплекса и/или фармацевтического препарата, как описано выше объекту, нуждающемуся в таком лечении. Дополнительные острые, хронические или рецидивирующие заболевания пародонта описаны, например, в Armitage, A. Ann Periodontol 1999, 4, 1-6.

Используемый в настоящем описании термин «объект» относится к животному, предпочтительно млекопитающему, наиболее предпочтительно человеку, которое является или являлось объектом лечения, терапии, профилактики, наблюдения или эксперимента.

Используемый в настоящем описании термин «терапевтически эффективное количество» означает такое количество активного соединения или фармацевтического агента, которое вызывает биологический или лекарственный ответ в тканевой системе, у животного или человека, который ищет исследователь, ветеринар, врач или другой клиницист, который включает облегчение симптомов заболевания или нарушения, подлежащего лечению.

ПРИМЕРЫ

Образование и свойства комплексов

Пример 1: Образование 1:2 комплекса миноциклина (свободного основания) и стеарата магния

Миноциклин (свободное основание) взвешивали в круглодонной колбе вместе со стеаратом магния в молярном соотношении 1:2. В частности, миноциклин (10 мг, M=457,48 г/моль, 218,8 мкмоль) объединяли со стеаратом магния (25,848 мг, M=591,24 г/моль, 43,717 мкмоль). Оба компонента кратковременно перемешивали в ручном шейкере. Смесь суспендировали в неденатурированном этаноле (96% об./об., 2 мл) с получением светло-желтой непрозрачной суспензии. Закрытую колбу помещали на водяную баню при легком покачивании. Начиная приблизительно с 50°C происходило образование и растворение комплекса. При приблизительно 60-70°C образовывался прозрачный оранжевый раствор, который оставался прозрачным после охлаждения до комнатной температуры. Растворитель удаляли в прокаленном шейкере. На Фиг. 1 показаны виалы с высушенными продуктами.

Пример 2: Образование 1:1 комплекса миноциклина (свободного основания) и стеарата магния

Комплекс, имеющий молярное соотношение 1:1, получали аналогично тому, как описано в Примере 1, с использованием соответствующим образом адаптированного количества миноциклина (свободного основания).

Пример 3: Образование 1:2 комплекса миноциклина гидрохлорида и стеарата магния

Комплекс миноциклина гидрохлорида и стеарата магния, имеющий молярное соотношение 1:2, получали аналогично тому, как описано в Примере 1 выше, в котором использовали соответствующее количество миноциклина гидрохлорида, в результате чего молярное соотношение миноциклина и стеарата магния составляло 1:2.

Пример 4: Образование 1:1 комплекса миноциклина гидрохлорида и стеарата магния

Комплекс миноциклина гидрохлорида и стеарата магния, имеющий молярное соотношение 1:1, получали аналогично тому, как описано в Примере 1 выше, в котором использовали соответствующее количество миноциклина гидрохлорида, в результате чего молярное соотношение миноциклина и стеарата магния составляло 1:1.

Пример 5: Образование 1:2 комплекса доксициклина (свободного основания) и стеарата магния

Комплекс доксициклина (свободного основания) и стеарата магния, имеющий молярное соотношение 1:2, получали аналогично тому, как описано в Примере 1 выше, в котором доксициклин использовали вместо миноциклина.

Пример 6: Образование 1:1 комплекса доксициклина (свободного основания) и стеарата магния

Комплекс доксициклина (свободного основания) и стеарата магния, имеющий молярное соотношение 1:1, получали аналогично тому, как описано в Примере 1 выше, в котором однако свободное основание доксициклина использовали вместо миноциклина, соответствующее количество доксициклина представляло собой такое, чтобы молярное соотношение составляло 1:1.

Продукты из вышеприведенных примеров имеют свойства, отличные от свойств соответствующих соединений тетрациклина (миноциклин, миноциклина гидрохлорид и доксициклин), что указывает на образование отдельных новых комплексов.

Растворимость комплексов по сравнению с соответствующим соединением тетрациклина (например, чистым миноциклином) снижается. Миноциклин растворим в большинстве полярных растворителей, таких как вода, диметилсульфоксид, этанол, метанол и N-метилпирролидон. Комплексы, напротив, плохо растворимы в воде, но хорошо растворимы в хлороформе. Считается, что противоион стеарата вносит вклад в модифицированные свойства растворимости. Варианты противоиона могут быть рассмотрены, чтобы подобрать растворимость.

Продукты, имеющие молярное соотношение соединения тетрациклина и стеарата магния 1:1, кристаллизуются при сушке, тогда как продукты, имеющие молярное соотношение 1:2, затвердевают с образованием стеклообразного твердого вещества (Фиг. 1). Из этих твердых веществ были взяты образцы и изучены под микроскопом. В твердых веществах, имеющих молярное соотношение 1:1, наблюдали неоднородную композицию (Фиг. 2, слева), тогда как образцы, имеющие молярное соотношение 1:2, имели однородный внешний вид (Фиг. 2, справа). Подобным образом твердое вещество, полученное из доксициклина и стеарата магния в соотношении 1:1, давало неоднородные агломераты (Фиг. 3, слева), тогда как стеклообразная структура образовывалась в случае молярного соотношения 1:2 (Фиг. 3, справа), экстракция посредством шпателя.

Пример 7: Стабилизация в водной среде

Миноциклин (10 мг; Фиг. 4, левая сторона) и комплекс Примера 1 (20 мг; Фиг. 4, правая сторона) помещали в отдельные виалы, чтобы получить приблизительно равное количество миноциклина. Каждый образец диспергировали в 4 мл соответствующего буфера (ФСБ) при pH 7,1 (Фиг. 4, верхний ряд) или pH 2,3 (Фиг. 4, нижний ряд). Образцы с комплексом приводили к суспензии вследствие более низкой растворимости комплекса. Образцы инкубировали при 37°C в течение нескольких дней, и спектры записывали после разделения с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором при длине волны 355 нм. Доминирующий пик при времени удерживания 4,75 мин соответствует миноциклину. В области нейтрального pH при 37°C полное разложение наблюдается через 3 дня в случае чистого миноциклина (Фиг. 4, вверху слева). В кислых условиях процесс разложения идет медленнее, хотя миноциклин тем не менее в некоторой степени непрерывно распадается. Комплекс, в свою очередь, менее подвержен разложению, поскольку он менее растворим вследствие своих липофильных свойств и менее интенсивно реагирует с растворителем (Фиг. 4, правая сторона). Считается, что в процессе инкубации дополнительные фракции комплекса растворяются и только после этого подвергаются разложению. Хотя тогда также наблюдается распад активного вещества, тем не менее в случае комплекса он происходит гораздо медленнее, в частности при нейтральных условиях (Фиг. 4, вверху справа). Таким образом, считается, что комплексообразование обеспечивает стабилизацию композиции в водной среде.

Пример 8: Спектроскопические свойства

а) Спектры поглощения в УФ/видимой области

Кроме того, наблюдались изменения в спектрах поглощения (Фиг. 5). Свежеприготовленный этанольный раствор миноциклина и комплекса Примера 1 получали при концентрации 5 мг/мл миноциклина. Из этих исходных растворов отбирали 10 мкл и разбавляли этанолом (3 мл) таким образом, чтобы была получена конечная концентрация миноциклина 16,6 мкг/мл. Спектры измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV-1800. Миноциклин показывает максимумы поглощения при 255 и 344 нм. При комплексообразовании первый максимум гипсохромно смещается до 244 нм, тогда как другой максимум батохромно смещается до 385 нм. При добавлении небольшого количества хлористоводородной кислоты оба максимума смещаются до 264 и 355 нм.

b) ИК-спектры поглощения

Спектры FTIR-ATR измеряли в таблетках бромида калия с использованием прибора Bruker IFS 28, оборудованного блоком Sensir ATR, в области от 4000 до 400 см^-1. ИК-спектры также указывают на комплексообразование (Фиг. 6; миноциклин: a - ʋ OH; b - ʋ NH; c - ʋ CH; d - ʋ C=O/CONH₂; e - ʋ C=C (ароматический); f ʋ - CN; стеарат магния: g - ʋ CH; h - ʋ_as COO^-; i - δ CH; j - CH₂ качание-колебание). Пики при 3478 см^-1 чистого миноциклина можно отнести к колебанию гидроксигруппы, образующей внутримолекулярные водородные связи. Напротив, комплекс показывает широкий пик в том же положении. В связи с тем, что эта группа является частью координационного центра для образования хелата, при комплексообразовании наблюдается затруднение свободных колебаний гидроксильных групп и, таким образом, сглаживание пика. Кроме того, колебания С-Н миноциклина затмеваются интенсивными колебаниями С-Н стеарата магния. Карбоксилатный пик при 1570 см^-1 остается узнаваемым. Возникший пик при 1700 см^-1 нельзя напрямую отнести к функциональной группе. Область характерной зоны также видоизменяется вследствие перекрывающихся вибраций.

