Способ получения экстракта из высшего растения Сабельника Залесова (Comarum salesovianum), обладающего противогриппозной активностью Российский патент 2025 года по МПК A61K36/73 B01D11/02 A61K125/00 A61P31/16 

Изобретение относится к способу получения средств на основе экстрактов из высшего растения Comarum salesovianum (Сабельника Залесова), обладающих противовирусной активностью в отношении вируса гриппа, и может быть использовано в биотехнологии, фармацевтической промышленности и медицине.

В настоящее время по своей социальной значимости грипп находится на первом месте среди всех инфекционных болезней человека. Эволюция вируса гриппа продолжается, и постоянно возникают новые антигенные варианты, вызывающие ежегодные эпидемии этого заболевания. Высокая изменчивость вируса гриппа и формирование иммунитета только к конкретному штамму обусловливает повторное заболевание гриппом [Грипп. Клиническая симптоматика Сологуб Т.В., Ледванов М.Ю., Малый В.П., Стукова Н.Ю., Романцов М.Г., Бизенкова М.Н., Полякова Т.Д. Успехи современного естествознания, 2009, №12. С. 27-29]. В дополнение к вакцинации как основной стратегии борьбы с гриппом Всемирной организацией здравоохранения рекомендовано применение противовирусных этиотропных химиопрепаратов, подавляющих размножение вируса и направленных на определенную вирус специфическую мишень в его цикле. На сегодняшний день в мире для лечения и профилактики гриппа применяется несколько групп таких препаратов: это препараты адамантанового ряда, ингибиторы нейраминидазы; в России, кроме этого, применяются ингавирин, арбидол. В связи с тем, что вирус гриппа непрерывно изменяется, обходя защитные ресурсы человеческого организма, и становится резистентным к уже имеющимся лекарственным препаратам, необходимость создания новых лечебных средств, в том числе и на основе соединений природного происхождения, является особо актуальной на сегодняшний день.

В последнее время для расширения базы лекарственного растительного сырья используются различные высшие растения.

Сабельник Залесова (Comarum salesovianum (Steph.) Asch. et Graebn. = Farinopsis salesoviana (Stephan) Chrtek et Sojk = Potentilla salesovii Stephan ex Willd) - это полукустарник 30-100 см высотой, с толстым у основания деревянистым стволом, ежегодно образующий цветущие, прямостоящие побеги, отмирающие осенью. Ветви покрыты буро-коричневой отслаивающейся корой, более молодые - беловатые, прижато-волосистые. Листья с 3-4 парами листочков, снизу часто белые от мучнистого налета. Белые с розовым оттенком цветки собраны в рыхлые малоцветковые соцветия или одиночные. Орешки длинноволосистые. Произрастает по долинам горных рек, каменистым склонам, россыпям и галечникам. Распространен в Средней и Центральной Азии и в Сибири (Горный Алтай), произрастая на каменистых и щебнистых склонах гор и по берегам рек [Флора СССР, 1941 Т.X.; Курбатский В.И. Comarum L. - Сабельник. Флора Сибири. Новосибирск: Наука, 1988. Т. 8. С. 35-38]. Химический состав растения представлен достаточно разрозненно. Так, обнаружено значительное количество флавонолов (до 4.7%) в листьях и цветках растения, органические кислоты [Триль В.М. Анатомо-морфологическая структура листа Comarum salesovianum (Steph.) Aschers et Graebn // Наука: комплексные проблемы. 2015. №2. С. 19-27]. В листьях выделены и идентифицированы производные фенольных липидов - 6-(8-ноненил) салициловая, 6-нонилсалициловая кислоты, 3-(8-ноненил) фенол [Gonchig Е., Erdenebat S., Togtoo О., Bataa S., Gendaram О., Kim Y.S., Ryu S.Y. Antimicrobial activity of Mongolian medicinal plants // Natural Product Sciences. 2008. Vol. 14. N1. Pp. 1-5]. T.B. Букреевой и А.Л. Шаварда (2017) подтверждены исследования вышеупомянутых авторов и дополнительно обнаружены гомологи анакардовых (или алкилсалициловых) кислот - 6-нонадиенилсалициловая, 6-ундецилсалициловая и 6-(10-ундеценил) салициловая кислоты, из листьев выделены мио-инозит и 3-глюкуронид кверцетина, из цветков - соль яблочной кислоты [Букреева Т.В., Шаварда A.Л. Анакардовые кислоты на поверхности цветков и листьев Comarum salesovianum (Rosaceae) // Растительные ресурсы. 2017. Т. 53(3). С. 435-442].

