Применение 5-пентадецилрезорцинола для повышения доли Akkermansia muciniphila в микробиоме человека Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 A61K31/05 A61P43/00 A61P37/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, а именно к применению 5-пентадецилрезорцинола для повышения доли Akkermancia muciniphilia в микробиоме человека, включая микробиому кишечника.

Предшествующий уровень техники

Akkermancia muciniphila - представитель семейства Verrucomicrobia. С тех пор, как два десятилетия назад была обнаружена и охарактеризована Akkermansia muciniphila, многочисленные исследования показали, что отсутствие или уменьшение количества этой комменсальной бактерии было связано с множеством заболеваний (таких как ожирение, диабет, стеатоз печени, воспаление и ответ на иммунотерапию рака). Хотя в основном они основаны на простых ассоциациях, в настоящее время все больше исследований переходят от корреляций к причинно-следственным связям. Причинно-следственные доказательства были получены на различных моделях животных, проведенных в разных лабораториях, а недавно также были обобщены в испытании на людях для проверки концепции (1).

Нарушения обмена веществ, включая ожирение, СД2, неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП) и сердечно-сосудистые заболевания, связаны со снижением численности Akkermansia spp. в исследованиях на грызунах и людях (3-8),

Akkermansia muciniphila нацелена на клетки кишечника хозяина и способствует регуляции барьерной функции кишечника, выработке противомикробных пептидов, иммунной регуляции, толщине слизистого слоя и регуляции воспаления. A. muciniphila регулирует митохондриальную активность, термогенез, воспаление, метаболизм липидов и глюкозы, что влияет на метаболическое здоровье.

У мышей Akkermansia muciniphila увеличивает количество бокаловидных клеток, выработку слизи и дифференцировку стволовых клеток в секреторные. Короткоцепочечные жирные кислоты, продуцируемые A. muciniphila, связываются с FFAR3-FFAR2 (также известными как GPR43-GPR41), чтобы стимулировать секрецию GLP1 и GLP2, способствуя тем самым регуляции метаболизма глюкозы и барьерной функции кишечника. Короткоцепочечные жирные кислоты также стимулируют выработку слизи. In vitro белок 9 (P9) и соединения внешней мембраны A. muciniphila (Amuc-1100) связываются с ICAM2 и Toll-подобным рецептором 2 (TLR2) соответственно. Активируя энтероэндокринные L-клетки, P9 стимулирует секрецию GLP1 как у мышей, так и у моделей in vitro. У мышей A. muciniphila и P9 стимулируют секрецию IL-6 энтероцитами и макрофагами, что, в свою очередь, стимулирует секрецию GLP1 L-клетками. У мышей и у людей A. muciniphila стимулирует выработку специфических биоактивных липидов из эндоканнабиноидной системы (2-OG, 1-PG/2-PG) клетками-хозяевами, и было показано in vitro и на мышах, что в конечном итоге это способствует стимуляции GLP1 и/или GLP2 и активирует ядерный рецептор PPARα, участвующий в регуляции воспаления и окисления жирных кислот. В контексте рака или воспалительных заболеваний кишечника A. muciniphila и Amuc_1100 регулируют дифференцировку иммунных клеток у мышей. Например, A. Muciniphila уменьшает развитие опухоли и увеличивает ответ на блокаду анти-PD1 за счет увеличения количества цитотоксических Т-клеток и регуляторных Т-клеток (T_reg). Как A. muciniphila, так и Amuc_1100 увеличивают дифференцировку клеток T_reg в толстой кишке. A. muciniphila снижает секрецию нескольких провоспалительных цитокинов, одновременно увеличивая продукцию IL-10 в различных моделях мышей.

Инокуляция A. muciniphila мышам с рассеянным склерозом приводит к уменьшению оценки заболевания, уменьшению демиелинизации потери аксонов и увеличению популяции клеток T_reg(9). Сходным образом, в экспериментальной мышиной модели рассеянного склероза был показан защитный эффект препарата metformin, который также увеличивает обилие A. muciniphila (10).

Боковой амиотрофический склероз является еще одним нейродегенеративным заболеванием, симптомы которого ослабевают после введения A. muciniphila на животных моделях (11); авторы связали этот защитный эффект с высвобождением никотинамида A. muciniphila (11).