Образование и свойства фармацевтических препаратов (экструдатов)

Пример 9: Экструзия 1:2 комплекса миноциклина (свободного основания) и стеарата магния

а) Получение комплекса

Для экструзии обычно требуется большее количество комплексов (например, количество, соответствующее 100 мг миноциклина или более). Компоненты взвешивали и обрабатывали, как описано выше в Примере 1. В дальнейшем раствор комплекса распределяли по нескольким чашкам Петри, покрытым тефлоновой пленкой, и покрывали перфорированной алюминиевой фольгой. Чашки Петри сушили в вакуумном сушильном шкафу при комнатной температуре в течение, по меньшей мере, 8 часов (или в течение ночи). Получали желтый порошок, который затем удаляли с тефлоновой пленки с помощью карты.

b) Получение экструзионного прекурсора

Затем проводили измельчение и гомогенизацию с помощью Retsch CryoMill. Порошок комплекса (1,00 г, что соответствует 289 мг чистого миноциклина) взвешивали в сосуде криомельницы вместе с двумя размольными шарами размером 1 см в сосуде криомельницы. Сосуд помещали в криомельницу и устанавливали следующие параметры: после фазы автоматического предварительного охлаждения проводили 6 циклов измельчения с частотой 30 Гц в течение 150 с каждый; между отдельными циклами измельчения проводили промежуточное охлаждение (30 с) с частотой 5 Гц. После оттаивания до комнатной температуры получали экструзионный прекурсор.

с) Экструзия

Для экструзии три зоны нагрева двухшнекового экструдера предварительно нагревали до H1=49°C, H2=52°C и H3=55°C. Блок управления двухшнековым экструдером устанавливали на 800 об/мин, что соответствует фактической частоте вращения приблизительно 150 оборотов шнеков в минуту. Экструзионный прекурсор осторожно добавляли в экструдер вручную небольшими порциями. При достаточном заполнении и по прошествии необходимого времени материал достигал температуры размягчения и был способен пластически деформироваться. Комплекс выходил из экструдера через фильерную пластину шириной 0,6 мм в виде непрерывной нити и попадал на поверхность, покрытую тефлоновой пленкой, где его охлаждали до комнатной температуры с получением конечного экструдата.

Пример 10: Экструзия 1:2 комплекса миноциклина (свободного основания) и стеарата магния вместе с Resomer 502

а) Получение комплекса

Компоненты для образования комплекса взвешивали и обрабатывали, как описано выше в Примере 1. В дальнейшем раствор комплекса распределяли по нескольким чашкам Петри, покрытым тефлоновой пленкой, и покрывали перфорированной алюминиевой фольгой. Чашки Петри сушили в вакуумном сушильном шкафу при комнатной температуре в течение, по меньшей мере, 8 часов (или в течение ночи). Получали желтый порошок, который затем удаляли с тефлоновой пленки с помощью карты.

b) Получение экструзионного прекурсора

Затем проводили измельчение и гомогенизацию с помощью Retsch CryoMill. Порошок комплекса (412,3 мг, что соответствует 115 мг чистого миноциклина) взвешивали в камере криомельницы вместе с 587,7 мг желаемого биоразлагаемого полимера (Resomer 502) и двумя размольными шарами размером 1 см в сосуде криомельницы. Сосуд помещали в криомельницу и устанавливали следующие параметры: после фазы автоматического предварительного охлаждения проводили 6 циклов измельчения с частотой 30 Гц в течение 150 с каждый; между отдельными циклами измельчения проводили промежуточное охлаждение (30 с) с частотой 5 Гц. После оттаивания до комнатной температуры получали экструзионный прекурсор (1 г, содержащий 11,5 масс.% чистого миноциклина).

с) Экструзия

Для экструзии три зоны нагрева двухшнекового экструдера предварительно нагревали до H1=49°C, H2=49°C и H3=53°C. Блок управления двухшнековым экструдером устанавливали на 800 об/мин, что соответствует фактической частоте вращения приблизительно 150 оборотов шнеков в минуту. Экструзионный прекурсор осторожно добавляли в экструдер вручную небольшими порциями. При достаточном заполнении и по прошествии необходимого времени материал достигал температуры стеклования и был способен пластически деформироваться. Смесь выходила из экструдера через фильерную пластину шириной 0,6 мм в виде непрерывной нити и попадала на поверхность, покрытую тефлоновой пленкой, где ее охлаждали до комнатной температуры с получением конечного экструдата. Полученный экструдат показан на Фиг. 9 (вверху).

Пример 11: Экструзия 1:2 комплекса миноциклина (свободного основания) и стеарата магния вместе с Resomer 503

Экструдат, содержащий 1:2 комплекс миноциклина (свободного основания) и стеарата магния из Примера 1 вместе с Resomer 503, получали аналогично тому, как описано в Примере 10, в котором Resomer 503 использовали вместо Resomer 502. Полученный экструдат показан на Фиг. 9 (внизу).

Пример 12: Экструзия 1:2 комплекса миноциклина (свободного основания) и стеарата магния вместе с Resomer 502/503 (1:1) и 10% моностеаратом глицерина (GMS)

Экструдат получали аналогично тому, как описано в Примере 10, в котором дополнительно использовали моностеарат глицерина (10 масс.% на основе общей массы смеси) и использовали смесь Resomer 502 и Resomer 503 (1:1 масс./масс.) в общем количестве с добавлением до 100 масс.% вместо Resomer 502.

Пример 13: Экструзия 1:2 комплекса миноциклина (свободного основания) и стеарата магния вместе с ПЭГ-PLGA (Expansorb DLG 50-6P) и 10% ПЭГ 1500

Порошок комплекса, полученный, как описано выше в Примерах 1 и 9 (412,3 мг, что соответствует 115 мг чистого миноциклина и 297,3 мг стеарата магния), взвешивали в камере Retsch CryoMill вместе с желаемым биоразлагаемым полимером (Expansorb DLG 50-6P, 487,7 мг), пластификатором (ПЭГ 1500, 100 мг) и двумя размольными шарами размером 1 см. Затем проводили измельчение и гомогенизацию. Контейнер помещали в криомельницу и устанавливали следующие параметры: после фазы автоматического предварительного охлаждения проводили 5 циклов измельчения с частотой 30 Гц в течение 150 с каждый; между отдельными циклами измельчения проводили промежуточное охлаждение (30 с) с частотой 5 Гц. После оттаивания до комнатной температуры получали экструзионный прекурсор (1 г, содержащий 11,5 масс.% чистого миноциклина).

Экструзию проводили аналогично тому, как описано в Примере 10.

Пример 14: Свойства высвобождения экструдатов

На Фиг. 7 четко показан вклад комплексов в соответствии с изобретением в отсроченное высвобождение миноциклина. Экструдаты, полученные экструзией из расплава, как описано в Примерах 9-13, разрезали на кусочки длиной 4 мм и инкубировали в 1 мл буфера при pH 7,0 и 37°C. Экструдаты Примеров 11-13 имеют содержание миноциклина 11,5%; экструдат чистого комплекса Примера 9 имеет содержание миноциклина 27,89%. Каждый раз, когда отбирали образец из инкубационных растворов, меняли весь буфер и определяли содержание миноциклина в старом буфере с помощью ВЭЖХ. Как видно из Фиг. 7, экструдат чистого комплекса Примера 9 показывает отсроченное высвобождение почти до трех недель. В конце эксперимента было проанализировано количество остаточных количеств миноциклина в экструдате Примера 9 и было показано, что активное вещество больше не присутствовало. Можно считать, что оставшиеся 40% со временем разложились.

Как можно увидеть из кривых для Примеров 10-12, добавление полимеров PLGA приводит к дополнительной задержке высвобождения. В этом случае приблизительно 10-13% оставшегося миноциклина все еще присутствовало в конце эксперимента. Это может быть частично связано с кислым микроокружением в полимерах PLGA и немного лучшей стабильностью в кислой среде, как показано на Фиг. 4.

Кроме того, добавление эксципиента, такого как моностеарат глицерина (Пример 12) может при желании ускорить высвобождение.

Наконец, экструдат на основе ПЭГ-PLGA Примера 13, содержащий Expansorb DLG50-6P и 10% ПЭГ 1500 в качестве пластификатора, также демонстрирует предпочтительные свойства замедленного высвобождения. Кроме того, этот экструдат имеет оптимизированную гибкость и механическую формуемость.

Пример 15: Дополнительные свойства экструдатов

а) Механические свойства

На Фиг. 8 представлены диаграммы «нагрузка-перемещение» при деформации экструдатов, подогнанные под геометрию ножа с острым лезвием. Для этих экспериментов экструдаты устанавливали на предметное стекло анализатора текстуры Brookfield CT3, оборудованного ножом с острым лезвием и определяли необходимую силу веса, требуемую для предварительно определенной глубины проникновения 0,5 мм при скорости 0,02 мм/сек. На верхней диаграмме показаны свойства хрупкости экструдатов, содержащих Resomer 502, 503 и их смеси с и без моностеарата глицерина. Экструдаты ПЭГ-PLGA с различными Expansorbs (нижняя диаграмма) показывают почти линейную зависимость между глубиной проникновения и необходимой силой. Отсутствие перепада силы указывает на необратимую деформацию, которую можно считать пластической. Макроскопически экструдаты демонстрируют превосходную гибкость. Композиция с 10% ПЭГ 1500 (Пример 13) не показывает никаких изменений механических свойств даже при длительном хранении в холодильнике. Напротив, композиция с 5% ПЭГ частично затвердевает во время хранения и ведет себя скорее как соответствующий экструдат без добавления ПЭГ.

b) Мукоадгезивные свойства

Удерживающую способность препаратов экструдата проверяли на экспериментальной установке для анализа удерживания, как показано на Фиг. 10А. Слизистую оболочку кишечника свиньи, полученную от Tönnies Lebensmittel GmbH & Co. KG (промытую, порционированную, упакованную и замороженную или использованную сразу), применяли в качестве модели поверхности, закрепленной в канале, показанном на Фиг. 10В. При применении непрерывного потока деионизированной воды с предварительно определенной скоростью промывания (предпочтительно 300 мкл/мин) и в течение предварительно определенного времени долю исследуемого препарата, все еще удерживаемую исследуемой поверхностью (слизистой оболочкой), определяли аналогично методу, предложенному Batchelor et al. (Int. J. Pharm. 2002, May 15;238(1-2):123-32). Было обнаружено, что препараты в соответствии с настоящим изобретением проявляют соответствующую биоадгезию.

