ПОРОШОК, ОБРАЗУЮЩИЙ ГЕЛЬ IN SITU Российский патент 2023 года по МПК C08L5/04 C08L5/06 C08L5/08 A61K31/722 A61K31/732 A61K31/734 A23L3/34 

Объектом настоящего изобретения является композиция в форме порошка, образующего гель in situ; способ получения указанного порошка и его использование для лечения кожных ран и в области консервирования пищевых продуктов являются дополнительными объектами изобретения. Кроме того, дополнительными объектами изобретения являются композиция в форме раствора или жидкой суспензии, которая представляет собой исходный материал для получения указанного порошка, и способ получения такой жидкой композиции.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Лечение ран в настоящее время является проблемой во всем мире. Рынок продуктов для лечения ран достаточно широк, особенно в развитых странах, таких как США, Европа и Япония, на которые в совокупности приходится более 80% мировых продаж, но в результате распространения служб здравоохранения ожидается также рост рынка в развивающихся странах. Эпидемиологические данные, относящиеся к 2014 году, показывают, что приблизительно 2% взрослого населения в западных странах страдают от хронических ран, и этот процент возрастает до 4% среди госпитализированного населения. Лечение ран является сложной задачей, потому что это сложный и последовательный процесс. Острые раны могут развиваться в сторону хронических ран или могут быть заражены бактериями; в обоих случаях эти события останавливают фазу заживления раны. По этим причинам медицинская система оказывает определенное давление на разработку новых методов лечения, которые имеют выгодное соотношение затрат и выгод как в отношении медицинских расходов, так и социальных затрат.

Продукты для лечения ран по существу предназначены для заживления ран и контроля инфекции. В настоящее время на рынке доступно несколько продуктов, например: традиционные продукты, такие как лейкопластыри, мази для местного применения, марля и швы; инновационные продукты, такие как медицинские средства на основе альгината и гидроколлоидов; активные продукты, такие как заменители кожи, заменители на клеточной основе, медицинские средства на основе коллагена, факторы роста; продукты для очищения ран, такие как моющие средства и герметики; противомикробные медицинские средства, например, на основе серебра или других противомикробных агентов; специализированные медицинские средства для лечения диабетической язвы стопы (DFU), пролежней (PU) и венозных язв нижних конечностей (VLU).

Лечение хронических ран является особенно сложной задачей, поскольку доступные в настоящее время продукты дают несколько неблагоприятных/побочных эффектов, например, местное раздражение и контактная сенсибилизация, иммунные реакции, абсорбция продукта, обезвоживание медицинского средства и/или участка раны, травма при удалении во время замены медицинского средства, необходимость часто менять медицинское средство, что отражается на стоимости лечения.

В настоящее время доступны некоторые инновационные продукты на основе гидрофильных полимеров, прежде всего альгината, пектина, гиалуроновой кислоты и их производных; данные продукты могут быть в форме повязок, нетканой марли, прозрачных пленок, мазей, спреев и гранул, которые при контакте с раной приводят к образованию коллоидного геля. Такие продукты обладают хорошей способностью удерживать и поглощать экссудат, образованный раной, что снижает риск протекания экссудата, мацерации кожи и необходимости частых смен медицинского средства.

Например, микрочастицы, состоящие из гентамицина/альгината/пектина, описаны в Aquino R Р et al., (2013) International Journal of Pharmaceutics 440: 188-194; данные микрочастицы были получены с помощью сверхкритической атомизации (SAA), и они полезны для лечения бактериальных инфекций ран.

Образование in situ гидрогеля из микрочастиц, состоящих из гентамицина/альгината/пектина, описано в De Cicco F et al., (2014), Carbohydrate Polymers 101:1216-1224; в данном исследовании микрочастицы были получены по технологии SAA или путем распылительной сушки.

Использование технологии сушки наноспреем при получении ингаляционного порошка, содержащего лизинат кетопрофена, описано, например, в Aquino R Р et al., (2014), The Scientific World Journal ID 838410, 7 страниц.

Порошок наночастиц, состоящий из гентамицина/альгината/пектина, описан в De Cicco et al., (2014), International Journal of Pharmaceutics 473: 30-37; такой порошок, способный к гелеобразованию in situ, был получен по технологии сушки наноспреем.

Несмотря на недавние разработки, в области здравоохранения все еще существует острая потребность в лечении ран.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения столкнулись с проблемой лечения ран, особенно в случае хронических и/или язвенных ран.

В частности, авторы настоящего изобретения обратились к проблеме уменьшения времени гелеобразования, когда порошок находится в контакте с раной, и улучшения способности порошка поглощать экссудат раны.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обратились к проблеме улучшения адгезионной способности геля, образованного in situ, чтобы избежать риска случайного отслоения при одновременном легком удалении геля из раны после использования.

Авторы настоящего изобретения также обратились к проблеме обеспечения того, чтобы образовавшийся in situ гель имел адекватную скорость пропускания водяного пара для поддержания сбалансированной гидратации раны, что не позволяет экссудату вызывать чрезмерную гидратацию раны или геля, образовавшегося в результате поглощения экссудата от вызывающих окклюзионных явлений.

Авторы настоящего изобретения нашли конкретную композицию в форме порошка, образующего гель in situ, которая способна улучшить лечение ран, особенно хронических и/или язвенных ран.

Как будет более подробно обсуждаться в экспериментальной части, композиция согласно изобретению имеет более короткое время гелеобразования, чем время гелеобразования композиции альгинат/пектин, описанное De Cicco et al. (2014), International Journal of Pharmaceuticalics 473: 30-37 и высокая способность абсорбировать экссудат (см. Пример 5).

Кроме того, гель, образующийся in situ, когда композиция согласно изобретению находится в контакте с раной, обладает улучшенной адгезивной способностью по отношению к адгезивной способности геля, описанного в De Cicco et al. (2014), International Journal of Pharmaceuticalics 473: 30-37 (см. Пример 6); гель, образованный порошком согласно изобретению, также имеет скорость пропускания водяного пара, которая достаточна для поддержания сбалансированной гидратации раны (см. Пример 7).

Наконец, конкретная композиция согласно изобретению индуцирует миграцию клеток статистически значимым образом по отношению к композиции альгинат/пектин (Пример 8).

Кроме того, порошок, образующий гель in situ согласно изобретению имеет вызывающую интерес область применения также в области консервирования пищевых продуктов. Действительно, свежие продукты, например мясо, фрукты, овощи и т.д., выделяют жидкости, которые увеличивают вероятность микробного загрязнения и сокращают срок хранения продуктов, как указывалось в Biji et al.; (2015), Journal of Food Science and Technology 52: 6125-6135. Порошок, образующий гель in situ в соответствии с изобретением способен контролировать развитие микробов даже без добавления активных ингредиентов, обладающих антимикробной активностью (см. Пример 10), поэтому его использование позволяет продлить сохранение качества, безопасности и сенсорных свойств пищевого продукта, служа активной упаковкой для свежих пищевых продуктов.

Следовательно, первым объектом изобретения является композиция в форме порошка, содержащая следующие полисахариды:

- альгиновую кислоту или альгинат натрия,

- пектин,

- хитозан,

где содержание полисахаридов составляет по меньшей мере 20 мас. % по отношению к общей массе порошка.

Вторым объектом изобретения является композиция в форме жидкого раствора или суспензии, содержащая следующие полисахариды:

- альгиновую кислоту или альгинат натрия,

- пектин,

- хитозан.

Третьим объектом изобретения является композиция в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, для применения в качестве лекарственного средства.

Четвертый объект изобретения представляет собой композицию в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, для применения при лечении кожных ран.

Пятый объект изобретения представляет собой способ лечения кожной раны у пациента путем нанесения на указанную рану композиции в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, в эффективном количестве для лечения указанной раны.

Шестым объектом изобретения является применение композиции в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, для нанесения на кожные раны.

Седьмым объектом изобретения является способ получения композиции в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, с помощью процесса распыления.

Восьмым объектом изобретения является способ получения композиции в жидком растворе или суспензии в форме, определенной во втором объекте изобретения.

Девятым объектом изобретения является применение композиции в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, в области пищевых продуктов.

РИСУНКИ

На Фиг. 1А показано изображение, полученное с помощью SEM (сканирующий электронный микроскоп) репрезентативного образца частиц субмикрометрического порошка согласно изобретению (2d1), полученного, как описано в примере 2А.

На Фиг. 1В показано изображение, полученное с помощью SEM репрезентативного образца частиц микрометрического порошка согласно изобретению (2d2), полученного, как описано в примере 2В.

На Фиг. 1С показано изображение, полученное с помощью SEM репрезентативного образца частиц субмикрометрического порошка в соответствии с изобретением (2d'1), полученного, как описано в примере 2А'.

На Фиг. 1D показано изображение, полученное с помощью SEM репрезентативного образца частиц субмикрометрического порошка в соответствии с изобретением (2d''1), полученного, как описано в примере 2А'.

На Фиг. 1Е показано изображение, полученное с помощью SEM репрезентативного образца частиц для сравнения субмикрометрического порошка (2d'''1), полученного, как описано в примере 2А'.

На Фиг. 2А показано распределение размеров репрезентативного образца частиц субмикрометрического порошка согласно изобретению (2d1), полученного, как описано в примере 2А, оцененного с помощью DLS (динамическое рассеяние света). Диаграмма представляет объемный % (об. %) частиц как функцию диаметра (d), измеренного в микронах (мкм). Частицы имеют средний диаметр (d_m)=0,52 мкм, 10% частиц имеют диаметр d₁₀=0,28 мкм; 50% частиц, имеющих диаметр d₅₀=0,54 мкм; и 90% частиц, имеющих диаметр d₉₀=0,72 мкм.

На Фиг. 2А' показано распределение размеров того же образца субмикрометрического порошка, показанного на фигуре 2А, по данным DLS после 30 дней хранения в условиях ускоренной стабильности. Диаграмма представляет объемный % (об. %) частиц как функцию диаметра (d), измеренного в микронах (мкм). Частицы имеют средний диаметр (d_m)=0,59 мкм, 10% частиц имеют диаметр d₁₀=0,31 мкм; 50% частиц имеют диаметр d₅₀=0,60 мкм; и 90% частиц, имеющих диаметр d₉₀=0,83 мкм.

На Фиг. 2В показано распределение размеров репрезентативного образца частиц микрометрического порошка согласно изобретению (2d2), полученного, как описано в примере 2В, оцененного LS. Диаграмма представляет объемный % (об. %) частиц как функцию диаметра (d), измеренного в микронах (мкм). Частицы имеют средний диаметр (d_m)=4,25 мкм, 10% частиц имеют диаметр d₁₀=1,78 мкм; 50% частиц, имеющих диаметр d₅₀=4,05 мкм; и 90% частиц, имеющих диаметр d₅₀=8,13 мкм.

На Фиг. 2С показано распределение размеров репрезентативного образца частиц для сравнения субмикрометрического порошка (2b1), полученного, как описано в примере 2А, оцененного с помощью DLS. Диаграмма представляет объемный % (об. %) частиц как функцию диаметра (d), измеренного в микронах (мкм). Частицы имеют средний диаметр (d_m)=0,76 мкм, 10% частиц имеют диаметр d₁₀=0,28 мкм; 50% частиц, имеющих диаметр d₅₀=0,75 мкм; и 90% частиц, имеющих диаметр d₉₀=1,82 мкм.

На Фиг. 2С' показано распределение размеров того же образца субмикрометрического порошка, показанного на Фиг. 2С, которое оценивали с помощью DLS после 30 дней хранения в условиях усиленной стабильности. Диаграмма представляет объемный % (об. %) частиц как функцию диаметра (d), измеренного в микронах (мкм). Частицы имеют средний диаметр (d_m)=1,26 мкм, 10% частиц имеют диаметр d₁₀=0,48 мкм; 50% частиц имеют диаметр d₅₀=1,32 мкм; и 90% частиц, имеющих диаметр d₉₀=2,92 мкм.

На Фиг. 2D показано распределение размеров репрезентативного образца частиц субмикрометрического порошка в соответствии с изобретением (2d'1), полученного, как описано в примере 2А', оцененного с помощью DLS. Диаграмма представляет объемный% (об. %) частиц как функцию диаметра (d), измеренного в микронах (мкм). Частицы имеют средний диаметр (d_m)=0,44 мкм, 10% частиц имеют диаметр d₁₀=0,18 мкм; 50% частиц, имеющих диаметр d₅₀=0,45 мкм; и 90% частиц, имеющих диаметр d₉₀=0,68 мкм.

