Ускоренный способ оценки антиоксидантной активности растительного сырья из сабельника болотного (COMARUM PALUSTRE L.) Российский патент 2023 года по МПК G01N33/00 A61K36/73 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для оценки антиоксидантной активности препаратов на основе растительного сырья из сабельника болотного, в частности для разработки способов лечения окислительного стресса у животных и птиц.

Известно, что развитие патологического состояния в организме животного или птицы сопровождается усилением свободно-радикального окисления липидов и снижением антиоксидантной защиты. Такое состояние рассматривается как окислительный стресс, при котором, в конечном итоге, образуются высокотоксичные соединения (Игнатенко, В.А. ТБК-активные продукты перекисного окисления липидов эритроцитов в УЗ-поле и при наличии этанола / В.А Игнатенко, А.В. Лысенкова, А.Л. Калинин, А.Л. Казущик А.Л // Проблемы здоровья и экологии. - 2012. - №4. - С. 117-122) - [1]. Одним из них является малоновый диальдегид (МДА) - общепринятый показатель уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) как в живых организмах, так и in vitro (Зайцев В.Г. Модельные системы перекисного окисления липидов и их применение для оценки антиоксидатного действия лекарственных препаратов: дисс. … канд. биол. наук. Волгоград, 2001). - [2]

При развитии окислительного стресса на фоне снижения антиоксидантной защиты в рацион животным и птицам необходимо введение экзогенных антиоксидантов, лучше природного происхождения. В последнее время в качестве эффективных антиоксидантов рассматриваются препараты на основе растительного сырья (Абатуров А.Е. Медикаментозное управление окислительно-восстановительным состоянием организма при заболеваниях органов дыхания (часть 6) / А.Е. Абатуров, А.П. Волосовец, Т.П. Борисова // Здоровье ребенка. - 2018. - №8 (Т. 13). - С. 783-796) - [3]. Фитоантиоксиданты в отличие от синтетических антиоксидантных препаратов обладают меньшей токсичностью и лучшей переносимостью.

Поэтому актуальной задачей является создание растительных антиоксидантных препаратов и разработка способа оценки антиоксидантной активности таких препаратов. Сырьем для такого препарата может являться сабельник болотный (Comarum palustre L.), который обладает различным фармакологическим действием, в том числе и антиоксидантным.

В качестве лекарственного растения сабельник болотный (Comarum palustre L.) используется издавна. В ветеринарной медицине сабельник рассматривается как перспективное сырье для разработки препаратов различного фармакологического действия (Титович Л.В. Терапевтическая эффективность препаративных форм сабельника болотного при стронгилятозах желудочно-кишечного тракта молодняка жвачных // Международный вестник ветеринарии. - 2011. - №1. - С. 40-44) - [4]. Однако, ветеринарные препараты антиоксидантного действия на основе сабельника болотного (Comarum palustre L.) находятся в стадии разработки.

Для разработки антиоксидантного препарата на основе сырья из сабельника болотного (Comarum palustre L.) необходимо произвести оценку его антиоксидантного действия.

Известен способ оценки антиоксидантной активности растительного сырья из сабельника болотного (Comarum palustre L.), заключающийся в определении антиоксидантной активности при его введении в модельную систему перекисного окисления липидов, представленную полученными из лецитина липосомами. Антиоксидантную активность определяют по снижению уровня свободно-радикального окисления, характеризующегося концентрацией МДА. Липосомы в известном способе готовятся инжекционным способом: в 5 мл дистиллированной воды при постоянном интенсивном помешивании шприцом с тонкой иглой быстро впрыскивали 0,25 мл раствора 10%-го раствора лецитина. Далее в течение 2,5 суток липосомы подвергают окислению, и только после этого этапа происходит определение МДА в системе (Патент РФ 2535139) [5].

Недостатками данного способа оценки антиоксидантной активности растительного сырья является трудоемкость и продолжительность подготовки окисленных липосом, а также возможность искажения результатов антиоксидантной активности растительного сырья за счет проявления аналогичных свойств этилового спирта (Игнатенко, В.А. ТБК-активные продукты перекисного окисления липидов эритроцитов в УЗ-поле и при наличии этанола / В.А Игнатенко, А.В. Лысенкова, А.Л. Калинин, А.Л. Казущик А.Л // Проблемы здоровья и экологии. - 2012. - №4. - С. 117-122) - [1].

