КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ НЕДЕРЖАНИЯ МОЧИ, ГИПЕРАКТИВНОСТИ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ИЛИ МЕНСТРУАЛЬНЫХ СПАЗМОВ Российский патент 2023 года по МПК A61K35/747 A61P13/06 A61P13/10 A61L15/36 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Во всем мире приблизительно 800 миллионов человек страдают недержанием мочи (UI), и 70% из них составляют женщины. Ургентное недержание мочи (UUI) представляет собой одну из форм UI. Гиперактивность мочевого пузыря (OAB) может включать мышечные спазмы мышц мочевого пузыря, из-за которых у человека может возникнуть ощущение, что ему нужно осуществить мочеиспускание, но может не происходить вытекание мочи. У некоторых пациентов с UUI или OAB может возникнуть ощущение потребности немедленно осуществить мочеиспускание независимо от того, переполнен ли мочевой пузырь. Ощущение наполнения мочевого пузыря может вовлекать различные части нервной системы человека и в конечном итоге может привести к сокращению мышц мочевого пузыря, особенно мышцы детрузора, во время мочеиспускания.

Несмотря на большое количество людей с UI, существует нехватка достаточного длительного лечения. Существуют различные продукты, предусматривающие возможность уменьшения симптомов недержания или оказания помощи без медицинского вмешательства, однако эти продукты могут вовлекать введение различных физических продуктов или обеспечение различных стимуляций рядом с мочевым пузырем человека.

Кроме того, менструальные спазмы как часть менструального цикла женщины представляют собой состояние, с которым значительная часть женщин сталкивается на регулярной основе. Менструальные спазмы возникают из-за сокращения матки, и их количество и тяжесть могут варьироваться в зависимости от различных случаев гормонального дисбаланса. Существуют различные варианты лечения для уменьшения менструальных спазмов, однако возможности для улучшения и более естественные решения все еще существуют.

Соответственно, существует потребность в композициях и способах предупреждения или лечения недержания мочи, гиперактивности мочевого пузыря или менструальных спазмов у субъекта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время неожиданно было обнаружено, что штаммы бактерий Lactobacillus или их ферменты или метаболиты могут служить в качестве модифицирующих средств, которые могут обеспечивать нейромодулирующую активность посредством активации определенных ферментов и генов, что может приводить к снижению сократительной способности мышц. Такие модифицирующие средства могут также уменьшить количество внеклеточного АТФ в целевой среде, что может помочь снизить сократительную способность мышц и органов, например мочевого пузыря. Таким образом, неожиданное открытие модифицирующих средств на основе определенных lactobacilli или их ферментов или метаболитов можно использовать в композиции для предупреждения или лечения недержания мочи, гиперактивности мочевого пузыря или менструальных спазмов у субъекта.

В одном аспекте предусмотрен способ предупреждения или лечения недержания мочи, гиперактивности мочевого пузыря или менструальных спазмов у субъекта. Способ может включать получение композиции. Композиция может включать модифицирующее средство, содержащее штамм Lactobacillus или его фермент или метаболит. Модифицирующее средство может обеспечивать нейромодулирующую активность посредством активации по меньшей мере одного из ферментов maoA, ферментов maoB и генов grin-1. Способ также может включать введение композиции субъекту для предупреждения или лечения недержания мочи, гиперактивности мочевого пузыря или менструальных спазмов.

В другом аспекте предусмотрен способ предупреждения или лечения недержания мочи, гиперактивности мочевого пузыря или менструальных спазмов у субъекта. Способ может включать получение композиции. Композиция может включать модифицирующее средство, содержащее штамм Lactobacillus или его фермент или метаболит. Модифицирующее средство может уменьшать количество АТФ в целевой среде. Способ также может включать введение композиции субъекту для предупреждения или лечения недержания мочи, гиперактивности мочевого пузыря или менструальных спазмов.

В еще другом аспекте композиция может включать носитель и модифицирующее средство. Модифицирующее средство может содержать штамм Lactobacillus gasseri или его фермент или метаболит, выбранный из группы, состоящей из: Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125162, Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125163 и их комбинаций.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Полное и достаточное раскрытие настоящего изобретения, предназначенное для специалиста в данной области техники, изложено более конкретно в остальной части описания, в которой предусмотрены ссылки на прилагаемые графические материалы, на которых:

На фиг. 1A представлен график, изображающий кратное изменение экспрессии maoA для первого набора образцов.

На фиг. 1B представлен график, изображающий кратное изменение экспрессии maoA для второго набора образцов.

На фиг. 2A представлен график, изображающий кратное изменение экспрессии maoB для первого набора образцов.

На фиг. 2B представлен график, изображающий кратное изменение экспрессии maoB для второго набора образцов.

На фиг. 3A представлен график, изображающий кратное изменение экспрессии grin-1 для первого набора образцов.

На фиг. 3B представлен график, изображающий кратное изменение экспрессии grin-1 для второго набора образцов.

На фиг. 4 представлен график, отображающий яркость изображения притока кальция в различных образцах из видов Lactobacillus или Lactococcus.

На фиг. 5A представлен график, изображающий сокращение мышц в зависимости от времени для образцов, включающих Lactobacillus gasseri и/или Escherichia coli и DMEM.

На фиг. 5B представлен график, изображающий сокращение мышц в зависимости от времени для образцов, включающих Lactobacillus gasseri и/или Proteus mirabilis и DMEM.

На фиг. 6A представлен график, отображающий яркость изображения притока кальция в различных образцах, включая LPS.

На фиг. 6B представлен график, отображающий яркость изображения притока кальция в отношении E. coli с течением времени.

На фиг. 6C представлен график, отображающий яркость изображения притока кальция в отношении E. faecalis с течением времени.

На фиг. 7A представлен график, отображающий яркость изображения притока кальция в образцах E. coli и/или L. crispatus.

На фиг. 7B представлен график, отображающий яркость изображения притока кальция в образцах E. coli и/или L. gasseri.

На фиг. 7C представлен график, отображающий яркость изображения притока кальция в образцах серийных разведений искусственной мочи (AU)/E. coli и L. crispatus/E. coli.

На фиг. 8A представлен график, изображающий количественную оценку внеклеточного АТФ из супернатантов E. coli и E. faecalis по сравнению с AU.

На фиг. 8B представлен график, изображающий количественную оценку внеклеточного АТФ из супернатантов E. coli, L. crispatus, L. gasseri и G. vaginalis по сравнению с AU.

На фиг. 8C представлен график, изображающий количественную оценку внеклеточного АТФ из L. crispatus, L. gasseri и L. vaginalis из супернатантов по сравнению с AU.

На фиг. 8D представлен график, изображающий количественную оценку внеклеточного АТФ из L. crispatus, выращенного в AU, по сравнению с AU, дополненной АТФ.

На фиг. 8E представлен график, изображающий количественную оценку L. crispatus, культивируемых при различных концентрациях АТФ.

На фиг. 8F представлен график, изображающий количественную оценку E.coli, культивированной при различных концентрациях АТФ.

На фиг. 8G представлен график, изображающий количественную оценку L. crispatus в AU, дополненной E. coli, по сравнению с L. crispatus в AU.

На фиг. 8H представлен график, изображающий количественную оценку L. crispatus в AU, дополненной G. vaginalis, по сравнению с L. crispatus в AU.

На фиг. 8I представлен график, изображающий количественную оценку внеклеточного АТФ из различных образцов E. coli и L. crispatus и их комбинации в AU.

На фиг. 8J представлен график, изображающий количественную оценку внеклеточного АТФ из различных образцов G. vaginalis и L. crispatus и их комбинации в AU.

На фиг. 8K представлен график, изображающий pH в образцах L. crispatus в AU по сравнению с L. crispatus в супернатанте G. vaginalis и AU.

На фиг. 8L представлен график, изображающий количественную оценку внеклеточного АТФ из различных образцов уротелиальных клеток.

На фиг. 9A представлен график, изображающий количественную оценку E. coli, культивированной в различных концентрациях ципрофлоксацина (Cip).

На фиг. 9B представлен график, изображающий количественную оценку внеклеточного АТФ из различных образцов E. coli и ципрофлоксацина.

На фиг. 10A представлен график, отображающий яркость изображения притока кальция в образцах с нейротрансмиттером γ-аминомасляной кислотой (GABA) и GABA, включенной с АТФ, по сравнению с АТФ.

На фиг. 10В представлен график, отображающий яркость изображения притока кальция в образцах с GABA и GABA, включенной с E. coli, по сравнению с E. coli.

На фиг. 11A представлен график, изображающий кратное изменение экспрессии гена maoA в E. coli и L. crispatus.

На фиг. 11B представлен график, изображающий кратное изменение экспрессии гена maoB в E. coli и L. crispatus.

На фиг. 12A представлен график, изображающий процент сокращения клеток миофибробластов, засеянных поверх коллагенового матрикса, испытанного в отношении различных бактериальных образцов, включая L. crispatus и/или E. coli.

На фиг. 12B представлен график, изображающий процент сокращения клеток миофибробластов, засеянных поверх коллагенового матрикса, испытанного в отношении различных бактериальных образцов, включая L. gasseri и/или E. coli.

На фиг. 12C представлен график, изображающий процент сокращения клеток миофибробластов, засеянных поверх коллагенового матрикса, испытанного в отношении различных образцов, включая GABA.

На фиг. 12D представлен график, изображающий процент сокращения клеток миофибробластов, засеянных поверх коллагенового матрикса, испытанного а отношении различных бактериальных образцов, включая E coli и E. Coli с GABA.

На фиг. 12E представлен график, изображающий процент сокращения клеток миофибробластов, засеянных поверх коллагенового матрикса, испытанного в отношении LPS.

На фиг. 13A представлен график, изображающий яркость изображения α-SMA образцов E. coli и L. crispatus по сравнению с образцом DMEM с FBS.

На фиг. 13B представлен график, изображающий кратное изменение количества альфа-актина гладких мышц (α-SMA) для L. crispatus и/или E coli по сравнению с образцом DMEM с FBS.

На фиг. 13C представлен график, изображающий кратное изменение количества TNF-α для L. crispatus и/или E coli по сравнению с образцом DMEM с FBS.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Используемый в данном документе термин «впитывающее изделие» относится к изделию, которое может быть помещено на теле носящего или в непосредственной близости от него (т. е. примыкая к телу) для впитывания и удерживания различных жидких, твердых и полутвердых продуктов выделения, выходящих из организма. Следует учитывать, что настоящее описание применимо к различным одноразовым впитывающим изделиям, включая без ограничения подгузники, трусы-подгузники, трусы для приучения к горшку, трусы для подростков, плавкам, гигиенические продукты для женщин, включая без ограничения прокладки или трусы при менструации, продукты для страдающих недержанием, предметы медицинской одежды, хирургические прокладки и бандажи, другие предметы личной гигиены или предметы одежды медико-санитарного назначения и т. п., без отступления от объема настоящего изобретения.

Используемые в данном документе термины «фермент» и «метаболиты» относятся к любому продукту, побочному продукту или веществу, полученному в результате культивирования бактерий, включая супернатант, плюс любые оставшиеся бактерии (мертвые или живые). Фермент или метаболит могут быть дополнительно обработаны посредством экстракции, фильтрации и/или других процедур.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам, применимым для предупреждения или лечения недержания мочи, гиперактивности мочевого пузыря или менструальных спазмов у субъекта.Композиции могут быть составлены с возможностью введения субъекту посредством местного нанесения в различных формах, включая, помимо прочего, жидкость, крем, гель или спрей. В качестве альтернативы или дополнения, композиции могут быть введены субъекту посредством механизма доставки, такого как, например, подложка в виде салфетки, или путем нанесения на впитывающее изделие, которое может доставлять композицию субъекту. Другой путь составления композиций для введения субъекту может заключаться в том, чтобы композиция была составлена в форме пилюли, которую субъект может принимать внутрь.

