ФЕРМЕНТАЦИОННЫЕ БУЛЬОНЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2023 года по МПК C12N1/02 A01N63/22 A61K35/74 C12N1/20 

В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что ферментационные бульоны после культивирования пробиотических микроорганизмов проявляют полезные характеристики, которые делают их пригодными в качестве кормовых добавок, а также средств для улучшения свойств других кормовых добавок.

Пробиотические микроорганизмы получают путем культивирования образца пробиотических микроорганизмов в среде для ферментации и последующего отделения пробиотических микроорганизмов от полученного таким образом ферментационного бульона.

Оставшийся ферментационный бульон обычно утилизируют. Однако в литературе также были раскрыты альтернативные пути применения ферментационного бульона. Например, в патенте США № 6060051 раскрыто применение оставшегося ферментационного бульона для выделения метаболита, который полезен против грибковых и бактериальных заболеваний растений и, в частности, обладает активностью против злакового корневого червя.

В соответствии с настоящим изобретением было неожиданно обнаружено, что высушивание остаточного ферментационного бульона, по-видимому, не оказывает вредного воздействия на активность активных веществ, которые содержатся в остаточном ферментационном бульоне, в частности, на ферментативную и противомикробную активность.

Кроме того, высушивание ферментационного бульона приводит к получению продукта, который легко можно обработать и, таким образом, применять в качестве кормовой добавки и смешивать с другими кормовыми добавками.

В частности, оказалось, что при смешивании различных высушенных ферментационных бульонов и/или при смешивании высушенного ферментационного бульона с пробиотическим микроорганизмом можно получать кормовые продукты с превосходными характеристиками, в частности, в отношении протеолитической активности, противомикробной активности в отношении патогенов и пребиотической активности в отношении полезных бактерий.

Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является способ получения высушенного ферментационного бульона, предусматривающий следующие стадии:

a) культивирование микроорганизмов в среде для ферментации с получением ферментационного бульона, содержащего микроорганизмы;

b) отделение по меньшей мере 20% микроорганизмов от ферментационного бульона;

c) высушивание полученного таким образом ферментационного бульона с получением высушенного ферментационного бульона.

На стадии отделения от ферментационного бульона удаляют по меньшей мере 20% микроорганизмов, предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98, 99 или 99,5%. В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментационный бульон не содержит или почти не содержит каких-либо микроорганизмов.

Отделение микроорганизмов от ферментационного бульона можно осуществлять, в частности, с помощью центрифугирования, флотации, фильтрации, в частности ультрафильтрации или микрофильтрации, и/или декантирования.

Высушивание ферментационного бульона предпочтительно проводят путем сублимационной сушки, распылительной сушки, вакуумной сушки, сушки на стеллажах, барабанной сушки, сушки в псевдоожиженном слое или распылительной грануляции ферментационного бульона.

Сублимационную сушку ферментационного бульона можно осуществлять путем сначала замораживания бульона с применением жидкого азота или сухого льда или заморозки при -20°C, а затем высушивания под высоким вакуумом (Ananta et al., 2004, Microbial Ecology in Health и Disease, 16(2-3): 113-124). Сублимационная сушка может также предусматривать испарительное охлаждение ферментационного бульона (Bond, 2007, pp. 99-107, in Methods in Molecular Biology No. 368. Humana Press, New York, USA).

В случае распылительной сушки ферментационного бульона крошечные капли бульона, распыляемые путем распыления через нагретую форсунку, распыляют в сушильную камеру против горячего воздуха. Содержимое ферментационного бульона собирают на дне камеры (Masters, 1972, Spray drying. Leonard Hill Books, London, UK).

Предпочтительным способом является распылительная грануляция, где ферментационный бульон непосредственно преобразовывается в свободносыпучие частицы гранулята соответствующего размера.

В отдельном варианте осуществления настоящего изобретения также после культивирования микроорганизмов и до отделения микроорганизмов и/или после отделения микроорганизмов можно осуществлять стадию концентрирования для увеличения общего содержания сухого вещества ферментационного бульона. Концентрирование ферментационного бульона можно осуществлять, в частности, путем выпаривания растворителя. Выпаривание растворителя, если оно необходимо, предпочтительно осуществлять с применением роторного испарителя, тонкопленочного испарителя или испарителя с падающей пленкой одностадийным или многостадийным способом.