В листьях и цветках Сабельника Залесова из Горного Алтая синтезируется значительное количество катехинов (до 1,8%), флавонолов - до 5,6%, танинов - до 15,7%, каротиноидов - до 70.40%, сапонинов и пектиновых веществ [Храмова Е.П., Кукушкина Т.А., Шалдаева Т.М., Сыева С.Я. Сравнительное исследование биологически активных веществ Dasiphora fruticosa и Comarum salesovianum из Горного Алтая. Химия растительного сырья. 2020(1). С. 189-197].

В целом, в растительном сырье из надземных (листья и соцветия) и подземных частей Comarum salesovianum фенольные соединения являются доминирующими, и на их долю приходится основной вклад противовирусного эффекта. Спектрофотометрическим методом в надземных и подземных органах Comarum salesovianum (Сабельник Залесова) удалось обнаружить основные классы полифенолов - флавонолы, катехины, танины, фенольные (оксикоричные) кислоты, а также тритерпеноидов - тритерпеновые сапонины и полисахаридов - пектины.

В народной медицине надземная часть растения используются для лечения туберкулеза, гепатита и воспаления желчного пузыря. Настой из надземных частей применяется для промывания горла, отвар из подземных частей - для лечения травм спины, входит в сборы, рекомендуемые при желудочно-кишечных заболеваниях и атеросклерозе [Ligaa U., Davaasuren B., Ninjin N. Medicinal plants of Mongolia used in western and eastern medicine. JKL printing, Ulaanbaatar, 2006. Pp. 218-219]. О применении Сабельника Залесова в медицинской литературе практически не упоминается, более известен Сабельник болотный (С. palustre L.). Есть сведения, что Сабельник Залесова проявляет антимикробную [Gonchig Е., Erdenebat S., Togtoo О., Bataa S., Gendaram О., Kim Y.S., Ryu S.Y. Antimicrobial activity of Mongolian medicinal plants // Natural Product Sciences. 2008. Vol. 14. N1. Pp. 1-5], антибактериальную [Odontuya G., Banzragchgarav O., Murata Т., Batkhuu J., Sasaki K., Yoshizaki F. Antibacterially active phenolic lipid derivatives from Comarum salesovianum (Steph.) Aschers. et Gr. // Phytochemistry Letters. 2015. Vol. 13. Pp. 360-364. DOI: 10.1016/j.phytol.2015.07.020], антифунгальную [Букреева T.B., Шаварда А.Л. Анакардовые кислоты на поверхности цветков и листьев Comarum salesovianum (Rosaceae) // Растительные ресурсы. 2017. Т. 53(3). С. 435-442] и противовирусную активности [Лобанова И.Е., Филиппова Е.И., Кукушкина Т.А., Проценко М.А., Храмова Е.П., Мазуркова Н.А., Высочина Г.И. Сравнительная оценка противовирусной активности экстрактов некоторых высших растений в отношении вируса гриппа A in vitro // Химия в интересах устойчивого развития. 2021 (29). С. 675-682].

Известно изобретение ЗАО "Эвалар" [Патент РФ на изобретение №2200021, опубл. 10.03.2003 г., «Настойка Comarum palustre L., средства на основе Comarum palustre и способ их получения»], в котором предложен способ получения настоек и сухих экстрактов 2-80%-м этиловым спиртом из высушенных корневищ, или травы, или смеси корневищ и травы Сабельника болотного (Comarum palustre L.) как средства для лечения костно-суставных заболеваний.