Кинетика высвобождения и антимикробная активность

Пример 16: Кинетика высвобождения и антимикробная активность (препараты миноциклина)

Для оценки кинетики высвобождения и биологической активности активных веществ был выбран подход, учитывающий условия в полости рта, а именно скорость тока жидкости (скорость циркуляции) и композицию бороздки в зубодесневой жидкости (как описано в Goodson, JM (2003), Periodontol 2000 31:43-54; Tew, JG et al. (1985), Infect Immun 49:487-93).

а) Кинетика высвобождения

В частности, были исследованы образцы следующих веществ, каждый из которых содержал количество активного вещества, эквивалентное 1 мг миноциклина (за исключением экструдата наполнителя):

порошок миноциклина гидрохлорида (приобретен у SIGMA, каталожный № M9511-25MG; на Фиг. 11/12: «миноциклин»)

микросферы миноциклин/PLGA (Арестин® от Orapharma Inc. Europe, PZN 1295115; 1 капсула=1 мг миноциклина; на Фиг. 11/12: «Арестин»)

Пример 11 (на Фиг. 11/12: «экструдат 503»)

Пример 10 (на Фиг. 11/12: «экструдат 502»)

контроль, состоящий из биоразлагаемого полимера без соединения тетрациклина (на Фиг. 11/12: «экструдат наполнителя»).

Образцы помещали в темные пробирки и добавляли соответствующее количество забуференного физиологического раствора, содержащего сывороточный альбумин (фосфатно-солевой буферный раствор с 15 мг/мл БСА). Через заданные интервалы времени образцы центрифугировали, предварительно определенное количество буфера удаляли и хранили (элюат) и затем добавляли свежую порцию буфера. Элюаты собирали в течение семи недель, как показано в Таблице 4, и исследовали в отношении их антимикробной активности с применением способов, описанных ниже (определение минимальной ингибирующей концентрации и ингибирование образования биопленки).

Таблица 4. Схема пипетирования образцов элюата, отобранных для оценки кинетики высвобождения: ⃰ означает, что элюаты, удаленные в это время, использовали для определения МИК; # означает, что элюаты, удаленные в это время, использовали для ингибирования образования биопленки.

Время Удаление (мкл) Добавление (мкл) Время Удаление (мкл) Добавление (мкл) 0 23,5 14 д⃰ 3’500 3’304 30 мин 22 22 17,5 д 3’304 3’304 60 мин⃰ 22 44 21 д⃰ 3’304 3’108 2 ч⃰ 44 44 24,5 д 3’108 3’108 3 ч 44 44 28 д⃰ 3’108 2’912 4 ч⃰ 44 88 31,5 д 2’912 2’912 6 ч⃰ 44 792 35 д⃰ 2’912 2’716 24 ч⃰ 792 1’056 38,5 д 2’716 2’716 2 д⃰ 1’056 1’056 42 д⃰ 2’716 2’520 3 д 1’056 1’056 45,5 д 2’520 2’520 4 д⃰ 1’056 1’056×3=3’168 49 д⃰ 2’520 2’324 7 д⃰ 3’168 3’500 52,5 д 2’324 2’324 10,5 д 3’500 3’500 56 д⃰ 2’324

Таблица 5. Эффективная концентрация миноциклина по сравнению с Streptococcus gordonii ATCC 10558 и Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 до 42 дней, рассчитанная на основе МИК элюатов (разведений)

Минициклин
S. gord. P. ging. Арестин
S. gord. P. ging. Экструдат 502
S. gord. P. ging. Экструдат 503
S. gord. P. ging. 1 ч >16000 >32000 >16000 >32000 1000 4000 4000 >32000 2 ч 8000 2000 8000 4000 2000 1000 4000 2000 4 ч 2000 1000 2000 1000 1000 1000 2000 2000 24 ч 250 500 1000 1000 500 1000 500 1000 2 д 62,5 62,5 125 250 125 250 250 500 7 д 4 62,5 15,6 62,5 15,6 62,5 125 250 14 д <2 4 8 8 15,6 31,3 31,3 62,5 21 д <2 <1 <2 <1 15,6 15,6 31,3 62,5 28 д <2 <1 <2 <1 15,6 15,6 15,6 15,6 35 д <2 <1 <2 <1 15,6 15,6 8 8 42 д <2 <1 <2 <1 8 2 8 2

b) Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК)

Определяли разведения, при которых рост двух индикаторных штаммов (Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, Streptococcus gordonii ATCC 10558) все еще ингибировался (минимальная ингибирующая концентрация, МИК). Для этой цели образцы элюатов смешивали с питательной средой и соответствующим бактериальным штаммом и инкубировали в течение 18 ч при 37°C в аэробных условиях. Подход и использованные среды находились в соответствии с рекомендациями Европейского комитета по определению чувствительности к антимикробным препаратам - EUCAST. Каждое определение проводили дважды; контроль роста выполняли каждый раз в одной лунке соответственно.

На Фиг. 11 показано, при какой степени разведения еще можно наблюдать ингибирование роста (т. е. минимальные ингибирующие концентрации элюатов (разведений) по сравнению с S. gordonii ATCC 10558 и P. gingivalis ATCC 33277 до 42 дней). Активность чистого миноциклина и коммерческого продукта (Арестина) присутствовала до 21 дня, тогда как препараты экструдатов 502 и 503 проявляли активность до конца наблюдения (42 дня).

В Таблице 5 на основе МИК для миноциклина в отношении двух штаммов (P. gingivalis ATCC 33277: 0,25 мкг/мл, S. gordonii ATCC 10558: 0,5 мкг/мл) была рассчитана эффективная концентрация активного вещества. Эти данные также подчеркивают активность элюатов в течение длительного периода времени.

с) Ингибирование образования биопленки

Поверхность 96-луночного планшета покрывали 10 мкл элюата. При добавлении смеси из 6 видов бактерий, ассоциированных с пародонтитом, биопленка образовывалась в течение 6 ч (как описано, например, в Jurczyk K., Nietzsche S., Ender C., Sculean A., Eick S. In-vitro activity of sodium-hypochlorite gel on bacteria associated with periodontitis. Clin Oral Investig. 2016 Nov;20(8):2165-2173). Затем определяли количество еще жизнеспособных бактерий в биопленке (колониеобразующие единицы=КОЕ).

На Фиг. 12 показана ингибирующая активность элюатов, полученных через 24 ч, 2 д, 7 д, 14 д и 28 д, в отношении образования биопленки. Ингибирование образования биопленки может быть связано с антимикробной активностью, с одной стороны, и вмешательством на стадиях образования биопленки (прикрепление микроорганизмов к поверхностям или к уже прикрепленным микроорганизмам (коагрегация), образование матрицы), с другой стороны. В настоящем описании элюат из наполнителя, по-видимому, также проявляет некоторые свойства в отношении биопленки. Через 24 ч инкубации между исследуемыми веществами не было различий. Однако позднее все препараты в соответствии с настоящим изобретением проявляют лучшую активность, чем чистый миноциклин. После 28 дней все еще присутствовало значительное ингибирование Экструдатом 503 (-1,9 log₁₀ КОЕ).

Пример 17: Кинетика высвобождения и антимикробная активность (препараты доксициклина)

Для оценки высвобождения, и кинетики, и биологической активности препаратов доксициклина был выбран аналогичный подход. В частности, были исследованы образцы следующих веществ, каждый из которых содержал количество активного вещества, эквивалентное 1 мг доксициклина (за исключением экструдата наполнителя):

доксициклина гиклат (1,15 мг доксициклина гиклата=1 мг доксициклина)

гель доксициклина (Лигосан®, 1 картридж=260 мг, 14% доксициклина)

экструдат доксициклина (соответствует 11,5% доксициклина, получен аналогичным образом, как описано в Примере 13)

экструдат наполнителя.

Исследования проводили аналогичным образом, как описано в Примере 16 выше. Было обнаружено, что кинетика высвобождения и антимикробная активность препарата в соответствии с настоящим изобретением по сравнению с эталонными образцами сопоставимы с результатами, полученными для препаратов миноциклина.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ

В качестве потенциальных комплексообразующих агентов авторы изобретения выбрали стеарат магния и стеарат кальция вследствие их высокого теоретического потенциала, их низкой токсичности, способности к биологическому разложению и их широкого использования в применении для доставки лекарственного средства. Образование лекарственного комплекса сопровождалось УФ/видимой области и ИК-спектроскопией. Кроме того, авторы изобретения хотели изучить влияние моностеарата глицерина, чтобы изменить скорость высвобождения и механические свойства.