Задачей предлагаемого способа является снижение продолжительности определения антиоксидантной активности препаратов, повышение точности определения.

Техническим результатом изобретения является снижение искажения результатов антиоксидантной активности растительного сырья и уменьшение затрат времени.

Поставленная задача и указанный технический результат достигаются благодаря тому, что в предлагаемом ускоренном способе оценки антиоксидантной активности растительного сырья из сабельника болотного (Comarum palustre L.), заключающимся в определении антиоксидантной активности в водных настоях сабельника болотного (Comarum palustre L.) по снижению уровня свободно-радикального окисления, определяемого по уровню малонового диальдегида (МДА) методом взаимодействия с тиобарбитуровой кислотой в модельной системе перекисного окисления липидов, представленной полученными из лецитина липосомами, согласно изобретению, для получения липосом 0,5 г лецитина заливают 5 мл дистиллированной воды, оставляют на 2 часа для гидратации, далее вводят в полученную смесь 0,15 мл глицерина и нагревают 30 минут на водяной бане при постоянном встряхивании смеси, а затем в течение 1 часа данную смесь выдерживают при температуре 80-90°С.

Данная система не включает в себя этилового спирта, который способен проявить антиоксидантные свойства и тем самым снизить точность определения антиоксидантной активности препарата. Также продолжительность подготовки окисленных липосом для данной системы минимальна, что позволяет снизить трудоемкость широкомасштабных скрининговых исследований.

Реализация способа состоит в следующем:

Готовят 2 модельные системы перекисного окисления липидов на основе липосом, полученных тепловым способом: контрольную (1) - без добавления растительного сырья из сабельника болотного, и опытную (2) - с сабельником болотным. В модельных системах перекисного окисления липидов исследуют уровень свободно-радикального окисления липидов по показателю МДА.

Приготовление липосом проводится тепловым способом. Это позволяет исключить введение этилового спирта в модельную систему, а, следовательно, повысить точность определения антиоксидантных свойств препарата, т.к. этиловый спирт может проявлять антиоксидантное действие (Игнатенко, В.А. ТБК-активные продукты перекисного окисления липидов эритроцитов в УЗ-поле и при наличии этанола / В.А Игнатенко, А.В. Лысенкова, А.Л. Калинин, А.Л. Казущик А.Л // Проблемы здоровья и экологии. - 2012. - №4. - С. 117-122) - [1].

Пример 1. Экспериментальные исследования проводились в химических лабораториях ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный Университет им. Н.В. Парахина» и в инновационном научно-исследовательском испытательном центре ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный Университет им. Н.В. Парахина». Объектом исследования являлось растительное сырье из сабельника болотного.

1 этап. Готовились 4 модельные системы перекисного окисления липидов по двум схемам.

Первые две системы готовились по предлагаемой нами схеме с приготовлением липосом тепловым способом:

1 - контрольная (1) (система без добавления настоя сабельника болотного)

2 - опытная (2) (с добавлением настоя сабельника болотного).

Приготовление липосом тепловым способом. 0,5 г подсолнечного лецитина заливали 5 мл дистиллированной воды, оставляли 2 часа для гидратации. Далее вводили в полученную смесь 0,15 мл глицерина и нагревали 30 минут на водяной бане при постоянном встряхивании смеси. Затем в течение 1 часа данную смесь выдерживали при температуре 80-90°С.

Окисление липосом. В приготовленные суспензии липосом контрольной (1) и опытной (2) модельных систем (обеих систем) впрыскивали 0,125 мл 3 мМ перекись водорода (Н₂О₂) и нагревали при температуре 37°С в течение 1 часа.

Третья и четвертая модельные системы перекисного окисления липидов готовились по известному способу с приготовлением липосом инжекционным способом:

3 - контрольная (3) (система без добавления сабельника болотного)

4 - опытная (4) (с добавлением сабельника болотного).