После удаления микроорганизмов из ферментационного бульона ферментационный бульон предпочтительно характеризуется содержанием твердых веществ (общим содержанием сухих веществ), составляющим от 1 до 10% по весу, в частности, от 1 до 6% по весу, и/или он предпочтительно содержит микроорганизмы в концентрации не более 1×10¹⁰ (КОЕ) на мл, более предпочтительно в концентрации не более 1×10⁹ (КОЕ) на мл, в частности, в концентрации от 1×10⁴ до 1×10⁹ (КОЕ) на мл или в концентрации от 1×10⁴ до 1×10⁸ (КОЕ) на мл.

После удаления микроорганизмов и перед началом высушивания ферментационного бульона можно добавлять специализированные вещества, в частности, для сохранения ферментов. Эти вещества можно выбрать, в частности, из средств против слеживания, средств против окисления, наполнителей и/или защитных средств. Примеры пригодных веществ включают полисахариды (в частности, крахмалы, виды целлюлозы, виды метилцеллюлозы, мальтодекстрины, виды камеди, декстраны, хитозан и/или инулины), полиэтиленгликоль, аминокислоты (в частности, пролин, глицин и/или глутаминовую кислоту), источники белка (в частности, пептоны, сухое обезжиренное молоко и/или порошок сладкой сыворотки), пептиды, сахара (в частности, лактозу, ксилозу, фруктозу, трегалозу, сахарозу и/или декстрозу), полиолы (в частности, маннит, глицерин и/или сорбит), дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, соевую муку, липиды (в частности, лецитин, растительные масла и/или минеральные масла), соли (в частности, хлорид натрия, карбонат натрия, карбонат кальция, мел, известняк, карбонат магния, фосфат натрия, фосфат кальция, фосфат магния и/или цитрат натрия) и силикаты (в частности, глины, в частности, беолитовую глину, аморфный диоксид кремния, разновидности коллоидального/осажденного диоксида кремния, цеолиты, фуллерову землю, байлит, клинтполит, монтмориллонит, диатомовую землю, тальк, бентониты и/или такие силикатные соли, как силикат алюминия, магния и/или кальция).

Предпочтительно по меньшей мере одно из данных веществ и/или комбинацию данных веществ добавляют, в случае использования, в таком количестве, чтобы они содержались в дополненной суспензии ферментационного бульона в количестве от одной десятой до двукратного количества, предпочтительно от одной пятой до равного количества относительно общего количества сухого вещества, содержащегося в ферментационном бульоне до добавления вещества (веществ).

Полученные сухие продукты можно подвергнуть дополнительной обработке, например путем измельчения или гранулирования, до достижения конкретного размера частиц или физического формата.

Дополнительные микроорганизмы, которые применяют для получения ферментационного бульона, предпочтительно являются пробиотическими микроорганизмами, в частности пробиотическими бактериями, и предпочтительно выбраны из Bacillus, в частности B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. clausii, B. coagulans, B. flexus, B. fusiformis, B. lentus, B. megaterium, B. mesentricus, B. mojavensis, B. polymixa, B. pumilus, B. smithii, B. toyonensis и B. vallismortis, Enterococcus, в частности E. faecium и E. faecalis, Geobacillus, в частности G. stearothermophilus, Clostridium, в частности C. butyricum, и Streptococcus, в частности S. faecalis, S. faecium, S. gallolyticus, S. salivarius, подвид thermophilus, и S. bovis, Lactobacillus, в частности L. acidophilus, L. amylolyticus, L. amylovorus, L. alimentarius, L. aviaries, L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. cellobiosus, L. coryniformis, L. crispatus, L. curvatus, L. delbrueckii, L. farciminis, L. fermentum, L. gallinarum, L. gasseri, L. helveticus, L. hilgardii, L. johnsonii, L. kefiranofaciens, L. kefiri, L. mucosae, L. panis, L. collinoides, L. paracasei, L. paraplantarum, L. pentosus, L. plantarum, L. pontis, L. reuteri, L. rhamnosus, L. sakei, L. salivarius и L. sanfranciscensis, Pediococcus, в частности P. acidilactici, P. dextrinicus и P. pentosaceus, Streptococcus, в частности S. lactis и S. thermophiles, Bifidibacterium, в частности S. adolescentis, B. animalis, B. bifidum, B. breve и B. longum.

