Штамм бактерий Escherichia coli со сниженной способностью накапливать ацетат - продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин гларгин Российский патент 2023 года по МПК C12N1/21 C07K14/62 C07K19/00 A61K38/28 A61P3/10 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к штамму-продуценту проинсулина инсулина гларгин Escherichia coli BL21-74/pF644 с низким содержанием ацетата при культивировании.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Сахарный диабет - одна из самых распространенных хронических болезней. По прогнозам ВОЗ в 21 веке диабет приобретет эпидемический характер. К 2030 году прогнозируется рост их числа больных диабетом до 552 миллионов и выход диабета на седьмое место среди причин смертности в мире. Более 80% пациентов, умерших за год, от диабета и его осложнений происходят из стран с низким или средним уровнем благосостояния населения. При этом заболеваемость в развитых странах выше, чем в развивающихся.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения Российская Федерация входит в десятку стран с наибольшим числом больных диабетом с тенденцией к увеличению этого числа. К 2025 году ВОЗ прогнозирует увеличение этого числа до 12,2 миллионов.

Сахарный диабет связан с колоссальными экономическими потерями практически во всех странах мира. В среднем, из всех мировых расходов на здравоохранение на диабет приходится около 12%. Экономические потери, связанные с диабетом, составляют в России около 3,12 млрд. долларов США в год. К 2030 году эта сумма может увеличиться до 3,35 млрд.

Главным направлением лечения больных с инсулинозависимым сахарным диабетом является заместительная инсулинотерапия. Инсулин является наиболее действенным гипогликемическим агентом, применяемым в настоящее время в клинике. За время своего существования препараты инсулина прошли эволюцию от природного инсулина, добываемого из поджелудочной железы домашних животных до рекомбинантных препаратов и аналогов человеческого инсулина, к которым относится инсулин гларгин.

Препараты животного происхождения к настоящему времени вышли из употребления. Основными препаратами инсулина на сегодняшний день являются рекомбинантные инсулины и аналоги (см., например, BOLLI G.B. et al., Insulin glargine, The Lancet, 2000, V.356, N.9228, p.443-445).

В норме пики выделения инсулина непосредственно связаны с приемом пищи. Между приемами пищи уровень эндогенного инсулина находится на базальном уровне. У здорового человека приблизительно 50% выделяемого за сутки инсулина является базальным (NAKASHIMA E. et al., Efficacy and safety of stepwise introduction of insulin lispro mix 50 in Japanese patients with type 2 diabetes inadequately controlled by oral therapy, Endocrine journal, 2013, V.60, N.6, p.763-772). Поэтому применение одного инсулина короткого действия недостаточно для воспроизведения физиологической гликемической кривой. Для этого используется инсулин короткого действия в сочетании с пролонгированным препаратом. Было показано, что применение аналогов человеческого инсулина длительного действия, например инсулина гларгин, позволяет в значительной степени воспроизвести естественную кривую активности базального инсулина, чего, обычно, не удается добиться с помощью инсулина НПХ (BOLLI G.B. et al., 2000).

Аминокислотная последовательность инсулина гларгин отличается от последовательности инсулина человека заменой остатка аспарагина в положении 21 А-цепи на глицин (GlyA21) и наличием двух дополнительных остатков аргинина в С-концевой части В-цепи (ArgB31, ArgB32) (LEVIEN T.L. et al., Insulin glargine: a new basal insulin, Annals of Pharmacotherapy, 2002, V. 36, N. 6, p.1019-1027).

Эти модификации, а также добавление в препарат небольшого количества ионов цинка, улучшают стабильность препарата и повышают изоэлектрическую точку аналога с 5,4 до 6,7, что приводит к уменьшению растворимости препарата в нейтральной среде подкожной клетчатки. Инсулин гларгин хорошо растворим при рН 4,0. Кислый раствор препарата нейтрализуется при подкожных инъекциях, и этот аналог инсулина, который ex vivo представляет собой прозрачный раствор, образует микропреципитаты, из которых происходит медленное высвобождение гексамеров инсулина и их диссоциация с образованием ди- и мономеров. Благодаря этим свойствам препарат медленно всасывается из подкожной ткани в кровоток, не обладает выраженным пиком действия и обеспечивает практически постоянную базальную концентрацию гормона в крови в течение суток. Добавление ионов цинка в препарат также замедляет процесс освобождения димеров и мономеров, что увеличивает время действия аналога (DUNN C.J. et al., Insulin glargine: an updated review of its use in the management of diabetes mellitus, Drugs, 2003, V.63, N.16, p.1743-1778).