Известна публикация Жуковой О.Л. и др. [Жукова О.Л., Абрамов А.А., Даргаева Т.Д., Маркарян А.А. Изучение фенольного состава подземных органов Сабельника болотного // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2006. Т. 47(5). С. 342-345], в которой представлены методики приготовления водно-спиртовых извлечений из корневищ Сабельника болотного.

Наиболее близким аналогом по назначению (прототипом) является публикация Лобановой И.Е. и др. об оценке водных и этанольных экстрактов из сухого измельченного сырья из листьев и цветков Comarum salesovianum (Сабельник Залесова), полученных методом ремацерации с последующей фильтрацией экстрактов, проявляющих активность в культуре клеток MDCK в отношении вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) и A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) [Лобанова И.Е., Филиппова Е.И., Кукушкина Т.А., Проценко М.А., Храмова Е.П., Мазуркова Н.А., Высочина Г.И. Сравнительная оценка противовирусной активности экстрактов некоторых высших растений в отношении вируса гриппа A in vitro //Химия в интересах устойчивого развития 29 (2021) 675-682].

Однако в данной работе оценка противовирусной активности проведена только одним методом in vitro, а именно по снижению титра вируса гриппа в присутствии водных и(или) этанольных экстрактов из листьев или цветков Сабельника Залесова. Не были проведены на культуре клеток MDCK исследования по определению 50%-х токсических и вирусингибирующих концентраций сухих экстрактов Сабельника Залесова, полученных из подземных органов растения методами водного, этанольного, этилацетатного и бутанольного извлечений, с последующими удалением растворителей, сушкой и получением экстрактивных веществ, а также не были проведены исследования качественного и количественного состава биологически активных соединений (БАС) сухих экстрактов и противовирусной активности экстрактов в моделях на лабораторных мышах.

Главная проблема при получении более эффективного противовирусного средства состоит в выборе экстрагента и способе получения сухих экстрактов. Методы экстракции и выбор экстрагента влияют на скорость и массу извлечения фенольных соединений из образцов растений. Поэтому выбор подходящего экстрагента и способа получения экстракта имеет важное значение для извлечения целевых фенольных соединений в сумме, по группам и отдельным компонентам.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение арсенала средств с противовирусной активностью в отношении гриппа человека A(H3N2) и птиц A(H5N1) за счет получения экстрактов из корней Сабельника Залесова.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения сухого экстракта из высшего растения Сабельника Залесова (Comarum salesovianum), обладающего противогриппозной активностью, включающем измельчение сырья Сабельника Залесова, получение экстракта методом ремацерации, последующую его фильтрацию и удаление растворителя с получением сухого экстракта, проявляющего активность в отношении РНК-геномного вируса гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1, отличающийся тем, что в качестве сырья используют корни растения Сабельника Залесова, в качестве экстрагента используют очищенную воду или 70%-й водный раствор этанола или этилацетат или н-бутанол в соотношении сухое сырье:экстрагент 1:40 при трехкратном экстрагировании на кипящей водяной бане в течение 30 мин с последовательным уменьшением количества экстрагента на 25% на втором и третьем этапах экстрагирования, объединением полученных экстрактов; фильтрацией, отгонкой экстрагентов, сушкой и получением экстрактивных веществ, причем индекс нейтрализации (ИН) вирусов водными растворами экстрактов из корней Comarum salesovianum в культуре клеток MDCK составляет:

- из этанольного экстракта в концентрации 50,0 мкг/мл в отношении РНК-геномного вируса гриппа субтипа A/H5N1 ИН=2,25 lg и субтипа A/H3N2 ИН= 3,5 lg;

- из водного экстракта в концентрации 500,0 мкг/мл в отношении РНК-геномного вируса гриппа субтипа A/H5N1 ИН=0,75 lg и субтипа A/H3N2 ИН=2,5 lg;