Хотя это может быть трудно представить, считается, что мышца детрузора, которая контролирует мочеиспускание, может быть подвержена влиянию бактерий, присутствующих в уротелиальном слое. Уротелий имеет толщину всего 3-5 мм, и известно, что уропатогены повреждают и проникают в этот слой. Уротелиальные клетки сообщаются с субуретральной тканью, которая содержит нервные окончания и миофибробласты, а также с гладкомышечными клетками, высвобождая некоторые возбудительные соединения. Считается, что бактериальные соединения могут индуцировать дополнительное высвобождение возбудительных соединений уротелиальными клетками в субуретральное пространство и отправку сигналов в мозг, ложно указывающих на то, что просвет находится под напряжением, ассоциированным с полным мочевым пузырем, тем самым индуцируя сокращение гладких мышц и опорожнение, что приводит к UUI или OAB. Считается, что определенные комменсальные бактерии играют роль во вмешательстве в патогенез UUI путем, который может позволить лучше контролировать сокращения мышц мочевого пузыря.

Различные бактериальные штаммы были собраны, идентифицированы и протестированы на нейромодулирующую активность. Нейромодулирующую активность проверяли путем поиска увеличения кратности изменения количества ферментов моноаминоксидазы A и B (maoA и maoB) и увеличения количества генов grin-1. Эти специфические ферменты и ген были выбраны для тестирования, потому что maoA и maoB являются ферментами, разрушающими биологические амины, включая нейротрансмиттеры серотонин, норэпинефрин, фенилэтиламины и дофамин. Эти нейротрансмиттеры, как известно, играют роль касательно частоты мочеиспускания, максимальной емкости мочевого пузыря и сокращения мышц мочевого пузыря. Grin-1 является важной субъединицей рецептора глутамата, которая образует закрытый ионный канал. Ионный канал контролирует поток Ca2+, ключевого двухвалентного катиона, необходимого для сокращения мышц мочевого пузыря.

Для тестирования нейромодулирующей активности были протестированы два набора образцов бактерий. Первый набор образцов бактерий, который будет описан для результатов тестирования на фиг. 1A, 2A и 3A включал Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Lactobacillus crispatus. Эти бактериальные образцы были протестированы в искусственной моче, также как и образцы в супернатанте (обозначены буквой S на фиг. 1A, 2A и 3A). Искусственная моча, использованная в этом тестировании, описана в данном документе в разделе «Материалы и способы тестирования». Бактериальные образцы представляли собой среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI), которую также тестировали в качестве контроля как в моче, так и отдельно.

Второй набор бактерий собирали из мочи различных субъектов исследования. В исследование были включены субъекты, страдающие UUI, а также субъекты, которые не страдали UUI. Мочу собирали через катетер, поэтому бактерии, собранные во втором наборе бактерий для тестирования, происходят из мочевого пузыря, а не из уретры или внешних мочеполовых тканей. Мочу культивировали в отношении жизнеспособных бактерий с использованием метода расширенного количественного культивирования, как описано в журнальной статье Hill et al.(Hilt, E. E., Mckinley, K., Pearce, M. M., Rosenfeld, A. B., Zilliox, M. J., Mueller, E. R., Brubaker, L., Gai, X., Wolfe, A. J., and Schreckenberger, P. C. (2013). Urine Is Not Sterile: Use of Enhanced Urine Culture Techniques To Detect Resident Bacterial Flora in the Adult Female Bladder. Journal of Clinical Microbiology, 52(3), 871-876. Retrieved March 1, 2016). Второй набор бактерий будет описан для результатов тестирования на фиг. 1B, 2B и 3B, включая Staphylococcus hominis 7134-1, Staphylococcus hominis 7134-7, Staphylococcus hominis 7144-1, Staphylococcus epidermidis 7171-2, Enterococcus faecalis 7171-3, Streptococcus pyogenes 7171-4, Escherichia coli 7171-8, Streptococcus mitis 7317-1A, Alloscardovia omnicolens 7317-2, Bifidobacterium breve 7317-3, Bifidobacterium breve 7317-4, Lactobacillus gasseri 7135-1 и Lactobacillus gasseri 7171-1. Также во втором наборе бактерий для тестирования тестировали среду сердечно-мозговым экстрактом (BHI) и RPMI 1, BHI и RPMI 2, агар Мана, Рогозы и Шарпа (MRS) и RPMI, RPMI 1 и RPMI 2, тестированные в качестве контролей. Бактерии из второго набора были идентифицированы с помощью матричной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF). Второй набор бактерий инкубировали с линиями клеток мочевого пузыря человека (5637 и Т24).

Обращаясь теперь к фиг. 1A и 1B, исследование экспрессии гена было проведено для определения кратного изменения экспрессии maoA для первого набора образцов бактерий (фиг. 1A) и для второго набора образцов бактерий (фиг. 1B). Как показано на фиг. 1A и 1B, штаммы Lactobacillus gasseri на фиг. 1B продемонстрировали значительное увеличение кратного изменения maoA по сравнению с другими штаммами бактерий мочевого пузыря. На фиг. 2A и 2B показано тестирование первого и второго набора образцов бактерий соответственно для экспрессии гена maoB, и аналогично на фиг. 1A и 1B продемонстрировано усиление экспрессии maoB по сравнению с другими протестированными штаммами бактерий штаммами L. gasseri.

На фиг. 3A и 3B изображено кратное изменение экспрессии генов grin-1 для первого и второго набора бактериальных образцов соответственно. Штаммы бактерий L. gasseri из второго набора бактериальных образцов, показанных на фиг. 3B снова продемонстрировали значительное усиление экспрессии grin-1 по сравнению с другими бактериальными образцами. Звездочки, использованные на фиг. 1A-3B демонстрируют значительное увеличение или различие.

Анализируя результаты тестирования экспрессии ферментов и генов на фиг. 1A-3B, стоит отметить, что образцы бактерий, включая Lactobacillus crispatus, также обеспечивали некоторое усиление экспрессии maoB (фиг. 2A) и grin-1 (фиг. 3A), однако, не до того же уровня усиления экспрессии maoB и grin-1, как штамм Lactobacillus gasseri. Кроме того, бактериальные образцы Lactobacillus crispatus не повышали уровень фермента maoA, как показано на фиг. 1А. Это дало неожиданный результат: тестированные штаммы бактерий Lactobacillus gasseri обеспечивали усиленную экспрессию всех трех из maoA, maoB и grin-1, в то время как бактерии Lactobacillus crispatus из того же рода обеспечивали лишь небольшое усиление экспрессии maoB и grin-1 и снижение экспрессии фермента maoA.

Дополнительные испытания были проведены для определения подавления притока кальция различными образцами бактерий. Бактериальные образцы, протестированные в этом тесте, представляли собой иономицин, MRS, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri KE-1 (обозначение в ATCC No. PTA-125162), Lactobacillus casei ATCC 393, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus plantarum ATCC 15917, Lactobacillus plantarum ATCC 14917, Lactobacillus amylovorous, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus rhamnosus GR-1, Lactobacillus rhamnosus ATCC 21052, Lactobacillus johnsonii, Lactococcus lactis, Lactobacillus paracasei и Lactobacillus reuteri RC-14. Результаты подавления притока кальция проиллюстрированы на фиг. 4. Пунктирная линия на фиг. 4 указывает на подавление притока кальция, тогда как сплошная линия указывает на стимулированный приток кальция. Как показано на фиг. 4, несмотря на количественное увеличение экспрессии grin-1, Lactobacillus gasseri не стимулировал приток кальция в уротелий. Фактически, Lactobacillus gasseri подавляла приток кальция. Для сравнения, многие другие виды бактерий рода Lactobacillus, которые были протестированы, неожиданно характеризовались гораздо более высокими уровнями, представляющими собой уровни яркости, связанные с содержанием кальция, или более низким подавлением притока кальция. Как обсуждалось ранее, ионы Ca2+ являются ключевыми двухвалентными катионами, которые необходимы для сокращения мышц мочевого пузыря, и, таким образом считается, что способность бактерий Lactobacillus gasseri или их ферментов подавлять приток кальция может помочь уменьшить сокращения, связанные с UUI и OAB.

Обращаясь к фиг. 5A и 5B супернатант Lactobacillus gasseri продемонстрировал замедление сокращений в анализе сокращения с участием коллагенового геля по сравнению с супернатантами от уропатогенов Escherichia coli и Proteus mirabilis. Кроме того, сокращения также замедлялись при тестировании супернатанта L. gasseri в сочетании с супернатантом E. coli и P. mirabilis.

Специфические штаммы Lactobacillus gasseri для тестирования, собранные, кульутивированные и протестированные в данном документе, были депонированы в АТСС. Обсуждаемый выше Lactobacillus gasseri 7135-1 получил обозначение № PTA-125163 в Американской коллекции типовых культур (АТСС) (штамм DK1). Геномное секвенирование Lactobacillus gasseri 7135-1 (обозначение в АТСС № PTA-125163) было завершено и опубликовано, получив регистрационные номера в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) BioSample: SAMN11332831 (название образца: LGASSERI-7135) и BioProject: PRJNA530717. Обсуждаемый выше Lactobacillus gasseri 7171-1 получил обозначение № PTA-125162 АТСС (штамм KE1). Геномное секвенирование Lactobacillus gasseri 7171-1 (обозначение в АТСС № PTA-125162) было завершено и опубликовано, получив регистрационные номера в NCBI BioSample: SAMN11332833 (название образца: LGASSERI-7171) и BioProject:PRJNA530718. Оптимально, штаммы L. gasseri выращивают на агаре MRS или бульоне в анаэробных условиях.

Было проведено дополнительное тестирование роли внеклеточного высвобождения аденозинтрифосфата (АТФ) бактериями и его роли в сократимости мышц мочевого пузыря, таких как мышца детрузора. Для этого тестирования ответы хозяина на действие различных урогенитальных бактерий были смоделированы с использованием линий клеток уротелия мочевого пузыря, а затем с помощью анализов сокращения миофибробластов. Ответы измеряли с помощью анализов притока кальция, экспрессии генов и отложения альфа-актина в гладких мышцах.

Приток Ca²⁺ в уроэпителиальные клетки, опосредованный бактериальными супернатантами

Внутриклеточный кальций выполняет множество функций внутри клетки и регулирует важные механизмы, такие как экспрессия генов, метаболизм и пролиферация. Этот приток может быть быстро индуцирован в присутствии АТФ, и ранее было показано, что он обуславливается внеклеточно некоторыми бактериями in vitro. Пациентам с инфекциями мочевыводящих путей часто вводят антибиотики. Это уменьшает количество бактерий в просвете, где они подвергаются воздействию терапевтических концентраций антибиотика. Однако бактерии могут также внутриклеточно внедряться в уротелиальные клетки, где может достигаться только субтерапевтическая концентрация антибиотиков.

Обращаясь к фиг. 6A, супернатант E. coli 1A2 был способен индуцировать приток Ca²⁺. В отличие от предыдущих отчетов, тестирование с липополисахаридами (LPS) не стимулировало быстрого притока кальция в модельном тестировании. Как показано на фиг. 6B, супернатанты из E. coli увеличивали уровни притока Ca²⁺ перед выравниванием примерно через четыре часа. Как показано на фиг. 6С, супернатант из E. faecalis 33186 не демонстрировал значительного увеличения уровней притока Ca²⁺ в период времени до приблизительно пяти часов. В GIS. На фиг. 6A-6C, каждый столбик представляет общую среднюю яркость изображения через 60 секунд после обработки контрольной выборки. Статистическая значимость была определена с использованием критерия Тьюки, p≤0,05, и отмечена тремя звездочками.