Учитывая готовность модельной системы, приготовленной по известному способу только через 2,5 суток, начали ее приготовление на 2,5 суток раньше, чем первую и вторую модельные системы.

Приготовление липосом (известным) инжекционным способом. Для приготовления 10% раствора лецитина вводили лецитина в 5 мл 96%-го спирта, нагревали до 30-40°С и интенсивно перемешивали до однородного состояния. Липосомы готовили инжекционным способом: в 5 мл дистиллированной воды при постоянном интенсивном помешивании шприцом с тонкой иглой быстро впрыскивали 0,25 мл раствора 10%-го раствора лецитина.

Окисление липосом. В приготовленные суспензии липосом контрольной (1) и опытной (2) модельных систем (обеих систем) впрыскивали 0,125 мл 3 мМ перекись водорода (Н₂О₂) и нагревали при температуре 37°С в течение 6 часов. Далее 2 суток выдерживали при комнатной температуре.

2 этап исследования - определение концентрации МДА в модельных системах, приготовленных по известному и предлагаемому способам. В контрольные модельные системы (1) и (3): к 0,5 мл суспензии липосом добавляли 0,5 мл 0,92 М раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 49 мМ ТБК. Нагревали 15 минут на кипящей водяной бане. После чего исследовали полученные растворы на фотоколориметре при длине волны 532 нм против дистиллированной воды.

В опытные модельные системы (2) и (4): к 0,5 мл суспензии липосом добавляли по 0,0035 мл настоя сабельника болотного, затем 0,5 мл 0,92 М раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 49 мМ ТБК. Нагревали 15 минут на кипящей водяной бане. После чего исследовали полученные растворы на фотоколориметре при длине волны 532 нм против дистиллированной воды. В модельных системах (контрольных (1), (3) и опытных (2), (4)) перекисного окисления липидов исследовали уровень свободно-радикального окисления липидов по показателю МДА, МДА определяли по реакции с ТБК. Уровень МДА в контрольных модельных системах перекисного окисления липидов без добавления сабельника болотного (Comarum palustre L.) составил: в 1-ой - 0,54 ед. опт. пл., в 3-ей - 0,31 ед. опт. пл., а в опытных модельных системах перекисного окисления липидов с добавлением сабельника болотного (Comarum palustre L.) уровень МДА составил во 2-ой - 0,39 ед. опт. пл., в 4-ой - 0,24 ед. опт. пл.

Как видно из таблицы 1 уровень МДА с использованием сабельника болотного (Comarum palustre L.) снижается в системе, изготовленной по предлагаемому способу (сравнение систем (1) и (2)), на 0,15 ед. опт. пл. (27%), что указывает на снижение уровня свободно-радикального окисления (по уровню МДА) в модельной системе перекисного окисления липидов при введении настоя из сабельника болотного (Comarum palustre L.). Такая же динамика отмечается и при добавлении настоя сабельника в модельную систему, изготовленную по известному способу (сравнение систем (3) и (4)): МДА снижается на 0,07 ед. опт. пл. (22%).

Пример 2. Экспериментальные исследования проводились в химических лабораториях ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный Университет им. Н.В. Парахина» и в инновационном научно-исследовательском испытательном центре ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный Университет им. Н.В. Парахина».

Объектом исследования являлось растительное сырье из сабельника болотного.

1 этап. Готовились 2 модельные системы перекисного окисления липидов по двум схемам.

Первая система (1) готовилась по предлагаемому способу с приготовлением липосом тепловым способом:

Приготовление липосом тепловым способом. 0,5 г подсолнечного лецитина заливали 5 мл дистиллированной воды, оставляли 2 часа для гидратации. Далее вводили в полученную смесь 0,15 мл глицерина и нагревали 30 минут на водяной бане при постоянном встряхивании смеси. Затем в течение 1 часа данную смесь выдерживали при температуре 80-90°С.

Окисление липосом. В приготовленную суспензию липосом модельной системы впрыскивали 0,125 мл 3 мМ перекись водорода (Н₂О₂) и нагревали при температуре 37°С в течение 1 часа.