A. muciniphila является многообещающим кандидатом для усиления клинического ответа на иммунотерапию ингибиторами контрольных точек. Введение штамма A. muciniphila улучшало противоопухолевую активность после лечения агентами против PD1 как у стерильных мышей, которым трансплантировали стул от нереспондеров, так и у мышей, предварительно подвергшихся воздействию антибиотиков.

A. muciniphila Muc ^T может улучшать барьерную функцию кишечника путем восстановления толщины слоя слизи у мышей, а также кишечной экспрессии антимикробного пептида Reg3g, которые оба изменяются при ожирении и метаболических нарушениях(12). Позже увеличение толщины слизистого слоя, наблюдаемое при добавлении A. muciniphila Muc ^T, было связано с увеличением количества клеток, продуцирующих слизь, у мышей (13).

Старение является еще одним состоянием, при котором сообщалось о снижении кишечного барьера и усилении воспаления (14). Интерес к изучению роли A. muciniphila в старении был вызван различными исследованиями на людях, в которых сообщалось о более низкой распространенности A. muciniphila у пожилых здоровых людей (> 65 лет), чем у более молодых взрослых (< 50 лет) и долгожителей (15-17).

В целом эти исследования на мышах показали, что введение A. muciniphila Muc ^T улучшало некоторые возрастные изменения, включая воспаление, целостность барьера и поведение.

Подтверждено, что введение Muc ^T A. muciniphila возможно, безопасно и хорошо переносится людьми с метаболическим синдромом, о чем свидетельствует тот факт, что любые изменения маркеров, связанных с воспалением, гематологической функцией, функцией почек, печени и мышц, наблюдались при использовании любой формы A. muciniphila Muc ^T. (18, 19).

Показано, что белок Akkermansia muciniphila-Nlrp3 принимает участие в нейропротекции при травматическом повреждении мозга (2).

Это привело к витку разработок биомедицинских препаратов на основе пробиотических штаммов Akkermansia muciniphilia.

Однако, подходы, основанные на применении пробиотических штаммов обладают определенными недостатками, в частности, относительно низкая устойчивость к абиотическим жидкостям в пищеварительном тракте макроорганизма;

- при одновременном приеме с антибактериальными и противомикробными препаратами снижается количество живых бактерий в применяемом пробиотике;

- сложность в подборе индивидуальной дозы препарата для пациента;

- невозможно получить «идеальный» штамм пробиотика, который бы подходил всем.

Из патента RU2738265 (опубл. 11.12.2020) известен способ модуляции или стабилизации кишечной микробиоты путем перорального введения одного или нескольких дефензинов (противомикробных полипептидов). Однако, синтез таких полипептидов имеет некоторые сложности.

Из описания заявки EP3974026 «Композиция для улучшения функции печени» известно, что резорциновые липиды обладают различными функциональными свойствами у людей, такими как пероральный антибактериальный эффект, иммуносупрессия, антидиабетический эффект, противовоспалительный эффект, регуляция кишечной флоры, антихолестериновый эффект, эффект против ожирения, улучшение сна, подавление старения и регуляция циркадного ритма (например, Патентные документы 1-10): [Патентный документ 1] Японский патент № 2613474, [Патентный Документ 2] Японская Патентная заявка № 2013-091612, [Патентный Документ 3] Японская Патентная заявка № 2014-139166, [Патентный документ 4] ,Патентный Документ 5] Японская Патентная заявка № 2015-218130, [Патентный Документ 6] Японская Патентная заявка № 2015-231986, [Патентный Документ 7] Японская Патентная заявка № 2016-132641, [Патентный Документ 8] Японская Патентная заявка № 2016-153387, [Патентный документ 9] Японский патент № 5926616, [Патентный документ 10] Японский патент № 5951448.

Однако, в указанных патентных документах речь идет о резорцинах с длиной алкильной цепи С₁₃-С₂₇, причем в данных источниках не были исследованы и описаны какие-либо готовые лекарственные формы на основе данных резорцинов и их терапевтическая эффективность.

Метформин, по-видимому, является важным фактором, поскольку этот антидиабетический препарат может стимулировать рост A.muciniphila и, следовательно, был идентифицирован как основной искажающий фактор в исследованиях, посвященных СД2 (20).

Поэтому на сегодняшний день сохраняется высокая потребность в разработке эффективных и доступных препаратов на основе малых молекул для повышения уровня Akkermansia muciniphilia.