- из этилацетатного экстракта в концентрации 500,0 мкг/мл в отношении РНК-геномного вируса гриппа субтипа A/H5N1 ИН=3,75 lg и субтипа A/H3N2 ИН= 3,5 lg;

- из бутанольного экстракта в концентрации 500,0 мкг/мл в отношении РНК-геномного вируса гриппа субтипа A/H5N1 ИН=2,0 lg и субтипа A/H3N2 ИН=3,0 lg;

индекс селективности (SI), характеризующий противовирусную активность экстрактов из корней Comarum salesovianum в культуре клеток MDCK, составляет:

- этанольного экстракта в отношении РНК-геномного вируса гриппа субтипа A/H5N1 SI=5,08 и субтипа A/H3N2 SI=5,1;

- водного экстракта в отношении РНК-геномного вируса гриппа субтипа A/H5N1 SI=12,26 и субтипа A/H3N2 SI=112,01;

- этилацетатного экстракта в отношении РНК-геномного вируса гриппа субтипа A/H5N1 SI =15,44 и субтипа A/H3N2 SI=10,8;

- бутанольного экстракта в отношении РНК-геномного вируса гриппа субтипа A/H5N1 SI = 4,45 и субтипа A/H3N2 SI=58,59;

а коэффициент защиты К3,%, характеризующий противовирусную активность экстрактов из корней Comarum salesovianum in vivo на мышах в суточной дозе препарата 133,3 мкг/г массы мыши, в отношении РНК-геномного вируса гриппа субтипа A/H5N1 составляет:

- этанольный экстракт - К3=24,9%;

- водный экстракт - К3=8,3%;

- этилацетатный экстракт - К3=8,3%;

- бутанольный экстракт - К3=41,6%.

Ниже приведены примеры заявляемых способов получения противовирусного средства.

Пример 1. Получение сухого экстракта методом этанольного извлечения из корней Comarum salesovianum: 25 г измельченных корней (1-2 мм) экстрагировали 70% этанолом трижды (1:40), последовательно используя 1000 мл, 750 мл и 500 мл экстрагента на кипящей водяной бане по 30 мин. Экстракты объединяли и отфильтровывали через воронку Шотта. Затем фильтрат отгоняли на ротационном испарителе. Остатки фильтрата упаривали досуха при Т=40°С. Выход этанольного экстракта составил 2,41 г, что составляет 9,64% от исходного образца.

Пример 2. Получение сухого экстракта методом водного извлечения из корней Comarum salesovianum: 25 г измельченных корней (1-2 мм) экстрагировали дистиллированной водой трижды (1:40), последовательно используя 1000 мл, 750 мл и 500 мл экстрагента на кипящей водяной бане по 30 мин. Экстракты объединяли и отфильтровывали через воронку Шотта. Затем фильтрат отгоняли на ротационном испарителе. Остатки фильтрата упаривали досуха при Т=40°С. Выход водного экстракта составил 2,20 г, что составляет 8,80% от исходного образца.

Пример 3. Получение сухого экстракта методом этилацетатного извлечения из корней Comarum salesovianum: 25 г измельченных корней (1-2 мм) экстрагировали этилацетатом трижды (1:40), последовательно используя 1000 мл, 750 мл и 500 мл экстрагента на кипящей водяной бане по 30 мин. Экстракты объединяли и отфильтровывали через воронку Шотта. Затем фильтрат отгоняли на ротационном испарителе. Остатки фильтрата упаривали досуха при Т=40°С. Выход этилацетатного экстракта составил 1,04 г, что составляет 4,16% от исходного образца.

Пример 4. Получение сухого экстракта методом бутанольного извлечения из корней Comarum salesovianum: 25 г измельченных корней (1-2 мм) экстрагировали н-бутанолом трижды (1:40), последовательно используя 1000 мл, 750 мл и 500 мл экстрагента на кипящей водяной бане по 30 мин. Экстракты объединяли и отфильтровывали через воронку Шотта. Затем фильтрат отгоняли на ротационном испарителе. Остатки фильтрата упаривали досуха при Т=40°С. Выход бутанольного экстракта составил 1,50 г, что составляет 5,99% от исходного образца.