На Фиг. 2Е показано распределение размеров репрезентативного образца частиц субмикрометрического порошка в соответствии с изобретением (2d''1), полученного, как описано в примере 2А', оцененного с помощью DLS. Диаграмма представляет объемный % (об. %) частиц как функцию диаметра (d), измеренного в микронах (мкм). Частицы имеют средний диаметр (d_m)=0,68 мкм, 10% частиц имеют диаметр d₁₀=0,28 мкм; 50% частиц, имеющих диаметр d₅₀=0,65 мкм; и 90% частиц, имеющих диаметр d₉₀=1,68 мкм.

На Фиг. 2F показано распределение размеров репрезентативного образца частиц для сравнения субмикрометрического порошка (2d'''1), полученного, как описано в примере 2А', оцененного с помощью DLS. Диаграмма представляет объемный % (об. %) частиц как функцию диаметра (d), измеренную в микронах (мкм). Частицы имеют средний диаметр (d_m)=0,94 мкм, 10% частиц имеют диаметр d₁₀=0,38 мкм; 50% частиц, имеющих диаметр d₅₀=0,95 мкм; и 90% частиц, имеющих диаметр d₉₀=1,98 мкм.

На Фиг. 3А показаны фотографические изображения, полученные в нулевой момент времени (а) и через пять минут (b) репрезентативного образца субмикрометрического порошка согласно изобретению (2d1), полученного, как описано в примере 2А, в контакте с симулированной жидкостью раны (SWF).).

На Фиг. 3В показана способность абсорбировать экссудат двумя репрезентативными образцами порошка согласно изобретению, то есть субмикрометрическим порошком (2d1) и микрометрическим порошком (2d2), полученными соответственно, как описано в примерах 2А и 2В. Диаграмма представляет % увеличения массы сухого порошка в результате гелеобразования (Δ) как функцию времени (t), измеренного в минутах.

Диаграмма далее показывает, что полное гелеобразование субмикрометрического порошка (2d1) и микрометрического порошка (2d2) происходит соответственно приблизительно через 3-5 минут и 5-10 минут.

На Фиг. 3С показана способность абсорбировать экссудат репрезентативным образцом порошка согласно изобретению, т.е. субмикрометрическим порошком (2d1), полученным, как описано в примере 2А, по сравнению с образцом порошка только альгината (Alg), пектина (Pect), только хитозана (Chit). Диаграмма представляет % увеличения массы сухого порошка в результате гелеобразования (Δ) как функцию времени (t), измеренного в минутах.

На Фиг. 4А показано изображение, представляющее каждую группу клеток: необработанные (CTRL) или обработанные только альгинатом (Alg), только пектином (Pect), только хитозаном (Chit), композицией в форме субмикрометрического порошка (2b1) (Alg/Pect), причем композиция в форме субмикрометрического порошка (2d1) (Alg/Pect/Chit) получена в микроскопе с помощью 10-кратной линзы во время эксперимента, описанного в Примере 8, через 0 и 24 часа после создания очага клеточного монослоя.

На Фиг. 4В показана скорость миграции клеток, выраженная в виде расстояния (d) в микрометрах (мкм), пройденного за 24 часа, каждой группы клеток: необработанные (CTRL) или обработанные только альгинатом (Alg), только пектином (Pect), только хитозаном (Chit), композицией в форме субмикрометрического порошка (2b1) (Alg/Pect), причем композиция в форме субмикрометрического порошка (2d1) (Alg/Pect/Chit) такая, как описано в Примере 8. Диаграмма представляет измеренное расстояние (d) в микронах (мкм) между двумя краями раны в зависимости от типа лечения. Считалось, что значение Р<0,05 указывает на статистически значимое различие.

На Фиг. 5 показано высвобождение доксициклина из композиции в форме субмикрометрического порошка (2е1), в которой массовое соотношение Alg/Pect/Chit составляет 6/6/1, и из композиций в форме субмикрометрического порошка, в которых массовое соотношение составляет соответственно 3/1/1 и 1/1/1. Для сравнения использовали порошок, состоящий только из хиклата доксициклина (Dox). График представляет процентное содержание высвобожденного доксициклина (%) как функцию времени (а часах).

На Фиг. 6А показана функциональная схема устройства, использованного в примере 2А для получения композиций в форме субмикрометрического порошка.

На Фиг. 6В показана функциональная схема устройства, использованного в примере 2В для получения композиций в форме микрометрического порошка.

На Фиг. 7А показано репрезентативное изображение каждой группы: необработанное мясо (CTRL+), порошок (2d1) (CTRL-), мясо + порошок (2d1) 200:1 вес/вес (А), мясо + порошок (2d1) 300:1 вес/вес (В), мясо + порошок (2d1) 400:1 вес/вес (С) и мясо + порошок (2d1) 500:1 вес/вес (D), полученные с помощью микроскопа с помощью линзы 2,5× во время эксперимента, описанного в Примере 10, после 8 дней инкубации при 4°С.

На Фиг. 7В показан микробный заряд, выраженный в КОЕ/мл (КОЕ - колониеобразующая единица) каждой группы: необработанное мясо (CTRL+), порошок (2d1) (CTRL-), мясо+порошок (2d1) 200:1 вес/вес (А), мясо + порошок (2d1) 300:1 вес/вес (В), мясо + порошок (2d1) 400:1 вес/вес (С) и мясо + порошок (2d1) 500:1 вес/вес (D). Считалось, что значения Р менее 0,01 и Р менее 0,005 указывают на статистически значимое различие.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полисахариды представляют собой класс органических химических соединений, характеризующихся большим количеством повторяющихся звеньев, связанных вместе для образования больших сложных молекул. Химически полисахариды подразделяются на: гомополисахариды, химическая структура которых представляет собой полимерное повторение одного моносахаридного звена; важным гомополисахаридом является, например, гликоген; и гетерополисахариды, то есть состоящие из объединения множества разных моносахаридов посредством гликозидных связей. Примером гетерополисахаридов являются гликозаминогликаны, состоящие из димеров (то есть пар) различных моносахаридов, которые повторяются в полимерных последовательностях.

Альгиновая кислота и альгинат натрия представляют собой природные полисахариды, полученные из бурых водорослей, состоящие из двух мономеров, гулуроновой кислоты и маннуроновой кислоты.

Пектин, полученный из плодов, например, из кожуры цитрусовых, представляет собой гетерополисахарид, состоящий из множества различных моносахаридов. Структура одного из наиболее широко известных пектинов основана на цепочке звеньев галактуроновой кислоты, связанных альфа-связями (1-4); другие сахаридные звенья могут также присутствовать в пектине, например, ксилоза, апиоза, рамноза, галактоза, арабиноза.

Степень амидирования (DA) пектина определяется как процент амидированных единиц галактуроновой кислоты по отношению к общим единицам галактуроновой кислоты, присутствующей в молекуле пектина.

Степень метоксилирования (DM) пектина определяется как процент метоксилированных звеньев карбоксильных групп по отношению к общему количеству звеньев карбоксильных групп, присутствующих в молекуле пектина.

Хитозан является природным веществом, полученным из хитина, присутствующим, например, в раковине ракообразных. Хитозан представляет собой линейный полисахарид, состоящий из D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, связанных бета-связями (1-4).

Используемые здесь термины «обработка», «лечение» относящиеся к кожным ранам, означает установление процесса частичного или полного заживления раны и/или частичного или полного уменыпенияя инфекции раны. В предпочтительном варианте осуществления лечение пациента, страдающего от кожной раны, означает полное заживление раны.

Используемый здесь термин «эффективное количество» представляет собой количество композиции в форме порошка, которое при применении к пациенту является эффективным для установления процесса частичного или полного заживления раны.

Следовательно, первым объектом изобретения является композиция в форме порошка, содержащая следующие полисахариды:

- альгиновая кислота или альгинат натрия,

- пектин,

- хитозан,

где содержание полисахаридов составляет по меньшей мере 20 мас. % по отношению к общей массе порошка.

Предпочтительно композиция по первому объекту изобретения содержит

- альгиновую кислоту или альгинат натрия от 10 до 60 мас. %,

- пектин от 10 до 60 мас. %,

- хитозан от 5 до 70 мас. %

по отношению к общей массе полисахаридов.

Вторым объектом изобретения является композиция в форме жидкого раствора или суспензии, содержащая следующие полисахариды:

- альгиновая кислота или альгинат натрия,

- пектин,

- хитозан.

Предпочтительно, композиция по первому или второму объекту изобретения содержит

- альгиновую кислоту или альгинат натрия от 15 до 60 мас. %,

- пектин от 15 до 60 мас. %,

- хитозан от 5 до 70 мас. %

по отношению к общей массе полисахаридов.

Предпочтительно в композиции по первому или второму объекту изобретения альгиновая кислота или альгинат натрия имеет высокое содержание остатков маннуроновой кислоты, например, содержание остатков маннуроновой кислоты 55 мас. % или более, предпочтительно более 60 мас. %; предпочтительно от 55 до 75 мас. %, более предпочтительно от 60 до 73 мас. % по отношению к общей массе альгиновой кислоты или альгината натрия соответственно.

Предпочтительно в композиции по первому или второму объекту изобретения пектин амидирован, например, он имеет степень амидирования (DA) 2% или более, предпочтительно 3% или более; предпочтительно от 2 до 30%, более предпочтительно от 3 до 25%.

Предпочтительно, чтобы в композиции согласно первому или второму объекту изобретения пектин имел низкую степень метоксилирования (DM), например, 48% или менее, предпочтительно менее 40%; предпочтительно от 20 до 48%, более предпочтительно от 25 до 40%.

Предпочтительно, чтобы в композиции согласно первому или второму объекту изобретения хитозан имеет низкую молекулярную массу, например, 400000 Да или менее; предпочтительно менее 200000 Да; предпочтительно от 15000 до 400000 Да, более предпочтительно от 50000 до 200000 Да.

Необязательно, композиция согласно первому или второму объекту изобретения также может содержать, по меньшей мере, дополнительный полисахарид, например, декстран, α- и β-гликаны, каррагинан, гепарин, гиалуроновую кислоту или гиалуронат натрия.

В варианте осуществления согласно первому или второму объекту изобретения дополнительный полисахарид предпочтительно представляет собой гиалуроновую кислоту или гиалуронат натрия, более предпочтительно от 0,1 до 10 мас. % по отношению к общей массе полисахаридов.

Необязательно, композиция согласно первому или второму объекту изобретения также может содержать по меньшей мере один ингредиент, выбранный из: успокаивающих средств, заживляющих агентов, факторов роста, пептидов, противовоспалительных агентов и противомикробных препаратов, по отдельности или в комбинации.

Успокаивающими средствами согласно первому или второму объекту изобретения являются, например, экстракт алоэ вера или экстракт календулы.

Подходящими заживляющими агентами согласно первому или второму объекту изобретения являются, например, гистидин, рутин, витамин А, витамины группы В.

Подходящими факторами роста согласно первому или второму объекту изобретения являются, например, фактор роста нервов (NGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) или эпидермальный фактор роста (EGF).

Подходящими пептидами согласно первому или второму объекту изобретения являются, например, N-концевой пептид, полученный из аннексина А1 (Ас2-26), или антимикробные пептиды (AMP).

Подходящие противовоспалительные агенты согласно первому или второму объекту изобретения представляют собой, например, нестероидные противовоспалительные агенты, такие как производные пропионовой кислоты, такие как кетопрофен, оксикамы, такие как пироксикам, стероидные противовоспалительные агенты, такие как бетаметазон или их фармацевтически приемлемые соли.

Подходящими антимикробными агентами согласно первому или второму объекту изобретения являются, например, аминогликозидные антибиотики, такие как гентамицин, линкозамиды, такие как клиндамицин, макролиды, такие как кларитромицин, хинолоны, такие как левофлоксацин, тетрациклины, такие как доксициклин, или их фармацевтически приемлемые соли.

Более предпочтительно, композиция согласно первому или второму объекту изобретения содержит

- от 25 до 60 мас. % альгината натрия,

- от 25 до 60 мас. % пектина,

- от 5 до 50 мас. % хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов.

