УНИВЕРСАЛЬНАЯ ТЕСТ-ПОЛОСКА ДЛЯ ВЫБОРОЧНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ МЕТОДОМ ИММУНОХРОМАТОГРАФИИ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/543 

Изобретение относится к определению группы токсичных метаболитов - афлатоксин В1, охратоксин А, фумонизин, зеараленон, Т2 токсин и дезоксиниваленол, и может быть использовано как быстрый и удобный инструмент внелабораторного скрининга продуктов питания, кормов и сельскохозяйственной продукции.

Микотоксины - низкомолекулярные вторичные метаболиты плесневых грибов. На сегодняшний день известно более 300 микотоксинов (Trucksess and Diaz-Amigo, 2011), но, к счастью, только 20 из них обнаружены в пищевых продуктах в количествах, достаточных для негативного воздействия на человека или животных. Микотоксинам свойственна высокая токсичность, они обладают мутагенными, тератогенными, канцерогенными, иммунодепрессивными свойствами (Sharma 1993; Zinedine, Soriano et al. 2007), а также гено- и нефротоксичностью (Wang, Quan et al. 2006; Xu, Xie et al. 2009). Поражение растительных культур может происходить как при вызревании, так и при хранении (особенно при нарушении его условий). Наиболее часто встречающиеся микотоксины - афлатоксин В1 (преимущественно в арахисе, фисташках, орехах, семенах масличных культур), охратоксин А (в рисе, ржи, пшенице, гречихе, ячмене), фумонизины (в хлебных злаках, кукурузе, рисе), зеараленон (в пшенице, хлебных злаках, рисе, ячмене, овсе), Т2 токсин (в рисе, ржи, пшенице, ячмене, овсе), дезоксиниваленол (в кукурузе, рисе, ржи, пшенице, гречихе). Приоритетным загрязнителем для зерновых продуктов является дезоксиниваленол; для орехов и семян масличных - афлатоксин В1; для продовольственного зерна и мукомольно-крупяных изделий - охратоксин А, для кукурузы и продуктов ее переработки - фумонизин.

Большинство микотоксинов не разрушается в процессе обычной обработки пищевого сырья, поэтому, попав в него на начальном этапе, микотоксины сохраняются при прохождении продукции по технологической цепочке, попадая в конечный продукт. Отсюда следует необходимость тщательного мониторинга микотоксинов на всех этапах производства - от хранения и транспортировки сырья до конечного товара.

Традиционно для решения этой задачи используются физико-химические методы анализа, сочетающие низкий предел обнаружения и высокую воспроизводимость результатов. Однако для применения этих методов необходимо дорогостоящее оборудование и квалифицированный персонал, а стоимость анализа одной пробы довольно высока. Необходимость тщательной очистки проб делает невозможным проведение анализа напрямую и требует продолжительных стадий очистки проб и концентрирования аналита.

Активно развиваются альтернативные методы, основанные на селективном иммунном распознавании микотоксинов антителами. Среди них особе место занимает иммунохроматография, подход, сочетающий высокие аналитические характеристики, малое время анализа и простоту выполнения. Однако из-за необходимости контроля различных видов микотоксинов важно сокращение затрат при производстве тест-систем. Нами вместо разработки тест-систем на каждое соединение предлагается использовать одну тест-полоску, способную детектировать любой из целевых аналитов. Изготовление тест-системы в предлагаемом варианте упрощается и удешевляется по сравнению с обычной мультипараметрической тест-системой, в которой на одной полоске происходит одновременное определение всех аналитов. Мультипараметрическая тест-система требует использования более дорогих компонентов, более сложных условий сборки и валидации теста.

Наиболее близкими аналогами изобретения являются иммунохроматографические тест-системы с непрямым введением маркера и детекцией микотоксинов в различных средах:

1. тест-система для непрямого иммунохроматографического определения деоксиниваленола и Т-2 токсина, в которой антитела помещены в буфера для нанесения пробы, описанная в публикации Петраковой и соавторов «Lateral flow immunoassay for bisphenol A: "External" antibodies as the simplest tool for sensitive immunochromatographic tests («Внешние» антитела как простой инструмент для высокочувствительного анализа): Talanta, 2017, v. 175, p.77-81. DOI: 10.1016/j.talanta.2017.07.027;

2. иммунохроматографическая тест-система для непрямого определения Т2 токсина, в которой маркер и специфические антитела предварительно нанесены и высушены на мембране, описанная в публикации Урусова и соавторов «Immunochromatographic assay of Т-2 toxin using labeled anti-species antibodies)) (Иммунохроматографический анализ T2 токсина с использованием меченых антивидовых антител), Applied Biochemistry and Microbiology, 2017, v. 53, N 5, p.594-599. DOI: 10.1134/S0003683817050167.