Сущность изобретения

Предлагается применение 5-пентадецилрезорцинола для перорального применения с эффектом повышения доли Akkermansia muciniphila в микробиоме человека. Данные свойства 5-пентадецилрезорцинола были показаны в приведенных здесь исследованиях. В исследовании специфической фармакологической активности 5-пентадецилрезорцинола с использованием животной модели жировой диеты было показано, что 5-пентадецилрезорцинол значительно повышает долю Akkermansia muciniphila в микробиоме человека.

В одном из вариантов выполнения пентадецилрезорцинол используют для повышения доли Akkermansia muciniphila в микробиоме кишечника.

В одном из вариантов выполнения 5-пентадецилрезорцинол применяют в дозе 0,006 мг/сут в течение 28 дней.

В одном из вариантов выполнения увеличение доли Akkermansia muciniphila достигается в микробиоме толстой кишки.

В одном из вариантов выполнения увеличение доли Akkermansia muciniphila достигается в микробиоме тонкой кишки.

Задачей настоящего изобретения является применение 5-пентилрезорцинола с высокой степенью эффективности для лечения и профилактики воспалительных и метаболических заболеваний.

Техническим результатом, проявляющимся при осуществлении изобретения, является то, что 5-пентадецилрезорцинол в качестве действующего вещества, обеспечивает эффективное повышение содержания Akkermansia muciniphila в микробиоме человека. Лекарственные препараты на основе 5-пентилрезорцинола могу быть использованы для лечения воспалительных заболеваний и метаболических нарушений.

Метаболические расстройства, которые могут успешно подвергаться коррекции с помощью настоящего лечения, включают избыточную массу, ожирение, метаболический синдром, дефицит инсулина или расстройства, связанные с инсулинорезистентностью, сахарный диабет 2 типа, нарушение толерантности к глюкозе, нарушение метаболизма липидов, гипергликемия, стеатоз печени, дислипидемия. Настоящее лечение является особенно подходящим для терапевтического или профилактического лечения ожирения и инсулинорезистентности.

Указанный технический результат реализуется за счет свойств действующего вещества - 5-пентадецилрезорцинола.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показаны результаты определения содержания Akkermansia muciniphila в микробиоме тонкой кишки методом метагеномного 16S-секвенирования.

На фиг. 2 показаны результаты определения содержания Akkermansia muciniphila в микробиоме толстой кишки методом метагеномного 16S-секвенирования.

Результаты, полученные в этих исследованиях, иллюстрируются следующими примерами. Приведенные примеры не являются ограничивающими объем притязаний, а служат лишь для иллюстрации вариантов осуществления изобретения.

Пример 1

Получение фармацевтической композиции на основе 5-пентадецилрезорцинола.

Полученная фармацевтическая композиция на основе 5-пентадецилрезорцинола для перорального применения имеет следующий состав:

5-пентадецилрезорцинол - 0,750 гр

Спирт этиловый, 96 % - 0,2 л

Вода для инъекций - 0,8 литра.

В день введения препарата к 24 мл воды для инъекций добавляли 1 мл фармацевтической композиции на основе 5-пентадецилрезорцинола, перемешивали. В шприц отбирали 0,2 мл полученного раствора и перорально через зонд вводили животному 1 раз в сутки, 5 дней в неделю. Курс - 28 дней.

Таким образом, разовая доза составляет:

5-пентадецилрезорцинол - 0,006 мг, Этанол - 0,0016 г

Высокая эффективность 5-пентдецилрезорцинола для повышения доли Akkermansia muciniphila в микробиоме доказана согласно проведенным испытаниям.

Была выполнена оценка эффективности фармацевтической композиции на основе 5-пентадецилрезорцинола на животных моделях с жировым рационом на аутбредных самцах мышей C57B1/6, при хроническом пероральном введении изучаемой композиции.

Жировой рацион получали путем обогащения стандартного рациона до 30% триглицеридами животного происхождения, для чего стандартный полнорационный комбикорм для лабораторных грызунов смешивали и пропитывали смальцем в соотношении корм : смалец - 7:3.

В эксперимент включаются клинически здоровые животные, прошедшие 7-дневный период карантина. Условия содержания животных: стандартные условия SPF вивария.