Пример 5. Содержание биологически активных соединений (БАС) в сухих экстрактах корней Comarum salesovianum.

Определяли содержание БАС в сухих экстрактах корней Comarum salesovianum (табл. 1). Содержание флавонолов и фенолокислот, а также общее содержание фенольных соединений (ФС) выше в сухих экстрактах, экстрагированных водой. Танины в большей мере экстрагировались этилацетатом, катехины и сапонины - бутанолом.

Пример 6. Оценка противовирусной активности водного, этанольного, этилацетатного и бутанольного экстрактов из корней Comarum salesovianum in vitro

Определение максимально переносимых концентраций образцов и изучение их способности подавлять инфекционность вируса гриппа in vitro. При определении токсических концентраций исследуемых образцов исходную концентрацию образца (5000 мкг/мл) разводили в 2; 4; 10; 20; 40; 100; 200 раз средой DMEM, вносили по 100 мкл разведений образцов в лунки 96-луночного планшета с клеточным монослоем (по 4 лунки на каждое разведение образца) и убирали в термостат на 2 сут при температуре 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности. Спустя 2 сут с помощью инвертированного микроскопа производили оценку деструктивных изменений монослоя клеток MDCK, инкубированных с различными концентрациями исследуемого образца. Параллельно, в качестве клеточного контроля, использовали монослой культуры MDCK без внесения препарата. За максимально переносимую концентрацию (МПК) принимали ту концентрацию, при которой не было выявлено цитотоксического эффекта.

Исследование способности растительных образцов влиять на инфекционную активность (титр) вируса гриппа А в монослое клеток было проведено при использовании МПК для данной клеточной культуры. Препарат сравнения озельтамивир карбоксилат был использован в концентрации 100 мкг/мл. В лунки 96-луночных планшетов с клеточным монослоем за 1 ч до заражения вносили по 100 мкл образца, разведенного до необходимой концентрации средой DMEM, содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США). Инфицирование монослоя клеток осуществляли десятикратными разведениями вируса гриппа, приготовленными на этой же среде, в объеме 100 мкл/лунку (по 4 лунки на каждое разведение вируса). Клетки инкубировали 2 сут при температуре 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности. Далее определяли наличие вируса гриппа в культивируемой среде по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% суспензией куриных эритроцитов. Титр вируса гриппа в опыте (с исследуемым образцом), а также в соответствующем контроле (без образца) определяли в lg ТЦД₅₀/МЛ и рассчитывали индекс нейтрализации (ИН), составляющий разницу между титрами вируса в контроле и опыте (lg) [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. Миронова А.Н. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.]. В соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. Миронова А.Н. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.], вещество обладает высокой активностью, если подавляет инфекционность вируса в 100 и более раз (ИН≥2,0 lg).

Определение 50%-х цитотоксических и 50%-х ингибирующих вирус гриппа концентраций образцов in vitro. 50%-е цитотоксические (СС₅₀) и 50%-е вирусингибирующие (IC₅₀) концентрации препаратов определяли колориметрическим методом - изучали изменение оптической плотности (ОП) раствора красителя, поглощенного живыми клетками в монослое культуры клеток MDCK [Smee D.F., Morrison А.С., Barnard D.L., Sidwell R.W. Comparison of colorimetric and visual methods for determining anti-influenza (H1N1 and H3N2) viruses activities and toxicities of compounds. Journal of Virological Methods. 2002; 106: 71-79]. В эксперименте использовали концентрацию 5000 мкг/мл и ряд последовательных 5 кратных разведений фракций экстрактов Сабельника Залесова: в 5, 10, 20, 40, 80 раз средой DMEM (диапазон исследуемых концентраций составлял 8,0÷5000,0 мкг/мл). Препарат сравнения озельтамивир карбоксилат разводили таким же способом, но в диапазоне исследуемых концентраций 0,32÷200,00 мкг/мл.