В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пробиотические микроорганизмы относятся к роду Bacillus, в частности, выбраны из следующих штаммов и их комбинаций: B. subtilis DSM 32315, B. subtilis DSM 32540, B. subtilis DSM 32592, B. licheniformis DSM 32314, B. pumilus DSM 32539, B. amyloliquefaciens CECT 5940.

Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения являются высушенные ферментационные бульоны, которые можно получить с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением.

Высушенные ферментационные бульоны по настоящему изобретению предпочтительно содержат микроорганизмы в количестве не более 1×10¹¹ (КОЕ) на грамм высушенного ферментационного бульона, более предпочтительно в количестве не более 1×10¹⁰ (КОЕ) на грамм, в частности, в количестве от 1×10⁴ до 1x10¹¹ (КОЕ) на грамм, или в количестве от 1×10⁴ до 1×10¹⁰ (КОЕ) на грамм, или в количестве от 1×10⁴ до 1×10⁹ (КОЕ) на грамм высушенного ферментационного бульона.

Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения является высушенный ферментационный бульон, содержащий микроорганизмы в количестве не более 1×10¹¹ (КОЕ) на грамм высушенного ферментационного бульона, более предпочтительно в количестве не более 1×10¹⁰ (КОЕ) на грамм, в частности, в количестве от 1×10⁴ до 1×10¹¹ (КОЕ) на грамм, или в количестве от 1×10⁴ до 1×10¹⁰ (КОЕ) на грамм, или в количестве от 1×10⁴ до 1×10⁹ (КОЕ) на грамм высушенного ферментационного бульона, при этом микроорганизмы предпочтительно выбраны из B. subtilis и B. amyloliquefaciens.

Количество клеток (КОЕ) в высушенных ферментационных бульонах по настоящему изобретению, таким образом, предпочтительно составляет менее 1 вес. %, в частности, менее 0,5 или 0,2 вес. %, более предпочтительно менее 0,1 вес. %, в частности, менее 0,05 или 0,02 вес. %. В конкретных вариантах осуществления количество клеток (КОЕ) в высушенных ферментационных бульонах составляет даже менее 0,01 вес. %, в частности, менее 0,005, 0,002 или 0,001 вес. %.

Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения является высушенный ферментационный бульон, содержащий клетки (КОЕ) в количестве менее 1 вес. %, в частности, менее 0,5 или 0,2 вес. %, более предпочтительно менее 0,1 вес. %, в частности, менее 0,05 или 0,02 вес. %, при этом в конкретных вариантах осуществления количество клеток (КОЕ) в высушенном ферментационном бульоне составляет даже менее 0,01 вес. %, в частности, менее 0,005, 0,002 или 0,001 вес. %, при этом микроорганизмы предпочтительно выбраны из B. subtilis и B. amyloliquefaciens. Количество клеток (КОЕ) в весовых процентах предпочтительно рассчитывают на основании количества клеток (КОЕ) так, как раскрыто у Jeong et al. (1990) в Biotechnology and Bioengineering, том 35, страницы 160-184.

Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения является, в частности, высушенный ферментационный бульон после культивирования микроорганизма, из которого удалено по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 50, 70 или 90% микроорганизмов, содержащий по меньшей мере одно вещество, выбранное из средств против слеживания, средств против окисления, наполнителей и/или защитных средств, в частности, выбранных из полисахаридов (в частности, видов крахмала, видов целлюлозы, видов метилцеллюлозы, мальтодекстринов, видов камеди, декстранов, хитозана и/или инулинов), полиэтиленгликоля, аминокислот (в частности, пролина, глицина и/или глутаминовой кислоты), источников белка (в частности, пептонов, сухого обезжиренного молока и/или порошка сладкой сыворотки), пептидов, сахаров (в частности, лактозы, ксилозы, фруктозы, трегалозы, сахарозы и/или декстрозы), полиолов (в частности, маннита, глицерина и/или сорбита), дрожжевого экстракта, солодового экстракта, соевой муки, липидов (в частности, лецитина, растительных масел и/или минеральных масел), солей (в частности, хлорида натрия, карбоната натрия, карбоната кальция, мела, известняка, карбоната магния, фосфата натрия, фосфата кальция, фосфата магния и/или цитрата натрия) и силикатов (в частности, видов глины, в частности беолитовой глины, аморфного диоксида кремния, видов коллоидального/осажденного диоксида кремния, цеолитов, фуллеровой земли, байлита, клинтполита, монтмориллонита, диатомовой земли, талька, бентонитов и/или таких силикатных солей, как силикат алюминия, магния и/или кальция). По меньшей мере одно вещество, которое содержится в высушенном ферментационном бульоне, и/или смесь таких веществ предпочтительно присутствуют в высушенном ферментационном бульоне в количестве по меньшей мере 0,1 вес. %, более предпочтительно в количестве по меньшей мере 0,5 вес. % или по меньшей мере 1 вес. %, в частности, в количестве от 0,1 до 67 или от 10 до 67 вес. %, предпочтительно в количестве от 0,5 до 50 или от 10 до 50 вес. %, более предпочтительно в количестве от 1 до 30 или от 10 до 30 вес. %.

В соответствии с настоящим изобретением "высушенный ферментационный бульон" означает ферментационный бульон, который характеризуется общим содержанием сухого вещества, составляющим по меньшей мере 70 вес. %, более предпочтительно по меньшей мере 80 вес. %, в основном более 90 вес. %, в частности, по меньшей мере 95 вес. %.

Дополнительным объектом настоящего изобретения являются также композиции, содержащие по меньшей мере два, предпочтительно по меньшей мере три, в частности два, три, четыре или пять различных видов высушенных ферментационных бульонов, в частности, после культивирования упомянутых ранее бактерий.

Согласно настоящему изобретению неожиданно было дополнительно обнаружено, что ферментационные бульоны после культивирования Bacillus amyloliquefaciens обладают неожиданными полезными характеристиками, такими как очень высокая протеолитическая активность.

Следовательно, дополнительным аспектом настоящего изобретения является ферментативный бульон после культивирования Bacillus amyloliquefaciens. Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения также являются композиции, в частности кормовые композиции, содержащие ферментационный бульон после культивирования B. amyloliquefaciens, где ферментационный бульон предпочтительно представляет собой ферментационный бульон после культивирования B. amyloliquefaciens CECT 5940.

Ферментационный бульон после культивирования B. amyloliquefaciens предпочтительно получают путем культивирования пробиотических микроорганизмов видов B. amyloliquefaciens в среде для ферментации с получением ферментационного бульона, содержащего указанные пробиотические микроорганизмы, а затем отделения по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70 или 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90, 95 или 98% микроорганизмов от ферментационного бульона, так чтобы ферментационный бульон после культивирования B. amyloliquefaciens, в частности B. amyloliquefaciens, предпочтительно был таким, из которого было удалено по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90 или 95% микроорганизмов.

После удаления/отделения микроорганизмов ферментационный бульон предпочтительно характеризуется содержанием твердых веществ (общим содержанием сухих веществ), составляющим от 1 до 10% по весу, в частности, от 1 до 6% по весу, и/или он предпочтительно содержит микроорганизмы в концентрации не более 1х10¹⁰ на мл, более предпочтительно в концентрации не более 1х10⁹ на мл, в частности, в концентрации от 1х10⁴ до 1x10⁹ на мл или в концентрации от 1х10⁴ до 1x10⁸ на мл.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментационный бульон после культивирования B. amyloliquefaciens применяют в концентрированной или высушенной форме, при этом концентрирование и/или высушивание предпочтительно проводят так, как раскрыто ранее в настоящем описании, и/или концентрированный или высушенный ферментационный бульон обладает характеристиками, которые упомянуты ранее в настоящем описании.

Следовательно, конкретным объектом настоящего изобретения также является концентрированный и/или высушенный ферментационный бульон после культивирования B. amyloliquefaciens, в частности, B. amyloliquefaciens CECT 5940.

Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения также является высушенный ферментационный бульон, содержащий B. amyloliquefaciens, в частности B. amyloliquefaciens CECT 5940, в количестве не более 1×10¹¹ (КОЕ) на грамм высушенного ферментационного бульона, более предпочтительно в количестве не более 1×10¹⁰ (КОЕ) на грамм, в частности, в количестве от 1×10⁴ до 1×10¹¹ (КОЕ) на грамм, или в количестве от 1×10⁴ до 1×10¹⁰ (КОЕ) на грамм, или в количестве от 1×10⁴ до 1×10⁹ (КОЕ) на грамм высушенного ферментационного бульона.

Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения является высушенный ферментационный бульон, содержащий клетки (КОЕ) B. amyloliquefaciens, в частности, B. amyloliquefaciens CECT 5940, в количестве менее 1 вес. %, в частности менее 0,5 или 0,2 вес. %, более предпочтительно менее 0,1 вес. %, в частности менее 0,05 или 0,02 вес. %, при этом в конкретных вариантах осуществления количество клеток (КОЕ) в высушенном ферментационном бульоне составляет даже менее 0,01 вес. %, в частности, менее 0,005, 0,002 или 0,001 вес. %.

Ферментационный бульон после культивирования B. amyloliquefaciens в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно обладает протеолитической активностью, составляющей по меньшей мере 500 мЕд/мл, более предпочтительно по меньшей мере 1000 мЕд/мл, которую определяют способом, раскрытым в демонстрационных примерах.

В соответствии с настоящим изобретением неожиданно было дополнительно обнаружено, что свойства корма можно улучшать, если перед приготовлением конечного корма обработать корм для животных или кормовую добавку ферментационным бульоном после культивирования микроорганизмов.

Следовательно, другим объектом настоящего изобретения является способ улучшения свойств корма или кормовой добавки, где корм для животных или кормовую добавку обрабатывают/выдерживают по меньшей мере с одним ферментационным бульоном по меньшей мере одного микроорганизма, из которого предпочтительно было удалено по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 50, 70 или 90% микроорганизмов, при этом обработку/выдерживание предпочтительно проводят для улучшения свойств конечного кормового продукта.

Микроорганизм, который применяют для получения ферментационного бульона, предпочтительно в данном случае выбран из пробиотических микроорганизмов, в частности пробиотических бактерий и предпочтительно из Bacillus, в частности B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. clausii, B. coagulans, B. flexus, B. fusiformis, B. lentus, B. megaterium, B. mesentricus, B. mojavensis, B. polymixa, B. pumilus, B. smithii, B. toyonensis и B. vallismortis, Enterococcus, в частности E. faecium и E. faecalis, Geobacillus, в частности G. stearothermophilus, Clostridium, в частности C. butyricum и Streptococcus, в частности S. faecalis, S. faecium, S. gallolyticus, S. salivarius, подвид thermophilus, и S. bovis, Lactobacillus, в частности L. acidophilus, L. amylolyticus, L. amylovorus, L. alimentarius, L. aviaries, L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. cellobiosus, L. coryniformis, L. crispatus, L. curvatus, L. delbrueckii, L. farciminis, L. fermentum, L. gallinarum, L. gasseri, L. helveticus, L. hilgardii, L. johnsonii, L. kefiranofaciens, L. kefiri, L. mucosae, L. panis, L. collinoides, L. paracasei, L. paraplantarum, L. pentosus, L. plantarum, L. pontis, L. reuteri, L. rhamnosus, L. sakei, L. salivarius и L. sanfranciscensis, Pediococcus, в частности P. acidilactici, P. dextrinicus и P. pentosaceus, Streptococcus, в частности S. lactis и S. thermophiles, Bifidibacterium, в частности S. adolescentis, B. animalis, B. bifidum, B. breve и B. longum, при этом в очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пробиотические микроорганизмы принадлежат к роду Bacillus, в частности, выбраны из следующих штаммов и их комбинаций: B. subtilis DSM 32315, B. subtilis DSM 32540, B. subtilis DSM 32592, B. licheniformis DSM 32314, B. pumilus DSM 32539, B. amyloliquefaciens CECT 5940.

Для этой цели ферментационный бульон также предпочтительно получают путем сначала культивирования микроорганизмов в подходящей среде для ферментации и последующего отделения от ферментационного бульона по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 50, 70 или 90% микроорганизмов.