Образование комплекса также может отрицательно повлиять на активность лекарственного средства. Следовательно, были проведены измерения биологической активности. Наконец, были проведены эксперименты по высвобождению in vitro для оценки влияния состава на кинетику высвобождения.

А. Материалы и методы

Миноциклин и доксициклин были приобретены у Ontario Chemicals Inc. (Онтарио, Канада). Стеарат магния и стеарат кальция были любезно предоставлены Magnesia Germany (Мюльхайм, Германия). Полимеры PLGA и гранулы Tegin® 4100 (глицерина моностеарат, сокращенно GMS) были предоставлены Evonik (Дармштадт, Германия). Нильский красный был приобретен у Sigma Aldrich (Мюнхен, Германия). Staphylococcus aureus ATCC 29213 использовали для скрининга антимикробной активности. Все использованные растворители были приобретены у Sigma Aldrich и были, по меньшей мере, химически чистыми.

I. Хелатирование производных тетрациклина

Образование липофильного лекарственного комплекса было предложено в качестве потенциального способа повышения стабильности лекарственного средства и увеличения времени высвобождения. Для этой цели исследовали различные молярные композиции антибиотиков и стеарата магния или кальция соответственно. Для образования комплекса тетрациклины и соли стеарата взвешивали в колбах в молярном соотношении 1:1, 1:2 и 2:1. Например, 10 мг миноциклина объединяли с 25,48 мг стеарата магния (молярное соотношение 1:2). В каждую колбу добавляли 2 мл этанола, в результате чего получали желтые суспензии. Колбы нагревали на водяной бане при 70°C в течение 2 минут.

II. Методы, используемые для характеристики комплека

Чтобы доказать существование комплекса миноциклина, были необходимы исследования хелатов. Поэтому спектры поглощения производных чистого тетрациклина и их растворов комплекса исследовали на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Shimadzu, Дуйсбург, Германия). Предварительно 10 мкл свежеприготовленных исходных растворов 5 мг/мл разбавляли 3 мл этанола и снимали спектры поглощения в диапазоне от 250 до 450 нм в кварцевой кювете. Для записи инфракрасных (ИК) спектров были изготовлены однородные прессованные порошки АФИ и селенида цинка. В дальнейшем эти прессованные порошки исследовали с помощью Bruker IFS 28, оборудованного устройством Sensir ATR (Bruker, Billerica, США), работающего в диапазоне от 4000 до 680 см^-1. Кроме того, растворы высушивали на роторном испарителе и остатки соскребали с колбы. Эти остатки исследовали под микроскопом (Carl Zeiss Microscopy, Йена, Германия). Эти остатки также подвергались воздействию различных растворителей, чтобы выявить изменения растворимости.

III. Диско-диффузионный метод

После принятия решения о том, что миноциклин является предпочтительным активным компонентом, был проведен метод диффузии в агар с использованием дисков, чтобы исследовать его антимикробную активность после комплексообразования. Методика соответствовала рекомендациям, установленным EUCAST. Исследуемое вещество представляло собой комплекс миноциклина, содержащий 10 мг/мл миноциклина, и контрольные образцы представляли собой миноциклин, растворенный в этаноле (10 мг/мл), и чистый этанол. Растворы разбавляли этанолом в соотношении 3:7 и сразу после этого каждые 10 мкл пипетировали на незагруженные диски для исследования антибиотиков диаметром 6 мм (BD, Альшвиль, Швейцария), таким образом каждый диск (за исключением контрольного этанола) содержал 30 мкг миноциклина. Оставленную на ночь культуру S. aureus ATCC 29213 суспендировали в McFarland 0,5, каждые 100 мкл наносили на чашку с агаром Мюллера-Хинтона (Oxoid, Бейсингсток, Великобритания). После испарения растворителя исследуемые диски помещали на чашки. После инкубации при 35°C в течение 18 ч измеряли диаметры зон ингибирования.

IV. Получение экструзионного прекурсора с помощью криоизмельчения и экструзии горячего расплава

Перед криоизмельчением раствор этанольного комплекса миноциклина наносили на чашки Петри, покрытые тефлоновой фольгой, тонким слоем капель. Чашки Петри хранили в вакуумном сушильном шкафу, по меньшей мере, 12 часов при 25°C. Затем высушенный порошок комплекса миноциклина собирали с тефлоновой фольги.

Для обеспечения достаточного заполнения экструзионной камеры необходимы объемы партии приблизительно 1 г. Следовательно, для криоизмельчения 412,3 мг порошка комплекса миноциклина (содержащего 115 мг миноциклина) и 587,7 мг желаемого полимера PLGA помещали в камеру измельчения вместе с двумя 10-миллиметровыми стальными сферами. Экструдаты, содержащие 10% GMS, поэтому включали только 487,7 мг полимера PLGA. После соответствующей установки в Retsch CryoMill (Retsch, Хан, Германия) смесь подвергали фазе автоматического предварительного охлаждения с последующими 5 циклами измельчения при 30 Гц в течение 150 с. После каждого цикла измельчения 30-секундная фаза охлаждения поддерживала подходящие рабочие температуры при 5 Гц.

В дальнейшем смесь была готова к экструзии. Следовательно, использовали двухшнековый экструдер ZE 5 Eco (Three-Tec, Сьон, Швейцария) со встроенным преобразователем частоты SK 500 E. Использовали фильеру диаметром 600 мкм и винты с соотношением L/D 21,25. Температура экструзии зависела от полимера и предполагаемого диаметра. Начиная с 49°C в первой зоне нагрева, температура постепенно повышалась до 53°C в третьей зоне нагрева для Resomer 502, 503 и их смеси. Для экструдатов, содержащих 10% GMS, в последней зоне нагрева применяли 55°C. Порошок миноциклин-PLGA медленно и вручную загружали в отверстие экструдера со скоростью 800 об/мин в соответствии с преобразователем частоты. Выходящее непрерывное полимерное волокно фиксировали на поверхности, покрытой тефлоновой фольгой. Конечный продукт разрезали скальпелем на куски желаемой длины.

V. Определение содержания лекарственного средства

Содержание миноциклина в экструдатах определяли количественно с помощью метода ВЭЖХ после экстракции лекарственного средства из экструдата. Для экстракции использовали метод, предложенный A. Holmkvist et al. 2016 (24). После взвешивания экструдат переносили в 15 мл центрифужную пробирку. Для растворения полимера добавляли 2 мл ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУК). После 1 минуты встряхивания с помощью шейкера IKR-VIBRO-FIX добавляли 4 мл метанола для растворения миноциклина и осаждения полимера. Затем пробирку центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут и стерилизовали фильтрованием через 0,45 мкм тефлоновый фильтр. ВЭЖХ проводили на системе Waters 600 E с колонкой XTerra RP18 5 мкм 3,9×150 (Waters). Объем образца 20 мкл вводили со скоростью потока 1,0 мл/мин. Для подвижной фазы была выбрана программа градиента. Начиная с 25 мМ KH₂PO₄+0,06% H₃PO₄ (A), который за 10 минут переходит в 60% ацетонитрил (B). Через 5 минут подвижная фаза постепенно изменилась обратно на А в течение 1 минуты. Время удерживания составляло 9,5 минут, и лекарственное средство обнаруживали с помощью детектора УФ/видимая область при 355 нм. Линейные калибровочные кривые (r²˃0,999) получали в диапазоне 2-50 мкг/мл. Была достигнута степень восстановления 96%.

Для исследования стабильности использовали систему Agilent 1200 Series с колонкой XTerra RP18 5 мкм 3,9×150 (Waters). Объем образца 10 мкл вводили со скоростью потока 1,0 мл/мин. Для этого метода также применяли программу градиента. Подвижная фаза начиналась с композиции вода/метанол (95/5+0,1% ТФУК) (A) и в течение 7 минут переходила в чистый метанол (0,1% ТФУК) (B). Через 3 минуты подвижная фаза возвращалась в растворитель А в течение 1 минуты. Время удерживания составляло 4,8 минуты. Для оценки и извлечения хроматограмм использовали программное обеспечение Chem32.

VI. Исследования высвобождения и исследование стабильности

Экструдаты разрезали на куски длиной 4 мм +/- 100 мкм. Для каждого типа полимера 5 экструдатов (длиной 4 мм) взвешивали и подвергали воздействию 1 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) pH 7,0 в 2 мл стеклянной виале. Виалы инкубировали на защищенной от света водяной бане при 37°C. В течение 3 недель каждые 2 дня собирали образцы. Начиная с 22 дня интервал отбора образцов был увеличен до 4 дней. Отбор образцов включал полную замену буфера. Образцы хранили в холодильнике при 2-8°C до тех пор, пока содержание в них лекарственного средства не было определено описанным выше методом ВЭЖХ. Профиль высвобождения изучался в течение 42 дней. По истечении этого периода времени остатки экструдатов также исследовали этим методом ВЭЖХ для количественного определения оставшегося содержания миноциклина.

Для исследования стабильности 10 мг образцы для миноциклина и 20 мг для комплекса взвешивали в 4 мл стеклянных виалах. Одну виалу каждого вида инкубировали в 4 мл ФСБ с pH 7,0 и другую виалу подвергали воздействию 4 мл кислого раствора при рН 2,3, который корректировали хлористоводородной кислотой. До 9-го дня образцы брали каждый день, при этом удаленный объем не заменяли. С этого момента интервалы были увеличены до 3-4 дней.