Описанная в первой публикации тест-система представляет собой мембранный композит, в состав которого входит:

1. рабочая мембрана с иммобилизованными конъюгатами Т2 токсина и диоксиниваленола с белками-носителями в аналитической зоне и с иммобилизованными антивидовыми антителами в контрольной зоне;

2. мембраны под конъюгат с нанесенными и высушенным конъюгатом антивидовых антител против иммуноглобулинов мыши;

3. мембраны для впитывания и сепарации тестируемой пробы;

4. конечная адсорбирующая мембрана для впитывания компонентов пробы после прохождения реакции;

5. флакон с буфером для разбавления пробы, в который одновременно внесены мышиные моноклональные антитела против Т2 токсина и деоксиниваленола.

Анализ проводят следующим образом:

1. Экстракты растительного сырья смешивают с буфером для разведения пробы, в который добавлены антитела одновременно к двум антигенам;

2. 100 мкл полученного раствора наносят на нижнюю часть тест-полоски (мембраны для нанесения пробы);

3. После нанесения инкубируют 15 минут;

4. Результат анализа фиксируют визуально или с использованием детектора.

Результат анализа интерпретируют следующим образом:

1. Если на рабочей мембране проявляется одна окрашенная контрольная линия, то в пробе отсутствуют и Т2 токсин, и деоксиниваленол;

2. Если окрашивается контрольная линии и одна из аналитических, то в пробе присутствует только один определяемый токсин;

3. Если окрашенных линий не наблюдается, анализ признается недействительным и повторяется.

Представленная во второй публикации тест-система представляет собой мембранный композит, в состав которого входит:

1. рабочая мембрана с иммобилизованными конъюгатом Т2 токсина с белком-носителем в аналитической зоне и иммобилизованными антивидовыми антителами в контрольной зоне;

2. мембраны под конъюгат с нанесенными и высушенными конъюгатом антивидовых антител против иммуноглобулинов мыши и специфическими антителами против Т2 токсина;

3. мембраны для впитывания и сепарации тестируемой пробы;

4. конечная адсорбирующая мембрана для впитывания компонентов пробы после прохождения реакции;

5. флакон с буфером для разбавления пробы. Анализ проводят следующим образом:

1. Экстракты растительного сырья смешивают с буфером для разведения пробы;

2. 100 мкл полученного раствора наносят на нижнюю часть тест-полоски (мембраны для нанесения образца);

3. После нанесения инкубируют 15 минут;

4. Результат анализа фиксируют визуально или с использованием детектора.

Результат анализа интерпретируют следующим образом:

4. Если на рабочей мембране проявляется одна окрашенная контрольная линия, то в пробе присутствует Т2 токсин.

5. Если окрашиваются и контрольная, и аналитическая линии, то в пробе отсутствует Т2 токсин.

6. Если окрашенных линий не наблюдается, анализ признается недействительным и повторяется.

В первом варианте хоть и происходит одновременная детекция двух микотоксинов, но она осложнена взаимным влиянием образующихся комплексов «окрашенный маркер-антивидовые антитела-специфические антитела к различным микотоксинам». Расширение до большего количества одновременно определяемых микотоксинов потребует значительного роста концентрации конъюгата антивидовых антител с окрашенным маркером (чтобы их количество было достаточным для покрытия всех свободных антител, вносимых в систему с буфером для разведения пробы) и в то же время - неоправданных расходов специфических антител. Такой перерасход особенно критичен при анализе проб, которые не могут быть контаминированы одновременно различными токсинами, или если нужно подтверждение контаминации, выявленной по внешним признакам.