После подкожного введения, как уже отмечалось ранее, начало действия инсулина гларгин наступает примерно через 1 час. Средняя продолжительность действия составляет 24 часа, а максимальная - 29 часов. При однократном ежедневном подкожном введении препарата устойчивая средняя концентрация этого аналога в крови достигается через 2-4 суток после введения первой дозы (BOLLI G.B. et al., 2000).

В настоящее время наиболее перспективной является технология получения инсулина и инсулиновых аналогов с использованием методологии экспрессии гена проинсулина человека в клетках Escherichia coli в составе гибридных белков в виде нерастворимых "телец включения" (БАИРАМАШВИЛИ Д. И., Генноинженерный инсулин человека: успехи и перспективы, Российский химический журнал, 2005, V.49, N.1, с.34).

Одним из факторов, лимитирующих накопление биомассы и гибридного белка, является накопления ацетата в культуральной жидкости (TAKAHASHI C.M. et al., Effects of acetate on the growth and fermentation performance of Escherichia coli KO11, Applied biochemistry and biotechnology, 1999, V.81, p.193-203).

В Escherichia coli ацетат является основным продуктом метаболизма как в аэробных, так и в анаэробных условиях роста. Ацетат может подавлять синтез ДНК, РНК, белков, липидов и пептидогликанов (KIM T.S. et al., Reduction of acetate and lactate contributed to enhancement of a recombinant protein production in E. coli BL21, Journal of Microbiology and Biotechnology, 2015, V.25, N.7, p.1093-1100).

В фазе экспоненциального роста, например, во время культивирования с глюкозой, ацетат преимущественно образуется из ацетил-коэнзима А (ацетил-КоА) с помощью ферментов фосфат-ацетилтрансферазы (продукта гена pta) и ацетат-киназы (продукта гена ackA) (SCHÜTZE A. et al., The impact of ackA, pta, and ackA-pta mutations on growth, gene expression and protein acetylation in Escherichia coli K-12, Frontiers in Microbiology, 2020, V.11, p.233). В результате этого метаболического пути из ацетил-КоА, АДФ и неорганического фосфата образуется ацетат и АТФ.

В анаэробных условиях ацетат представляет собой основной продукт смешанного кислотного брожения. Продукт гликолиза пируват превращается в ацетил-КоА и формата с помощью фермента пируватформатлиазы (продукта гена PFL) (SAWERS G. et al., Anaerobic regulation of pyruvate formate-lyase from Escherichia coli K-12, Journal of bacteriology, 1988, V. 170, N. 11, p.5330-5336). Ацетил-КоА, образующийся в результате этой реакции, может быть преобразован в либо ацетат по пути генерации АТФ, либо в этанол при потреблении NADH.

Одним из способов снижения накопления ацетата является повышение экспрессии гена E. coli Mlc, регулятора экспрессии генов транспорта и метаболизма глюкозы.

Ген Mlc (Made large colony) регулирует экспрессию оперона глюкозо-фосфотрансферазной системы (PTS), который производит ферменты для захвата глюкозы (PLUMBRIDGE J., Regulation of gene expression in the PTS in Escherichia coli: the role and interactions of Mlc, Current opinion in microbiology, 2002, V.5, N.2, p.187-193).

Центральными игроками в регуляции углеродного катаболита в E. coli являются транскрипционный активатор Crp (белок-рецептора цAMP); сигнальный метаболит cAMP, аденилатциклаза (Cya) и гены фосфотрансферазной системы (PTS), участвующие в транспорте и фосфорилировании углеводов. PTS в E. coli состоит из двух цитоплазматических белков, EI (фермент I, продукт гена ptsI) и HPr (гистидин-фосфорилируемый белок, продукт гена ptsH, а также углевод-специфических комплексов EII (фермент II).

Глюкозоспецифическая фосфотрансферазная система E. coli состоит из цитоплазматического белка EIIAGlc, кодируемого геном crr, и мембраносвязанного белка EIICBGlc, кодируемого ptsG, которые транспортируют и одновременно фосфорилируют глюкозу. Фосфорильные группы переносятся от фосфоенолпирувата (PEP) посредством каскадных реакций фосфорилирования на глюкозу.