После удаления/отделения микроорганизмов ферментационный бульон предпочтительно характеризуется содержанием твердых веществ (общим содержанием сухих веществ), составляющим от 1 до 10% по весу, в частности, от 1 до 6% по весу, и/или он предпочтительно содержит микроорганизмы в концентрации не более 1×10¹⁰ на мл, более предпочтительно в концентрации не более 1×10⁹ на мл, в частности, в концентрации от 1×10⁴ до 1×10⁹ на мл или в концентрации от 1×10⁴ до 1×10⁸ на мл.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментационный бульон применяют в концентрированной или высушенной форме, при этом концентрирование и/или высушивание предпочтительно проводят так, как раскрыто ранее в настоящем описании, и/или концентрированный или высушенный ферментационный бульон обладает характеристиками, которые упомянуты ранее в настоящем описании.

В частности, было обнаружено, что количество антипитательных факторов (ANF) можно значительно снизить, если перед приготовлением конечного корма обработать корм или кормовую добавку ферментационным бульоном.

Сырьевые материалы для кормов для животных, такие как кукуруза и особенно соевый шрот (SBM), содержат ANF. SBM является основным источником белка в рационе для птицы и свиньи, но также становится все более и более важным в качестве кормовой добавки для кормов на водной основе. ANF (например, белковые ингибиторы, некрахмальные полисахариды, лектины, антигенные белки), присутствующие в кормах, препятствуют усвоению питательных веществ корма и могут вызывать проблемы со здоровьем животного. Таким образом, уменьшение или удаление различных ANF перед употреблением корма имеет важное значение.

Известно, что ферментация соевого шрота лактобактериями и палочковидными бактериями уменьшает количество ANF и увеличивает питательную ценность корма. Есть, например, данные о том, что ферментация SBM конкретными бактериальными штаммами может привести к разрушению антигенных белков β-конглицинина и глицинина. Считается, что эти ANF обуславливают аномальные морфологические изменения кишечника и печени, наблюдаемые у серрановых, которых кормили SBM. Помимо уменьшения количества ANF в сырьевом материале во время ферментации сырьевого материала можно получить антимикробные пептиды (AMP), которые могут подавлять патогенные бактерии у хозяина.

Как неожиданно было обнаружено в соответствии с настоящим изобретением, ферментационные бульоны микроорганизмов также можно применять для улучшения свойств кормовых добавок и, в частности, для эффективного уменьшения количества и/или исключения ANF, таким образом, дополнительным объектом настоящего изобретения является способ улучшения свойств корма для животных или кормовой добавки для животных, где корм для животных или кормовую добавку для животных обрабатывают ферментационным бульоном по меньшей мере одного микроорганизма, при этом из ферментационного бульона было удалено предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 50, 70 или 90% микроорганизмов.

Предпочтительным предметом данного аспекта настоящего изобретения является способ уменьшения количества антипитательных факторов (ANF), в частности β-конглицинина и/или глицинина, в корме для животных или кормовой добавке для животных, при котором корм для животных или кормовую добавку для животных обрабатывают ферментационным бульоном по меньшей мере одного микроорганизма.

Дополнительным предпочтительным предметом данного аспекта настоящего изобретения является способ разрушения микотоксинов в корме для животных или кормовой добавке для животных, где корм для животных или кормовую добавку для животных обрабатывают ферментационным бульоном по меньшей мере одного микроорганизма.

Дополнительные улучшения свойств корма или кормовой добавки, которые можно достичь путем выдерживания корма или кормовой добавки с ферментационным бульоном, заключаются в большей полезности белков, содержащихся в корме или кормовой добавке, для животного, в лучшей сохранности корма или кормовой добавки, в частности, путем снижения pH и/или уменьшения количества загрязняющих микроорганизмов в корме или кормовой добавке. Следовательно, дополнительными предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются способы улучшения таких свойств.

Кормовые добавки, которые предпочтительно обрабатывают ферментационным бульоном для улучшения их свойств и/или свойств конечного корма, предпочтительно выбраны из кукурузы, сои, ячменя, риса, овса, сорго, соевого шрота, рапсового шрота и хлопкового шрота.