Дополнительное тестирование в отношении кальция, представляющее собой тестирование притока, было также выполнено с супернатантами из Lactobacillus crispatus ATCC 33820 и Lactobacillus gasseri штамма KE-1 (обозначение в ATCC № PTA-125162). Как показано на фиг. 7A-7C, добавление супернатантов L. crispatus и L. gasseri продемонстрировало уменьшение притока кальция, вызванного супернатантами E. coli, до пятидесяти процентов. На фиг. 7A-7C, каждая точка представляет среднюю яркость изображения в определенный момент времени. Статистическая значимость была определена с использованием критерия Тьюки, p≤0,05, и отмечена тремя звездочками.

Количественная оценка бактериального внеклеточного АТФ

На фиг.8A-8D, 8I, 8J и 8L отображен подсчет количества внеклеточного АТФ, высвобождаемого различными бактериальными образцами, по сравнению с контрольной AU без бактерий. Люминесцентный анализ использовали для подсчета количества внеклеточного АТФ, высвобождаемого бактериальными супернатантами. Как показано на фиг. 8A, супернатанты E. coli и E. faecalis из ночных культур содержали 10000 ± 900 нМ и 8333 ± 557 нМ АТФ, соответственно, что было выше, чем контроль искусственной мочи (AU), которая содержала 111 ± 10 нМ. Таким образом, уропатогенная E. coli может высвобождать АТФ в AU и вызывать приток кальция. Как показано на фиг. 8B, супернатанты E. coli, L. crispatus и L. gasseri из ночной культуры содержали 0,11 ± 0,01 мкМ, 0,025 ± 0,001 мкМ и 0,023 мкМ АТФ соответственно, что было выше, чем в AU, которая содержала 0,0071 ± 0,0002 мкМ. Кроме того, супернатанты компонентов микробиоты мочи, G. vaginalis ATCC 14018 и L. vaginalis NCFB 2810 содержали 1,36 ± 0,24 мкМ и 0,33 ± 0,032 мкМ АТФ соответственно, что было больше, чем в контроле AU 0,000071 ± 0,000029 мкМ, как показано на фиг. 8B и 8C.

Как показано на фиг. 8D, количество АТФ, оставшееся при выращивании L. crispatus в AU, дополненной 0,1 мМ АТФ в течение 24 часов, составляло 22,89 ± 0,98 мкМ, что составляло меньше половины контроля (49,2 ± 6,3 мкМ) (P≤0,0005). Для дополнительного исследования снижения количества АТФ L. crispatus культивировали в AU, дополненной различными концентрациями АТФ (фиг. 8E), а также в AU, дополненной 50% супернатанта E. coli (фиг. 8G) и 25% супернатанта G. vaginalis (фиг. 8H и 8J) в качестве потенциальных естественных источников АТФ. Рост L. crispatus увеличивался вследствие увеличения концентрации АТФ (фиг. 8E), включая выделение АТФ из супернатантов E. coli и G. vaginalis (фиг. 8H и 8J). Lactobacillus crispatus также снижал количество АТФ после культивирования в течение ночи в AU, дополненной 25% супернатанта E. coli (фиг. 8I) и 25% супернатанта G. vaginalis индивидуально (фиг. 8J). Как показано на фиг. 8F, дополнение E. coli АТФ оказывало некоторый подавляющий эффект на ее рост. В присутствии АТФ или супернатанта из G. vaginalis pH L. crispatus дополнительно снижался, как показано на фиг. 8К. Наконец, как показано на фиг. 8L, тестирование уротелиальных клеток (5637 ATCC) показало, что они содержат 0,0047 ± 0,0008 мкМ АТФ, и после обработки 0,009 мкМ АТФ в течение 2 минут количество АТФ, высвобождаемое уротелиальными клетками, увеличилось до 9,3 ± 0,07 мкМ. На фиг. 8A-8L, статистическая значимость была определена с использованием критерия Тьюки, p≤0,05, и обозначена тремя звездочками (p менее 0,05 *, 0,01 **, 0,001 ***).

Дополнительное тестирование было завершено на E. coli и ее высвобождении АТФ. Тестирование проводилось для определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) и субтерапевтических концентраций воздействия антибиотика ципрофлоксацина (Cip). После культивирования бактерий E. coli с различными концентрациями Cip от 10 мкг/мл до 0,031 мкг/мл, MIC антибиотика к E. coli составляла от 1 до 1,5 мкг/мл, как показано на фиг. 9А. Использование концентраций MIC ципрофлаксацина ниже MIC, составляющей 0,25, 0,125, 0,0625 мкг/мл индуцировало у E. coli высвобождение большего количества АТФ до 0,0261 ± 0,003 мкМ, как показано на фиг. 9B (p менее 0,05 *, 0,01 **, 0,001 ***).

Из результатов, изображенных на фиг. 8L, 9A и 9B, было показано, что субтерапевтическое воздействие ципрофлоксацина индуцировало высвобождение большего количества АТФ E. coli, что, в свою очередь, может влиять на урологически-неврологические состояния и усиливать сокращения мочевого пузыря. Кроме того, роль, которую микробиота мочи пациентов с недержанием мочи может иметь в неконтролируемом мочеиспускании, была дополнительно подтверждена обнаружением большого количества представителя микробиоты, G. vaginalis, высвобождающего сравнительно большие количества АТФ (1,36 ± 0,24 мкМ) (см. фиг. 8B). Если бы эти количества продуцировались in vivo, они, вероятно, обуславливали бы большее высвобождение уротелиальными клетками в субуретральное пространство, что потенциально могло бы привести к митохондриальной дисфункции и апоптозу клеток.

Исследование влияния GABA на приток Са²⁺, вызванный АТФ и бактериальным супернатантом

Для оценки способности нейротрансмиттера γ-аминомасляной кислоты (GABA) ингибировать стимуляцию притока кальция, вызванного АТФ, AU, содержащую 1 мкМ GABA, смешивали с АТФ в AU. Как показано на фиг. 10А, было обнаружено, что GABA снижает стимуляцию притока кальция, вызванного АТФ. Аналогичным образом, чтобы проверить способность GABA снижать стимуляцию притока кальция, вызванного бактериальным супернатантом, GABA смешивали с супернатантом E. coli, и, как показано на фиг. 10B, GABA также продемонстрировала способность подавлять стимуляцию притока кальция, вызванного супернатантом E. coli. Статистическая значимость была определена с использованием критерия Тьюки, p≤0,05, и отмечена тремя звездочками.

Экспрессия moaA и moaB в уротелиальных клетках (5637 ATCC), подвергнутых воздействию бактериальных супернатантов

Посредством повышения уровня внутриклеточного кальция, АТФ может обуславливать митохондриальную дисфункцию. Экспрессия генов митохондриальных ферментов, moaA и moaB, была измерена из-за их потенциальной способности разрушать нейротрансмиттеры, такие как серотонин, норэпинефрин, фенилэтиламины и дофамин. Как упоминалось ранее, эти нейротрансмиттеры, как известно, играют роль в частоте мочеиспускания, максимальной емкости мочевого пузыря и сокращении мышц мочевого пузыря. Супернатанты как чистых культур, так и смесей E. coli и L. crispatus добавляли к культурам 5637 клеток на 3 часа. Экспрессию генов, кодирующих maoA и moaB, измеряли с помощью количественной ПЦР относительно GAPDH (A и BA продемонстрированы на фиг. 11A, супернатант E. coli обуславливал несущественное (1,63 ± 0,05 раза) подавление уровня экспрессии гена maoA, тогда как супернатант L. crispatus обуславливал активацию (1,912 ± 0,093 раза)). Супернатант E. coli не продемонстрировал влияния на экспрессию гена maoB, тогда как супернатант L. crispatus увеличивал его экспрессию в 60 раз, как показано на фиг. 11B.

Анализ сокращения миофибробластов

Бактериальные супернатанты из штаммов E. coli, L. crispatus и L. gasseri KE-1 (обозначение в ATCC № PTA-125162) добавляли к коллагеновому матриксу, в котором содержатся миофибробласты, как из чистой культуры, так и из смесей с DMEM с 2% FBS. Кроме того, в качестве контролей были включены GABA, АТФ и LPS. Анализ сокращения коллагена с использованием клеток первичных миофибробластов, засеянных поверх коллагенового матрикса, был протестирован в отношении бактериальных продуктов. Как показано на фиг. 12A и 12B, супернатант культур E. coli был способен индуцировать наибольшую степень сокращения (72,67%) в линии клеток миофибробластов через 24 часа, и это уменьшалось при добавлении супернатантов L. crispatus или L. gasseri (48,56%, 29,8% соответственно). Как показано на фиг. 12C, чистый АТФ обуславливал сокращение миофибробластов в первый час (30,37%) и это продолжалось в течение 24 часов (68,56%). Хотя GABA не обуславливала сокращения в анализе миофибробластов, она подавляла сокращение, обусловленное E. coli, как показано на фиг. 12D. Основываясь на уже известных литературных источниках, считается, что сокращение, возможно обусловленное E. coli, было вызвано действием LPS. Однако, как показано на фиг. 12E, после пяти часов воздействия LPS на миофибробласты сокращение было вдвое меньше чем то, что было индуцировано АТФ (27,2% по сравнению с 57,5%).

Иммуноцитохимический анализ для определения внутриклеточного альфа-актина в гладких мышцах (α-SMA) и индуцирования TNF-α бактериями

Для дополнительного подтверждения сократительной способности миофибробластов в присутствии бактериальных соединений оценивали влияние на α-SMA. Было высказано предположение, что альфа-актин гладких мышц (α-SMA) играет роль в появлении сократительной способности во время заживления ран и фиброзно-стенозирующих заболеваний. Бактериальные супернатанты из E. coli, L. crispatus и L. gasseri KE-1 (обозначение в ATCC № PTA-125162) и в комбинации культивировали совместно с миофибробластами в течение 1 часа. Супернатант E. coli увеличивал яркость внутриклеточного изображения (38,3 ± 2,5), которая связана с α-SMA (см. фиг. 13A и 13B), и она была снижена L. crispatus (8,2 ± 0,3).

Супернатанты бактерий, идентичные тестированным на фиг. 13A, добавляли к миофибробластам, которые выращивали в коллагеновом матриксе, а затем инкубировали при 37°C с 5% CO₂ в течение 3 часов и тестировали в отношении экспрессии генов. Как показано на фиг. 13B, супернатант E. coli не увеличивал экспрессию α-SMA (изменение в 1,42 ± 0,4 раза), указывая на то, что яркость изображения была связана только с сокращением альфа-актина в гладких мышцах. Lactobacillus crispatus также подавлял уровень экспрессии гена α-SMA (изменение в 2,245 ± 0,6 раза) (см. фиг. 13B), что дает основания предположить, что он потенциально может снизить количество α-SMA. Кроме того, L. crispatus потенциально может снизить экспрессию α-SMA, обусловленную E. coli. Яркость изображения измеряли с помощью конфокальной микроскопии с окрашиванием ДНК синим флуоресцентным красителем 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), чтобы показать окрашивание α-SMA. Чтобы определить, способствует ли длительная активация кальциевого канала апоптозу, обусловленному бактериальными компонентами, в качестве индикатора измеряли фактор некроза опухоли альфа (TNF-α). E. coli обуславливала более чем 700-кратную активацию (771 ± 30) TNF-α (фиг. 13C), тогда как воздействие L. crispatus приводило только к четырехкратному увеличению (4,22 ± 1,0). Когда супернатанты E. coli и L. crispatus смешивали и применяли для анализа, экспрессия TNF-α, индуцированная E. coli, сильно снижалась (52,47 ± 7,2), как показано на фиг. 13C.