Комплекс cAMP-Crp и репрессор Mlc участвуют в регуляции экспрессии гена ptsG и pts оперона. При отсутствии глюкозы Mlc связывается с операторными областями генов ptsG, mlc, manXYZ, malT, ptsHI и crr и предотвращает транскрипцию. Если глюкоза присутствует в среде, количество нефосфорилированного EIICBGlc увеличивается за счет переноса фосфатов на глюкозу. В этой ситуации Mlc связывается с EIICBGlc и, таким образом, операторные области генов фосфотрансферазной системы (PTS) освобождаются и, тем самым, активируется их транскрипция (SHIMIZU K., Metabolic regulation of a bacterial cell system with emphasis on Escherichia coli metabolism, International Scholarly Research Notices, 2013, V. 2013).

Увеличение уровня экспрессии гена Mlc потенциально может приводить к снижению транспорта глюкозы и, как следствие, снижению избыточного накопления ацетил-КоА, переводя его катаболизм преимущественно через цикл трикарбоновых кислот. В результате путь образования ацетата задействуется в меньшей степени.

Таким образом, для обеспечения доступной инсулинозаместительной терапии необходимы новые высокоэффективные штаммы-продуценты инсулина и его аналогов, в том числе гларгина, со сниженной способностью накапливать ацетат.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Все термины и сокращения, используемые в настоящей заявке, употребляются в том же значении, как это принято в данной области техники, и понятны специалистам.

Настоящее изобретение относится к штамму-продуценту проинсулина инсулина гларгин Escherichia coli BL21-74/pF644, а также к способу получения инсулина гларгин, который может быть использован в качестве лекарственного средства.

Термины «белок», «пептид» и «полипептид» использованы взаимозаменяемо.

Термин «инсулин» для целей настоящего изобретения означает гормон инсулин человека. Инсулин человека содержит две полипептидные цепи: А-цепь и В-цепь. А-цепь представляет собой пептид из 21 аминокислоты (SEQ ID NO:1), а В-цепь - пептид из 30 аминокислот (SEQ ID NO:2), при этом две цепи соединены дисульфидными мостиками: первый мостик образован между цистеином в положении 7 в А-цепи и цистеином в положении 7 в В-цепи и второй мостик - между цистеином в положении 20 в А-цепи и цистеином в положении 19 в В-цепи. Третий мостик расположен между цистеинами в положениях 6 и 11 в А-цепи.

Термин «аналог инсулина» для целей настоящего изобретения означает модифицированный инсулин, в котором один или несколько аминокислотных остатков инсулина были заменены другими аминокислотными остатками, и/или в котором один или несколько аминокислотных остатков были удалены из инсулина, и/или в котором один или несколько аминокислотных остатков были добавлены и/или вставлены в инсулин. Примерами аналогов инсулина являются инсулин-аспарт (то есть инсулин человека AspB28) и инсулин-лизпро (то есть инсулин человека LysB28, РгоВ29), инсулин-глулизин (LysB3, GluB29 человеческий инсулин) и инсулин гларгин (Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)- инсулин) и другие.

Термины «инсулин» и «аналог инсулина» могут использоваться в настоящем изобретении взаимозаменяемо.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, форма которого способствует эффективному проявлению биологической активности активного ингредиента, содержащегося в нем, и который не содержит никаких дополнительных компонентов, являющихся неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет введена данная композиция.

Использованный в данном описании термин «лечение» (а также «терапия») относится к клиническому воздействию в попытке изменить естественное течение болезни у подвергаемого лечению индивидуума, и оно может быть проведено либо с целью профилактики, либо в процессе курса лечения клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, но не ограничиваются этим, предупреждение возникновения или рецидива заболевания, облегчение симптомов, сведение к минимуму любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности симптомов или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию или улучшенный прогноз.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к штамму-продуценту проинсулина инсулина гларгин Escherichia coli BL21-74/pF644, а также к способу получения аналога инсулин гларгин, который может быть использован в качестве лекарственного средства для лечения диабета I типа и диабета II типа.

В одном из предпочтительных воплощений настоящего изобретения инсулин гларгин содержит A-цепь, которая имеет аминокислотную последовательность c SEQ ID NO:3, и B-цепь, которая имеет аминокислотную последовательность c SEQ ID NO:4.