Экспериментальные группы

1) 12 мышей С57/black6 SPF самки, находящихся на стандартном рационе в течение 28 дней

2) 12 мышей С57/black6 SPF самки, находящихся на жировом рационе в течение 28 дней

3) 12 мышей С57/black6 SPF самки находящихся на стандартном рационе и получающих 0,2 мл растворителя (0,8 % раствор этанола) путем зондового введения в течение 28 дней

4) 12 мышей С57/black6 SPF самки, находящихся на жировом рационе и получающих 0,2 мл растворителя (0,8 % раствор этанола) путем зондового введения в течение 28 дней

5) 12 мышей С57/black6 SPF самки, находящихся на стандартном рационе и получающих 0,2 мл раствора фармацевтической композиции на основе 5-пентадецилрезорцинола путем зондового введения в течение 28 дней

6) 12 мышей С57/black6 SPF самки, находящихся на жировом рационе и получающих 0,2 мл раствора фармацевтической композиции на основе 5-пентадецилрезорцинола путем зондового введения в течение 28 дней.

На 28 день животных выводят из эксперимента.

Было проведено исследование содержания Akkermansia muciniphila в микробиоме тонкой кишки методом метагеномного 16S-секвенирования.

Ни жировой рацион, ни введение спирта не оказывают значимого влияния на долю Akkermansia muciniphila в микробиоме тонкой кишки. Введение раствора фармацевтической композиции 5-пентадецилрезорцинола оказал статистически значимое влияние на содержание Akkermansia muciniphila, увеличив ее долю в микробиоме тонкой кишки с 4,9% до 12,1% на стандартном рационе и с 7,7% до 32,0% на жировом рационе (фиг 1.)

Пример 2

Было проведено исследование содержания Akkermansia muciniphila в микробиоме толстой кишки методом метагеномного 16S-секвенирования.

Ни жировой рацион, ни введение спирта не оказывают значимого влияния на долю Akkermansia muciniphila в микробиоме толстой кишки. Введение раствора фармацевтической композиции 5-пентадецилрезорцинола оказал статистически значимое влияние на содержание Akkermansia muciniphila, увеличив ее долю в микробиоме толстой кишки с 7,3% до 11,4% на стандартном рационе и с 11,4% до 26% на жировом рационе (фиг. 2).

Список цитированной литературы

1. Cani, P.D., Depommier, C., Derrien, M. et al. Akkermansia muciniphila: paradigm for next-generation beneficial microorganisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 19, 625-637 (2022). https://doi.org/10.1038/s41575-022-00631-9;

2. Chen Y, Chen J, Wei H, Gong K, Meng J, Long T, Guo J, Hong J, Yang L, Qiu J, Xiong K, Wang Z and Xu Q (2023) Akkermansia muciniphila-Nlrp3 is involved in the neuroprotection of phosphoglycerate mutase 5 deficiency in traumatic brain injury mice. Front. Immunol. 14:1172710. doi: 10.3389/fimmu.2023.1172710;

3. Amandine Everard, Vladimir Lazarevic, Nadia Gaïa, Maria Johansson, Marcus Ståhlman, Fredrik Backhed, Nathalie M Delzenne, Jacques Schrenzel, Patrice François & Patrice D Cani, Microbiome of prebiotic-treated mice reveals novel targets involved in host response during obesity. The ISME Journal volume 8, pages2116-2130 (2014);

4. Amandine Everard, Clara Belzer, Lucie Geurts et al. Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity, PNAS, May 13, 2013, 110 (22) 9066-9071, https://doi.org/10.1073/pnas.1219451110

5. A Santacruz, MC Collado, L Garcia-Valdes, MT Segura et. Al. Gut microbiota composition is associated with body weight, weight gain and biochemical parameters in pregnant women. British Journal of Nutrition, Volume 104, Issue 1, 14 July 2010, pp. 83 - 92, DOI: https://doi.org/10.1017/S0007114510000176;

6. Caroline L J Karlsson 1, Jenny Onnerfält, Jie Xu, Göran Molin, Siv Ahrné, Kristina Thorngren-Jerneck, The microbiota of the gut in preschool children with normal and excessive body weight, Comparative Study Obesity (Silver Spring). 2012 Nov;20(11):2257-61. doi: 10.1038/oby.2012.110. Epub 2012 May 1;