Для фиг. 13A-13C, статистическая значимость была определена с использованием критерия Тьюки, p≤0,05, и обозначена тремя звездочками (p менее 0,05 обозначено одной звездочкой).

Из проведенных в данном документе испытаний было подтверждено, что L. crispatus и L. gasseri не высвобождают значительных количеств АТФ (см. фиг. 8B), и было обнаружено, что L. crispatus способен снижать уровни АТФ в AU, дополненной 0,1. мМ АТФ (см. фиг. 8D). Кроме того, L. crispatus и L. gasseri подавляли стимуляцию притока кальция, обусловленного соединениями, полученными из E. coli, как показано на фиг. 6A-6C. Были получены предварительные доказательства того, что некоторые комменсальные бактерии могут разлагать или использовать АТФ, при этом L. crispatus снижает его уровень в AU. Испытанные бактериальные штаммы L. gasseri продемонстрировали способность повышать или увеличивать экспрессию maoA, moaB и grin-1, включая ферменты, которые могут разрушать нейроактивные химические вещества, представляющие собой биогенные амины (см. фиг. 1A-3B). L. crispatus продемонстрировал способность активировать maoB (см. фиг. 11B) или увеличивать их количество, но не продемонстрировал способность активировать экспрессию maoA или гена grin-1 (см. фиг. 1A, 3A, 11A) статистически значимым образом. Существует мнение, что снижение уровня этих митохондриальных ферментов ухудшает неврологические расстройства, а также может быть другим механизмом, с помощью которого комменсальные бактерии смягчают действие этих химических веществ.

Lactobacilli, как правило, ограничиваются гликолитическими и ферментативными путями, которые обеспечивают продуцирование гораздо меньшего количества АТФ, чем дыхательные пути, используемые другими бактериями. Если lactobacilli, присутствующие в микробиоте мочевого пузыря или даже во влагалище, могут улавливать АТФ, они могут не только потенциально предоставить дополнительный источник энергии для бактерий, но и изолировать его от эпителиального слоя, тем самым способствуя гомеостатической среде. Это важные результаты, поскольку было показано, что АТФ обуславливает сокращение миофибробластов (см. фиг. 12C-12E), что позволяет предположить потенциальный механизм преждевременного опорожнения и возможность штаммов lactobacilli вмешиваться в этот процесс. Однако не все протестированные штаммы lactobacilli обязательно обеспечивали защиту от воздействия АТФ. Lactobacillus vaginalis, обычно обнаруживаемая в полости рта, влагалища и кишечника, была ассоциирована с промежуточными степенями бактериального вагиноза и, как было обнаружено, высвобождает 0,33 ± 0,032 мкМ АТФ (см. фиг. 8C), что в несколько раз больше, чем E. coli. Не ограничиваясь теорией, это говорит о том, что определенные lactobacilli на самом деле могут быть частью процесса болезни.

Нейротрансмиттер GABA может продуцироваться бактериями, включая некоторые виды Lactobacillus, и хотя он не обуславливает сокращения миофибробластов, он может подавлять сокращение, вызываемое E. coli (см. фиг. 12C, 12D). Повышение внутриклеточных уровней кальция может приводить к секреции АТФ уротелиальными клетками (см. фиг. 8L), вероятно, с участием двух потенциальных механизмов. АТФ может высвобождаться через каналы, такие как полуканалы коннексина, паннексина, а также через несколько анионных каналов. Возможно, что стимуляция притока кальция в уротелиальные клетки может обуславливать повышенную экспрессию везикулярного переносчика нуклеотидов (VNUT) в клетке и последующее высвобождение АТФ в субуретральный и мышечный слой, обуславливая сокращение мочевого пузыря. Альтернативой является постоянно активированный кальциевый канал, ведущий к перегрузке митохондрий кальцием, апоптозу и высвобождению АТФ из уротелиальных клеток.

Как предполагалось ранее, альфа-актин гладких мышц (α-SMA) играет роль в появлении сократительной способности во время заживления ран и фиброзно-стенозирующих заболеваний. Результаты конфокальной и qPCR в данном документе показывают прямую корреляцию между сокращением α-SMA и индуцированным уропатогенными бактериями сокращением в модели с участием коллагенового геля, как показано на фиг. 13А. Также наблюдалась прямая корреляция между релаксацией α-SMA и подавлением экспрессии α-SMA, и расслаблением, индуцированным L. crispatus. Повышенный уровень внутриклеточного кальция может вызвать переход уротелиальных клеток к фазе апоптоза. TNF-альфа может быть индуктором апоптоза [22], и поэтому способность L. crispatus снижать стимулированную E. coli активацию этого гена в клетках миофибробластов может быть значительной (см. фиг. 13B).

Таким образом, комменсальные представители мочевой микробиоты, в частности L. crispatus и L. gasseri, могут ослаблять способность уропатогенной E. coli стимулировать пути, ассоциированные с такими состояниями, как UUI.

Композиция может быть представлена в самых разнообразных формах, таких как, например, простые растворы (на водной или масляной основе), твердые формы (например, гели или палочки), лосьоны, суспензии, кремы, гели, виды молочка, бальзамы, мази, спреи, эмульсии, масляные смолы, аэрозоли и т. п. Композиции могут быть представлены в жидкой форме различных степеней вязкости. Предпочтительно, композиции, пригодные в настоящем изобретении, являются растворимыми для облегчения введения их состава потребителю.

Носитель

Композиции могут включать носитель. Носитель может быть любым дерматологически приемлемым носителем. Используемый в данном документе термин «дерматологически приемлемый носитель», как правило, относится к носителю, который является подходящим для местного нанесения субъекту и совместим с композициями, включающими модифицирующие средства на основе lactobacilli или их ферменты. Жидкие материалы, представляющие собой носители, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают те, которые широко известны для применения в косметической, фармацевтической и медицинской областях в качестве основы для мазей, лосьонов, кремов, успокаивающих средств, аэрозолей, гелей, суспензий, спреев, пен, средств для промывания и т. п., и могут применяться на установленных для них уровнях. В некоторых вариантах осуществления носитель может составлять от приблизительно 0,01% до приблизительно 99,98% (по общему весу композиции) в зависимости от применяемого носителя.

Предпочтительные материалы, представляющие собой носители, включают материалы, представляющие собой полярные растворители, такие как вода. Другие предполагаемые носители включают смягчающие средства, гигроскопические вещества, полиолы, поверхностно-активные вещества, сложные эфиры, перфторуглероды, силиконы и другие фармацевтически приемлемые материалы, представляющие собой носители. В одном варианте осуществления носитель является летучим, что обеспечивает немедленное нанесение противомикробного ингредиента на требуемую поверхность с улучшением при этом общего впечатления от использования продукта посредством уменьшения времени высушивания. Неограничивающие примеры этих летучих носителей включают диметикон, циклометикон, метилперфторизобутиловый эфир, метилперфторбутиловый эфир, этилперфторизобутиловый эфир и этилперфторбутиловый эфир, 5c5t.

Если композиция образует смачивающую композицию, такую, как описанная ниже для применения с влажной салфеткой, то композиция будет, как правило, содержать воду. Композиции могут соответствующим образом содержать воду в количестве, составляющем от приблизительно 0,01% (по общему весу композиции) до приблизительно 99,98% (по общему весу композиции), или от приблизительно 1,00% (по общему весу композиции) до приблизительно 99,98% (по общему весу композиции), или от приблизительно 50,00% (по общему весу композиции) до приблизительно 99,98% (по общему весу композиции), или от приблизительно 75,00% (по общему весу композиции) до приблизительно 99,98% (по общему весу композиции). В некоторых вариантах осуществления количество воды может составлять от приблизительно 50,00% (по общему весу композиции) до приблизительно 70,00% (по общему весу композиции). В некоторых вариантах осуществления количество воды может составлять более 90,00% (по общему весу композиции).

Смягчающие средства

В одном варианте осуществления композиции могут необязательно содержать одно или более смягчающих средств, которые, как правило, используются для смягчения, успокаивания и иным образом разглаживания и/или увлажнения кожи. Подходящие смягчающие средства, которые можно включать в композиции, включают масла, такие как алкилдиметиконы, алкилметиконы, алкилдиметиконсополиолы, фенилсиликоны, алкилтриметилсиланы, диметикон, кроссполимеры диметикона, циклометикон, ланолин и его производные, сложные эфиры жирных кислот, жирные кислоты, сложные эфиры глицерина и их производные, сложные эфиры пропиленгликоля и их производные, алкоксилированные карбоновые кислоты, алкоксилированные спирты, жирные спирты и их комбинации.

Некоторые варианты осуществления композиций могут включать одно или более смягчающих средств в количестве, составляющем от приблизительно 0,01% (по общему весу композиции) до приблизительно 20% (по общему весу композиции), или от приблизительно 0,05% (по общему весу композиции) до приблизительно 10% (по общему весу композиции), или от приблизительно 0,10% (по общему весу композиции) до приблизительно 5% (по общему весу композиции).

Сложные эфиры

В некоторых вариантах осуществления композиции включают один или более сложных эфиров. Сложные эфиры могут быть выбраны из цетилпальмитата, стеарилпальмитата, цетилстеарата, изопропиллаурата, изопропилмиристата, изопропилпальмитата и их комбинаций. Жирные спирты включают октилдодеканоловый, лауриловый, миристиловый, цетиловый, стеариловый, бегениловый спирты и их комбинации. Жирные кислоты могут включать без ограничения каприновую кислоту, ундециленовую кислоту, лауриновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, арахидиновую кислоту и бегеновую кислоту. Эфиры, такие как эвкалиптол, цетеарил глюкозид, диметилизосорбидполиглицерил-3-цетиловый эфир, полиглицерил-3-децилтетрадеканол, миристиловый эфир пропиленгликоля и их комбинации, можно также соответствующим образом применять в качестве смягчающих средств. Другие соединения, представляющие собой сложные эфиры, подходящие для применения в противомикробных композициях или настоящем изобретении, перечислены в International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 11-е издание, CTFA, (январь, 2006) ISBN-10: 1882621360, ISBN-13: 978-1882621361, и в 2007 Cosmetic Bench Reference, Allured Pub. Corporation (15 июля 2007 года) ISBN-10: 1932633278, ISBN-13: 978-1932633276, обе из которых включены в данный документ посредством ссылки до степени, в которой они согласуются с данным документом.

Гигроскопические вещества

Гигроскопические вещества, которые являются подходящими в качестве носителей в композициях по настоящему изобретению, включают, например, глицерин, производные глицерина, гиалуроновую кислоту, производные гиалуроновой кислоты, бетаин, производные бетаина, аминокислоты, производные аминокислот, гликозаминогликаны, гликоли, полиолы, сахара, сахарные спирты, гидролизаты гидрогенизированных крахмалов, гидроксикислоты, производные гидроксикислот, соли PCA и т. п. и их комбинации. Конкретные примеры подходящих гигроскопических веществ включают мед, сорбит, гиалуроновую кислоту, гиалуронат натрия, бетаин, молочную кислоту, лимонную кислоту, цитрат натрия, гликолевую кислоту, гликолят натрия, лактат натрия, мочевину, пропиленгликоль, бутиленгликоль, пентиленгликоль, этоксидигликоль, метил глюцет-10, метил глюцет-20, полиэтиленгликоли (как перечислено в International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, такие как от PEG-2 до PEG 10), пропандиол, ксилит, мальтит или их комбинации.