B. Результаты

I. Образование комплекса

Молярные соотношения

Молярные соотношения 2:1, 1:1 и 1:2 (производное тетрациклина: соль жирной кислоты) были исследованы в качестве потенциальных хелатных комплексов. Комбинация миноциклина и стеарата магния давала для всех соотношений желтый раствор. Напротив, сочетание миноциклина со стеаратом кальция привело к получению суспензии в соотношении 1:2. Поэтому данное соотношение было исключено из дальнейших исследований. Доксициклин был похож на миноциклин в отношении комплексов стеарата магния. Появлялись прозрачные растворы с менее интенсивным желтым окрашиванием. Сочетание доксициклина со стеаратом кальция выявило слегка мутные растворы для соотношений 1:1 и 1:2.

II. Характеристика комплекса

1. УФ/видимая спектроскопия

Ярким признаком успешного хелатирования являются изменения в спектрах поглощения. Миноциклин имеет максимум поглощения при 255 и 344 нм в этаноле (Фиг. 13). После сочетания со стеаратом магния спектр изменился в зависимости от концентрации стеарата магния. Спектры при соотношениях 1:1 и 1:2 имеют практически идентичную форму и положение их максимумов поглощения является одинаковым. Комплексообразование приводит для первого максимума к гипсохромному сдвигу до 244 нм, в то время как последний обнаруживает батохромный сдвиг до 385 нм. При соотношении 2:1 нет четких максимумов вследствие перекрывающегося спектра миноциклина и частично развитого комплекса. В заключение, спектры указывают на успешное хелатирование в молярном соотношении от 1:1 до 1:2.

В комбинации со стеаратом кальция спектр поглощения миноциклина претерпевает сопоставимые изменения. Соотношение 1:1 приводит к гипсохромному сдвигу для коротковолнового максимума и батохромному сдвигу для длинноволнового максимума, тогда как соотношение 1:2 уже было исключено. Аналогично соотношение 2:1 напоминает перекрывающийся спектр чистого АФИ и комплекса. У обоих также есть общее, что после добавления небольших количеств хлористоводородной кислоты (HCl) максимумы поглощения миноциклина и комплексов смещаются до 264 нм и приблизительно 355 нм (Фиг. 13). Это указывает на распад комплекса, что является пригодным для последующего обнаружения во время анализа ВЭЖХ.

Для доксициклина результаты, как и ожидалось, являются довольно близкими к миноциклину вследствие структурного сходства. Однако следует отметить, что оба максимума поглощения доксициклина смещены батохромно, независимо от хелатирующего иона (Фиг. 13). Стеарат магния показывает незначительные различия в положении максимумов поглощения в зависимости от количества соли жирной кислоты. Интересно, что спектры в соотношениях 2:1 и 1:1 для стеарата кальция являются практически идентичными. Следовательно, хелатирование, по-видимому, является неполным, пока не будет достигнуто соотношение 1:2. Добавление HCl также приводит к распаду комплексов со спектрами и максимумами, которые являются близкими к таковым миноциклина.

В заключение необходимо отметить, что этот эксперимент приводит к исключению всех соотношений 2:1 и соотношения 1:1 доксициклина и стеарата кальция вследствие недостаточного образования комплекса.

2. ИК-спектроскопия

ИК-спектры также свидетельствуют о хелатировании (Фиг. 14). Пики при 3478 см^-1 (а) в спектре чистого миноциклина могут быть отнесены к колебанию гидроксида, участвующему во внутримолекулярной Н-связи. Вместо этого комплекс предоставляет широкий пик. Это указывает на препятствие свободной вибрации сайтов связывания вследствие присутствия ионов магния или кальция. Колебания C-H миноциклина (c) подавляют более заметные пики C-H (g) стеарата магния и кальция. Пик карбоксилата при 1570 см^-1 (h) остается четко различимым. При 1700 см^-1 появляется новый пик, который нельзя четко отнести к определенной функциональной группе. Область характерного признака также изменилась вследствие перекрывающихся вибраций, но не дает никаких дополнительных доказательств.

Однако для доксициклина в ИК-спектре наблюдается более широкий пик при приблизительно 3300 см^-1 (а), который невозможно отличить между колебаниями O-H и N-H. Тем не менее этот пик также расширяется и сглаживается в присутствии двухвалентных катионов (Фиг. 15).

3. Сушка комплекса и микроскопия

Для дальнейшей обработки было необходимо перевести комплекс в порошковую форму. Поэтому растворы комплекса медленно высушивали, и их остатки тщательно исследовали. Высушенные комплексы миноциклина и доксициклина-стеарата магния выглядели как стеклообразные аморфные структуры при молярном соотношении 1:2. На Фиг. 2 показана эта однородная структура, также как неоднородный внешний вид соотношения 1:1 в случае миноциклина. К сожалению, комплексы стеарата кальция не дали таких однородных результатов ни для одного из антибиотиков. Даже несмотря на то, что соотношения оставшихся комплексов могут подходить для других форм обработки, молярное соотношение 1:2 продемонстрировало более обнадеживающие свойства для предполагаемого применения.

Также наблюдались изменения растворимости. Комплекс миноциклина показал пониженную растворимость в воде по сравнению с исходным лекарственным средством. В свою очередь, растворимость в органических растворителях была улучшена, особенно в хлороформе. Эти изменения также предполагают образование хелатного комплекса.

На этом этапе для дополнительных экспериментов был выбран миноциклин, хотя комплекс доксициклина и стеарата магния казался вполне подходящим. Следовательно, причиной был более широкий спектр действия и превосходная способность проникновения в ткани (Cunha, BA. et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2018, 37(1), 15-20). Таким образом, следующие параграфы посвящены комплексу миноциклина и стеарата магния в соотношении 1:2.

III. Диско-диффузионный метод

Хорошо известно, что поливалентные катионы могут иметь отрицательное влияние на антибиотический потенциал тетрациклиновых антибиотиков (Naz, S. et al. Arzneimittelforschung 1996, 46(7), 701-704). В связи с этим был проведен диско-диффузионный метод для исследования антибиотической активности миноциклина после комплексообразования. Диаметр зоны ингибирования имеет решающее значение для антибиотической активности (Фиг. 16: чашки с агаром, инкубированные с S. aureus ATCC 29213. Левая чашка: диски, загруженные этанолом; средняя чашка: диски, загруженные этанольным раствором комплекса миноциклина; правая чашка: диски, загруженные этанольным раствором миноциклина). Контрольные диски, загруженные этанолом, не смогли предотвратить рост исследуемого микроорганизма. Чистый миноциклин имел диаметр 26 мм, и комплекс достигал 24 мм. Несмотря на то, что зона ингибирования комплекса немного меньше, комплекс остается активным в отношении микробиологических угроз.

IV. Экструзия горячего расплава

Перед процессом экструзии криомельница обеспечивает однородный экструзионный прекурсор, сохраняя при этом минимальное тепловое напряжение.

С помощью Resomer 502 RG и 503 RG получали экструдаты в диапазоне размеров от 600 до 800 мкм (Фиг. 9). Примечательно, что Resomer 503 обладает вязкоупругими свойствами, что приводит к расширению непосредственно после экструзии. Напротив, Resomer 502 дает непрерывный воспроизводимый 600 мкм экструдат. Больший диаметр приводит к различному количеству доступного лекарственного средства, если применяются экструдаты одинаковой длины. На Фиг. 9 показаны различия в размерах. Позже были исследованы композиции Resomer 502 и 503. Эти смеси не повлияли на диаметр продукта. Добавление GMS также не изменило диаметр экструдата, но уменьшило хрупкость.

Тем не менее, эти экструдаты все еще находились в желаемом диапазоне размеров. Кроме того, была проведена экструзия чистого порошка комплекса миноциклина. Используя этот подход, можно было получить экструдаты, но они были хрупкими и демонстрировали хрупкую механическую устойчивость. Таким образом, эти экструдаты служили только в качестве эталона для экспериментов по высвобождению in vitro.

V. Высвобождение in vitro

Профиль высвобождения in vitro (Фиг. 17) демонстрирует для всех композиций более высокую начальную скорость высвобождения, которая постепенно замедляется. Экструдаты чистого комплекса миноциклина показали самое быстрое высвобождение, но также отсутствие разрыва.

Добавление полимера PLGA может изменить скорость высвобождения до желаемого уровня. Как и ожидалось, Resomer 502 предлагает более быстрое высвобождение по сравнению с Resomer 503 вследствие его более низкой молекулярной массы. Это различие особенно заметно в первые две недели, пока их скорости высвобождения не начнут выравниваться. Примечателен также более высокий стандартный вариант для Resomer 502. Для композиции 1:1 Resomer 502 и 503 ожидалось высвобождение между кривыми отдельных полимеров. Эти ожидания оправдались до 7-го дня, когда полимерная смесь уступала. Через 42 дня полимерная смесь почти достигает уровня высвобождения Resomer 503. Таким образом, напротив, влияние GMS оказывается еще большим. Первоначально GMS использовали в качестве смягчителя для экструдатов, но эффект был относительно небольшим, хотя общая стабильность была увеличена. Более значительное преимущество заключается в значительном увеличении скорости высвобождения. В течение 10 дней было высвобождено удвоенное количество по сравнению с партией без GMS. Начиная с 10-го дня, их скорости высвобождения также выравниваются и отсутствует большая разница.