Для определения СС₅₀ ряд полученных разведений вносили на монослой клеток в объеме 100 мкл/лунку 96-луночного планшета и ставили в термостат при температуре 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности на трое суток. В качестве клеточного контроля использовали интактный монослой (без внесения исследуемого образца).

Для определения IC₅₀ в отношении двух штаммов вируса гриппа А в лунки 96-луночных планшетов с монослоем клеток вносили ряд разведений образцов в объеме 100 мкл/лунку, через два часа инкубирования при температуре 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности добавляли по 100 мкл разведения вируса с множественностью инфицирования (MOI) 100 ТЦД₅₀/клетку. Планшеты помещали в термостат при температуре 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности на трое суток.

Через 3-е суток инкубирования в атмосфере 5% СО₂ при 37°С, культуральную среду удаляли и в каждую лунку планшета вносили витальный (прижизненный) краситель МТТ в объеме 0,75 мл с концентрацией 1 мг/мл, растворенный в ФСБ-Д (фосфатно-солевом буфере Дульбекко). Планшеты инкубировали в течение 90 мин при 37°С, далее удаляли супернатант и вносили 0,1 мл ДМСО. Спустя 10 мин. на многофункциональном спектрофотометре xMark Microplate Absorbance Reader (США) в 96-луночных планшетах при длине волны 540 нм измеряли ОП, которая является показателем количества жизнеспособных клеток в монослое, сохраненных при цитопатическом действии вируса или цитотоксическом эффекте образца.

Результаты измерения ОП в зависимости от концентрации препарата представляли в полулогарифмической системе координат и рассчитывали СС₅₀ (мкг/мл) и IC₅₀ (мкг/мл) препарата при помощи компьютерной программы SoRMaxPro-4.0. СС₅₀ - это концентрация вещества в питательной среде, при которой разрушаются (теряют жизнеспособность) 50% клеток в неинфицированном монослое. IC₅₀ - это концентрация вещества в питательной среде, при которой не разрушаются (остаются жизнеспособными) 50% клеток в инфицированном монослое. На основании этих показателей рассчитывали индекс селективности (SI) исследуемого образца: SI=СС₅₀ (мкг/мл) : IC₅₀ (мкг/мл). Активными считаются соединения с SI выше 8 [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. Миронова А.Н. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.].

Пример 7. Результаты противовирусной активности водного, этанольного, этилацетатного и бутанольного экстрактов из корней Comarum salesovianum in vitro

Пример 8. Результаты противовирусной активности водного, этанольного, этилацетатного и бутанольного экстрактов из корней Comarum salesovianum in vivo

Изучение противовирусных свойств экстрактов Сабельника Залесова на модели гриппозной инфекции, вызванной вирусом гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005(H5N1)

Материалы и методы

Лабораторные животные. В работе были использованы разнополые аутбредные мыши ICR массой 15-17 г., полученные из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Мышей содержали на стандартном рационе, со свободным доступом к воде и корму.

Исследуемые препараты. В эксперимент по исследованию противовирусных свойств экстрактов Сабельника Залесова на модели гриппозной инфекции, вызванной вирусом гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) использованы следующие образцы: Сабельник Залесова С Comarum salesovianum (этанольный экстракт), Сабельник Залесова Comarum salesovianum (водный экстракт), Сабельник Залесова Comarum salesovianum (этилацетатный экстракт), Сабельник Залесова Comarum salesovianum (бутанольный экстракт).

Препарат сравнения. В качестве референс-препарата использовали Тамифлю («Ф. Хоффманн - Ля Рош Лтд.», Швейцария).

Вырусы. Для оценки противовирусной активности экстрактов на лабораторных животных использовали штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005(H5N1), полученный из Государственной коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора.