Композиции по настоящему изобретению могут включать одно или более гигроскопических веществ в количестве, составляющем от приблизительно 0,01% (по общему весу композиции) до приблизительно 20% (по общему весу композиции), или от приблизительно 0,05% (по общему весу композиции) до приблизительно 10% (по общему весу композиции), или от приблизительно 0,1% (по общему весу композиции) до приблизительно 5,0% (по общему весу композиции).

Поверхностно-активные вещества

В некоторых вариантах осуществления композиция может включать одно или более поверхностно-активных веществ. В одном варианте осуществления, где композиция включена в салфетку, композиция может также предположительно содержать одно или более поверхностно-активных веществ. Они могут быть выбраны из анионных, катионных, неионных, цвиттер-ионных и амфотерных поверхностно-активных веществ. Количества поверхностно-активных веществ могут находиться в диапазоне от 0,01 до 30%, или от 10 до 30%, или от 0,05 до 20%, или от 0,10 до 15% по общему весу композиции. В некоторых вариантах осуществления, например, где смачивающую композицию применяют с помощью салфетки, поверхностно-активное вещество может составлять менее 5% по общему весу смачивающей композиции.

Подходящие анионные поверхностно-активные вещества включают без ограничения C₈-C₂₂алкансульфаты, эфиры серной кислоты и сульфонаты. Среди подходящих сульфонатов находятся первичный C₈-C₂₂алкансульфонат, первичный C₈-C₂₂алкандисульфонат, C₈-C₂₂алкенсульфонат, C₈-C₂₂гидроксиалкансульфонат или алкилглицериновый эфир сульфоновой кислоты. Конкретные примеры анионных поверхностно-активных веществ включают лаурилсульфат аммония, лауретсульфат аммония, лаурилсульфат триэтиламина, лауретсульфат триэтиламина, лаурилсульфат триэтаноламина, лауретсульфат триэтаноламина, лаурилсульфат моноэтаноламина, лауретсульфат моноэтаноламина, лаурилсульфат диэтаноламина, лауретсульфат диэтаноламина, лауриновый моноглицерид сульфата натрия, лаурилсульфат натрия, лауретсульфат натрия, лауретсульфат калия, лаурилсаркозинат натрия, лауроилсаркозинат натрия, лаурилсульфат калия, тридецетсульфат натрия, метиллауроилтаурат натрия, лауроилизетионат натрия, лауратсульфосукцинат натрия, лауроилсульфосукцинат натрия, тридецилбензолсульфонат натрия, додецилбензолсульфонат натрия, лауриламфоацетат натрия и их смеси. Другие анионные поверхностно-активные вещества включают соли C₈–C₂₂ацилглицината. Подходящие соли глицината включают кокоилглицинат натрия, кокоилглицинат калия, лауроилглицинат натрия, лауроилглицинат калия, миристоилглицинат натрия, миристоилглицинат калия, пальмитоилглицинат натрия, пальмитоилглицинат калия, стеароилглицинат натрия, стеароилглицинат калия, кокоилглицинат аммония и их смеси. Катионные противоионы для образования соли глицината могут быть выбраны из натрия, калия, аммония, алканоламмония и смесей этих катионов.

Подходящие катионные поверхностно-активные вещества включают без ограничения алкилдиметиламины, алкиламидопропиламины, производные алкилимидазолина, кватернизированные аминэтоксилаты и соединения четвертичного аммония.

Подходящие неионные поверхностно-активные вещества включают без ограничения спирты, кислоты, амиды или алкилфенолы, реагирующие с алкиленоксидами, особенно оксидом этилена, либо отдельно, либо с оксидом пропилена. Конкретные неионные вещества представляют собой конденсаты C₆–C₂₂алкилфенолов и оксида этилена, продукты конденсации C₈–C₁₃алифатических первичных или вторичных неразветвленных или разветвленных спиртов с оксидом этилена и продукты, полученные посредством конденсации оксида этилена с продуктами реакции оксида пропилена и этилендиамина. Другие неионные вещества включают оксиды длинноцепочечных третичных аминов, оксиды длинноцепочечных третичных фосфинов и диалкилсульфоксиды, алкилполисахариды, оксиды аминов, блок-coполимеры, этоксилаты касторового масла, этоксилаты цетоолeилового спирта, этоксилаты цетостеарилового спирта, этоксилаты децилового спирта, этоксилаты динонилфенолов, этоксилаты додецилфенолов, этоксилаты с концевыми группами, производные эфира амина, этоксилированные алканоламиды, сложные эфиры этиленгликоля, алканоламиды жирных кислот, алкоксилаты жирных спиртов, этоксилаты лаурилового спирта, этоксилаты моноразветвленных спиртов, этоксилаты природных спиртов, этоксилаты нонилфенолов, этоксилаты октилфенолов, этоксилаты олеиламинов, алкоксилаты статистических сополимеров, этоксилаты сложного эфира сорбитана, этоксилаты стеариновой кислоты, этоксилаты стеарилового амина, этоксилаты синтетических спиртов, этоксилаты талловых масляных жирных кислот, твердые этоксилаты аминов и трид этоксилаты тридеканола.

Подходящие цвиттер-ионные поверхностно-активные вещества включают, например, оксиды алкиламинов, алкилгидроксисултаины, оксиды силиконаминов и их комбинации. Конкретные примеры подходящих цвиттер-ионных поверхностно-активных веществ включают, например, 4-[N,N-ди(2-гидроксиэтил)-N-октадециламмонио]-бутан-1-карбоксилат, S-[S-3-гидроксипропил-S-гексадецилсульфонио]-3-гидроксипентан-1-сульфат, 3-[P,P-диэтил-P-3,6,9-триоксатетрадексопцилфосфонио]-2-гидроксипропан-1-фосфат, 3-[N,N-дипропил-N-3-додекокси-2-гидроксипропиламмонио]-пропан-1-фосфонат, 3-(N,N-диметил-N-гексадециламмонио)пропан-1-сульфонат, 3-(N,N-диметил-N-гексадециламмонио)-2-гидроксипропан-1-сульфонат, 4-[N,N-ди(2-гидроксиэтил)-N-(2-гидроксидодецил)аммонио]-бутан-1-карбоксилат, 3-[S-этил-S-(3-додекокси-2-гидроксипропил)сульфонио]-пропан-1-фосфат, 3-[P,P-диметил-P-додецилфосфонио]-пропан-1-фосфонат, 5-[N,N-ди(3-гидроксипропил)-N-гексадециламмонио]-2-гидрокси-пентан-1-сульфат, лаурилгидроксисултаин и их комбинации.

Подходящие амфотерные поверхностно-активные вещества включают без ограничения производные алифатических соединений четвертичного аммония, фосфония и сульфония, в которых алифатические радикалы могут быть с прямой или разветвленной цепью и где один из алифатических заместителей содержит от приблизительно 8 до приблизительно 18 атомов углерода и один заместитель содержит анионную группу, например, карбоксильную, сульфонатную, сульфатную или фосфатную. Иллюстративные амфотерные вещества представляют собой кокодиметилкарбоксиметилбетаин, кокоамидопропилбетаин, кокобетаин, олеилбетаин, цетилдиметилкарбоксиметилбетаин, лаурил-бис-(2-гидроксиэтил)карбоксиметилбетаин, стеарил-бис-(2-гидроксипропил)карбоксиметилбетаин, олеилдиметил-гамма-карбоксипропилбетаин, лаурил-бис-(2-гидроксипропил)альфа-карбоксиэтилбетаин, кокоамфоацетаты и их комбинации. Сульфобетаины могут включать стеарилдиметилсульфопропилбетаин, лаурилдиметилсульфоэтилбетаин, лаурил-бис-(2-гидроксиэтил)сульфопропилбетаин и их комбинации.

Модификаторы реологических свойств

Необязательно один или более модификаторов реологических свойств, таких как загустители, можно добавлять в композицию. Подходящие модификаторы реологических свойств совместимы со средством, обеспечивающим баланс микробиоты кожи. Как используется в данном документе, «совместимый» относится к соединению, которое при смешивании со средством, обеспечивающим баланс микробиоты кожи, не оказывает отрицательного действия на свойства средства, обеспечивающего баланс микробиоты кожи.

Загущающую систему применяют в композициях с целью регулирования вязкости и стабильности композиций. В частности, загущающие системы предотвращают стекание композиции с рук или тела во время распределения и применения композиции. Если композицию применяют с продуктом, представляющим собой салфетку, то можно применять более густой состав для предотвращения перемещения композиции из подложки в виде салфетки.

Загущающая система должна быть совместима с соединениями, применяемыми в настоящем изобретении; то есть загущающая система при применении в комбинации со средством, обеспечивающим баланс микробиоты кожи, не должна выпадать в осадок, образовывать коацерват или препятствовать пользователю ощущать пользу от кондиционирования (или другие требуемые преимущества), которую получают от композиции. Загущающая система может содержать загуститель, который может обеспечивать как загущающий эффект, требуемый от загущающей системы, так и кондиционирующее действие в отношении кожи пользователя.

Загустители могут включать целлюлозные полимеры, камеди, акрилаты, крахмалы и различные полимеры. Подходящие примеры включают без ограничения гидроксиэтилцеллюлозу, ксантановую камедь, гуаровую камедь, картофельный крахмал и кукурузный крахмал. В некоторых вариантах осуществления могут являться подходящими PEG-150 стеарат, PEG-150 дистеарат, PEG-175 диизостеарат, полиглицерил-10 бегенат/эйкозандиоат, дистеарет-100 IPDI, полиакриламидометилпропансульфоновая кислота, бутилированный PVP и их комбинации.

Хотя вязкость композиций будет, как правило, зависеть от применяемого загустителя и других компонентов композиций, загустители композиций соответствующим образом обеспечивают композицию, характеризующуюся вязкостью, находящейся в диапазоне от более 1 сП до приблизительно 30000 сП или больше. В другом варианте осуществления загустители обеспечивают композиции, характеризующиеся вязкостью, составляющей от приблизительно 100 сП до приблизительно 20000 сП. В еще одном варианте осуществления загустители обеспечивают композиции, характеризующиеся вязкостью, составляющей от приблизительно 200 сП до приблизительно 15000 сП. В вариантах осуществления, где композиции включены в салфетку, вязкость может находиться в диапазоне от приблизительно 1 сП до приблизительно 2000 сП. В некоторых вариантах осуществления предпочтительно, чтобы вязкость композиции составляла менее 500 сП.

При включении загущающей системы композиции по настоящему изобретению могут включать загущающую систему в количестве, составляющем не более чем приблизительно 20% (по общему весу композиции) или от приблизительно 0,01% (по общему весу композиции) до приблизительно 20% (по общему весу композиции). В другом аспекте загущающая система присутствует в противомикробной композиции в количестве, составляющем от приблизительно 0,10% (по общему весу композиции) до приблизительно 10% (по общему весу композиции), или от приблизительно 0,25% (по общему весу композиции) до приблизительно 5% (по общему весу композиции), или от приблизительно 0,5% (по общему весу композиции) до приблизительно 2% (по общему весу композиции).