Более предпочтительно, композиция согласно первому или второму объекту изобретения содержит

- от 30 до 50 мас. % альгината натрия,

- от 30 до 50 мас. % пектина,

- от 5 до 20 мас. % хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов.

Еще более предпочтительно, композиция согласно первому или второму объекту изобретения содержит

- 30 мас. % - 50 мас. % альгината натрия,

- 30 мас. % - 50 мас. % пектина,

- 5 мас. % - 20 мас. % хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов, в которой

- содержание маннуроновой кислоты в альгинате натрия составляет от 55 до 75 мас. % по отношению к общей массе альгината натрия;

- степень амидирования (DA) пектина составляет от 2 до 30%, и/или степень его метоксилирования (DM) составляет от 20 до 48%;

- хитозан имеет молекулярную массу от 15000 до 400000 Да.

В предпочтительном варианте осуществления композиция согласно первому или второму объекту изобретения содержит

- от 40 до 50 мас. % альгината натрия,

- от 40 до 50 мас. % пектина,

- от 5 до 15 мас. % хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов, в которой

- содержание маннуроновой кислоты в альгинате натрия составляет от 55 до 75 мас. % по отношению к общей массе альгината натрия;

- степень амидирования (DA) пектина составляет от 2 до 30%, и/или степень его метоксилирования (DM) составляет от 20 до 48%;

- хитозан имеет молекулярную массу от 15000 до 400000 Да.

В варианте осуществления композиция согласно первому или второму объекту изобретения состоит из

- 46 мас. % альгината натрия,

- 46 мас. % пектина,

- 7 мас. % хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов, в которой

- содержание маннуроновой кислоты в альгинате натрия составляет от 55 до 75 мас. % по отношению к общей массе альгината натрия;

- степень амидирования (DA) пектина составляет от 2 до 30%, и/или степень его метоксилирования (DM) составляет от 20 до 48%;

- хитозан имеет молекулярную массу от 15000 до 400000 Да.

В другом варианте осуществления композиция согласно первому или второму объекту изобретения содержит

- от 40 до 50 мас. % альгината натрия,

- от 40 до 50 мас. % пектина,

- от 5 до 15 мас. % хитозана,

- от 0,1 до 3 мас. % гиалуроновой кислоты или гиалуроната натрия по отношению к общей массе полисахаридов, в которой

- содержание маннуроновой кислоты в альгинате натрия составляет от 55 до 75 мас. % по отношению к общей массе альгината натрия;

- степень амидирования (DA) пектина составляет от 2 до 30%, и/или степень его метоксилирования (DM) составляет от 20 до 48%;

- хитозан имеет молекулярную массу от 15000 до 400000 Да.

В другом варианте осуществления композиция согласно первому или второму объекту изобретения состоит из

- 26 мас. % альгината натрия,

- 26 мас. % пектина,

- 47 мас. % хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов, в которой

- содержание маннуроновой кислоты в альгинате натрия составляет от 55 до 75 мас. % по отношению к общей массе альгината натрия;

- степень амидирования (DA) пектина составляет от 2 до 30%, и/или степень его метоксилирования (DM) составляет от 20 до 48%;

- хитозан имеет молекулярную массу от 15000 до 400000 Да.

Необязательно указанные предпочтительные варианты осуществления могут также включать по меньшей мере один антимикробный ингредиент, предпочтительно доксициклин или его фармацевтически приемлемую соль.

Предпочтительно в композиции согласно первому или второму объекту изобретения, принимая в качестве эталона хитозан равным 1, массовое соотношение между альгиновой кислотой или альгинатом натрия/пектином/хитозаном составляет от 0,20/0,20/1 до 10/10/1, предпочтительно оно составляет от 0,75/0,75/1 до 10/10/1, предпочтительно оно выбирается в диапазоне от 0,55/0,55/1, 3/3/1 до 6/6/1.

Необязательно композиция согласно первому или второму объекту изобретения также может содержать по меньшей мере одну неорганическую соль, выбранную из: карбоната натрия и бикарбоната натрия или калия; более предпочтительно бикарбонат натрия.

Предпочтительно композиция согласно первому или второму объекту изобретения содержит от 2,5 до 30 мас. % по меньшей мере одной неорганической соли по отношению к общей массе полисахаридов; более предпочтительно от 2,5 до 30 мас. % бикарбоната натрия по отношению к общей массе полисахаридов.

Предпочтительно согласно первому объекту изобретения в композиции в форме порошка процентное содержание полисахаридов составляет, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 99,9% по отношению к общей массе порошка.

Согласно первому объекту изобретения, в композиции в форме порошка, по массе, по меньшей мере, одного успокаивающего средства, заживляющего агента, фактора роста, пептида, противовоспалительного или противомикробного средства составляет от 0,01 до 5% по отношению к общей массе порошка.

Согласно первому объекту изобретения в композиции в форме порошка количество по меньшей мере одного успокаивающего средства, заживляющего агента, фактора роста, пептида, противовоспалительного или противомикробного средства составляет от 0,01 мкг до 2 мг.

В предпочтительном варианте осуществления согласно первому объекту изобретения композиция в форме порошка состоит на 100 мас. % из полисахаридов по отношению к общей массе порошка.

В еще более предпочтительном варианте осуществления согласно первому объекту изобретения композиция согласно первому объекту изобретения включает, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95% по меньшей мере 97%, по меньшей мере 99,9% состоит на 100% из полисахаридов по отношению к общей массе порошка и состоит из

- 46 мас. % альгината натрия,

- 46 мас. % пектина,

- 7 мас. % хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов, в которой

- содержание маннуроновой кислоты в альгинате натрия составляет от 55 до 75 мас. % по отношению к общей массе альгината натрия;

- степень амидирования (DA) пектина составляет от 2 до 30%, а степень его метоксилирования (DM) составляет от 20 до 48%;

- хитозан имеет молекулярную массу от 15000 до 400000 Да.

В другом еще более предпочтительном варианте осуществления согласно первому объекту изобретения композиция согласно первому объекту изобретения включает, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95% по меньшей мере 97%, по меньшей мере 99,9% состоит на 100% из полисахаридов по отношению к общей массе порошка и состоит из

- 26 мас. % альгината натрия

- 26 мас. % пектина,

- 47 мас. % хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов, в которой

- содержание маннуроновой кислоты в альгинате натрия составляет от 55 до 75 мас. % по отношению к общей массе альгината натрия;

- степень амидирования (DA) пектина составляет от 2 до 30%, а степень его метоксилирования (DM) составляет от 20 до 48%;

- хитозан имеет молекулярную массу от 15000 до 400000 Да.

Согласно первому объекту изобретения композиция в форме порошка имеет диаметр частиц от 100 нм до 5 мкм, предпочтительно от 200 нм до 2,5 мкм, еще более предпочтительно от 400 нм до 800 нм.

Предпочтительно, согласно второму объекту изобретения в композиции в жидком растворе или суспензии, образующей общую концентрацию полисахаридов, составляет, по меньшей мере, 0,25% мас./об., предпочтительно, по меньшей мере, 0,40% мас./об.; предпочтительно оно составляет от 0,25 до 5,0% мас./об., более предпочтительно оно составляет от 0,40 до 1,5% мас./об.

Предпочтительно, согласно второму объекту изобретения композиция находится в форме водного или водно-спиртового раствора, раствора или суспензии на основе этанола или изопропанола.

Предпочтительно согласно второму объекту изобретения водно-спиртовой раствор составляет от 2,5 до 25% об./об.; более предпочтительно 5% об./об.

Третьим объектом изобретения является композиция в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, для применения в качестве лекарственного средства.

Четвертый объект изобретения представляет собой композицию в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, для применения при лечении кожных ран.

Пятым объектом изобретения является способ лечения кожной раны у пациента путем нанесения на указанную рану композиции в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, в эффективном количестве для лечения такой раны.

Предпочтительно в способе согласно пятому объекту изобретения эффективное количество для лечения такой раны составляет от 5 до 25 мг/см² поражения.

Шестым объектом изобретения является применение композиции в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, для нанесения на кожные раны, предпочтительно в качестве медицинского устройства.

В варианте осуществления четвертого, пятого или шестого объекта изобретения композиция не содержит, по меньшей мере, одного ингредиента, выбранного из: успокаивающих средств, заживляющих агентов, факторов роста, пептидов, противовоспалительных агентов и противомикробных агентов.

В варианте осуществления четвертого, пятого или шестого объекта изобретения композиция также содержит, по меньшей мере, один ингредиент, выбранный из: успокаивающих средств, заживляющих агентов, факторов роста, пептидов, противовоспалительных агентов и противомикробных агентов.

Хорошо известно, что кератиноциты, являясь самой большой группой клеток в коже, способны запускать интенсивную митотическую активность по краям раны. Через один или два дня после поражения те же кератиноциты, стимулируемые локальным высвобождением фактора роста, пролиферируют и мигрируют внутри раны. Миграция клеток представляет собой этап, который требует присутствия жидкой среды и состоит из различных стадий, контролируемых хемотаксическим градиентом, генерируемым факторами роста. В отсутствие гидратированной поверхности кератиноциты секретируют протеолитические ферменты, которые глубоко проникают в раневое ложе, в попытке достичь уровня влажности, подходящего для процесса миграции. Прежде всего, кератиноциты отделяются друг от друга и прилипают к клеткам базальной мембраны, подвергаясь во время миграции трансформации, которая видит их расширение в направлении, в котором необходим рост ткани. Только когда клетки касаются друг друга от одной части раны к другой, процесс миграции прерывается в результате механизма, известного как «контактное торможение». Когда кожная поверхность полностью покрыта новыми эндотелиальными клетками, рану можно считать закрытой.

Как будет более подробно рассмотрено в экспериментальной части, композиция согласно изобретению индуцирует миграцию клеток кератиноцитов и, следовательно, ее использование в форме порошка, например, в качестве медицинского устройства, представляет собой важную помощь в процессе заживления ран.

Седьмым объектом изобретения является способ получения композиции в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, с помощью процесса распыления.

Согласно седьмому объекту изобретения процесс распыления может происходить в соответствии с методиками, известными специалисту в данной области, такими как распылительная сушка, как описано в De Cicco F et al, (2014), Carbohydrate Polymers 101: 1216-1224; или с помощью сверхкритического распыления (SAA), как описано в Aquino R Р et al., (2013) International Journal of Pharmaceuticalics 440: 188-194 или в De Cicco F et al., (2014), Carbohydrate Polymers 101: 1216-1224; или с помощью технологии сушки наноспреем, как описано в De Cicco et al. (2014), International Journal of Pharmaceuticalics 473: 30-37.

Предпочтительно, в соответствии с седьмым объектом изобретения, процесс распыления композиции в жидком растворе или суспензии для получения соответствующей композиции в форме порошка происходит с помощью технологии распылительной сушки, в которой в общих чертах используется процедура, описанная в De Cicco et al., (2014), International Journal of Pharmaceutics 473: 30-37, для получения порошков, состоящих из субмикрометрических частиц, и процедура, описанная в De Cicco F et al., (2014), Carbohydrate Polymers 101: 1216-1224 для получения микрометрических порошков, но с использованием конкретных рабочих параметров. Использование конкретной композиции согласно изобретению преимущественно позволяет снизить температуру на входе композиции в камеру распыления по сравнению с предшествующим уровнем техники, упомянутым выше.

Следовательно, предпочтительно, в соответствии с седьмым объектом изобретения, процесс распыления для получения композиции в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, осуществляется с помощью технологии распылительной сушки с использованием следующих рабочих параметров:

- температура на входе композиции в жидком растворе или суспензии в соответствии со вторым объектом изобретения составляет от 50 до 110°С, предпочтительно от 50 до 100°С, еще более предпочтительно от 50 до 60°С;

- скорость подачи распылителя от 7,5 до 20 мл/мин, предпочтительно 9,5 мл/мин;

- диаметр распылительного сопла от 3,0 до 500 мкм, предпочтительно 4,0 мкм;

- поступающий воздушный поток от 100 до 600 л/мин, предпочтительно 100 л/мин;

- давление в сушильной камере составляло от 38 до 60 мбар, предпочтительно 38 мбар;

- относительная скорость распыления составляла от 50 до 100%, предпочтительно 100%.