Эксперименты по высвобождению in vitro демонстрируют контролируемое высвобождение в течение 42 дней.

VI. Исследования стабильности

Это исследование проводили для выяснения участи, по меньшей мере, 40% необнаруженного миноциклина. На Фиг. 18 представлен продолжающийся распад миноциклина и комплекса в зависимости от pH среды. Миноциклин демонстрирует заметную деструкцию при нейтральном значении pH. В течение 3 дней пик миноциклина через 4,8 минуты исчезает, в то время как продукты деструкции становятся заметными. Значительная деструкция также очевидна на макроскопическом уровне вследствие изменения цвета с желтого на абсолютно черный. Однако комплекс способен защищать миноциклин в определенной степени. Через 3 недели пик миноциклина все еще виден, в то же время, конечно, пики продуктов разложения постепенно растут. Пониженная растворимость в воде вызывает незначительную склонность к распаду. Тем не менее, по мере прохождения периода инкубации все больше частей комплекса растворяются и становятся обнаруживаемыми. Это также можно заметить на хроматограмме на 2-й день, где наблюдается рост пика миноциклина. Наступление химического равновесия между растворенным миноциклином, который подвергается распаду, и еще не растворенным комплексом миноциклина является возможным.

Кислая среда обеспечивает более длительный срок действия АФИ. Наблюдается более умеренный распад для миноциклина по сравнению с условиями нейтрального pH. То же утверждение справедливо для комплекса, хотя в этом случае снова заметно дополнительное решение с течением времени. С этого момента миноциклин и комплекс испытывают одинаковую степень деструкции. Как было показано ранее, миноциклин высвобождается из комплекса в кислотных условиях. Следовательно, наблюдаются аналогичные хроматограммы и скорости деструкции.

Обсуждение

Тетрациклины обладают широким спектром антимикробной активности и зарекомендовали себя в качестве местных антимикробных средств при пародонтальной терапии. Проблема для всех тетрациклинов заключается в их ограниченной стабильности в воде. Миноциклин разлагается быстрее, чем доксиклин, и является предрасположенным к эпимеризации в водных средах и некоторых органических растворителях, в частности N-метилпирролидоне (NMP). Эти эпимеры обеспечивают только 5% исходной активности антибиотика.

Задержки таких процессов можно достигнуть, если миноциклин был хелатирован заранее. Из этих комплексов комплексы магния оказались более стабильными, чем их кальциевые аналоги, вероятно, вследствие их более высокой плотности заряда. Такое влияние плотности заряда было заметно во время процесса хелатирования, описанного в настоящей заявке. Магний и кальций представляют собой оба двухвалентные катионы, но вследствие меньшего диаметра атомов (Mg: 145 пм, Ca: 194 пм) таким образом магний с его более высокой плотностью заряда может легче взаимодействовать с сайтом хелатирования. Это объясняет образование мутных растворов в случае доксициклина и суспензии соотношения 1:2 для миноциклина. Кроме того, за счет выбора солей жирных кислот магния и кальция в качестве второго соединения можно избежать попадания воды и изменения физических свойств АФИ.

Исследования УФ/видимой области и ИК-спектроскопии подтвердили образование комплекса и пригодность для дальнейшей обработки. Сдвиги максимумов поглощения в зависимости от концентрации катионов и сглаживание и расширение пиков колебаний ОН демонстрируют взаимодействия во время хелатирования. Там миноциклин и доксициклин продемонстрировали равную совместимость для процесса комплексообразования. Кроме того, оба антибиотика обладают противовоспалительными свойствами, которые являются предпочтительными при лечении воспалительного заболевания, такого как пародонтит. Но, как упоминалось ранее, миноциклин был выбран для дальнейшей разработки вследствие его более липофильных характеристик и превосходного спектра действия.

Продолжительность этого действия подлежала уточнению вследствие возможного препятствия взаимодействия между АФИ и поливалентным катионом. К счастью, диско-диффузионный метод показал высокую активность. Возможным объяснением для слегка уменьшенного диаметра может быть уменьшенная диффузия молекул миноциклина через матрицу агара вследствие взаимодействия с молекулами стеарата магния, создавая более крупные и более гидрофобные молекулы. Тем не менее, эти результаты способствовали продвижению следующей стадии разработки - экструзии.

Процесс производства сам по себе является сравнительно быстрым и простым. Получение прекурсора требует небольших усилий, и отсутствие токсичных растворителей снижает риски во время изготовления, создает совместимый продукт и обеспечивает стабильность АФИ. Ограничением получения в лабораторных масштабах является заполнение экструдера вручную, что приводит к прерывистому потоку прекурсора.

Конечный продукт в виде предварительно отформованной вставки демонстрирует несколько предпочтительных свойств в отношении предполагаемого применения. Также нет необходимости в специальном оборудовании для нанесения - простой пинцет будет достаточным. Диаметр экструдатов не является фиксированным, но может быть установлен. Применение различных диаметров, адаптированных к размеру кармана, и одновременное нанесение различных диаметров (например, 600 мкм в окружении 300 мкм) представляется весьма перспективным.

Достигнутая лекарственная нагрузка 11,5% является близкой к разумному пределу вследствие сложной композиции со стеаратом магния. Общая доля комплекса в экструдате составляет 41,2%, оставляя 58,8% для полимера, контролирующего высвобождение. Значительное количество стеарата магния способствует незначительным свойствам гибкости экструдатов. Возможны различные варианты дозирования за счет одновременного размещения нескольких экструдатов в одной бороздке. Кроме того, скорость высвобождения регулируется путем выбора полимера и дополнительного эксципиента.

Период высвобождения in vitro, составляющий 42 дня, является пока исключительным по сравнению с коммерчески доступными системами. Как и ожидалось, Resomer 502 с его более низкой молекулярной массой показал более высокую скорость высвобождения по сравнению с Resomer 503. Примечателен вариант более высокого стандарта для Resomer 502, который также может быть связан с более низкой молекулярной массой и, следовательно, более быстрым автокатализом и деструкцией (Fredenberg, S. et al. Int J Pharm 2011, 415, 34-52). Однако смесь обоих полимеров вела на удивление неожиданно. Внезапное падение ее скорости высвобождения сложно учесть в контексте. Возможным объяснением может быть вариант от партии к партии, аналитические трудности или взаимодействия полимер-полимер, которые или создают микросреду, которая способствует распаду АФИ, или препятствуют высвобождению миноциклина.

Для всех образцов бросается в глаза одно наблюдение: более высокий процент АФИ остается незамеченным. Поэтому был запланирован эксперимент по стабильности. Известная хрупкость миноциклина в водной среде приводит к первому предположению о распаде в течение периода эксперимента по высвобождению. Этим процессам способствует повышенная температура 37°C. Для лучшего понимания миноциклин и комплекс исследовали при pH 7,0 и pH 2,3. Нейтральный pH напоминает физиологический pH, в то время как кислый pH моделирует условия, которые могут возникать внутри разлагающихся полимеров PLGA. Исследования стабильности выявили защитную функцию комплекса при нейтральных значениях pH. Тем не менее, часть АФИ распадается. Анализ остатков, проведенный в конце эксперимента по высвобождению, показал, что от 10 до 15% АФИ остается внутри экструдатов. Взятые вместе, эти результаты в значительной степени освещают предназначение отсутствующего АФИ.

Вывод и заключение

Целью этого исследования была разработка альтернативного устройства с контролируемым высвобождением для местного лечения пародонтита антимикробными препаратами. Как воспалительное и бактериальное заболевание пародонтит можно лечить с помощью антибиотика местного действия или антисептического состава. Одним классом из возможных антибиотиков в таких составах является группа тетрациклинов. Цель авторов изобретения состояла в том, чтобы предоставить предварительно отформованную вставку, которая обеспечивает повышенную стабильность лекарственного средства, легкое нанесение и контролируемое высвобождение в течение нескольких недель. Поэтому был предложен хелатный комплекс, состоящий из тетрациклинового антибиотика и соли жирной кислоты. В этом случае миноциклин и доксициклин сочетались со стеаратом магния и кальция в различных молярных соотношениях. Эти хелатные комплексы стабилизируют активный фармацевтический ингредиент и делают возможным включение в полимерную матрицу PLGA посредством экструзии горячего расплава. Хелатные комплексы были охарактеризованы с помощью УФ/видимой области и ИК-спектроскопии, приводя к предпочтению комплексов миноциклин-магний. Для повторной оценки антибиотической активности комплекса проводили диско-диффузионный метод. Перед экструзией комплекс смешивали с различными полимерами PLGA и подвергали криоизмельчению. Экструзия горячего расплава предоставляла гомогенные экструдаты диаметром от 600 до 900 мкм. Они содержат 11,5% миноциклина, регулируются по длине и просты в использовании. Исследования высвобождения in vitro выявили контролируемое высвобождение лекарственного средства в течение 42 дней.