В одном варианте осуществления композиции могут включать гидрофобные и гидрофильные ингредиенты, такие как лосьон или крем. Обычно эти эмульсии имеют диспергированную фазу и диспергирующую фазу и обычно образованы с помощью добавления поверхностно-активного вещества или комбинации поверхностно-активных веществ с изменяющимися значениями гидрофильно-липофильного баланса (HLB). Подходящие эмульгаторы включают поверхностно-активные вещества, характеризующиеся значениями HLB, составляющими от 0 до 20 или от 2 до 18. Подходящие неограничивающие примеры включают цетеарет-20, цетеарилглюкозид, цетет-10, цетет-2, цетет-20, кокамид MEA, глицериллаурат, глицерилстеарат, PEG-100 стеарат, глицерилстеарат, глицерилстеарат SE, гликоль дистеарат, гликоль стеарат, изостеарет-20, лаурет-23, лаурет-4, лецитин, сесквистеарат метилглюкозы, олет-10, олет-2, олет-20, PEG-100 стеарат, PEG-20 глицериды миндального масла, PEG-20 сесквистеарат метилглюкозы, PEG-25 гидрогенизированное касторовое масло, PEG-30 диполигидроксистеарат, PEG-4 дилаурат, PEG-40 сорбитан перолеат, PEG-60 глицериды миндального масла, PEG-7 оливат, PEG-7 глицерилкокоат, PEG-8 диолеат, PEG-8 лаурат, PEG-8 олеат, PEG-80 сорбитанлаурат, полисорбат 20, полисорбат 60, полисорбат 80, полисорбат 85, пропиленгликоль изостеарат, сорбитанизостеарат, сорбитанлаурат, сорбитанмоностеарат, сорбитанолеат, сорбитансесквиолеат, сорбитанстеарат, сорбитантриолеат, стеарамид MEA, стеарет-100, стеарет-2, стеарет-20, стеарет-21. Композиции могут дополнительно содержать поверхностно-активные вещества или комбинации поверхностно-активных веществ, которые создают упорядоченные структуры из жидких кристаллов или упорядоченные структуры из липосом. Подходящие неограничивающие примеры включают OLIVEM 1000 (INCI: цетеарил оливат (и) сорбитан оливат, доступные от HallStar Company (Чикаго, Иллинойс)); ARLACEL LC (INCI: сорбитанстеарат (и) сорбитил лаурат, коммерчески доступные от Croda (Эдисон, Нью-Джерси)); CRYSTALCAST MM (INCI: бета-ситостерол (и) стеарат сахарозы (и) дистеарат сахарозы (и) цетиловый спирт (и) стеариловый спирт, коммерчески доступные от MMP Inc. (Саут-Плейнфилд, Нью-Джерси)); UNIOX CRISTAL (INCI: цетеариловый спирт (и) полисорбат 60 (и) цетеариловый глюкозид, коммерчески доступные от Chemyunion (Сан-Паулу, Бразилия)). Другие подходящие эмульгаторы включают лецитин, гидрогенизированный лецитин, лизолецитин, фосфатидилхолин, фосфолипиды и их комбинации.

Гелеобразующие средства

В некоторых вариантах осуществления, в которых композиция представлена в форме геля, дисперсная фаза геля может быть образована из любого из ряда различных гелеобразующих средств, в том числе чувствительных к температуре («термогелевых») соединений, чувствительных к ионам соединений и т. д. Например, термогелевые системы реагируют на изменение температуры (например, повышение температуры) превращением из жидкости в гель. В общем, представляющий интерес температурный диапазон составляет от приблизительно 25°C до приблизительно 40°C, в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 35°C до приблизительно 39°C и в одном конкретном варианте осуществления при температуре тела человека (приблизительно 37°C). В некоторых случаях можно применять термогелевые блокcoполимеры, привитые coполимеры и/или гомополимеры. Например, в некоторых вариантах осуществления по настоящему изобретению можно применять блокcoполимеры полиоксиалкилена с образованием термогелевой композиции. Подходящие термогелевые композиции могут включать, например, гомополимеры, такие как поли(N-метил-N-н-пропилакриламид), поли(N-н-пропилакриламид), поли(N-метил-N-изопропилакриламид), поли(N-н-пропилметакриламид), поли(N-изопропилакриламид), поли(N,н-диэтилакриламид); поли(N-изопропилметакриламид), поли(N-циклопропилакриламид), поли(N-этилметилакриламид), поли(N-метил-N-этилакриламид), поли(N-циклопропилметакриламид) и поли(N-этилакриламид). Еще другие примеры подходящих термогелевых полимеров могут включать производные эфира целлюлозы, такие как гидроксипропилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и этилгидроксиэтилцеллюлоза. Кроме того, термогелевые полимеры можно получать с помощью образования coполимеров с участием (из) мономеров или путем объединения таких гомополимеров с другими водорастворимыми полимерами, такими как акриловые мономеры (например, акриловая или метакриловая кислота, акрилат или метакрилат, акриламид или метакриламид и их производные).

Чувствительные к ионам соединения

Композиции по настоящему изобретению также могут включать чувствительное к ионам соединение. Как правило, такие соединения хорошо известны из уровня техники и имеют склонность к образованию геля в присутствии определенных ионов или при определенном значении pH. Например, один подходящий класс чувствительных к ионам соединений, которые можно применять в настоящем изобретении, представляет собой анионные полисахариды. Анионные полисахариды могут образовывать трехмерную сеть полимеров, которая действует как дисперсная фаза геля. В общем, анионные полисахариды включают полисахариды, имеющие общий анионный заряд, а также нейтральные полисахариды, которые содержат анионные функциональные группы.

Противомикробные средства

В некоторых вариантах осуществления композиция может включать одно или более антибактериальных средств для увеличения периода хранения. Некоторые подходящие противомикробные средства, которые можно применять в настоящем изобретении, включают традиционные противомикробные средства. Как используется в данном документе, термин «традиционные противомикробные средства» означает соединения, которые были ранее известны регулирующим органам как обеспечивающие противомикробный эффект, такие как те, что перечислены в Приложении V Регламента Европейского Союза в перечне консервантов, разрешенных в косметических продуктах. Традиционные противомикробные средства включают без ограничения пропионовую кислоту и ее соли; салициловую кислоту и ее соли; сорбиновую кислоту и ее соли; бензойную кислоту и ее соли и сложные эфиры; формальдегид; параформальдегид; oртофенилфенол и его соли; цинк-пиритион; неорганические сульфиты; сульфиты водорода; хлорбутанол; бензойные парабены, такие как метилпарабен, пропилпарабен, бутилпарабен, этилпарабен, изопропилпарабен, изобутилпарабен, бензилпарабен, метилпарабен натрия и пропилпарабен натрия; дегидроуксусную кислоту и ее соли; муравьиную кислоту и ее соли; дибромгексамидинизетионат; тиомерсал; соли фенилртути; ундециленовую кислоту и ее соли; гексетидин; 5-бром-5-нитро-1,3-диоксан; 2-бром-2-нитропропан-1,3,-диол; дихлорбензиловый спирт; триклокарбан; п-хлор-м-крезол; триклозан; хлороксиленол; имидазолидинилмочевину; полиаминопропилбигуанид; феноксиэтанол, мезатемамин; кватерний-15; климбазол; DMDM гидантоин; бензиловый спирт; пироктоноламин; бромхлорофен; oрто-цимен-5-ол; метилхлоризотиазолинон; метилизотиазолинон; хлорофен; хлорацетамид; хлоргексидин; хлоргексидина диацетат; хлоргексидина диглюконат; хлоргексидина дигидрохлорид; феноксиизопропанол; бромид и хлориды алкил(C12-C22)триметиламмония; диметилоксазолидин; диазолидинилмочевину; гексамидин; гексамидин диизетионат; глутараль; 7-этилбициклооксазолидин; хлорфенезин; гидроксиметилглицинат натрия; хлорид серебра; хлорид бензетония; хлорид бензалкония; бромид бензалкония; бензилгемиформаль; йодпропинил бутилкарбамат; этиллауроиларгинат HCl; лимонную кислоту и цитрат серебра.

Другие противомикробные средства, которые можно добавлять в композиции по настоящему изобретению, включают нетрадиционные противомикробные средства, о которых известно, что они демонстрируют противомикробные действия в дополнение к их первичным функциям, но которые ранее не были известны в качестве противомикробных средств регулирующим органам (таких как в перечне Приложения V Регламента Европейского Союза). Примеры этих нетрадиционных противомикробных средств включают без ограничения гидроксиацетофенон, каприлилгликоль, коко-PG-димониум хлорид фосфат натрия, фенилпропанол, молочную кислоту и ее соли, каприлгидроксаминовую кислоту, левулиновую кислоту и ее соли, лауроиллактилат натрия, фенэтиловый спирт, сорбитан каприлат, глицерил капрат, глицерил каприлат, этилгексилглицерин, п-анисовую кислоту и ее соли, глюконолактон, дециленгликоль, 1,2-гександиол, глюкооксидазу и лактопероксидазу, лейконосток/ферментированный фильтрат корня редиса и глицериллаурат.

Количество противомикробных средств в композициях зависит от относительных количеств других компонентов, присутствующих в композиции. Например, в некоторых вариантах осуществления противомикробное средство может присутствовать в композициях в количестве, составляющем от приблизительно 0,001% до приблизительно 5% (по общему весу композиции), в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 0,01 до приблизительно 3% (по общему весу композиции) и в некоторых вариантах осуществления от приблизительно 0,05% до приблизительно 1,0% (по общему весу композиции). В некоторых вариантах осуществления противомикробное средство может присутствовать в композиции в количестве, составляющем менее 0,2% (по общему весу композиции). Однако в некоторых вариантах осуществления композиция может практически не содержать никакие противомикробные средства. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиция не содержит традиционное противомикробное средство или нетрадиционное противомикробное средство.

Вспомогательные ингредиенты

Композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать вспомогательные ингредиенты, традиционно находящиеся в косметических, фармацевтических, медицинских, применяемых в домашнем хозяйстве, применяемых для промышленных целей композициях/продуктах или композициях/продуктах личной гигиены в установленном порядке и при установленных уровнях. Например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные и совместимые материалы для комбинированной терапии, такие как антиоксиданты, противопаразитические средства, противозудные средства, противогрибковые средства, антисептические активные средства, биологически активные средства, вяжущие средства, кератолитические активные средства, анестезирующие средства местного действия, средства против жжения, средства против покраснений, смягчающие кожу средства, анальгезирующие средства для наружного применения, пленкообразователи, средства для отшелушивания омертвевших клеток кожи, солнцезащитные средства и их комбинации.

Другие подходящие добавки, которые могут быть включены в композиции по настоящему изобретению, включают совместимые красящие вещества, дезодорирующие средства, эмульгаторы, противопенообразователи (если пена не требуется), смазочные средства, кондиционирующие средства для кожи, защитные средства для кожи и средства, полезные для кожи (например, алоэ древовидное и токоферилацетат), растворители (например, водорастворимый гликоль и гликолевые эфиры, глицерин, водорастворимые полиэтиленгликоли, водорастворимые полиэтиленгликолевые эфиры, водорастворимые полипропилeнгликоли, водорастворимые полипропилeнгликолевые эфиры, диметил изосорбид), солюбилизирующие средства, суспендирующие средства, компоненты моющих средств, (например, соли щелочных и щелочноземельных металлов, представляющие собой карбонат, бикарбонат, фосфат, гидрофосфат, дигидрофосфат, сульфат водород сульфат), смачивающие средства, регулирующие значения pH ингредиенты (подходящий диапазон значений pH композиций может составлять от приблизительно 3,5 до приблизительно 8), хелатирующие средства, пропелленты, красящие вещества и/или пигменты и их комбинации.

Другой компонент, который может являться подходящим для добавления в композиции, представляет собой отдушку. Можно применять любую совместимую отдушку. Как правило, отдушка присутствует в количестве, составляющем от приблизительно 0% (по весу композиции) до приблизительно 5% (по весу композиции) и более типично от приблизительно 0,01% (по весу композиции) до приблизительно 3% (по весу композиции). В одном желательном варианте осуществления отдушка будет характеризоваться чистым, свежим и/или нейтральным ароматом для создания привлекательной для конечного потребителя среды-носителя для доставки.

Органические солнцезащитные средства, которые могут присутствовать в композициях, включают этилгексилметоксициннамат, авобензон, октокрилен, бензофенон-4, фенилбензимидазолсульфоновую кислоту, гомосалат, оксибензон, бензофенон-3, этилгексилсалицилат и их смеси.