Ферментационные бульоны микроорганизмов, которые предпочтительно применяют в соответствии с настоящим изобретением для обработки корма для животных или кормовой добавки для животных, выбраны из ферментационных бульонов после культивирования пробиотических микроорганизмов, в частности пробиотических бактерий, предпочтительно ферментационных бульонов после культивирования пробиотических микроорганизмов, которые уже раскрыты выше в описании, т.е. из Bacillus, в частности B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. clausii, B. coagulans, B. flexus, B. fusiformis, B. lentus, B. megaterium, B. mesentricus, B. mojavensis, B. polymixa, B. pumilus, B. smithii, B. toyonensis и B. vallismortis, Enterococcus, в частности E. faecium и E. faecalis, Geobacillus, в частности G. stearothermophilus, Clostridium, в частности C. butyricum и Streptococcus, в частности S. faecalis, S. faecium, S. gallolyticus, S. salivarius, подвид thermophilus, и S. bovis, Lactobacillus, в частности L. acidophilus, L. amylolyticus, L. amylovorus, L. alimentarius, L. aviaries, L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. cellobiosus, L. coryniformis, L. crispatus, L. curvatus, L. delbrueckii, L. farciminis, L. fermentum, L. gallinarum, L. gasseri, L. helveticus, L. hilgardii, L. johnsonii, L. kefiranofaciens, L. kefiri, L. mucosae, L. panis, L. collinoides, L. paracasei, L. paraplantarum, L. pentosus, L. plantarum, L. pontis, L. reuteri, L. rhamnosus, L. sakei, L. salivarius и L. sanfranciscensis, Pediococcus, в частности P. acidilactici, P. dextrinicus и P. pentosaceus, Streptococcus, в частности S. lactis и S. thermophiles, Bifidibacterium, в частности S. adolescentis, B. animalis, B. bifidum, B. breve и B. longum, при этом в очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментационные бульоны получают из пробиотических микроорганизмов из рода Bacillus, которые, в частности, выбраны из следующих штаммов и их комбинаций: B. subtilis DSM 32315, B. subtilis DSM 32540, B. subtilis DSM 32592, B. licheniformis DSM 32314, B. pumilus DSM 32539, B. amyloliquefaciens CECT 5940.

Для осуществления предварительной обработки корма или кормовой добавки корм или кормовую добавку и ферментационный бульон предпочтительно смешивают в соотношении от 1:2 до 20:1, более предпочтительно от 1:1 до 10:1. Предпочтительное соотношение смешивания зависит от того, используется ли ферментационный бульон в жидкой, концентрированной или высушенной форме, поскольку в концентрированной и высушенной форме активные вещества присутствуют в более высоких концентрациях. В случае неконцентрированных ферментационных бульонов предпочтительное соотношение кормовой добавки и ферментационного бульона составляет от 1:2 до 2:1 (по весу), тогда как для высушенных ферментационных бульонов предпочтительное соотношение смеси кормовой добавки и ферментационного бульона составляет от 5:1 до 20:1 (по весу).

Для обеспечения эффективного улучшения свойств корма или кормовой добавки выдерживание корма или кормовой добавки и ферментационного бульона предпочтительно осуществляют в течение по меньшей мере одного часа, в частности от одного часа до 100 часов, более предпочтительно по меньшей мере в течение 2 часов, в частности от 2 часов до 80 часов, главным образом в течение по меньшей мере 4 часов, предпочтительно от 4 часов до 50 часов.

Ферментационные бульоны по настоящему изобретению, в частности высушенные ферментационные бульоны, обладают предпочтительно по меньшей мере одной, более предпочтительно по меньшей мере двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или десятью, в частности, всеми из следующих характеристик:

a) протеазная активность;

b) целлюлазная активность;

c) ксиланазная активность;

d) амилазная активность;

e) фитазная активность;

f) каталазная активность;

g) супероксиддисмутазная активность;

i) лактоназная активность;

j) активность против антипитательных факторов (ANF), в частности против β-конглицинина и/или глицинина;

k) активность против микотоксинов;

l) активность против патогенных микроорганизмов, в частности, против C. perfringens и/или S. suis;

m) активность в отношении гашения кворума;

n) пребиотическая активность в отношении полезных микроорганизмов.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментационные бульоны по настоящему изобретению обладают по меньшей мере следующими характеристиками:

a) протеазная активность;

b) целлюлазная активность;

c) ксиланазная активность;

d) амилазная активность;

e) активность против антипитательных факторов (ANF), в частности против β-конглицинина и/или глицинина;

f) активность против патогенных микроорганизмов, в частности против C. perfringens и/или S. suis.