Подход авторов изобретения к новой форме применения для пациента с пародонтитом предлагает несколько преимуществ. Стабильность миноциклина повышается за счет предлагаемого комплексообразования до и после применения. Процесс изготовления является универсальным, не содержит токсичных растворителей, обеспечивает доступность для масштабирования и предоставляет твердую предварительно отформованную вставку. Эта предварительно отформованная вставка характеризуется простотой применения без какого-либо специального оборудования, возможностью регулировки и контролируемым пролонгированным высвобождением в течение 42 дней, чего еще не было достигнуто в других составах. Таким образом, экструдаты обладают многообещающим потенциалом для продвижения в качестве ценного терапевтического средства, в частности в области пародонтальной терапии.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР

Сравнительный пример 18: Обработка Na₂HPO₄

Опубликованная международная заявка WO 2012/128417 A1 описывает в Примере 1 образование «ионного комплекса» путем смешивания 5 масс.% водного раствора тетрациклина гидрохлорида с 5 масс.% водным раствором Na₂HPO₄ в объемном соотношении 1:1. Комплексы миноциклин⋅ион HCl также были заявлены в WO 2012/128417 A1. Поэтому аналогичную реакцию проводили для сравнения фосфата миноциклина с хелатным комплексом миноциклина авторов изобретения.

В первой попытке 375 мг миноциклин⋅HCl и Na₂HPO₄ взвешивали в 15 мл пробирке Falcon. После этого к каждому порошку добавляли 7,125 мл бидистиллированной воды. Миноциклин⋅HCl не был растворим в такой высокой концентрации, что приводило к желтой суспензии. Na₂HPO₄ легко растворился (Фиг. 19). Эти два раствора смешивали, в результате чего получали оранжевый раствор (Фиг. 20). В отличие от WO 2012/128417 A1, осадков не наблюдалось; растворимость даже увеличилась. Раствор центрифугировали при 4000 об/мин в течение 4 минут, но осадка не наблюдали.

Эксперимент повторяли с растворами 1 масс.% миноциклина HCl и 1 масс.% Na₂HPO₄. Поэтому по 75 мг каждого соединения взвешивали в 15-миллилитровых пробирках Falcon и добавляли 7,425 мл бидистиллированной воды. При этой концентрации миноциклин⋅HCl был растворим и давал желтый раствор (Фиг. 21). Смешивание обоих компонентов также приводит к желтому раствору (Фиг. 22). Осадки не наблюдались, и центрифугирование при 4000 об/мин в течение 4 минут не изменило состояние растворов. Конечный раствор имел значение pH 7,1, что указывает на присутствие миноциклина в качестве катиона. Тем не менее, чтобы убедиться в катионном состоянии миноциклинов перед смешиванием обоих растворов, эксперимент также повторяли с заменой 400 мкл 7,425 мл бидистиллированной воды на 0,1 М HCl. Изменение pH также не привело к выпадению осадка (Фиг. 23).

Таким образом, для миноциклин⋅HCl не наблюдали успешного осаждения комплекса малорастворимых ионов с динатрия фосфатом в качестве анионного аналога.

Настоящее раскрытие дополнительно включает следующие аспекты.

[1] Комплекс, содержащий соединение тетрациклина (TC) или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват и карбоксилат двухвалентного металла (MA₂), в котором: молярное соотношение TC:MA₂ находится в диапазоне 1:0,8-3,0; катион двухвалентного металла М представляет собой катион щелочноземельного металла и A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из C₈-C₂₄карбоновой кислоты. [2] Комплекс по аспекту [1], в котором соединение тетрациклина (ТС) выбрано из миноциклина, доксициклина, тетрациклина, хлортетрациклина, окситетрациклина, ролитетрациклина, тигециклина, демеклоциклина, лимециклина, меклоциклина, метациклина, омадациклина, сарециклина, эравациклина, кломоциклина, 9-(N, N-диметилглициламидо)-6-деметил-6-дезокситетрациклина и 9-(N, N-диметилглициламидо)миноциклина. [3] Комплекс по любому одному из предшествующих аспектов, в котором: соотношение TC:MA₂ составляет 1:2; и/или M выбран из Mg²⁺ и Ca²⁺; и/или A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из карбоновой кислоты, выбранной из арахиновой кислоты (C₂₀), стеариновой кислоты (C₁₈), пальмитиновой кислоты (C₁₆), миристиновой кислоты (C₁₄), лауриновой кислоты (C₁₂), каприновой кислоты (C₁₀), каприловой кислоты (C₈), гидроксистеариновой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, линоленовой кислоты и рицинолевой кислоты. [4] Комплекс по любому одному из предшествующих аспектов, имеющий формулу [(TC)⋅2(MgA₂)], в которой соединение тетрациклина (TC) представляет собой миноциклин или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват. [5] Фармацевтический препарат, содержащий комплекс по любому одному из аспектов [1]-[4] и необязательно один или более фармацевтически приемлемых эксципиент(ов). [6] Фармацевтический препарат по аспекту [5], который предназначен для местного введения и/или выбран из группы, состоящей из экструдата, частицы, гранулы, порошка, пленки, стрипа, прессованного порошка, чипа, пасты, крема, геля, эмульсии, суспензии, линимента, мази, бальзама, лосьона, глазных капель, спрея, аэрозоля для местного применения, раствора для местного применения, суспензии для местного применения, кожного пластыря и нетканого материала. [7] Фармацевтический препарат по аспекту [5] или [6], дополнительно содержащий в качестве эксципиента один или более биоразлагаемых полимер(ов), выбранных из биоразлагаемых полиэфиров, таких как поли(гликолевая кислота) (PGA), поли(молочная кислота) (PLA), поли(молочная-со-гликолевая кислота) (PLGA), полигидроксимасляная кислота (PHB) или поликапролактон (PCL); смешанных биоразлагаемых полиэфиров, таких как PLA-PCL и PLGA-PCL; биоразлагаемых ПЭГилированных диблочных (AB) или триблочных (ABA или BAB) сополимеров, таких как ПЭГ-PLA, ПЭГ-PLGA, ПЭГ-PCL и ПЭГ-PCL-PLGA; и пектинов, и/или в котором общее содержание соединения тетрациклина (TC) находится в диапазоне 5-20 масс.%. [8] Фармацевтический препарат по любому одному из аспектов [5]-[7], который имеет форму нитевидного экструдата, предпочтительно имеющий по существу круглое или по существу эллиптическое поперечное сечение и/или максимальный диаметр поперечного сечения в диапазоне 0,1-10 мм. [9] Способ изготовления комплекса по любому одному из аспектов [1]-[4], включающий следующие стадии: (a) смешивание соединения тетрациклина (TC) или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата и карбоксилата двухвалентного металла (MA₂) в молярном соотношении 1:0,8-3,0 с органическим растворителем для получения дисперсии, в которой катион двухвалентного металла M представляет собой катион щелочноземельного металла и A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из C₈-C₂₄карбоновой кислоты; (b) нагревание указанной дисперсии с образованием комплекса; (c) удаление растворителя для получения комплекса. [10] Способ изготовления фармацевтического препарата по аспекту [8], включающий следующие стадии: (d) измельчение комплекса по любому одному из аспектов [1]-[4] и, если присутствует, одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов для получения экструзионного прекурсора; (e) экструзия указанного экструзионного прекурсора при температуре выше комнатной температуры; (f) охлаждение продукта стадии (е) для получения фармацевтического препарата в форме нитевидного экструдата. [11] Комплекс по любому одному из аспектов [1]-[4] или фармацевтический препарат по любому одному из аспектов [5]-[8] для применения в способе лечения организма человека или животного. [12] Комплекс по любому одному из аспектов [1]-[4] или фармацевтический препарат по любому одному из аспектов [5]-[8] для применения в способе терапии и/или профилактики (i) бактериальной инфекции или (ii) бактериальной инфекции, вызванной одной или более бактериями, выбранными из группы, состоящей из Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Streptococcus gordonii, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces naeslundii и Parvimonas micra. [13] Комплекс по любому одному из аспектов [1]-[4] или фармацевтический препарат по любому одному из аспектов [5]-[8] для применения по аспекту [12], в котором антибиотическая активность сохраняется в течение периода, по меньшей мере, 21 дня. [14] Комплекс по любому одному из аспектов [1]-[4] или фармацевтический препарат по любому одному из аспектов [5]-[8] для применения в способе терапии и/или профилактики острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта. [15] Комплекс по любому одному из аспектов [1]-[4] или фармацевтический препарат по любому одному из аспектов [5]-[8] для применения в способе по аспекту [14], в котором заболевание пародонта выбрано из заболеваний десен, вызванных зубным налетом, пародонтита, хронического пародонтита, агрессивного пародонтита, пародонтита как проявления системных заболеваний, некротических заболеваний пародонта, абсцессов пародонта, пародонтита, связанного с эндодонтическими поражениями, периимплантного мукозита, периимплантита и эндодонтических инфекций.