Как ранее отмечено в данном документе, композиции по настоящему раскрытию можно наносить на механизм доставки, такой как подложка, который, в свою очередь, можно использовать для доставки и/или нанесения композиции на основе пребиотиков на кожу пользователя. Подходящие подложки включают полотно, такое как тканевое полотно, полученное влажным формованием, или полотно, полученное суховоздушным формованием, марлю, ватный тампон, трансдермальный пластырь, емкость или держатель. Различные полотна, на которые может быть нанесена композиция, могут обеспечивать продукты в форме салфеток, косметических салфеток, туалетной бумаги, бумажных полотенец, пеленок, подгузников, трусов-подгузников, гигиенических продуктов для женщин (тампонов, прокладок), перчаток, носков, масок или их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления подложка, на которую нанесена композиция, может образовывать часть впитывающего изделия. Например, композиция может быть нанесена на подложку, которая может образовывать по меньшей мере часть обращенной к телу подкладки впитывающего изделия. Особенно предпочтительные аппликаторы включают волокнистые полотна, в том числе пригодные и непригодные для смывания в канализацию целлюлозные полотна и нетканые полотна из синтетического волокнистого материала. Пригодные полотна могут представлять собой таковые, полученные влажным формованием, суховоздушным формованием, полученные по технологии мелтблаун или спанбонд. Подходящий синтетический волокнистый материал включает полученный по технологии мелтблаун полиэтилен, полипропилен, coполимеры полиэтилена и полипропилена, двухкомпонентные волокна, в том числе полиэтилен или полипропилен, и т. п. Пригодные нетканые полотна могут представлять собой полотна, полученные по технологии мелтблаун, коформ, спанбонд, полотна, полученные суховоздушным формованием; нетканые материалы, полученные водоструйным скреплением, полотна, полученные по технологии спанлейс, скрепленные кардочесанные полотна.

В определенных вариантах осуществления, особенно в тех, в которых композицию наносят на полотно, может быть желательным, чтобы состав обеспечивал определенные физические свойства, такие как ощущение гладкости, смазываемости, нежирности; способность по меньшей мере частично переноситься с полотна на кожу пользователя; способность сохраняться на полотне при приблизительно комнатной температуре или способность быть совместимым со способом производства полотна. В некоторых вариантах осуществления предпочтительным является то, что по меньшей мере часть композиции переносят с ткани на кожу потребителя при применении.

Композицию можно наносить на полотно во время формования полотна или после того, как полотно было сформовано и высушено, что часто называется обработкой вне производственной линии или постобработкой. Подходящие способы нанесения композиции на полотно включают способы, известные из уровня техники, такие как глубокая печать, флексографическая печать, распыление, WEKO™, нанесение с использованием щелевой экструзионной головки или электростатическое распыление. Одним особенно предпочтительным способом нанесения вне производственной линии является ротационная глубокая печать.

В тех случаях, где композицию добавляют к полотну во время формирования полотна и перед высушиванием, можно предпочтительно применять способ нанесения, при котором композиция внедряется на поверхность полотна. Один способ добавления пребиотика на поверхность полотна заключается в нанесении композиции во время крепирования тканевого полотна. Неожиданно, что саму композицию можно применять в качестве крепирующей композиции или можно комбинировать с другими хорошо известными крепирующими композициями для нанесения композиции на тканевое полотно без значительного ухудшения важных свойств полотна, таких как прочность, жесткость или осыпаемость.

В некоторых вариантах осуществления, при которых композицию наносят на механизм доставки, такой как подложка, композиция может быть нанесена в добавляемом количестве, варьирующем от приблизительно 1% до приблизительно 500%, или от приблизительно 30% до приблизительно 400%, или от приблизительно 100% до приблизительно 350%. Конечно, предполагается, что композиция может быть нанесена на вещество для доставки за пределами этого диапазона и все еще находится в объеме настоящего раскрытия.

Волокнистые полотна, содержащие композицию, полученную в соответствии с настоящим изобретением, можно внедрять в продукты с несколькими прослойками. Например, в одном аспекте волокнистое полотно, полученное в соответствии с настоящим изобретением, можно соединять с одним или более другими волокнистыми полотнами с образованием продукта для обтирания, обладающего требуемыми характеристиками. Другие полотна, наслоенные на волокнистое полотно по настоящему изобретению, могут представлять собой, например, полотно, крепированное влажным способом; каландрированное полотно; тисненое полотно; полотно, высушенное сухо-воздушным способом; полотно, крепированное сухо-воздушным способом; некрепированное полотно, высушенное сухо-воздушным способом; полотно, полученное суховоздушным формованием и т. п., и при этом могут содержать или не содержать какие-либо средства, обеспечивающее баланс микробиоты кожи.

Способы получения нетканых листов основы, полученных суховоздушным формованием, описаны, например, в опубликованной заявке на патент США № 2006/0008621, включенной в настоящий документ посредством ссылки в той степени, в которой она согласуется с данным документом.

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ ТЕСТИРОВАНИЯ

Получение бактериального супернатанта

UPEC Escherichia coli 1A2 поддерживали на агаре LB (Difco, MD), Lactobacillus gasseri ATCC KE-1 (обозначение в ATCC № PTA-125162) (изолят мочи), Lactobacillus crispatus ATCC 33820, Enterococcus faecalis ATCC 33186, поддерживали на агаре MRS. (Difco, MD), Gardnerella vaginalis ATCC 14018, Lactobacillus vaginalis NCFB 2810 поддерживали на CBA и селективном агаре Gardnerella. Для исследований, обсуждаемых в данном документе, все штаммы бактерий выращивали в искусственной моче, которая, как было показано в предварительных экспериментах, не стимулирует приток кальция в присутствии линий клеток человека.

Супернатанты собирали из культур, выращенных в течение ночи (24 часа) при 37°C после достижения стационарной фазы. Культуры осаждали посредством центрифугирования при 5000 об./мин. (центрифуга 5804 R от Eppendorf) в течение 15 минут. pH супернатанта доводили до 7,0 с помощью 0,1 молярной HCl или NaOH, стерилизовали посредством фильтрования с помощью стерильного шприцевого фильтра с размером поры 0,22 мкм, разделяли на аликвоты и хранили при -20°C до использования. В случае E. coli и E. faecalis ночные культуры разбавляли в соотношении 1:100 свежей искусственной мочой, возвращали в условия инкубации при 37°C и отбирали образцы при Т= 1, 2, 3, 4, 5 и 24 часа для тестирования. Для экспериментов, включающих добавление супернатантов из L. crispatus или L. gasseri к супернатантам из уропатогенов, уротелиальные клетки сначала обрабатывали супернатантом L. crispatus или L. gasseri в течение одной минуты, затем добавляли супернатант уропатогенов. В случае серийного разведения супернатант L. crispatus разводили в 6 раз по сравнению с супернатантом E. coli.

Для исследования субтерапевтической концентрации ципрофлоксацина L. crispatus выращивали в среде Мана, Рогозы, Шарпа (MRS, Difco, MD). Кривые роста этих бактерий были построены с использованием планшет-ридера (Eon Biotek, VT) при OD600 и 37°C для определения экспоненциальной фазы.

Культура клеток

Эпителиальные клетки мочевого пузыря (5637-ATCC HTB-9) поддерживали в среде RPMI 1640 (среда Roswell-Park Memorial Institute - Thermo Fisher Scientific, Массачусетс), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс) и 2 мМ L-глутамина (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс) при 37°C и 5% CO₂. Среду меняли каждые 48 часов или чаще, если клетки были конфлюентными (90%-100%), после промывки 1X PBS и трипсинизации 0,25% трипсин-EDTA (1X) (Gibco) с соотношением 1 к 10. Первичные клетки миофибробластов были извлечены из ладонной фасции во время операции на нормальной ткани. Первичные культуры поддерживали в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS; Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США), 1% L-глутамином (Life Technologies) и 1% раствором антибиотика-фунгицида (Life Technologies) при 37°C в 5% CO₂. Все первичные линии клеток использовали в не более чем четырех пассированиях, после чего их выбрасывали.

Выделение РНК и проведение qPCR в отношении клеточных линий

РНК выделяли из образцов (200 нг/мкл) с использованием мини-набора для РНК Ambion от Life Technologies Purelink™ (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс), следуя инструкциям производителя. cDNA получали в соответствии с инструкциями к набору обратной транскрипции cDNA высокой емкости Applied Biosystems (Thermo-Fisher Scientific, Массачусетс), и ПЦР проводили с использованием термоциклера для градиентной ПЦР Master Cycler (Eppendorf, Нью-Йорк). Используя GAPDH в качестве конститутивного гена была проведена qPCR, при которой каждый образец использовали на планшете в трех повторностях для каждого из условий. Список использованных последовательностей праймеров можно найти в таблице 1. Использовали смесь Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс).

Флуоресцентная микроскопия притока кальция 5637 клеток

Приток кальция измеряли с помощью набора для анализа кальция Fluo-4 Direct TM (Invitrogen TM, Калифорния). Образцы и реагенты были подготовлены в соответствии с предусмотренным руководством протоколом. Девяносто шести-луночные планшеты засевали 100 мкл 5637 клеток в концентрации 1×10⁵ клеток/мл в дополненной RPMI и обеспечивали достижение конфлюентности, которое происходило приблизительно через 48-72 часа. Клетки подсчитывали с использованием автоматического устройства для подсчета клеток Invitrogen Countess (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс) в соответствии с инструкцией производителя. Пятьдесят микролитров среды для культивирования клеток удаляли из начальных 100 мкл и добавляли 50 мкл кальциевого реагента Fluo-4 DirectTM в каждую лунку. Планшет инкубировали при 37°C в течение 30 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Контроли включали иономицин (1 мкМ, Sigma ≥98% HPLC), АТФ (1 мкМ, Sigma A1852), GABA (1 мкМ, Sigma BioXtra ≥99%) и LPS (0,13 мг/мл, Sigma L3755). Эффект обработок оценивали с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Nikon Ts2R при 10-кратном увеличении при 494 нм для возбуждения и 516 нм для излучения в течение 60 секунд. Яркость изображения рассчитывали с использованием ImageJ и она свидетельствует о притоке Ca²⁺ в цитоплазматическое пространство уротелиальных клеток либо из внеклеточной среды, либо из внутриклеточных пулов Ca²⁺ (называемых притоком Ca²⁺).

Количественная оценка АТФ

Высвобождение АТФ из бактериальных супернатантов измеряли с использованием набора для колориметрического/флуориметрического анализа АТФ (Biovision Inc, Калифорния). Образцы и реагенты были подготовлены в соответствии с предусмотренным протоколом. Числа OD были получены с помощью ридера для микропланшетов BioTek EON. Набор для люминесцентного анализа (анализ жизнеспособности микробных клеток BacTiter-Glo™, G8230) использовали для подсчета количества внеклеточного АТФ, высвобождаемого бактериями в супернатант и высвобождаемого клетками в клеточную среду. Гибридный многорежимный ридер для микропланшетов Synergy™ H4 использовали для подсчета количества внеклеточного АТФ.