Функциональная схема устройства, используемого для получения композиции в форме порошка по технологиям Nano Spray и Mini Spray, показана соответственно на Фиг. 6Аи 6В.

На фиг. 6А в качестве неограничивающего объяснения показан пример устройства 1, приспособленного для получения композиции (в частности, композиции согласно настоящему изобретению) в субмикрометрической форме порошка, начиная с жидкого раствора или суспензии (в частности, водной), устройство 1, использующее технологию распыления Nano Spray и последующую сушку.

Устройство 1 содержит сушильную камеру 9, через которую проходит поток воздуха (обозначенный на Фиг. 6А стрелками со сплошными линиями), перемещаемый с помощью аспиратора 90 и, следовательно, нагреваемый нагревателем 91 (например, электрическим резистором), аспиратором 90. и нагреватель 91 оба расположены предпочтительно выше по потоку от сушильной камеры 9. В начальной части сушильной камеры 9 установлена распылительная головка 8, с которой связана линия для подачи жидкого раствора или суспензии, причем указанная линия подачи содержит контейнер 83, в который загружен жидкий раствор или суспензия, и всасывающий насос 85, предпочтительно перистальтический насос, подходящий для подачи жидкого раствора или суспензии, из контейнера 83 в распылительную головку 8.

Распылительная головка 8 содержит мембрану (специально изготовленную из нержавеющей стали), которая распыляет жидкий раствор или суспензию, причем указанная мембрана снабжена массивом отверстий микрометрических размеров, причем диаметр указанных отверстий преимущественно составляет от 2,5 до 7 мкм. Затем к мембране присоединяется пьезоэлектрический кристалл, который служит в качестве исполнительного механизма, поскольку он вибрирует на соответствующей частоте (в частности, на ультразвуковой частоте), вызывает вибрацию мембраны и, следовательно, высвобождение жидкого раствора или суспензии, через отверстия мембраны.

Жидкий раствор или суспензия затем высвобождается в сушильной камере 9 в форме капель, равномерно распределенных и имеющих контролируемые субмикрометрические размеры. Как только они попадают в сушильную камеру 9, капли направляются потоком воздуха, который также высушивает их. Траектории, пройденные жидким раствором или распыленной суспензией, а затем высушенные в форме порошка, схематически показаны на Фиг. 6А пунктирными линиями.

Способ, используемый для получения композиции в форме порошка, заключается в том, чтобы электрически заряжать субмикрометрические частицы композиции, которые, в частности, приобретают отрицательный электрический заряд.

Свойство частиц быть электрически заряженным преимущественно используется в устройстве 1 для сбора порошка. В частности, в конечной части сушильной камеры 9 установлен коллектор электростатических частиц. Такой коллектор содержит отрицательный электрод 77, соединенный с землей, и положительный электрод 7 для сбора частиц, причем положительный электрод 7 предпочтительно наносят на боковые стенки сушильной камеры 9 и окружают отрицательный электрод 77. Частицы композиции, переносимые воздушным потоком, будучи отрицательно заряженным, притягивается положительным электродом 7, где он осаждается, тем самым отделяясь от воздушного потока. Композиция в форме порошка, накопленная на положительном электроде 7, затем собирается с помощью соответствующего устройства (например, шпателя).

Воздушный поток преимущественно откачивается из сушильной камеры 9 после прохождения очищающего устройства 88 (например, НЕРА-фильтра), подходящего для предотвращения попадания любых активных молекул, не осажденных на положительном электроде 7, в окружающую среду. Для контроля температуры внутри сушильной камеры 9 первый зонд 74 и второй зонд 94 установлены соответственно во входной секции и в выходной секции сушильной камеры 9.

Существует множество контрольных параметров, которые устройство 1 позволяет регулировать и которые влияют, например, на размер частиц композиции, полученных с помощью устройства 1, включая, в частности:

- диаметр отверстий мембраны распылительной головки 8;

- частота колебаний пьезоэлектрического кристалла распылительной головки 8;

- емкость всасывающего насоса 85;

- концентрация активных молекул в жидком растворе или суспензии;

- емкость аспиратора 90 и

- температура на входе в сушильную камеру 9.

Устройство 1 в соответствии с технологией «Nano Spray», показанной на Фиг. 6А, имеет множество существенных преимуществ. Поскольку частицы связаны, используя свои электрические свойства, можно выделить частицы субмикрометрических размеров. Кроме того, воздушный поток в сушильной камере 9 может быть по существу ламинарным с относительно длительным постоянством частиц и, как следствие, их эффективной сушкой даже при относительно низких температурах. Наконец, устройство 1 имеет особенно высокий выход.

На Фиг. 6В в качестве неограничивающего объяснения показан пример устройства 2, приспособленного для получения композиции (в частности, композиции согласно настоящему изобретению) в форме микрометрического порошка, начиная с жидкого раствора или суспензии (в частности, водной), причем устройство 2 использует технологию распыления «Mini Spray» и последующую сушку.

Устройство 2 содержит сушильную камеру 49, через которую проходит поток воздуха (обозначенный на Фиг. 6 В стрелками со сплошными линиями), перемещаемый с помощью аспиратора 40 и, следовательно, нагреваемый нагревателем 41 (например, электрическим резистором), причем аспиратор 40 предпочтительно расположен выше по потоку от сушильной камеры 49, причем аспиратор 40 предпочтительно расположен ниже по потоку от сушильной камеры 9. В начальной части сушильной камеры 49 установлено сопло 48, к которому присоединена линия для подачи жидкого раствора, или суспензия, причем указанная линия подачи содержит контейнер 38, в который загружен жидкий раствор или суспензию, и всасывающий насос 58, предпочтительно перистальтический насос, подходящий для перемещения жидкого раствора или суспензии из контейнера 38 в сопло 48.

К соплу 48 дополнительно присоединена пневматическая линия 23 подачи, проходящая потоком сжатого газа, например, воздуха или азота. Поток сжатого воздуха встречается с жидким раствором или суспензией в начальном сегменте сопла 48. В корпусе сопла 48 происходит смешивание жидкого раствора или суспензии с газом под давлением и, следовательно, пневматическое распыление жидкий раствор или суспензия. В последнем сегменте сопла 48, отличающемся направлением схождения, жидкий раствор или суспензия, смешанная с находящимся под давлением газом, дополнительно ускоряется для последующего выпуска в сушильную камеру 49 через выпускную секцию сопла 48. Диаметр выходного сечения сопла 48 предпочтительно составляет от 0,25 миллиметра до 1 миллиметра. Жидкий раствор или суспензия затем выпускается в сушильную камеру 49 в форме капель, равномерно распределенных и имеющих контролируемые микрометрические размеры. Как только они попадают в сушильную камеру 49, капли направляются потоком воздуха, который также высушивает их. Траектории, пройденные жидким раствором или распыленной суспензией, а затем высушенные в форме порошка, схематически показаны на Фиг. 6В пунктирными линиями.

Воздушный поток откачивается из сушильной камеры 9 посредством выпускной секции, расположенной в конечной части сушильной камеры 49, преимущественно получаемой в боковой стенке последней части сушильной камеры. На нижней стенке сушильной камеры 49 вместо этого образуется выпускное отверстие, в которое под действием силы тяжести осаждаются любые остатки (в частности, частицы, имеющие больший размер, чем желаемые размеры), которые затем собираются в контейнере 35 для последующей утилизации после отсоединения контейнера 35 от сушильной камеры 49. Для контроля температуры внутри сушильной камеры 49 первый зонд 19 и второй зонд 18 установлены соответственно во входной секции и в выходной секции сушильной камеры 9.

Ниже по потоку от сушильной камеры 9 размещается циклонный сепаратор 3, выполненный с возможностью вызывать потерю кинетической энергии (и, следовательно, скорости) от воздушного потока, который переносит частицы композиции, которые осаждаются к нижней части циклонного сепаратора 3, в результате чего получается отверстие, которое сообщается с коллекторным кожухом 93. Затем композиция в форме порошка накапливается в коллекторном кожухе 93 для последующего извлечения после отсоединения кожуха 93 для сбора от циклонного сепаратора 3. На вершине циклонного сепаратора 3 вместо этого получается выпускная секция для воздушного потока. Затем воздушный поток выпускается из циклонного сепаратора 3 после прохождения через очищающее устройство 12 (например, НЕРА-фильтр), подходящее для предотвращения попадания в окружающую среду любых активных молекул, не осажденных в собирающем кожухе 93 (в частности, потому что их размеры меньше, чем желаемый размер).

Существует множество контрольных параметров, которые устройство 2 позволяет регулировать и которые влияют, например, на размер частиц композиции, полученных с помощью устройства 2, включая, в частности:

- диаметр выходного сечения сопла 48;

- емкость всасывающего насоса 85;

- концентрация активных молекул в жидком растворе или суспензии;

- скорость потока сжатого газа в пневматической линии 23 подачи;

- емкость аспиратора 40 и

- температура на входе в сушильную камеру 49.

Хотя устройство 2 в соответствии с технологией «Mini Spray», показанной на Фиг. 6В, имеет многочисленные и существенные преимущества (включая особенно высокий выход), тем не менее оно позволяет получать частицы с большими размерами по сравнению с частицами, которые вместо этого могут быть получены с помощью устройства 1 в соответствии с технологией «Nano Spray», показанной на фиг. 6А. Микрометрические размеры частиц необходимы для того, чтобы они могли в циклонном сепараторе 3 успешно отделяться от воздушного потока, который их переносит, и осаждаться под действием силы тяжести в собирающий кожух 93.

Предпочтительно способ согласно седьмому объекту изобретения позволяет получить композицию в форме порошка, имеющую диаметр частиц от 100 нм до 5 мкм, предпочтительно от 200 нм до 2,5 мкм, еще более предпочтительно от 400 нм до 800 нм.

Восьмым объектом изобретения является способ получения композиции в жидком растворе или суспензии в форме, определенной во втором объекте изобретения, включающий следующие этапы:

A) добавления водного раствора альгиновой кислоты или альгината натрия и пектина к коллоидному раствору хитозана,

B) повышения рН полученной композиции до значения от 4,5 до 6,5 рН с использованием 0,1 М водного раствора NaOH,

В) необязательно добавления

раствора по меньшей мере еще одного полисахарида, выбранного из декстрана, α- и β-гликанов, каррагинана, гепарина, гиалуроновой кислоты и гиалуроната натрия, предпочтительно выбранных из гиалуроновой кислоты и гиалуроната натрия

и/или

раствора по меньшей мере одного ингредиента, выбранного из: успокаивающих средств, заживляющих агентов, факторов роста, пептидов, противовоспалительных агентов и противомикробных препаратов

и/или

по меньшей мере, одной неорганической соли, выбранной из: карбоната натрия и бикарбоната натрия или калия, предпочтительно, бикарбоната натрия.

Предпочтительно способ согласно восьмому объекту изобретения включает в себя следующий этап:

A) добавления водного раствора альгиновой кислоты или альгината натрия и пектина к коллоидному раствору хитозана и триполифосфата натрия,

B) повышения рН полученной композиции до значения от 4,5 до 6,5 рН с использованием 0,1 М водного раствора NaOH,

В) необязательно добавления

раствора по меньшей мере еще одного полисахарида, выбранного из декстрана, α- и β-гликанов, каррагинана, гепарина, гиалуроновой кислоты и гиалуроната натрия, предпочтительно выбранных из гиалуроновой кислоты и гиалуроната натрия

и/или

раствора по меньшей мере одного ингредиента, выбранного из: успокаивающих средств, заживляющих агентов, факторов роста, пептидов, противовоспалительных агентов и противомикробных препаратов.

Предпочтительно способ согласно восьмому объекту изобретения дополнительно включает следующие этапы:

a) получения водного раствора альгиновой кислоты или альгината натрия,

b) добавления пектина к раствору, полученного в а);

c) получения кислого водного или кислого водно-спиртового раствора хитозана на основе этанола или изопропанола

d) необязательно добавление водного раствора триполифосфата натрия к раствору, полученному с) с получением раствора коллоидного хитозана.