Вторая модельная система перекисного окисления липидов (2) готовились по известному способу с приготовлением липосом инжекционным способом.

Приготовление липосом инжекционным способом. Для приготовления 10% раствора лецитина вводили лецитина в 5 мл 96%-го спирта, нагревали до 30-40°С и интенсивно перемешивали до однородного состояния. Липосомы готовили инжекционным способом: в 5 мл дистиллированной воды при постоянном интенсивном помешивании шприцом с тонкой иглой быстро впрыскивали 0,25 мл раствора 10%-го раствора лецитина.

Окисление липосом. В приготовленную суспензию липосом модельной системы впрыскивали 0,125 мл 3 мМ перекись водорода (Н₂О₂) и нагревали при температуре 37°С в течение 1 часа.

2 этап исследования - определение концентрации МДА в модельных системах, приготовленных по известному и предлагаемому способам.

В модельные системы, приготовленные по предлагаемому и известному способам: к 0,5 мл суспензии липосом добавляли 0,5 мл 0,92 М раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 49 мМ ТБК. Нагревали 15 минут на кипящей водяной бане. После чего исследовали полученные растворы на фотоколориметре при длине волны 532 нм против дистиллированной воды.

В приготовленных по предлагаемому и известному способам модельных системах перекисного окисления липидов исследовали уровень свободно-радикального окисления липидов по показателю МДА, МДА определяли по реакции с ТБК. Уровень МДА в модельных системах перекисного окисления липидов составил: в 1-ой - 0,59 ед. опт. пл., во 2-ой - 0,23 ед. опт. пл.

Как видно из таблицы 2 в системе, изготовленной по известному способу, уровень МДА ниже на 0,26 ед. опт. пл. (53%), чем в системе, изготовленной по предлагаемому способу. Сниженный уровень МДА в системе (2) указывает на проявление этиловым спиртом антиоксидантных свойств в системе перекисного окисление липидов на основе липосом, приготовленных инжекционным способом, поэтому в данном случае необходим длительный процесс окисления липосом. В предлагаемом способе липосомы для создания модельной системы изготавливают тепловым способом. В нем исключен этиловый спирт, что позволяет ускорить процесс окисления суспензии липосом с 2,5 суток до 1 часа.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для оценки антиоксидантной активности препаратов на основе растительного сырья из сабельника болотного, в частности для разработки способов лечения окислительного стресса у животных и птиц. Ускоренный способ оценки антиоксидантной активности растительного сырья из сабельника болотного (Comarum palustre L.) заключается в определении антиоксидантной активности в водных настоях сабельника болотного (Comarum palustre L.) по снижению уровня свободно-радикального окисления, определяемого по уровню малонового диальдегида (МДА) методом взаимодействия с тиобарбитуровой кислотой в модельной системе перекисного окисления липидов, представленной полученными из лецитина липосомами. Для получения липосом 0,5 г лецитина заливают 5 мл дистиллированной воды, оставляют на 2 часа для гидратации, далее вводят в полученную смесь 0,15 мл глицерина и нагревают 30 минут на водяной бане при постоянном встряхивании смеси, а затем в течение 1 часа данную смесь выдерживают при температуре 80-90°С. Техническим результатом является снижение искажения результатов антиоксидантной активности растительного сырья и уменьшение затрат времени. 2 табл.

Ускоренный способ оценки антиоксидантной активности растительного сырья из сабельника болотного (Comarum palustre L.), заключающийся в определении антиоксидантной активности в водных настоях сабельника болотного (Comarum palustre L.) по снижению уровня свободно-радикального окисления, определяемого по уровню малонового диальдегида (МДА) методом взаимодействия с тиобарбитуровой кислотой в модельной системе перекисного окисления липидов, представленной полученными из лецитина липосомами, отличающийся тем, что для получения липосом 0,5 г лецитина заливают 5 мл дистиллированной воды, оставляют на 2 часа для гидратации, далее вводят в полученную смесь 0,15 мл глицерина и нагревают 30 минут на водяной бане при постоянном встряхивании смеси, а затем в течение 1 часа данную смесь выдерживают при температуре 80-90°С.