Во втором варианте и специфические антитела, и конъюгаты антивидовых антител с маркером наносятся одновременно на одну мембрану, что требует значительного расхода реагентов для обеспечения мультипараметрической детекции и зачастую вызывает негативные эффекты при хранении. При этом для каждого микотоксина требуется создание отдельной тест-полоски со своим протоколом нанесения реагентов и последующей обработки мембран.

Задачей заявленного изобретения является сокращение стадий производства и упрощение технологического процесса. Результат заявленного изобретения заключается в сокращении вариантов изделия: с шести отдельных тест-полосок (с нанесенными реагентами разной специфичности) до одного варианта универсальной тест-полоски и набора буферных растворов с разными антителами. Таким образом, определение одного выбранного микотоксина потребует только выбора флакона со специфическими к определяемому микотоксину антителами.

Указанный результат достигается тем, что:

- на рабочую мембрану нанесены сразу 6 и более аналитических зон (сорбированы конъюгаты микотоксинов с белками-носителями);

- на стекловолоконную мембрану нанесен конъюгат антивидовых антител против иммуноглобулинов мыши с окрашенными наночастицами;

- специфические антитела к определяемым микотоксинам исключены из комплектации самой тест-полоски и помещены в буфер для разведения пробы, при этом антитела разной специфичности не смешиваются друг с другом;

- для проведения анализа берется универсальная тест-полоска и выбирается необходимый раствор специфических антител.

Для проведения анализа, как показано на рис. 1:

1. Готовятся универсальные тест-полоски, на которые уже нанесены конъюгат окрашенного маркера с антивидовыми антителами, аналитические зоны - конъюгаты микотоксинов с белками-носителями - и реагенты контрольной зоны.

2. В зависимости от задачи (контролируемого аналита) выбирается раствор специфических антител, который смешивается с анализируемой пробой в отношении 1 к 1 и инкубируется в течение 1 минуты (контролируемый микотоксин определяется исходя из наибольшей вероятности контаминации им данной серии проб на основе информации о виде продукции, условиях выращивания и хранения).

3. На мембрану для пробы наносится 100-150 мкл полученного раствора и инкубируется 15 минут.

4. По образованию окрашенных линий проводится интерпретация результата.

Описанный анализ включает следующие процессы:

Анализируемая проба смешивается с тестируемой пробой. Находящиеся в растворе антитела связываются с определяемым микотоксином. После этого проба наносится на мембраны для пробы и начинает движение вдоль тест-полоски. Доходя до мембраны с конъюгатом, антитела связываются с ним, образуя комплекс антиген-специфическое антитело-антивидовые антитело-окрашенный маркер. Комплексы продолжают движение вдоль тест-полоски и доходят до аналитических зон. Если в пробе присутствует микотоксин, то комплексы не связываются в аналитической зоне (все центры связывания антител уже заняты) и продолжают свое движение. Если в пробе нет микотоксина или его количество ниже заявленного предела детекции, то свободные антитела в составе комплекса метка-антивидовые антитела-специфические антитела связываются с поверхностью мембраны и образуют окрашенную линию. Избыток комплексов доходит до контрольной линии, где связывается с иммобилизованными антивидовыми антителами независимо от наличия антигена в пробе, образуя окрашенную линию контрольной зоны.

Интерпретация результатов анализа производится в соответствие со схемой, представленной на рис. 2: при использовании раствора антител против афлатоксина В1 проводят идентификацию первой аналитической зоны (рис 2 А). Ее появление свидетельствует об отсутствии микотоксина в пробе. Если же линия не проявляется (на тесте присутствует только одна контрольная зона), делается вывод о наличии микотоксина в пробе (превышение порогового значения концентрации). Полное отсутствие какой-либо из окрашенных линий или проявление иных аналитических зон толкуется как недействительный результат анализа. Аналогично анализ с использованием антител против охратоксина А интерпретируется по окрашиванию второй аналитической зоны (рис 2 Б), антител против фумонизина - по окрашиванию третьей аналитической зоны (рис 2 В), антител против зеараленона - четвертой аналитической зоны (рис 2 Г), антител против Т2 токсина - пятой аналитической зоны (рис 2 Д), антител против дезоксиниваленола - шестой аналитической зоны (рис 2 Е).