Настоящее изобретение относится к комплексу, образованному из соединения тетрациклина (TC) или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата и карбоксилата двухвалентного металла (MA₂), в котором молярное соотношение TC:MA₂ находится в диапазоне 1:0,8-3,0, катион двухвалентного металла М представляет собой катион щелочноземельного металла и A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из C₈-C₂₄карбоновой кислоты. При этом соединение тетрациклина (ТС) выбрано из миноциклина, доксициклина, хлортетрациклина, ролитетрациклина, тигециклина, демеклоциклина, лимециклина, меклоциклина, метациклина, омадациклина, сарециклина, эравациклина, кломоциклина, 9-(N,N-диметилглициламидо)-6-деметил-6-дезокситетрациклина и 9-(N,N-диметилглициламидо)миноциклина. Также изобретение относится к фармацевтическому препарату, способам получения указанных комплекса и фармацевтического препарата, применению указанного комплекса и способу лечения с использованием указанного комплекса или фармацевтического препарата. Комплексы соединений тетрациклина в соответствии с настоящим изобретением разлагаются в водных средах медленнее, чем соответствующие соединения тетрациклина, и имеют более низкую растворимость в воде и обеспечивают более отсроченное и замедленное высвобождение по сравнению с соответствующими соединениями тетрациклина. Предложенные комплексы могут быть использованы для терапии и/или профилактики бактериальной инфекции или острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта. 6 н. и 14 з.п. ф-лы, 23 ил., 4 табл., 18 пр.

1. Комплекс, образованный из соединения тетрациклина (TC) или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата и карбоксилата двухвалентного металла (MA₂), для терапии и/или профилактики бактериальной инфекции или острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта, в котором:

молярное соотношение TC:MA₂ находится в диапазоне 1:0,8-3,0;

катион двухвалентного металла М представляет собой катион щелочноземельного металла и

A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из C₈-C₂₄карбоновой кислоты,

в котором соединение тетрациклина (ТС) выбрано из миноциклина, доксициклина, хлортетрациклина, ролитетрациклина, тигециклина, демеклоциклина, лимециклина, меклоциклина, метациклина, омадациклина, сарециклина, эравациклина, кломоциклина, 9-(N,N-диметилглициламидо)-6-деметил-6-дезокситетрациклина и 9-(N,N-диметилглициламидо)миноциклина.

2. Комплекс по п.1, в котором:

соотношение TC:MA₂ составляет 1:2; или

M выбран из Mg²⁺ и Ca²⁺; или

A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из карбоновой кислоты, выбранной из арахиновой кислоты (C₂₀), стеариновой кислоты (C₁₈), пальмитиновой кислоты (C₁₆), миристиновой кислоты (C₁₄), лауриновой кислоты (C₁₂), каприновой кислоты (C₁₀), каприловой кислоты (C₈), гидроксистеариновой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, линоленовой кислоты и рицинолевой кислоты.

3. Комплекс по любому одному из предшествующих пунктов, в котором:

соотношение TC:MA₂ составляет 1:2; и

M выбран из Mg²⁺ и Ca²⁺; и

A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из карбоновой кислоты, выбранной из арахиновой кислоты (C₂₀), стеариновой кислоты (C₁₈), пальмитиновой кислоты (C₁₆), миристиновой кислоты (C₁₄), лауриновой кислоты (C₁₂), каприновой кислоты (C₁₀), каприловой кислоты (C₈), гидроксистеариновой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, линоленовой кислоты и рицинолевой кислоты.

4. Комплекс по любому одному из предшествующих пунктов, имеющий формулу [(TC)⋅2(MgA₂)], в которой соединение тетрациклина (TC) представляет собой миноциклин или его фармацевтически приемлемую соль, гидрат или сольват.

5. Фармацевтический препарат для терапии и/или профилактики бактериальной инфекции или острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта, содержащий комплекс по любому одному из пп.1-4 и необязательно один или более фармацевтически приемлемый(х) эксципиент(ов).

6. Фармацевтический препарат по п.5, который предназначен для местного введения и/или выбран из группы, состоящей из экструдата, частицы, гранулы, порошка, пленки, стрипа, прессованного порошка, чипа, пасты, крема, геля, эмульсии, суспензии, линимента, мази, бальзама, лосьона, глазных капель, спрея, аэрозоля для местного применения, раствора для местного применения, суспензии для местного применения, кожного пластыря и нетканого материала.

7. Фармацевтический препарат по п.5 или 6, дополнительно содержащий в качестве эксципиента один или более биоразлагаемый(х) полимер(ов), выбранный(х) из биоразлагаемых полиэфиров, таких как поли(гликолевая кислота) (PGA), поли(молочная кислота) (PLA), поли(молочная-со-гликолевая кислота) (PLGA), полигидроксимасляная кислота (PHB) или поликапролактон (PCL); смешанных биоразлагаемых полиэфиров, таких как PLA-PCL и PLGA-PCL; биоразлагаемых ПЭГилированных диблочных (AB) или триблочных (ABA или BAB) сополимеров, таких как ПЭГ-PLA, ПЭГ-PLGA, ПЭГ-PCL и ПЭГ-PCL-PLGA; и пектинов, и/или в котором общее содержание соединения тетрациклина (TC) находится в диапазоне 5-20 мас.%.

8. Фармацевтический препарат по п.7, в котором биоразлагаемые полимеры имеют диапазон средневесовой молекулярной массы 4-250 кДа и/или имеют температуру стеклования 42-48°C, имеют характеристическую вязкость [дл/г] (0,1% в CHCl₃ при 25°C) 0,03-1,70.

9. Фармацевтический препарат по п.7 или 8, в котором биоразлагаемые полимеры представляют собой сополимеры PLGA, имеющие диапазон средневесовой молекулярной массы (кДа) 5-90, имеющие характеристическую вязкость [дл/г] (0,1% в CHCl₃ при 25°C) 0,14-0,82, и/или которые заканчиваются группами сложного эфира, алкилового эфира и/или ПЭГ.

10. Фармацевтический препарат по любому одному из пп.7-9, в котором биоразлагаемые полимеры представляют собой поли(D, L-лактид-со-гликолиды), имеющие диапазон средневесовой молекулярной массы 7000-38000 и/или характеристическую вязкость [дл/г] (0,1% в CHCl₃ при 25°C) 0,16-0,44.

11. Фармацевтический препарат по любому одному из пп.5-10, который находится в форме нитевидного экструдата.

12. Фармацевтический препарат по п.11, имеющий по существу круглое или по существу эллиптическое поперечное сечение и/или максимальный диаметр поперечного сечения 0,1-10 мм, 0,2-5 мм, 0,3-1 мм, 0,4-0,8 мм, 0,3-0,6 мм, 0,2-5 мм, 0,3-1 мм, 0,6-0,9 мм, 0,4-0,8 мм, 0,3-0,6 мм, 0,3 мм, 0,4 мм, 0,5 мм или 0,6 мм.

13. Способ получения комплекса по любому одному из пп.1-4, включающий следующие стадии:

(а) смешивание соединения тетрациклина (ТС) или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или сольвата и карбоксилата двухвалентного металла (МА₂) в молярном соотношении 1:0,8-3,0 с органическим растворителем для получения дисперсии, в которой катион двухвалентного металла M представляет собой катион щелочноземельного металла и A представляет собой карбоксилат-анион, полученный из C₈-C₂₄карбоновой кислоты;

(b) нагревание указанной дисперсии с образованием комплекса;

(c) удаление растворителя для получения комплекса.

14. Способ получения фармацевтического препарата по п.11, включающий следующие стадии:

(d) измельчение комплекса по любому одному из пп.1-4 и, если присутствует, одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов для получения экструзионного прекурсора;

(e) экструзия указанного экструзионного прекурсора при температуре выше комнатной температуры;

(f) охлаждение продукта стадии (е) для получения фармацевтического препарата в форме нитевидного экструдата.

15. Применение комплекса по любому одному из пп.1-4 или фармацевтического препарата по любому одному из пп.5-12 в способе терапии и/или профилактики (i) бактериальной инфекции; (ii) бактериальной инфекции, вызванной одной или более бактериями, выбранными из группы, состоящей из Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Streptococcus gordonii, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces naeslundii и Parvimonas micra; и/или (iii) острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта.

16. Применение по п.15, в котором антибиотическая активность сохраняется в течение периода по меньшей мере 21 день.

17. Применение по п.15, в котором заболевание пародонта выбрано из заболеваний десен, вызванных зубным налетом, пародонтита, хронического пародонтита, агрессивного пародонтита, пародонтита как проявления системных заболеваний, некротических заболеваний пародонта, абсцессов пародонта, пародонтита, связанного с эндодонтическими поражениями, периимплантного мукозита, периимплантита и эндодонтических инфекций.

18. Способ лечения организма человека или животного, включающий введение терапевтически эффективного количества комплекса по п.1 или фармацевтического препарата по п.5 объекту, нуждающемуся в таком лечении, где способ предназначен для терапии и/или профилактики (i) бактериальной инфекции; (ii) бактериальной инфекции, вызванной одной или более бактериями, выбранными из группы, состоящей из Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Streptococcus gordonii, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces naeslundii и Parvimonas micra; и/или острого, хронического или рецидивирующего заболевания пародонта.

19. Способ по п.18, в котором антибиотическая активность сохраняется в течение периода по меньшей мере 21 день.

20. Способ по п.18, в котором заболевание пародонта выбрано из заболеваний десен, вызванных зубным налетом, пародонтита, хронического пародонтита, агрессивного пародонтита, пародонтита как проявления системных заболеваний, некротических заболеваний пародонта, абсцессов пародонта, пародонтита, связанного с эндодонтическими поражениями, периимплантного мукозита, периимплантита и эндодонтических инфекций.