В одном из предпочтительных воплощений настоящего изобретения проинсулин инсулина гларгин содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO:5.

Штамм-продуцент инсулина гларгин Escherichia coli BL21-74/pF644 был депонирован в Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ, Российская Федеpация, 142290, Московская область, г. Пущино, пр-кт Науки, 5) под NO: VKM B-3695D 17.02.2023.

Настоящее изобретение также относится к способу получения инсулина гларгин, включающему культивирование штамма-продуцента Escherichia coli BL21-74/pF644 в подходящих для экспрессии проинсулина инсулина гларгин условиях.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ получения инсулина-гларгин включает получение проинсулина в телах включения клеток штамма-продуцента.

В дальнейшем проинсулин подвергают концентрированию, например, с помощью тангенциальной проточной фильтрации или диафильтрации. Затем проинсулин ферментативно расщепляют протеазой.

В одном из вариантов осуществления изобретения пептидное расщепление осуществляется посредством ферментативного гидролиза с использованием трипсина.

В одном из вариантов осуществления изобретения проинсулин может быть слит с лидерным полипептидом, например, посредством пептидного линкера.

Состав и длину линкера можно определять с помощью методов, хорошо известных в данной области и можно оценивать их эффективность.

После расщепления трипсином полученный инсулин-гларгин может быть очищен хроматографическим способом.

В одном из вариантов настоящего изобретения способ получения инсулина-гларгин, может включать продолжительное культивирование бактериального продуцента белка-предшественника инсулина-гларгин, где культивирование продуцента проводят в биореакторе в режиме перфузии клеточной биомассы через половолоконные мембраны с непрерывным питанием питательными средами.

В одном из вариантов настоящего изобретения предложен способ получения фармацевтической композиции на водной основе для лечения диабета I типа и II типа у пациента, включающей в себя 300 Ед/мл инсулина-гларгин, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli BL21-74/pF644 в подходящих для экспрессии проинсулина инсулина гларгин условиях.

В одном из вариантов настоящего изобретения предложено применение штамма Escherichia coli BL21-74/pF644 по изобретению для получения фармацевтической композиции на водной основе для лечения диабета I типа и II типа у пациента, включающей в себя 300 Ед/мл инсулина-гларгин.

В одном из вариантов фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно включает одно или несколько вспомогательных веществ, выбранных из глицерина, оксида цинка, соляной кислоты, метакрезола или гидроксида натрия. В одном из вариантов способ по изобретению используют в промышленном масштабе получения фармацевтических композиций инсулина.

Фармацевтическая композиция может содержать вспомогательные вещества, в том числе, сурфактанты, например, неионные сурфактанты. Особенно предпочтительны фармацевтически общепринятые сурфактанты, такие как, например, частичные сложные эфиры и сложные эфиры жирных кислот, простые эфиры многоатомных спиртов, таких как глицерин, сорбит и др. Сурфактанты могут быть представлены в фармацевтической композиции в концентрации 5-200 мг/мл. В одном из вариантов осуществления изобретения, сурфактант представляет собой глицерин в концентрации от 10 до 30 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления изобретения глицерин представлен в фармацевтической композиции в концентрации 17 мг/мл.

Средство может дополнительно содержать консерванты (например, фенол, метакрезол, p-крезол, парабены), изотонические агенты (например, маннит, сорбит, лактоза, декстроза, трегалоза, хлорид натрия, глицерин), буферные вещества, соли, кислоты и щелочные металлы, а также другие эксципиенты. Указанные вещества могут быть представлены в каждом случае индивидуально или альтернативно в виде смесей.

В одном из вариантов осуществления изобретения, фармацевтическая композиция содержит метакрезол в концентрации 1-20 мг/мл. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит метакрезол в концентрации 2,7 мг/мл.

В одном из вариантов осуществления изобретения, фармацевтическая композиция содержит цинк. Концентрация цинка в фармацевтической композиции находится в диапазоне то 0 до 1 мг/мл. Цинк может быть представлен в форме хлорида цинка, но соль не ограничивается хлоридом цинка. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хлорида цинка составляет от 0 до 2 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация хлорида цинка составляет 0,19 мг/мл.

В одном из вариантов осуществления изобретения, фармацевтическая композиция на водной основе может содержать 0,19/мл хлорида цинка, 2,7 мг/мл метакрезола и 17 мг/мл глицерина. Значение pH фармацевтической композиции на водной основе составляет от 3,4 до 4,6, предпочтительно 4.