Предпочтительно в способе согласно восьмому объекту изобретения общая концентрация полисахаридов композиции в жидком растворе или суспензии в форме, определенной во втором объекте изобретения, составляет, по меньшей мере, 0,25% мас./об., предпочтительно, по меньшей мере, 0,40% мас./об.; предпочтительно оно составляет от 0,25 до 5,0% мас./об., более предпочтительно оно составляет от 0,40 до 1,5% мас./об.

Предпочтительно в способе согласно восьмому объекту изобретения альгиновая кислота или альгинат натрия имеет высокое содержание остатков маннуроновой кислоты; пектин амидирован и имеет низкую степень метоксилирования (DM); хитозан имеет низкую молекулярную массу, как описано согласно второму объекту изобретения.

В варианте осуществления способа согласно восьмому объекту изобретения, в котором используется водно-спиртовой раствор, указанный раствор составляет от 2,5 до 25% об./об.; более предпочтительно 5% об./об.

В варианте осуществления способа согласно восьмому объекту изобретения, в котором используется водно-спиртовой раствор, способ также включает этап удаления водно-спиртового растворителя/диспергирующего агента путем испарения при более низких температурах, чем температура испарения одной воды.

Успокаивающие средства, заживляющие агенты, факторы роста, пептиды, противовоспалительные агенты, противомикробные средства и неорганические соли, подходящие для способа согласно восьмому объекту изобретения, являются теми же, что перечислены в отношении первого и второго объекта изобретения.

Девятым объектом изобретения является применение композиции в форме порошка, как определено в первом объекте изобретения, в области пищевых продуктов и, в частности, для консервации пищевых продуктов.

Предпочтительно, согласно девятому объекту изобретения массовое соотношение между пищей и порошком, как определено в первом объекте изобретения, составляет от 100:1 до 500:1; более предпочтительно оно составляет от 200:1 до 300:1.

Как будет более подробно обсуждаться в экспериментальной части, порошок согласно изобретению способен контролировать развитие микробов даже без добавления активных ингредиентов, обладающих антимикробной активностью. Действительно, порошок согласно изобретению способен адсорбировать жидкости и влагу, которые образуются в свежих продуктах во время их хранения, что позволяет продлить качество, безопасность и сенсорные свойства сохраняемого продукта и служить активной упаковкой для свежих продуктов питания.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Пример 1 - Получение жидких композиций

1А) Водная композиция (без неорганических солей)

1а) получение раствора альгината натрия

53,6 мг альгината натрия (FMC Biopolymer), имеющего содержание маннуроновых остатков 65 мас. % по отношению к общей массе альгината натрия, добавляли к 21,4 мл дистиллированной воды, оставляя раствор при перемешивании в течение приблизительно 10 минут.

1b) Получение водной композиции альгината натрия и пектина

К раствору альгината натрия, полученного, как описано в а), добавили 53,6 мг амидированного пектина (Herbstreith & Fox), имеющего степень амидирования (DA) между 18-23% и степень метоксилирования (DM) между 27-32%, оставляя полученный раствор при перемешивании на 15 минут.

1с) Получение раствора коллоидного хитозана.

8,9 мг хитозана (Sigma Aldrich), имеющего молекулярную массу от 50000 до 150000 DA, добавляли к 3,6 мл раствора 0,1 М HCl в дистиллированной воде, оставляя при перемешивании в течение приблизительно 15 минут; к полученному кислому раствору хитозана добавляли 1,45 мл водного раствора триполифосфата натрия 10 мМ.

1d) Получение водной композиции альгината натрия, пектина и хитозана (изобретение)

Раствор коллоидного хитозана и триполифосфата натрия, полученный, как описано в 1с), медленно и при постоянном перемешивании добавляли к раствору альгината и пектина, полученного, как описано в 1b); рН полученной композиции повышали до значения 5,3 с использованием 0,1 М водного раствора NaOH.

1е) Получение водной композиции альгината натрия, пектина и хитозана + доксициклина (ИЗОБРЕТЕНИЕ)

Готовили водный раствор доксициклина, добавляя 1,1 мг доксициклина хиклата (Sigma-Aldrich) к 1 мл деионизированной воды. Полученный таким образом раствор медленно добавляли к водной композиции согласно изобретению (1d) и оставляли при непрерывном перемешивании на 10 минут.

1B) водно-спиртовая композиция (без неорганических солей)

1с') Получение водно-спиртового раствора коллоидного хитозана Н₂О/этанол

96,2 мг хитозана (Sigma Aldrich), имеющего молекулярную массу от 50000 до 150000 Да, добавляли к 70 мл раствора СН₃СООН 1% масса/объем в дистиллированной воде, оставляя при перемешивании в течение приблизительно 15 минут; к полученному кислому раствору хитозана при перемешивании добавляли 10 мл раствора Н₂О/этанол (96°) 50:50 объем/объем.

1d') Получение водно-спиртовой композиции - Н₂О/этанол альгината натрия, пектина и хитозана (ИЗОБРЕТЕНИЕ)

Коллоидный водно-спиртовой раствор хитозана, полученный, как описано в 1с'), медленно и при постоянном перемешивании добавляли к раствору альгината и пектина, полученного, как описано в 1b); рН полученной композиции повышали до значения 5,3 с использованием 0,1 М водного раствора NaOH.

1C) Водная композиция, содержащая неорганическую соль согласно изобретению

1с'') Получение водного раствора коллоидного хитозана

96,2 мг хитозана (Sigma Aldrich), имеющего молекулярную массу от 50000 до 150000 DA, добавляли к 70 мл раствора СН₃СООН 1% масса/вода в дистиллированной воде, оставляя при перемешивании в течение приблизительно 15 минут.

1d'') Получение водной композиции альгината натрия, пектина и хитозана и бикарбоната натрия (ИЗОБРЕТЕНИЕ)

Водный коллоидный раствор хитозана, полученный, как описано в 1 с''), медленно и при постоянном перемешивании добавляли к раствору альгината и пектина, полученного, как описано в 1b); к полученным растворам добавляли 12,4 мг бикарбоната натрия, что соответствует 6,1% масса/масса по отношению к общей массе полимеров.

1D) Водная композиция, содержащая неорганическую соль (СРАВНЕНИЕ)

1d'') Получение водной композиции альгината натрия, пектина и хитозана и карбоната аммония

Водный коллоидный раствор хитозана, полученный, как описано в 1 с''), медленно и при постоянном перемешивании добавляли к раствору альгината и пектина, полученного, как описано в 1b); к полученным растворам добавляли 10,17 мг карбоната аммония, что соответствует 5% масса/масса по отношению к общей массе полимеров.

Пример 2 - Получение композиции в форме порошка

2А) получение композиции в форме субмикрометрического порошка

Образец каждой из жидких композиций, полученных соответственно в примерах 1b (СРАВНЕНИЕ), 1d и 1е (ИЗОБРЕТЕНИЕ), выдерживали при постоянном перемешивании и подвергали процессу распыления с помощью технологии сушки наноспреем с помощью устройства Nano Spray Dryer В-90 (Buchi Laboratoriums-Tecnik, Flawil, Швейцария). Температура на входе в распылитель композиции 1b (СРАВНЕНИЕ) составляла 90°С, в то время как температура на входе конкретной композиции 1d или 1е (ИЗОБРЕТЕНИЕ) составляла 50°С, т.е. преимущественно ниже.

Остальные параметры процесса были одинаковыми как для композиции сравнения, так и для композиции изобретения, как описано ниже:

- скорость подачи распылителя 9,5 мл/мин;

- диаметр распылительного сопла 4,0 мкм;

- расход поступающего воздуха 100 л/мин;

- давление в сушильной камере 38 мбар;

- относительная скорость распыления 90%

Такие параметры позволили получить из соответствующих жидких композиций порошок, частицы которого имеют субмикрометрические размеры со средним выходом процесса выше 85%, выраженным как средний процент конечного продукта по сравнению с количеством обрабатываемого материала.

В частности,

- из водной композиции 1b (СРАВНЕНИЕ) была получена композиция в форме субмикрометрического порошка 2b1 (СРАВНЕНИЕ),

- из водной композиции 1d (ИЗОБРЕТЕНИЕ) была получена композиция в форме субмикрометрического порошка 2d1 (ИЗОБРЕТЕНИЕ),

- из водной композиции 1е (ИЗОБРЕТЕНИЕ) была получена композиция в форме субмикрометрического порошка 2е1 (ИЗОБРЕТЕНИЕ).

2А') получение композиции в форме субмикрометрического порошка

Образец каждой из жидких композиций, полученных соответственно в примерах 1d' и 1d'' (ИЗОБРЕТЕНИЕ) и 1d''' (СРАВНЕНИЕ), выдерживали при непрерывном перемешивании и подвергали процессу распыления с помощью технологии сушки наноспреем с помощью сушильного аппарата Nano Spray В-90 (Buchi Laboratoriums-Tecnik, Flawil, Швейцария). Температура на входе в распылитель композиций 1d', 1d'' и 1d''' составляла 50°С.

Остальные параметры процесса были одинаковыми как для композиции сравнения, так и для композиции изобретения, как описано ниже:

- скорость подачи распылителя 9,5 мл/мин;

- диаметр распылительного сопла 4,0 мкм;

- расход поступающего воздуха 100 л/мин;

- давление в сушильной камере 38 мбар;

- относительная скорость распыления 90%

Такие параметры позволили получить из соответствующих жидких композиций порошок, частицы которого имеют субмикрометрические размеры со средним выходом процесса выше 85%, выраженным как средний процент конечного продукта по сравнению с количеством обрабатываемого материала.

В частности,

- из водно-спиртовой композиции - H₂O/этанол 1d' (ИЗОБРЕТЕНИЕ) была получена композиция в форме субмикрометрического порошка 2d'1 (ИЗОБРЕТЕНИЕ)

- из водной композиции, содержащей бикарбонат натрия 1d'' (ИЗОБРЕТЕНИЕ), была получена композиция в форме субмикрометрического порошка 2d''1 (ИЗОБРЕТЕНИЕ)

- из водной композиции, содержащей карбонат аммония 1d''' (СРАВНЕНИЕ), была получена композиция в форме субмикрометрического порошка 2d'''1 (СРАВНЕНИЕ).

2В) получение композиции в форме микрометрического порошка

Другой образец каждой из жидких композиций, полученных соответственно в примерах 1b (СРАВНЕНИЕ), 1d и 1е (ИЗОБРЕТЕНИЕ), выдерживали при постоянном перемешивании и подвергали процессу распыления с помощью технологии минираспыления с использованием устройства Mini Spray Dryer В-191. (Buchi Laboratoriums-Tecnik, Flawil, Швейцария).

В случае процесса мини-распылительной сушки также температура на входе в распылитель композиции 1d или 1е (ИЗОБРЕТЕНИЕ) была ниже, т.е. 105°С, чем температура, необходимая для обработки композиции 1b (СРАВНЕНИЕ), которая составляла 120°С.

В частности,

- из водной композиции 1b (СРАВНЕНИЕ) была получена композиция в форме микрометрического порошка 2b2 (СРАВНЕНИЕ) и

- из водной композиции 1d (ИЗОБРЕТЕНИЕ) была получена композиция в форме микрометрического порошка 2d2 (ИЗОБРЕТЕНИЕ)

- из водной композиции 1е (ИЗОБРЕТЕНИЕ) получали композицию в форме микрометрического порошка 2е2 (ИЗОБРЕТЕНИЕ).

Пример 3 - Морфологический анализ композиции изобретения в форме порошка Композиции в форме порошка согласно изобретению (2d1) и (2d2), полученные соответственно с помощью технологии наноспрея и мини-распылительной сушки, как описано в примере 2А или 2В, были проанализированы с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) с помощью микроскопа Carl Zeiss EVO MA 10, оборудованного вторичным электронным детектором (Carl Zeiss SMT Ltd, Кембридж, Великобритания). Частицы порошка покрывали золотой патиной толщиной 200 с помощью металлизатора LEICAEMSCD005. Анализы проводились при 20 кэВ. Минимум 20 изображений SEM были получены для каждого отдельного образца, чтобы проверить морфологическую однородность частиц.

Как показано на Фиг. 1А, из анализа SEM было обнаружено, что частицы субмикрометрического порошка (2d1) имеют сферическую форму и высокую шероховатость поверхности, что делает частицы чувствительными к контакту с жидкостью.