Эффективность данного подхода подтверждается следующими представленными ниже примерами:

Пример 1 (определение концентрации охратоксина А)

С использованием заявляемого устройства проводят анализ экстрактов зерен кукурузы. Пробы с разной концентрацией охратоксина А смешивают с раствором специфических антител и инкубируют 1 минуту. После этого на поверхность мембраны для пробы вносят 150 мкл полученной смеси. Через 15 минут проводят документирование результатов анализа и их последующую цифровую обработку.

На рисунке 3 представлен график полученной зависимости интенсивности окрашивания аналитической зоны (результат цифровой обработки изображений тест-полосок) от концентрации охратоксина А в пробе. Из полученных данных видно, что созданный тест способен проводить идентификацию микотоксина охратоксина А в с экстрактах зерен кукурузы с пределом обнаружения 5 мкг/кг (начало роста интенсивности окрашивания, т.е. появления линии в аналитической зоне).

Пример 2 (определение концентрации зеараленона)

С использованием заявляемого устройства проводят анализ экстрактов зерен кукурузы. Пробы с разной концентрацией зеараленона смешивают с раствором специфических антител и инкубируют 1 минуту. После этого на поверхность мембраны для пробы вносят 150 мкл полученной смеси. Через 15 минут проводят документирование результатов анализа и их последующую цифровую обработку.

На рисунке 4 представлен график полученной зависимости интенсивности окрашивания аналитической зоны от концентрации зеараленона в пробе. Из полученных данных видно, что созданный тест способен проводить идентификацию зеараленона в экстрактах зерен кукурузы с пределом обнаружения 200 нг/г.

Краткое описание чертежей

На рис. 1 изображена схема аналитической системы. 1 - раствор со специфическими антителами для разведения пробы, 2 - мембрана под пробу, 3 - аналитические зоны, 4 - контрольная зона, 5 - впитывающая мембрана, 6 - мембрана для нанесения конъюгата, 7 - анализируемая проба.

На рис. 2 изображены результаты использования устройства при выборе реагентов для анализа соответствующих микотоксинов

А: 8 - раствор антител на афлатоксин В1, 9 - аналитическая линия на афлатоксин В1,

Б: 10 - раствор антител на охратоксин А, 11 - аналитическая линия на охратоксин А,

В: 12 - раствор антител на фумонизин, 13 - аналитическая линия на фумонизин,

Г: 14 - раствор антител на зеараленон, 15 - аналитическая линия на зеараленон,

Д: 16 - раствор антител на Т2 токсин, 17 - аналитическая линия на Т2 токсин,

Е: 18 - раствор антител на дезоксиниваленонл, 19 - аналитическая линия на дезоксиниваленол).

На рис. 3 изображена калибровочная кривая иммунохроматографического определения охратоксина А в экстрактах кукурузы.

На рис. 4 изображена калибровочная кривая иммунохроматографического определения зеараленона в экстрактах кукурузы.

Изобретение относится к определению группы токсичных метаболитов. Раскрыта аналитическая система для определения микотоксинов методом иммунохроматографии, представляющая собой тест-полоску - комплекс мембран с предварительно нанесенными реагентами, включающими контрольную зону с антивидовыми антителами, ряд аналитических зон с конъюгатами белок-микотоксин на 6 или более микотоксинов, стекловолоконную мембрану под конъюгат антивидовых антител с окрашенным маркером, при этом специфические к определяемому микотоксину антитела не входят в состав тест-полоски, а представлены раздельно, где каждый вид специфических к определяемому микотоксину антител находится в отдельном флаконе с буфером для разбавления проб. Изобретение обеспечивает сокращение вариантов изделия с шести отдельных тест-полосок до одного варианта универсальной тест-полоски и набора буферных растворов с разными антителами. 4 ил., 2 пр.

Аналитическая система для определения микотоксинов методом иммунохроматографии, представляющая собой тест-полоску - комплекс мембран с предварительно нанесенными реагентами, включающими контрольную зону с антивидовыми антителами, ряд аналитических зон с конъюгатами белок-микотоксин на 6 или более микотоксинов, стекловолоконную мембрану под конъюгат антивидовых антител с окрашенным маркером, отличающаяся тем, что специфические к определяемому микотоксину антитела не входят в состав тест-полоски, а представлены раздельно, где каждый вид специфических к определяемому микотоксину антител находится в отдельном флаконе с буфером для разбавления проб.