В одном из вариантов осуществления изобретения значение pH фармацевтической композиции может регулироваться путем добавления соляной кислоты и/или гидроксида натрия. В одном из вариантов осуществления изобретения pH фармацевтической композиции может регулироваться путем добавления 2 M раствора соляной кислоты и/или 2 M раствора гидроксида натрия.

В том случае, когда в настоящем изобретении указывается диапазон содержания какого-либо компонента в композиции, это означает, что включено каждое конкретное значение, находящееся внутри указанного диапазона. Например, диапазон от 10 до 30 мг/мл включается каждое значение 10; 10,1; 10,2 и так далее вплоть до 29,9 и 30,00 мг/мл.

Полученный штамм-продуцент Escherichia coli BL21-74/pF644 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: Клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, размером 1x3,5 мкм, подвижные, с хорошо различимыми тельцами включения после индукции синтеза гибридного белка.

Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением.

Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при температуре 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к канамицину (до 100 мг/мл).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Динамика накопления ацетата в процессе ферментации штамма BL21-74/pF644 в сравнении с исходным штаммом BL21/pF644.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, но не ограничивается ими.

Для получения штамма-продуцента гибридного полипептида с проинсулином гларгин электрокомпетентные клетки штамма реципиента Escherichia coli BL21-74, в котором нативный промотор гена mlc заменен на конституитивный Tac-промотор, с целью снижения накопления ацетата в процессе высокоплотной ферментации, трансформировали рекомбинантной плазмидной ДНК pF644 методом электропорации (см., например, LESSARD J.C., Transformation of E. coli via electroporation, Methods Enzymol, 2013, V.529, p.321-327) и высевали на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл канамицина.

Пример 1. Получение штамма BL21-74/pF644 для производства гибридного белка, предшественника инсулина гларгин.

Модификация промотора гена mlc, в котором нативный промотор гена mlc заменен на конституитивный Tac-промотор, проводилась посредством Red рекомбинации с pRed/ET (Gene Bridges, Гейдельберг, Германия), где финальный ПЦР продукт, содержал фланкирующие области, гомологичные области mlc промотора геномной ДНК, ген устойчивости к антибиотику тетрациклин и FRT- сайты для сайт специфической рекомбинации, опосредованной Flp- рекомбиназой для элиминации гена устойчивости к антибиотику.

Колонии с требуемой геномной модификацией отбирались на среде с антибиотиком тетрациклин и проверялись с помощью ПЦР и секвенирования.

После этого, ген устойчивости к антибиотику тетрациклин был удален из хромосомы после трансформации клеток плазмидой для экспрессии сайт-специфичной рекомбиназы FLP. Клоны отбирались и перепечатывались на среды, содержащие и не содержащие антибиотик. Клоны, потерявшие селективный маркер, тестировались с помощью ПЦР и секвенинирования. Для дальнейшей работы был отобран клон BL21-74.

Для получения штамма-продуцента гибридного полипептида с проинсулином гларгин электрокомпетентные клетки штамма реципиента Escherichia coli BL21-74 трансформировали рекомбинантной плазмидной ДНК pF644 методом электропорации и высевали на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл канамицина.

Полученные колонии трансформантов характеризовали по культурально-морфологическим признакам и оценивали продуктивность каждого клона по гибридному белку. Для оценки продуктивности проводили выращивание при температуре (37 ± 2)°С в жидкой питательной среде с канамицином в концентрации 50 мкг/мл в течение 2-3 часов до момента достижения оптической плотности OD600 0,5-1, после чего вносили индуктор экспрессии изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) и вели культивирование ещё 4 часа. Продуктивность каждого клона оценивали с помощью капиллярного гель-электрофореза.

Критериями выбора первоначального клона предварительного клеточного банка (ПБК) являлись стабильность генетической конструкции, продуктивность штамма, стабильность штамма при многократных пересевах и культурально-морфологические свойства штамма.

Полученный в результате отбора штамм-продуцент инсулина гларгин Escherichia coli BL21-74/pF644 был депонирован в Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ, Российская Федеpация, 142290, Московская область, г. Пущино, пр-кт Науки, 5) под NO: VKM B-3695D 17.02.2023.

Пример 2. Исследование количества ацетата в процессе ферментации штамма BL21-74/pF644 в сравнении с штаммом BL21/pF644.