Как показано на Фиг. 1В, из анализа SEM было обнаружено, что частицы микрометрического порошка (2d2) имеют преимущественно сферическую форму и более низкую шероховатость поверхности, чем шероховатость субмикрометрического порошка (2d1).

Композиции в порошковой форме согласно изобретению (2d'1) и (2d''1) и сравнительную композицию в форме порошка (2d'''1), полученную с помощью технологии сушки наноспреем, как описано в примере 2А', также анализировали сканирующей электронной микроскопией (SEM), как описано выше.

Как показано на Фиг. 1С, из анализа SEM было обнаружено, что также частицы субмикрометрического порошка (2d'1), полученные из водно-спиртовой композиции H₂O/этанол, имеют сферическую форму и высокую шероховатость поверхности, что делает частицы чувствительными к контакту с жидкость.

Как показано на Фиг. 1D, из анализа SEM было обнаружено, что также частицы субмикрометрического порошка (2d''1), полученные из водных композиций, содержащих бикарбонат натрия, имеют сферическую форму и высокую шероховатость поверхности, что делает частицы чувствительными к контакту с жидкость.

Как показано на Фиг. 1Е, из анализа SEM было обнаружено, что частицы сравнения субмикрометрического порошка (2d'''1), полученные из водных композиций, содержащих карбонат аммония, имеют эллипсоидальную форму с небольшой шероховатостью поверхности, что делает частицы менее восприимчивыми к контакту с жидкостью.

Пример 4 - Габаритный анализ композиции в форме порошка согласно изобретению

Размерное распределение композиции в форме субмикрометрического порошка согласно изобретению (2d1), полученной, как описано в примере 2А, с технологией Nano Spray Dryer, оценивали с помощью метода динамического рассеяния света (DLS) с помощью устройства N5 (Beckman Coulter, Майами, Флорида). Каждый образец диспергировали в дихлорметане, обрабатывали ультразвуком в течение 2 минут и анализировали с помощью детектора 90°. Для каждого образца средний диаметр и распределение по размерам получали как среднее из полученных результатов, анализируя 3 образца одной и той же партии продукции и анализируя минимум 3 партии. Чтобы проверить способность процесса обработки ультразвуком приводить частицы в дисперсию, были проведены анализы с различным временем обработки ультразвуком, составляющим от 2 до 30 минут, без регистрации каких-либо существенных изменений полученных данных.

Как показано на Фиг. 2А, из анализа DLS было обнаружено, что частицы порошка (2d1) имеют средний диаметр приблизительно 0,50 микрона (500 нм).

Размерное распределение композиции в микрометрической порошковой форме согласно изобретению (2d2), полученной, как описано в примере 2В, с использованием технологии минираспыления, оценивали по методике рассеяния света (LS) с помощью устройства LS13320 (Beckman Coulter, Майами, Флорида). Каждый образец диспергировали в дихлорметане, обрабатывали ультразвуком в течение 2 минут и анализировали с помощью детектора 90°. Для каждого образца средний диаметр и распределение по размерам получали как среднее из полученных результатов, анализируя 3 образца одной и той же партии продукции и анализируя минимум 3 партии.

Как показано на Фиг. 2В, из анализа LS было обнаружено, что частицы этого порошка имеют средний диаметр приблизительно 4,25 микрона.

Распределение по размеру сравнительной композиции в субмикрометрической порошковой форме (2b1), полученной, как описано в примере 2А, с использованием технологии Nano Spray Dryer, было оценено с помощью метода динамического рассеяния света (DLS) с помощью аппарата N5 (Beckman Coulter, Майами, Флорида). Каждый образец диспергировали в дихлорметане, обрабатывали ультразвуком в течение 2 минут и анализировали с помощью детектора 90°. Для каждого образца средний диаметр и распределение по размерам получали как среднее из полученных результатов, анализируя 3 образца одной и той же партии продукции и анализируя минимум 3 партии. Чтобы проверить способность процесса обработки ультразвуком приводить частицы в дисперсию, были проведены анализы с различным временем обработки ультразвуком, составляющим от 2 до 30 минут, без регистрации каких-либо существенных изменений полученных данных.

Как показано на Фиг. 2С, из анализа DLS было обнаружено, что частицы этого порошка (2b1) имеют средний диаметр приблизительно 0,76 микрона.

После 30 дней консервации в условиях ускоренной стабильности была также проведена оценка распределения размеров частиц одного и того же образца субмикрометрического порошка согласно изобретению (2d1) и частиц субмикрометрического порошка (2b1) (СРАВНЕНИЕ) используется выше.

Эксперименты по ускоренной стабильности порошков проводились в соответствии с руководящими принципами ICH Q1AR2 «Испытания на стабильность новых лекарственных веществ и продуктов», сохраняя порошки в янтарном стекле при 40°С и относительной влажности 75% в течение 30 дней. В конце этого периода образцы анализировали с использованием методов SEM и DLS, как описано выше.

Было показано, что как частицы порошка (2d1), так и частицы порошка (2b1) сохраняют свои морфологические характеристики после 30 дней хранения в условиях ускоренной стабильности.

Как показано на Фиг. 2А', частицы порошка (2d1) после 30 дней хранения в условиях ускоренной стабильности сохраняют почти неизменное распределение по размерам с изменением приблизительно на 5% относительно распределения по размерам, показанного на Фиг. 2А.

Напротив, как показано на Фиг. 2С', частицы порошка (2b1), состоящие только из альгината и пектина после 30 дней хранения в условиях ускоренной стабильности, подвергаются значительному расширению распределения по размерам с 20%-ным изменением по отношению к распределению размеров в нулевой момент времени показано на Фиг. 2С.

Композиции в форме порошка согласно изобретению (2d'1) и (2d''1) и сравнительную композицию в форме порошка (2d'''1), полученную с помощью технологии сушки наноспреем, как описано в примере 2А', также анализировали, сканирующей электронной микроскопией (SEM), как описано выше.

Как показано на Фиг. 2D, из анализа DLS было обнаружено, что частицы порошка (2d'1), полученные из водно-спиртовой композиции Н₂О/этанол, имеют средний диаметр менее 0,50 микрона (менее 500 нм) и узкий размер распределения.

Как показано на Фиг. 2Е, из анализа DLS было обнаружено, что частицы порошка (2d'1), полученные из водных композиций, содержащих бикарбонат натрия, имеют средний диаметр приблизительно 0,70 микрона (700 нм) и узкое распределение по размерам.

Как показано на Фиг. 2F, из анализа DLS было обнаружено, что частицы порошка (2d'''1), полученные из водных композиций, содержащих карбонат аммония, имеют средний диаметр приблизительно 1 микрон.

Пример 5 - Время гелеобразования и способность абсорбировать экссудат композицией в форме порошка согласно изобретению

Способность абсорбировать экссудат с течением времени каждой из композиций в форме порошка в соответствии с изобретением (2d1) и (2d2) оценивали, рассчитывая соотношение между содержанием жидкости в равновесии после гелеобразования и массой сухого порошка.

В частности, 15 мг порошка, полученного, как описано в примере 2А, помещали на диск из предварительно взвешенной фильтровальной бумаги. Диск помещали в контакт с донорным отсеком, содержащим смоделированную раневую жидкость (SWF), состав которой содержит 50% фетальной сыворотки теленка (Sigma-Aldrich, Милан, Италия), 50%-ный максимальный восстановительный разбавитель (Sigma-Aldrich, Милан, Италия, состоящий из 0,1% (масса/объем) пептона и 0,9% (масса/объем) хлорида натрия), термостатированный при 37°С.

Массу образующегося геля регистрировали с точной шкалой с точными временными интервалами. Все эксперименты были проведены на минимальном количестве 6 образцов на каждую произведенную партию, и результаты выражены как среднее ± стандартное отклонение. Разница между массой геля, образованного в равновесии, и массой сухого порошка представляет собой массу жидкости, абсорбированной в равновесии, которая была связана с массой сухого порошка.

На Фиг. 3А показано полное гелеобразование субмикрометрического порошка согласно изобретению (2d1).

Графики на Фиг. 3В показывают, что полное гелеобразование субмикрометрического порошка (2d1) и микрометрического порошка (2d2) происходит соответственно приблизительно через 3-5 минут и 5-10 минут.

Эти результаты особенно полезны, поскольку 15 мг композиции альгинат/пектин в форме субмикрометрической порошка, описанной в De Cicco et al., (2014) International Journal of Pharmaceuticalics 473: 30-37, требуют более длительного времени для полного гелеобразования, то есть 10-15 мин.; также 15 мг микрометрического порошка альгината/пектина, описанного в De Cicco F et al. (2014), Carbohydrate Polymers 101: 1216-122, требуют более длительного времени для полного гелеобразования, то есть приблизительно 30 минут.

Кроме того, диаграммы на Фиг. 3В показывают, что способность поглощать экссудат порошком согласно изобретению очень высока; в частности, субмикрометрический порошок (2d1) обладает способностью поглощать экссудат, который в 10-15 раз превышает его сухую массу.

Аналогично приведенному выше описанию была проведена оценка степени гелеобразования 15 мг субмикрометрического порошка (2d1), полученного в примере 2А, по сравнению с 15 мг только альгината, только 15 мг пектина и 15 мг только хитозана, что были получены с помощью того же процесса и с применением тех же рабочих условий, которые описаны в примере 2а.

На Фиг. 3С диаграмма, относящаяся к субмикрометрическому порошку (2d1), подтверждает, что полное гелеобразование 15 мг этого порошка происходит приблизительно через 3-5 минут.

Кроме того, на Фиг. 3С показано, что процент увеличения массы сухого порошка после гелеобразования (Δ) субмикрометрического порошка (2d1) в течение 5 минут от контакта между порошком и смоделированной жидкостью раны составляет приблизительно 1619, то есть приблизительно в 3 раза больше чем порошок на основе только альгината (приблизительно 540) и порошка на основе только пектина (приблизительно 560) и более чем в 3 раза больше, чем порошок на основе только хитозана (приблизительно 515).

Как описано в De Cicco et al., (2014), International Journal of Pharmaceutics 473: 30-37, в течение 5 минут после контакта 15 мг порошка и смоделированной раневой жидкости Δ субмикрометрического порошка альгинат/пектин составляет между 500 и 624, поэтому Δ субмикрометрического порошка (2d1) в 3,2-2,5 раза больше, чем Δ порошка, описанного в этой публикации.

Кроме того, диаграммы на Фиг. 3С показывают, что гель, образованный из порошка согласно изобретению, показывает постоянный объем, как только достигается максимальное поглощение жидкости, тогда как гели, образованные из порошков на основе только пектина или хитозана, показывают с течением времени уменьшение количества поглощаемой жидкости и порошка на основе альгината требуется всего за 30 минут для достижения максимальной абсорбции жидкости.

Точно так же была сделана оценка способности абсорбировать экссудат с течением времени каждой из композиций в форме порошка в соответствии с изобретением (2d'1) и (2d''1) и сравнением (2d'''1).

Полное гелеобразование субмикрометрического порошка (2d'1), полученного из водно-спиртовой композиции, и субмикрометрического порошка (2d''2), полученного из водной композиции, содержащей бикарбонат натрия, происходит соответственно приблизительно за 50 секунд и через 20 секунд.

Эти результаты являются особенно выгодными, поскольку они демонстрируют, что скорость гелеобразования порошков, полученных из конкретных водно-спиртовых композиций или из композиций, содержащих определенные неорганические соли, также лучше, чем скорость гелеобразования субмикрометрического порошка (2d1), полученного из водной композиции без добавления неорганические соли.

Не желая связываться с какой-либо конкретной теорией, авторы настоящего изобретения считают, что в случае частиц порошка (2d'1) удаление водно-спиртового растворителя определяет меньший средний диаметр и более грубую поверхность частиц по отношению к частиц (2d1), такие морфологические параметры определяют уменьшение плотности порошка, который затем образуется в гель с более высокой скоростью, чем порошок (2d1).

В случае частиц порошка (2d''1) удаление водного растворителя, содержащего неорганическую соль, приводит к вспениванию после выделения газообразного CO₂, что, в свою очередь, определяет уменьшение плотности порошка и более высокой скоростью гелеобразования по отношению к порошку (2d1).