Метод оценки противовирусной активности образцов на мышах

Мышей инфицировали интраназально, используя изофлурановую наркотизацию, при введении в обе ноздри суммарно 40 мкл штамма вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005, в дозе 10 ЛД₅₀. Препараты экстрактов в объеме 200 мкл/гол. перорально вводили за 1 час до заражения и далее 2 раза в день. Тамифлю в объеме 200 мкл/гол. перорально вводили через 1 час после заражения ВГ и далее 2 раза в день. Препараты экстрактов и Тамифлю вводили в течение 5 суток: в день заражения и далее в течение 4 суток после заражения вирусом гриппа. В группах, принимавших растворы экстрактов и Тамифлю, а также в контрольной (зараженной) группе было по 12 голов. За животными вели наблюдение в течение 16 дней, учитывая их гибель. По истечении срока эксперимента высчитывали процент гибели мышей, коэффициент защиты и среднюю продолжительность их жизни (СПЖ). Коэффициент защиты (КЗ) рассчитывали по формуле: % гибели в контроле - % гибели в опыте.

Статистическая обработка данных. При расчетах 50%-й летальной дозы и титров вируса гриппа в биологических образцах использовали метод Спирмана-Кербера. Для нескольких повторов определяли среднее значение показателя (М) и ошибку среднего (m).

Пример 9. Результаты противовирусной активности водного, этанольного, этилацетатного и бутанольного экстрактов из корней Comarum salesovianum in vivo

Таким образом, результаты, представленные в примерах 9-13, показывают достижение заявляемого технического результата, состоящего в получении сухих экстрактов (этанольного, водного, этилацетатного, бутанольного) из корней высшего растения Сабельника Залесова (Comarum salesovianum), обладающего высокой активностью против вируса гриппа человека A(H3N2) и птиц A(H5N1) не только по показателям индекса нейтрализации, но и по показателям индекса селективности в культуре клеток MDCK, а также по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни мышей по сравнению с прототипом.

Кроме того, определение содержания биологически активных соединений экстрактов (этанольного, водного, этилацетатного, бутанольного) из корней Сабельника Залесова позволяет контролировать характеристики указанных растительных образцов.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения сухого экстракта из высшего растения Сабельника Залесова (Comarum salesovianum), обладающего противогриппозной активностью. Способ получения сухого экстракта из высшего растения Сабельника Залесова (Comarum salesovianum), обладающего противогриппозной активностью, включающий измельчение сырья Сабельника Залесова, получение экстракта методом ремацерации, последующую его фильтрацию и удаление растворителя с получением сухого экстракта, проявляющего активность в отношении РНК-геномного вируса гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1, при этом в качестве сырья используют корни растения Сабельника Залесова, в качестве экстрагента используют очищенную воду, или 70%-ный водный раствор этанола, или этилацетат, или н-бутанол в соотношении сухое сырье : экстрагент 1:40 при трехкратном экстрагировании на кипящей водяной бане в течение 30 мин с последовательным уменьшением количества экстрагента на 25% на втором и третьем этапах экстрагирования, объединением полученных экстрактов; фильтрацией, отгонкой экстрагентов и сушкой с получением экстрактивных веществ. Вышеописанный способ позволяет расширить арсенал средств с противовирусной активностью в отношении вируса гриппа человека A(H3N2) и птиц А(H5N1). 4 табл., 9 пр.

Способ получения сухого экстракта из высшего растения Сабельника Залесова (Comarum salesovianum), обладающего противогриппозной активностью, включающий измельчение сырья Сабельника Залесова, получение экстракта методом ремацерации, последующую его фильтрацию и удаление растворителя с получением сухого экстракта, проявляющего активность в отношении РНК-геномного вируса гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1, отличающийся тем, что в качестве сырья используют корни растения Сабельника Залесова, в качестве экстрагента используют очищенную воду, или 70%-ный водный раствор этанола, или этилацетат, или н-бутанол в соотношении сухое сырье : экстрагент 1:40 при трехкратном экстрагировании на кипящей водяной бане в течение 30 мин с последовательным уменьшением количества экстрагента на 25% на втором и третьем этапах экстрагирования, объединением полученных экстрактов; фильтрацией, отгонкой экстрагентов и сушкой с получением экстрактивных веществ.