Ферментации проводили в течение 6 часов после внесения индуктора. В ходе ферментации отбирали пробы на измерение содержания ацетата.

Культивирование штамма-продуцента проводили в биореакторах Infors (Швейцария) с рабочим объемом 0,5 л. Состав среды: пептон комплекс - 60 г/л, дрожжевой экстракт - 60 г/л, глюкоза - 4 г/л, Сульфат магния гептагидрат - 2,2 мМ, антибиотик канамицин - 50 мг/л. Стартовые условия перемешивания: 400 об/мин, аэрация - 3 л/мин. Значения PO₂, температуры культивирования и рН устанавливали 30%, 37°С и 7,0 ед, соответственно. Ферментации проводили до истощения глюкозы в среде (начало роста значений рН) и затем подключали раствор 55% глюкозы в режиме рН-стат. В ходе ферментации отбирали пробы на измерение содержания ацетата. Результаты представлены на Фиг.1.

Пример 3. Определение продуктивности штамма-продуцента гибридного полипептида.

Индивидуальной колонией клеток штамма E. coli BL21, содержащей плазмиду pF644, инокулировали 2 мл LB среды, содержащей канамицин в концентрации 50 мкг/мл, растили в термошейкере при 37°С в течение 22 часов при перемешивании (170 об./мин). После измерения оптической плотности OD₆₀₀ ночной культуры засевали 40 мл жидкой среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина (ODстартовая₆₀₀ = 0,1) и растили 1-2 часа при 37°С на шэйкере-инкубаторе при перемешивании (180 об/мин) до достижения оптической плотности OD₆₀₀ = (0,8 ± 0,2). 20 мл культуры переносили в другую колбу (контроль без индукции), к оставшимся 20 мл добавляли 10 мкл 1М ИПТГ (конечная концентрация ИПТГ - 0,5 мМ). После 4 часов инкубирования на шэйкере-инкубаторе при перемешивании (180 об/мин) клеточные культуры центрифугировали (15 мин, 3000 об/мин), определяли массу влажного осадка клеток, замораживали. Содержание гибридного полипептида в % от массы влажного осадка измеряли методом капиллярного электрофореза. Оно составило не ниже 4,5%, а в индивидуальных экспериментах более 5% от массы влажного осадка клеточной биомассы.

Пример 4. Получение фармацевтической композиции инсулина гларгина 300 ед/мл.

Для получения фармацевтической композиции инсулина гларгина 300 ед/мл субстанцию, полученную в процессе культивирования клеток штамма Escherichia coli BL21-74/pF644, в количестве 3900 г заливают водой оставляют для набухания, затем подтитровывают до рН 3,0-3,5. К раствору инсулина-гларгина приливают 5525 г глицерина. 10,9 г оксида цинка растворяют в растворе соляной кислоты 10,0%. Готовят раствор для розлива: последовательно вносят навеску метакрезола в количестве 877, г, раствор оксида цинка, приливают раствор инсулина-гларгина с глицерином и добавляя раствор соляной кислоты 10,0% или 0,1 М раствор гидроксида натрия, доводя до рН от 3,5 до 4,5. Полученный раствор фильтруют через каскад фильтров с рейтингом от 0,45 до 0,22 мкм и разливают в картриджи с получением фармацевтической композиции инсулина гларгина 300 ед/мл. Приготовленного количества раствора достаточно для розлива 100000 картриджей вместимостью 3,0 мл или 200000 вместимостью 1,5 мл.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к штамму-продуценту проинсулина инсулина гларгин Escherichia coli BL21-74/pF644 с низким содержанием ацетата при культивировании. Предложенный штамм может быть использован для получения фармацевтических композиций и готовых лекарственных препаратов с увеличенным содержанием действующего вещества. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.

1. Штамм-продуцент проинсулина инсулина гларгин Escherichia coli BL21-74/pF644, депонированный в Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) под NO: VKM B-3695D.

2. Штамм-продуцент по п.1, где проинсулин содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 5.

3. Применение штамма-продуцента по п. 1 для получения фармацевтической композиции на водной основе для лечения диабета I типа и II типа у пациента, включающей в себя 300 Ед/мл инсулина гларгин.

4. Применение по п. 3, где композиция включает одно или несколько вспомогательных веществ, выбранных из глицерина, оксида цинка, соляной кислоты, метакрезола или гидроксида натрия.