Использование водно-спиртовых растворов, в которых используется спирт, отличный от того, который выбран в настоящем изобретении, например пропанол или бутанол, от 2,5 до 25% объем/объем, определило снижение времени гелеобразования по сравнению со временем гелеобразования субмикрометрического порошока (2d1).

Использование неорганической соли, отличной от выбранной в настоящем изобретении, например, карбоната аммония, определило время гелеобразования 4 минуты, которое не улучшилось относительно времени гелеобразования субмикрометрического порошка (2d1), полученного из водной композиции без добавления неорганической соли.

Пример 6 - Оценка адгезионной способности геля, образованного после гелеобразования in situ композиции в форме порошка согласно изобретению.

Адгезионные свойства геля, образованного in situ, оценивали с помощью теста на растягивающее напряжение с использованием прибора для испытания на растяжение Electroforce 3200 (Bose, Eden Prairie, MN) и применения модифицированного протокола в отношении стандарта ASTM D3808.

В частности, приблизительно 15 мг субмикрометрического порошка (2d1), полученного, как описано в примере 2А, поместили в контакт с нитроцеллюлозной мембраной, имеющей размер пор 0,45 мкм и площадь поверхности 3,14 см², предварительно увлажненную SWF. После образования геля мембрану помещали на держатель образца тестера на растяжение. Движение держателя образца было установлено равным 1 мм/мин, что приводило к сжатию геля по отношению к загрузочной головке устройства. Сила, необходимая для отрыва геля от мембраны, на которой он был сформирован, рассчитывалась путем вычисления кривой силы-времени, полученной прибором во время движения образца. Все эксперименты были проведены на минимальном количестве 6 образцов на каждую произведенную партию, и результаты выражены как среднее ± стандартное отклонение.

Было обнаружено, что адгезивная способность указанного геля, образованного in situ, составляет 11,6 кПа с увеличением примерно на 22%, что является лучшим результатом, описанным в статье De Cicco et al. (2014), International Journal of Pharmaceuticalics 473: 30-37, по отношению к гелю, образованному in situ из композиции альгинат/пектин в форме порошка.

Данный результат является особенно выгодным, поскольку он позволяет избежать риска случайного отслоения образовавшегося in situ геля, в то же время позволяя легко удалить гель из раны после использования.

Пример 7. Оценка скорости пропускания водяного пара (WVTR) гелем, образованным после гелеобразования in situ композиции в форме порошка согласно изобретению.

WVTR оценивали, как описано в стандартном протоколе ASTM, 2010.

В частности, приблизительно 25 мм диска геля, образованного in situ из субмикрометрического порошка (2d1), как описано в примере 5, помещали в пластиковую пробирку, содержащую 20 мл дистиллированной воды. Для покрытия края диска использовалась тефлоновая полоска, чтобы избежать утечек с края. Система поддерживалась в инкубаторе при 37°С. Потеря веса регистрировалась с точной шкалой с точными временными интервалами и отслеживалась по времени. Все эксперименты были проведены на минимальном количестве 6 образцов на каждую произведенную партию, и результаты выражены как среднее ± стандартное отклонение.

WVTR рассчитывался по следующей формуле:

WVTR=наклон/A

где

Наклон - это наклон графика

А - площадь поверхности испытуемого образца в м².

Было обнаружено, что WVTR этого геля, образованного in situ, находится в диапазоне от 90 до 95 г/м²/час, что находится в пределах рекомендуемого диапазона (80-105 г/м²/час); из этого результата делается вывод, что гель способен поддерживать сбалансированное увлажнение раны, предотвращая экссудат от определения окклюзионных явлений или возникновения чрезмерного увлажнения раны.

Пример 8 - Сравнительное исследование in vitro заживляющей способности ран путем оценки миграции клеток

Индукцию клеточной миграции новой композицией в форме субмикрометрического порошка (2d1), полученной, как описано в примере 2А, оценивали на клеточной линии НаСаТ (иммортализованные кератиноциты человека, полученные от CLS Cell Lines Service GmbH (Германия). Среда для поддержания клеток, использовали модифицированную по Дульбекко среду Игла (DMEM) с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) с добавлением антибиотиков (10000 Ед/мл пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина).Клетки высевали на 12-луночные планшеты с использованием 5×10⁵ и 10×10⁵ клеток для каждой лунки. Чашки, высеянные, как описано выше, были разделены на шесть групп:

- первую группу из 3 чашек приводили в контакт только с культуральной средой (СРАВНЕНИЕ);

- каждую чашку из второй группы из 3 чашек приводили в контакт с 5,01 мг только альгината (сырье, СРАВНЕНИЕ);

- каждую чашку третьей группы из 3 чашек приводили в контакт с 5,00 мг только пектина (сырье, СРАВНЕНИЕ);

- каждую чашку четвертой группы из 3 чашек приводили в контакт с 5,00 мг только хитозана (сырье, СРАВНЕНИЕ);

- каждую чашку пятой группы из 3 чашек приводили в контакт с 5,01 мг композиции в форме субмикрометрического порошка (2b1) (альгинат/пектин, СРАВНЕНИЕ);

- каждую чашку шестой группы из трех чашек помещали в контакт с 4,99 мг композиции в форме субмикрометрического порошка (2d1) (альгинат/пектин/хитозан, ИЗОБРЕТЕНИЕ).

После 24 часов инкубации, достигнув 100% слияния, в центре клеточного монослоя была сделана канавка с помощью стерильного наконечника пипетки. Все экспериментальные точки обеспечивали лечение миномицином С (10 мкг/мл, Sigma Aldrich) для блокирования клеточного митоза. Клеточный монослой, имеющий срез, инкубировали при 37°С в 5% СО₂ и 95% увлажненной области внутри инкубационной камеры интегрированной рабочей станции Leica AF-6000 LX Live Cell.

Изображения клеток во время эксперимента получали с помощью микроскопа с помощью 10-кратной контрастной линзы, используемой для регистрации движений клеток с частотой захвата 10 минут. Скорость миграции клеток отдельных клеток была определена путем измерения закрытия разреза. Для каждого отдельного разреза было записано 10 различных экспериментальных точек, и для каждой экспериментальной точки было выбрано 10 различных клеток, случайным образом, для измерения расстояния миграции.

На Фиг. 4А показано изображение, представляющее каждую группу клеток: необработанные (CTRL), только альгинат (Alg), только пектин (Pect), только хитозан (Chit), композиция в форме субмикрометрического порошка (2b1) (Alg/Pect), композиция в форме субмикрометрического порошка (2d1) (Alg/Pect/Chit), приобретенного в ходе эксперимента в моменты времени 0 и 24 часа после создания очага клеточного монослоя.

Из изображений на Фиг. 4А можно отметить, что гель, образованный в результате гелеобразования in situ композиции в форме порошка согласно изобретению (2d1), обладает большей способностью стимулировать миграцию клеток и ускорять закрытие раны сравнивали как с гелями, образованными в результате гелеобразования отдельных чистых полимеров, так и с гелями, образованными в результате гелеобразования композиции порошка сравнения (2b1).

На Фиг. 4В показана скорость миграции клеток, выраженная как расстояние (мкм), пройденное за 24 часа, каждой группы клеток: необработанные (CTRL), только альгинат (Alg), только пектин (Pect), только хитозан (Chit), композиция в форме субмикрометрического порошка (2b1) (Alg/Pect), композиция в форме субмикрометрического порошка (2d1) (Alg/Pect/Chit). Каждая цифра представляет три разных эксперимента и выражается как среднее ± стандартное отклонение. Статистические сравнения между группами оценивались с помощью t-критерия. Считалось, что значение Р менее 0,05 указывает на статистически значимое различие.

Гистограмма на Фиг. 4В показывает, что промиграционная способность субмикрометрического порошка (2d1) (ИЗОБРЕТЕНИЕ), состоящего из альгината натрия/пектина/хитозана, значительно больше, чем промиграционная емкость сравнительного субмикрометрического порошка (2b 1), состоящего из альгината натрия/пектина.

Пример 9 - Исследование in vitro высвобождения активного начала

В данном эксперименте высвобождение доксициклина из композиции в форме субмикрометрического порошка (2е1), полученной, как описано в примере 2А, в котором массовое соотношение Alg/Pect/Chit составляет 6/6/1, и из композиций в форме субмикрометрического порошка, которые отличаются от предыдущего только в весовом соотношении Alg/Pect/Chit, которое составляет соответственно 3/1/1 и 1/1/1. В качестве сравнения использовали порошок, состоящий только из доксициклина хиклата (сырье).

Высвобождение доксициклина контролировали с использованием вертикальных диффузионных ячеек типа Франца с SWF в донорном отделении. Все эксперименты были проведены на минимальном количестве 6 образцов на каждую произведенную партию, и результаты выражены как среднее ± стандартное отклонение.

На Фиг. 5 показаны кривые проницаемости композиций в форме субмикрометрического порошка согласно изобретению, в которых массовое соотношение Alg/Pect/Chit составляет соответственно 6/6/1, 3/1/1 и 1/1/1, и кривая проницаемости порошка одного доксициклина (Dox).

Графики на Фиг. 5 демонстрируют, что композиция согласно изобретению может преимущественно инкапсулировать антимикробный агент; кроме того, эти графики демонстрируют, что скорость высвобождения антимикробного агента можно контролировать из-за различного массового соотношения полисахаридов, которые составляют частицы порошка.

При наличии в композиции антимикробный агент способствует полной ликвидации инфекции раны; путем соответствующей модуляции свойств геля, образованного in situ, количество активного ингредиента может высвобождаться сразу после нанесения, а оставшаяся часть с высвобождением, растянутым во времени.

Пример 10 - Исследование способности ингибировать рост микроорганизмов на пищевых продуктах

Способность ингибировать рост микроорганизмов на пищевых продуктах с помощью новой композиции в форме субмикрометрического порошка (2d1), полученной, как описано в примере 2А, оценивали, используя порции домашней птицы и говядины, сохраненные в стандартных условиях (4°С, влажность 75%) в течение 8 дней.

От 5 до 12 мг порошка помещали в стерильные лунки на 6-луночный планшет. Затем на круглых подставках PLA (диаметром 30 мм × 3 мм) были установлены различные кубики домашней птицы, сопоставимые по весу и размерам (приблизительно 2,5 г, 1 см × 1 см), предварительно стерилизованные УФ-излучением, и помещенные в лунки вышеупомянутого планшета. Лунку, содержащую только порошок и подложку, использовали в качестве отрицательного контроля, тогда как лунку, содержащую только мясо и основу, использовали в качестве положительного контроля. Планшет закрывали парафиллумом и инкубировали при 4°С в течение 8 дней. Впоследствии и мясо, и основа были удалены стерильно; жидкости, выделяемые мясом, и порошок, присутствующий в лунках, извлекали с использованием 200 мкл жидкой среды Лурия-Бертани (LB) и помещали на разные чашки с агаром LB и инкубировали с О.Н. при 37°С. Результаты были представлены в виде общего прямого количества бактерий на поверхности, составляющей 25% чашки, и затем нормализации по отношению к общей поверхности чашки.

Все протестированные порошки продемонстрировали способность сильно уменьшать бактериальный заряд, присутствующий в жидкостях, которые обычно выделяются мясом из исследования и которые представляют собой воду, составляющую мясо в течение периода консервации; то есть жидкость, получаемая в результате явления «потеря при вытекании сока» или потерь жидкости при капании во время обработки и консервации. Эксперименты проводились при отсутствии контакта между образцами мяса и порошком, который был нанесен под круглые опоры PLA, на которых лежали мясные кубики, чтобы образовать гель при контакте с капельными жидкостями.

После 8 дней инкубации при 4°С изображения групп образцов получали с помощью микроскопа с контрастной линзой 2.5х.

На Фиг. 7А показано репрезентативное изображение каждой группы, соответственно, необработанное мясо (CTRL+), порошок (2d1) (CTRL-), мясо + порошок (2d1) 200:1 масса/масса (А), мясо + порошок (2d1) 300:1 масса/масса (В), мясо + порошок (2d1) 400:1 масса/масса (С) и мясо + порошок (2d1) 500:1 масса/масса (D).