7. Xiuying Zhang 1, Dongqian Shen, Zhiwei Fang, Zhuye Jie, Xinmin Qiu, Chunfang Zhang, Yingli Chen, Linong Ji. Human gut microbiota changes reveal the progression of glucose intolerance. PLoS One. 2013 Aug 27;8(8):e71108. doi: 10.1371/journal.pone.0071108. eCollection 2013;

8. Jing Li, Fangqing Zhao, Yidan Wang, Junru Chen et. al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 2017 Feb 1;5(1):14. doi: 10.1186/s40168-016-0222-x;

9. Shirong Liu, Rafael M. Rezende, Thais G. Moreira et.al. Oral Administration of miR-30d from Feces of MS Patients Suppresses MS-like Symptoms in Mice by Expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host and Microbe, November 26, 2019.DOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.10.008;

10. Nath, Narender, Metformin Attenuated the Autoimmune Disease of the Central Nervous System in Animal Models of Multiple Sclerosis, Journal of Immunology (2009), 182(12), 8005-8014 CODEN: JOIMA3; ISSN: 0022-1767. https://doi.org/10.4049/jimmunol.0803563;

11. Eran Blacher, Stavros Bashiardes, Hagit Shapiro et.al. Potential roles of gut microbiome and metabolites in modulating ALS in mice. Nature 2019 Aug;572(7770):474-480. doi: 10.1038/s41586-019-1443-5. Epub 2019 Jul 22;

12. Everard, A. et al. Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 9066-9071 (2013); doi: 10.1073/pnas.1219451110;

13. Shin, N. R. et al. An increase in the Akkermansia spp. population induced by metformin treatment improves glucose homeostasis in diet-induced obese mice. Gut 63, 727-735 (2014). https://doi.org/10.1136/gutjnl-2012-303839;

14. Ferrucci, L. & Fabbri, E. Inflammageing: chronic inflammation in ageing, cardiovascular disease, and frailty. Nat. Rev. Cardiol. 15, 505-522 (2018). https://doi.org/10.1038/s41569-018-0064-2;

15. Barcena, C. et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nat. Med. 25, 1234-1242 (2019). https://doi.org/10.1038/s41591-019-0504-5;

16. Biagi, E. et al. Gut microbiota and extreme longevity. Curr. Biol. 26, 1480-1485 (2016). https://doi.org/10.1016/j.cub.2016.04.016;

17. Kong, F. et al. Gut microbiota signatures of longevity. Curr. Biol. 26, R832-R833 (2016). https://doi.org/10.1016/j.cub.2016.08.015;

18. Plovier, H. et al. A purified membrane protein from Akkermansia muciniphila or the pasteurized bacterium improves metabolism in obese and diabetic mice. Nat. Med. 23, 107-113 (2017). https://doi.org/10.1038/nm.4236;

19. Depommier, C. et al. Supplementation with Akkermansia muciniphila in overweight and obese human volunteers: a proof-of-concept exploratory study. Nat. Med. 25, 1096-1103 (2019). https://doi.org/10.1038/s41591-019-0495-2;

20. Wu, H. et al. Metformin alters the gut microbiome of individuals with treatment-naive type 2 diabetes, contributing to the therapeutic effects of the drug. Nat. Med. 23, 850-858 (2017). https://doi.org/10.1038/nm.4345.

Изобретение относится к области биотехнологии, фармакологии и медицины и направлено на обеспечение эффективного повышения доли Akkermansia muciniphila в микробиоме человека. Изобретение представляет собой применение 5-пентадецилрезорцинола для повышения доли Akkermansia muciniphila в микробиоме человека. Изобретение позволяет повысить содержание Akkermansia muciniphila в микробиоме человека. 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

1. Применение 5-пентадецилрезорцинола для повышения доли Akkermansia muciniphila в микробиоме человека.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что 5-пентадецилрезорцинол используют для повышения доли Akkermansia muciniphila в микробиоме кишечника.

3. Применение по п.2, отличающееся тем, что 5-пентадецилрезорцинол применяют в дозе 0,006 мг/сут в течение 28 дней.

4. Применение по п.2 или 3, отличающееся тем, что увеличение доли Akkermansia muciniphila достигается в микробиоме толстой кишки.

5. Применение по п.2 или 3, отличающееся тем, что увеличение доли Akkermansia muciniphila достигается в микробиоме тонкой кишки.