Сокращение коллагенового матрикса, в котором содержатся миофибробласты

Коллагеновый матрикс был образован с использованием 1,8 мг/мл стерильного коллагена и раствора для нейтрализации. Раствор для нейтрализации готовили путем смешивания с тремя частями среды Waymouth (Sigma, W1625) и 2 частями 0,34 М NaOH (Sigma, 221465). Однокомпонентную смесь для нейтрализации затем добавляли к 4 частям коллагена, смешивали с 1×10⁵ клеток до конечного объема 500 мкл и добавляли в каждую лунку 24-луночного планшета. После 45-минутной инкубации при 37°C в каждую лунку добавляли 1 мл 2% FBS и планшет инкубировали в течение дополнительных 72 часов при 37°C. Затем среду удаляли, добавляли свежую среду и осуществляли обработку, и коллагеновый матрикс высвобождали с помощью стерильного шпателя. Планшет сканировали с помощью Canon PIXMA MP250 сразу после высвобождения, а также через 1, 3, 5 и 24 часа. Размер коллагенового матрикса измеряли с помощью ImageJ и рассчитывали процент сокращения. Чтобы уменьшить любое сотрясение для миофибробластов, все бактериальные штаммы выращивали в среде DMEM с 2% FBS.

Иммуноцитохимический анализ

Клетки миофибробластов культивировали в µ-Slide 8 Well (ibidi, 80826), чтобы они стали полностью конфлюентными (90%-100%). Культуры клеток промывали 1X PBS и фиксировали 1 мл 4% параформальдегида на лунку в течение 10 минут при комнатной температуре, затем добавляли 1 мл 0,1-0,2% Triton X-100 в PBS на каждое предметное стекло. После блокирования клеток для неспецифического окрашивания с помощью Background Sniper (Biocare Medical, BS966) их инкубировали в течение 8-10 минут, промывали, затем инкубировали в течение ночи при 4°C в 1% BSA в PBS, содержащем моноклональное антитело к актину, α-SMA (Sigma, A2547) разбавляли 1:200. Клетки промывали, избыточную жидкость аспирировали и добавляли раствор вторичного антитела (1-10 мкг/мл) (вторичное антитело осла к IgG мыши Alexa Fluor 488, ThermoFisher, A-21202) в 1% BSA в PBS. Клетки защищали от света и инкубировали 45 минут при комнатной температуре. После промывания PBS образцы инкубировали со 100 мкл DAPI (разбавленным 1:10000 в PBS) в течение 5 минут в темноте. Конфокальные изображения были получены с помощью Nikon Eclipse Ti2 (объектив X60, Nikon, Канада). Измерения интенсивности флуоресценции были получены от всех клеток и проанализированы с помощью программного обеспечения Image J. Контрольные образцы были идентичны экспериментальным образцам, за исключением того, что они подвергались действию неподходящих антител, совпадающих по изотипу.

Экстракция РНК из коллагенового матрикса, в котором содержатся миофибробласты, и qPCR

После инкубации и аспирации среды коллагеновый матрикс собирали в микроцентрифужные пробирки для высокоскоростного центрифугирования в течение 5 минут и затем супернатант выбрасывали. Аликвоту 100 мкл предварительно нагретой 0,25 мг/мл коллагеназы добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 15 минут при 37°C. РНК выделяли из образцов с помощью набора Direct-zol РНК Miniprep (Zymo Research) в соответствии с инструкциями производителя, и для лизирования образцов использовали реагент Trizol. Концентрацию РНК измеряли с помощью нанокапель. cDNA получали в соответствии с инструкциями к набору обратной транскрипции cDNA высокой емкости Applied Biosystems (Thermo-Fisher Scientific, Массачусетс), и ПЦР проводили с использованием термоциклера для градиентной ПЦР Master Cycler (Eppendorf, Нью-Йорк). Количественная ПЦР была проведена так, чтобы каждый образец использовали на планшете в трех повторностях для каждого из условий, как описано ранее. GAPDH также использовался как конститутивный ген. Список использованных праймеров можно найти в дополнительной таблице 1.

Искусственная моча

Используемая в данном документе искусственная моча (AU) была из состава из Critical Reviews in Microbiology, Volume 16, Issue 1, 1988, by McLean, Robert J. C., et al и показана в таблице 2.

При формировании искусственной мочи pH доводят до 5,8. При необходимости эту смесь можно стерилизовать посредством фильтрования через мембранный фильтр с размером поры 0,45 или 0,2 мкм. Триптический соевый бульон обычно добавляют для стимуляции роста бактерий.

Статистические данные

Данные выражены как среднее ± SEM. Статистическую значимость оценивали с помощью однофакторного ANOVA с последующим критерием Тьюки (GraphPad Prism 5).

Варианты осуществления

В свете вышеизложенных описания и примеров настоящее изобретение предусматривает следующие варианты осуществления.

Вариант осуществления 1. Способ предупреждения или лечения недержания мочи, гиперактивности мочевого пузыря или менструальных спазмов у субъекта, включающий: получение композиции, при этом композиция содержит модифицирующее средство, содержащее штамм Lactobacillus или его фермент или метаболит, при этом модифицирующее средство обеспечивает нейромодулирующую активность посредством активации по меньшей мере одного из ферментов maoA, ферментов maoB и генов grin-1; и введение композиции субъекту для предупреждения или лечения недержания мочи, гиперактивности мочевого пузыря или менструальных спазмов.

Вариант осуществления 2. Способ по варианту осуществления 1, где модифицирующее средство снижает уровень внеклеточного АТФ в целевой среде.

Вариант осуществления 3. Способ по варианту осуществления 1 или 2, где модифицирующее средство содержит штамм Lactobacillus gasseri или его фермент или метаболит.

Вариант осуществления 4. Способ по варианту осуществления 3, где штамм Lactobacillus gasseri или его фермент или метаболит выбраны из группы, состоящей из: Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125162, Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125163 и их комбинаций.

Вариант осуществления 5. Способ по варианту осуществления 3, где штамм Lactobacillus gasseri или его фермент или метаболит представляют собой Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125162.

Вариант осуществления 6. Способ по варианту осуществления 3, где штамм Lactobacillus gasseri или его фермент или метаболит представляют собой Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125163.

Вариант осуществления 7. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, дополнительно включающий: нанесение композиции на подложку.

Вариант осуществления 8. Способ по варианту осуществления 7, где подложка образует по меньшей мере часть впитывающего изделия.

Вариант осуществления 9. Способ по варианту осуществления 7, где подложка образует по меньшей мере часть салфетки.

Вариант осуществления 10. Способ по любому из вариантов осуществления от 1 до 6, где композиция представлена в форме жидкости для введения субъекту путем местного нанесения.

Вариант осуществления 11. Способ по любому из вариантов осуществления от 1 до 6, где композиция представлена в форме пилюли, выполненной с возможностью перорального введения субъекту.

Вариант осуществления 12. Способ предупреждения или лечения недержания мочи, гиперактивности мочевого пузыря или менструальных спазмов у субъекта, включающий: получение композиции, при этом композиция содержит модифицирующее средство, содержащее штамм Lactobacillus или его фермент или метаболит, при этом модифицирующее средство снижает количество АТФ в целевой среде; и введение композиции субъекту для предупреждения или лечения недержания мочи, гиперактивности мочевого пузыря или менструальных спазмов.

Вариант осуществления 13. Способ по варианту осуществления 12, где модифицирующее средство содержит штамм Lactobacillus crispatus или его фермент или метаболит.

Вариант осуществления 14. Композиция, содержащая: носитель; и модифицирующее средство, содержащее штамм Lactobacillus gasseri или его фермент или метаболит, выбранный из группы, состоящей из: Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125162, Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125163 и их комбинаций.

Вариант осуществления 15. Композиция по варианту осуществления 14, где штамм Lactobacillus gasseri или его фермент или метаболит представляют собой Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125162.

Вариант осуществления 16. Композиция по варианту осуществления 14, где штамм Lactobacillus gasseri или его фермент или метаболит представляют собой Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125163.

Вариант осуществления 17. Композиция по любому из вариантов осуществления от 14 до 16, где модифицирующее средство обеспечивает нейромодулирующую активность посредством активации по меньшей мере одного из ферментов maoA, ферментов maoB и генов grin-1.

Вариант осуществления 18. Композиция по любому из вариантов осуществления от 14 до 17, где композиция нанесена на подложку.

Вариант осуществления 19. Композиция по любому из вариантов осуществления от 14 до 17, где композиция представлена в форме жидкости.

Вариант осуществления 20. Композиция по любому из вариантов осуществления от 14 до 17, где композиция представлена в форме пилюли.

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, а именно к композиции и способам предупреждения или лечения недержания мочи или гиперактивности мочевого пузыря. Предложен способ предупреждения или лечения недержания мочи или гиперактивности мочевого пузыря, включающий получение композиции, содержащей модифицирующее средство, и местное введение композиции субъекту для предупреждения или лечения недержания мочи или гиперактивности мочевого пузыря. При этом модифицирующее средство содержит штамм Lactobacillus gasseri, обеспечивающий нейромодулирующую активность посредством активации по меньшей мере одного из ферментов maoA, ферментов maoB и генов grin-1, или штамм Lactobacillus crispatus, обеспечивающий снижение количества АТФ в целевой среде. Предложена также композиция для предупреждения или лечения недержания мочи или гиперактивности мочевого пузыря у субъекта, содержащая носитель и модифицирующее средство, содержащее штамм Lactobacillus gasseri или его фермент или метаболит, выбранные из группы, состоящей из: Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125162, Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125163 и их комбинаций. Изобретение позволяет контролировать сокращения мышц мочевого пузыря, а именно уменьшать сократительную способность мышц мочевого пузыря. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 13 ил., 2 табл.

1. Способ предупреждения или лечения недержания мочи или гиперактивности мочевого пузыря у субъекта, включающий:

получение композиции, при этом композиция содержит модифицирующее средство, содержащее штамм Lactobacillus gasseri, при этом модифицирующее средство обеспечивает нейромодулирующую активность посредством активации по меньшей мере одного из ферментов maoA, ферментов maoB и генов grin-1; и

местное введение композиции субъекту для предупреждения или лечения недержания мочи или гиперактивности мочевого пузыря.

2. Способ по п. 1, где модифицирующее средство снижает уровень внеклеточного АТФ в целевой среде.

3. Способ по п. 1, где штамм Lactobacillus gasseri выбран из группы, состоящей из: Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125162, Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125163 и их комбинаций.

4. Способ по п. 1, где штамм Lactobacillus gasseri представляет собой Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125162.

5. Способ по п. 3, где штамм Lactobacillus gasseri представляет собой Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125163.

6. Способ по п. 1, дополнительно включающий нанесение композиции на подложку.

7. Способ по п. 6, где подложка образует по меньшей мере часть впитывающего изделия.

8. Способ по п. 6, где подложка образует по меньшей мере часть салфетки.

9. Способ по п. 1, где композиция представлена в форме жидкости.

10. Способ предупреждения или лечения недержания мочи или гиперактивности мочевого пузыря субъекта, включающий:

получение композиции, при этом композиция содержит модифицирующее средство, содержащее штамм Lactobacillus crispatus, при этом модифицирующее средство снижает количество АТФ в целевой среде; и

местное введение композиции субъекту для предупреждения или лечения недержания мочи или гиперактивности мочевого пузыря.

11. Композиция для предупреждения или лечения недержания мочи или гиперактивности мочевого пузыря у субъекта, содержащая: носитель и модифицирующее средство, содержащее штамм Lactobacillus gasseri или его фермент или метаболит, выбранные из группы, состоящей из: Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125162, Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125163 и их комбинаций.

12. Композиция по п. 11, где штамм Lactobacillus gasseri или его фермент или метаболит представляют собой Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125162.

13. Композиция по п. 11, где штамм Lactobacillus gasseri или его фермент или метаболит представляют собой Lactobacillus gasseri с обозначением в АТСС № PTA-125163.

14. Композиция по п. 11, где модифицирующее средство обеспечивает нейромодулирующую активность посредством активации по меньшей мере одного из ферментов maoA, ферментов maoB и генов grin-1.

15. Композиция по п. 11, где композиция нанесена на подложку.

16. Композиция по п. 11, где композиция представлена в форме жидкости.