Из изображений на Фиг. 7А можно отметить, что необработанное мясо (CTRL+) имеет высокий и рассеянный бактериальный заряд в отличие от порошка (2d1) (CTRL -), который не имеет значительного бактериального заряда, и мяса + порошка (2d1) 200:1 масса/масса (А), мясо + порошок (2d1) 300:1 масса/масса (В), масса + порошок (2d1) 400:1 масса/масса (С) и мясо + порошок (2d1) 500:1 масса/масса (D), у которых бактериальный заряд ниже CTRL+ и пропорционален количеству порошка (2d1, ИЗОБРЕТЕНИЕ), использованного в оценочных тестах.

Гистограмма на фиг. 7В показывает микробный заряд, выраженный в КОЕ/мл каждой группы, соответственно необработанное мясо (CTRL+), порошок (2d1) (CTRL-), мясо + порошок (2d1) 200:1 масса/масса (А), мясо + порошок (2d1) 300:1 масса/масса (В), мясо + порошок (2d1) 400:1 масса/масса (С) и мясо + порошок (2d1) 500:1 масса/масса (D).

Каждая цифра представляет три разных эксперимента и выражается как среднее ± стандартное отклонение. Статистические сравнения были оценены с помощью t-критерия. Считалось, что значения Р менее 0,01 (**) и Р менее 0,005 (***) указывают на статистически значимое различие.

Проведенные исследования позволяют показать, что в мясе, консервированном в течение 8 дней в стандартных условиях (4°С, влажность 75%), соотношение массы мяса и порошка (2d1) между 200:1 снижает микробный заряд в организме капельная жидкость на 94% по отношению к положительному контролю (CTRL+), образованная капельной жидкостью только мяса, не обработанного порошком согласно изобретению; если соотношение массы мяса и порошка (2d1) составляет 300:1, бактериальный заряд уменьшается на 75%.

Данные, наложенные на вышеприведенные, были получены с использованием говядины.

В заключение, как описано в примере 5, композиция согласно изобретению имеет более короткие времена гелеобразования, чем времена гелеобразования композиции альгинат/пектин, описанные De Cicco et al. (2014), International Journal of Pharmaceuticalics 473: 30-37 и высокая способность абсорбировать экссудат. Кроме того, как описано в примере 5, гель, образованный in situ, когда композицию согласно изобретению приводят в контакт с раной, обладает улучшенной адгезионной способностью по сравнению с адгезивной способностью геля, описанного в De Cicco et al, (2014), International Journal of Pharmaceutics 473: 30-37.

Как описано в примере 7, гель, образованный композицией согласно изобретению, также имеет скорость пропускания водяного пара, которая достаточна для поддержания сбалансированной гидратации раны.

Как показано в примере 8, конкретная композиция согласно изобретению улучшает миграцию клеток статистически значимым образом по сравнению с композицией альгинат/пектин, поэтому ее использование в форме порошка является важной помощью в процессе заживления ран.

Как показано в примере 9, конкретная композиция согласно изобретению может преимущественно инкапсулировать антимикробный агент; кроме того, скорость высвобождения антимикробного агента преимущественно можно контролировать из-за различного массового соотношения полисахаридов, которые составляют частицы порошка.

Как показано в примере 10, конкретная композиция согласно изобретению способна контролировать развитие микробов даже без добавления активных ингредиентов, обладающих антимикробной активностью. Следовательно, композиция может быть с пользой использована в области пищевых продуктов, в частности, в области консервирования пищевых продуктов. Свежие продукты, например мясо, фрукты, овощи и т.д., выделяют жидкости, которые увеличивают вероятность микробного загрязнения и сокращают срок хранения продуктов. Порошок, образующий гель in situ, являющийся адсорбентом жидкостей и влаги, позволяет продлить качество, безопасность и органолептические свойства пищевых продуктов, служит активной упаковкой для свежих пищевых продуктов.

Наконец, как описано в примере 2, дополнительным преимуществом композиции согласно изобретению является то, что она позволяет проводить процесс распыления в более мягких условиях как в случае сушки наноспреем, так и в случае сушки с минираспылением.

Дополнительные преимущества композиции в форме порошка согласно изобретению представлены наличием адекватной текучести, так что порошок может диффундировать на рану, и способностью образовывать барьерный гель, который полностью заполняет полость раны, минимизируя бактериальный заряд и образование экссудата; способность уменьшать боль и потерю крови при очистке раны, потому что она сохраняет свойства геля с течением времени, даже если рана не производит экссудата; низкая системная токсичность или отсутствие таковой; будучи биоразлагаемым.

Все перечисленные выше признаки демонстрируют, что конкретная композиция в форме порошка, являющаяся объектом изобретения, способна улучшить лечение кожных ран, особенно хронических и/или язвенных ран, и представляет собой улучшение по сравнению с предшествующим уровнем техники.

Объектом настоящего изобретения является композиция в форме порошка, содержащая следующие полисахариды: альгиновую кислоту или альгината натрия, пектин, хитозан, где содержание полисахаридов составляет по меньшей мере 20 мас.% по отношению к общей массе порошка. Способ получения указанного порошка с помощью процесса распыления и его использование для лечения кожных ран и в области консервирования пищевых продуктов являются дополнительными объектами изобретения. Кроме того, дополнительными объектами изобретения являются композиция в форме раствора или жидкой суспензии, которая представляет собой исходный материал для получения указанного порошка, и способ получения указанной жидкой композиции. 6 н. и 9 з.п. ф-лы, 23 ил., 10 пр.

1. Абсорбирующая композиция в форме порошка для лечения кожных ран, содержащая следующие полисахариды:

- от 40 до 50 мас.% альгината натрия,

- от 40 до 50 мас.% пектина,

- от 5 до 15 мас.% хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов,

где мас.% полисахаридов составляет по меньшей мере 20% по отношению к общей массе порошка.

2. Абсорбирующая композиция в форме порошка для консервации пищевых продуктов, содержащая следующие полисахариды:

- альгиновую кислоту или альгинат натрия,

- пектин,

- хитозан,

где мас.% полисахаридов составляет по меньшей мере 20% по отношению к общей массе порошка.

3. Композиция по п. 1 или 2, где

- альгиновая кислота или альгинат натрия имеет содержание остатков маннуроновой кислоты 55 мас.% или более, предпочтительно более 60 мас.%; предпочтительно от 55 до 75 мас.%, более предпочтительно от 60 до 73 мас.% по отношению к общей массе альгиновой кислоты или альгината натрия соответственно;

и/или

- пектин имеет степень амидирования (DA) 2% или более, предпочтительно более 3%; предпочтительно от 2 до 30%, более предпочтительно от 3 до 25%;

и/или

- пектин имеет степень метоксилирования (DM) 48 % или менее, предпочтительно менее 40%; предпочтительно от 20 до 48%, более предпочтительно от 25 до 40%;

и/или

- хитозан имеет молекулярную массу 400000 Да или менее, предпочтительно менее 200000 Да; предпочтительно от 15000 до 400000 Да, более предпочтительно от 50000 до 200000 Да.

4. Композиция по любому из пп. 1-3, также содержащая:

- по меньшей мере один дополнительный полисахарид, предпочтительно выбранный из декстрана, α- и β-гликанов, каррагинана, гепарина, гиалуроновой кислоты и гиалуроната натрия, и/или

- по меньшей мере один ингредиент, выбранный из: успокаивающих средств, заживляющих агентов, факторов роста, пептидов, противовоспалительных агентов и противомикробных препаратов, и/или

- по меньшей мере одну неорганическую соль, выбранную из карбоната натрия и бикарбоната натрия или калия.

5. Композиция по п. 2, содержащая следующие полисахариды:

- от 15 до 60 мас.% альгиновой кислоты или альгината натрия,

- от 15 до 60 мас.% пектина,

- от 5 до 70 мас.% хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов.

6. Композиция по п. 2, содержащая:

- от 25 до 60 мас.% альгината натрия,

- от 25 до 60 мас.% пектина,

- 5 до 50 мас.% хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов.

7. Композиция по п. 1, состоящая из:

- 46 мас.% альгината натрия,

- 46 мас.% пектина,

- 7 мас.% хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов,

где

содержание маннуроновой кислоты в альгинате натрия составляет от 55 до 75 мас.% по отношению к общей массе альгината натрия;

степень амидирования (DA) пектина составляет от 2 до 30%, и степень его метоксилирования (DM) составляет от 20 до 48%;

хитозан имеет молекулярную массу от 15000 до 400000 Да.

8. Композиция по любому из пп. 2-6, состоящая из:

- 26 мас.% альгината натрия,

- 26 мас.% пектина,

- 47 мас.% хитозана

по отношению к общей массе полисахаридов,

где

содержание маннуроновой кислоты в альгинате натрия составляет от 55 до 75 мас.% по отношению к общей массе альгината натрия;

степень амидирования (DA) пектина составляет от 2 до 30%, и/или степень его метоксилирования (DM) составляет от 20 до 48%;

хитозан имеет молекулярную массу от 15000 до 400000 Да.

9. Композиция в форме порошка по любому из пп. 1-8,

- содержащая по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 99,9%, или состоящая на 100% из полисахаридов по отношению к общей массе порошка,

и/или

- имеющая диаметр частиц от 100 нм до 5 мкм, предпочтительно от 200 нм до 2,5 мкм, еще более предпочтительно от 400 нм до 800 нм.

10. Композиция в форме порошка по п. 1 для применения при лечении кожных ран.

11. Применение композиции в форме порошка по п. 1 для нанесения на кожные раны.

12. Применение композиции в форме порошка по п. 2 для консервации пищевых продуктов в области пищевых продуктов.

13. Автоматизированный способ получения композиции в форме порошка по любому из пп. 1-8 с помощью технологии распылительной сушки с использованием следующих рабочих параметров:

- температура на входе композиции в форме жидкого раствора или суспензии составляет от 50 до 60°С, где указанная композиция содержит следующие полисахариды:

- альгиновую кислоту или альгинат натрия,

- пектин,

- хитозан,

где

- альгиновая кислота или альгинат натрия присутствует в количестве от 15 до 60 мас.%,

- пектин присутствует в количестве от 15 до 60 мас.%,

- хитозан присутствует в количестве от 5 до 70 мас.%

по отношению к общей массе полисахаридов;

- скорость подачи распылителя 9,5 мл/мин;

- диаметр распылительного сопла 4,0 мкм;

- поступающий воздушный поток 100 л/мин;

- давление в сушильной камере 38 мбар;

- относительная скорость распыления 100%.

14. Способ получения композиции в форме жидкого раствора или суспензии, содержащей следующие полисахариды:

- альгиновую кислоту или альгинат натрия,

- пектин,

- хитозан,

где

- альгиновая кислота или альгинат натрия присутствует в количестве от 15 до 60 мас.%,

- пектин присутствует в количестве от 15 до 60 мас.%,

- хитозан присутствует в количестве от 5 до 70 мас.%

по отношению к общей массе полисахаридов, где способ включает следующий этап:

a) добавления водного раствора альгиновой кислоты или альгината натрия и пектина к коллоидному раствору хитозана,

b) повышения pH полученной композиции до значения pH от 4,5 до 6,5 с использованием 0,1 М водного раствора NaOH,

c) необязательно, добавления

раствора по меньшей мере одного дополнительного полисахарида, выбранного из декстрана, α- и β-гликанов, каррагинана, гепарина, гиалуроновой кислоты и гиалуроната натрия,

и/или

раствора по меньшей мере одного ингредиента, выбранного из: успокаивающих средств, заживляющих агентов, факторов роста, пептидов, противовоспалительных агентов и противомикробных препаратов,

и/или

по меньшей мере одной неорганической соли, выбранной из карбоната натрия и бикарбоната натрия или калия.

15. Способ по п. 14, включающий следующий этап:

- A) добавления водного раствора альгиновой кислоты или альгината натрия и пектина к коллоидному раствору хитозана и триполифосфата натрия,

- B) повышения pH полученной композиции до значения pH от 4,5 до 6,5 с использованием 0,1 М водного раствора NaOH,

- C) необязательно, добавления

раствора по меньшей мере одного дополнительного полисахарида, выбранного из декстрана, α- и β-гликанов, каррагинана, гепарина, гиалуроновой кислоты и гиалуроната натрия, предпочтительно выбранного из гиалуроновой кислоты и гиалуроната натрия,

и/или

раствора по меньшей мере одного ингредиента, выбранного из: успокаивающих средств, заживляющих агентов, факторов роста, пептидов, противовоспалительных агентов и противомикробных препаратов.