Ферментационные бульоны по настоящему изобретению, в частности высушенные ферментационные бульоны, предпочтительно содержат по меньшей мере пять, более предпочтительно по меньшей мере 6, 7, 8, 9, 10 или 12 метаболитов. Метаболиты предпочтительно имеют молекулярную массу от 200 до 5000 дальтон, более предпочтительно от 300 до 4000 дальтон.

Дополнительным объектом настоящего изобретения также являются композиции, в частности кормовые композиции, содержащие по меньшей мере один ферментационный бульон, в частности по меньшей мере один высушенный ферментационный бульон в соответствии с настоящим изобретением, при этом кормовая композиция предпочтительно содержит по меньшей мере дополнительную кормовую добавку, которая, в частности, дополнительно раскрыта ниже.

Дополнительным объектом настоящего изобретения является, в частности, композиция, в частности кормовая композиция, содержащая смеси различных видов ферментационных бульонов, в частности различных видов высушенных ферментационных бульонов, которые упомянуты ранее в настоящем описании, при этом кормовая композиция предпочтительно содержит по меньшей мере одну дополнительную кормовую добавку, которая, в частности, дополнительно раскрыта ниже.

Ферментационные бульоны по настоящему изобретению и содержащие их композиции при введении животным предпочтительно улучшают состояние здоровья у таких животных, и/или улучшают общее физическое состояние у таких животных, и/или увеличивают степень конверсии корма у таких животных, и/или снижают уровень смертности таких животных, и/или увеличивают выживаемость таких животных, и/или увеличивают прирост массы тела у таких животных, и/или увеличивают продуктивность у таких животных, и/или увеличивают устойчивость к заболеваниям у таких животных, и/или увеличивают иммунный ответ у таких животных, и/или создают или поддерживают здоровую микрофлору кишечника у таких животных, и/или уменьшают выделения патогенов с фекалиями таких животных. В частности, ферментационные бульоны и композиции по настоящему изобретению можно применять для способствования восстановлению здорового баланса микрофлоры кишечника после введения антибиотиков в терапевтических целях.

Таким образом, дополнительным предметом изобретения является способ улучшения состояния здоровья у животных, и/или улучшения общего физического состояния у животных, и/или увеличения коэффициента конверсии корма у животных, и/или снижения уровня смертности животных, и/или увеличения выживаемости животных, и/или увеличения прироста массы тела у животных, и/или увеличения продуктивности у животных, и/или увеличения устойчивости животных к заболеваниям, и/или увеличения иммунного ответа у животных, и/или создания или поддержания здоровой микрофлоры кишечника у животных, и/или уменьшения выделения патогенов с фекалиями животных, где животным вводят ферментационные бульоны по настоящему изобретению или композиции по настоящему изобретению, которые содержат такие ферментационные бульоны.

"Увеличение продуктивности у животных" относится, в частности, к любому из следующего: производство большего количества яиц, молока или мяса или обеспечение их более высокого качества, или увеличение производства отнимаемого потомства.

Ферментационные бульоны в соответствии с настоящим изобретением также можно применять для улучшения качества воды. Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения также является способ контроля и/или улучшения качества воды или водных растворов, в частности, питьевой воды и/или воды для вскармливания, предусматривающий стадию внесения в воду ферментационного бульона в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, ферментационные бульоны в соответствии с настоящим изобретением можно также применять для лечения растений, в частности для лечения микробных заболеваний растений. Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения также является способ лечения растений, в частности способ лечения и/или предупреждения развития микробных заболеваний растений, в частности культурных растений, предусматривающий стадию нанесения на растения по меньшей мере одного ферментационного бульона по настоящему изобретению. Нанесение можно осуществлять в жидкой форме, такой как распыление, или в твердой форме, в частности в виде порошка.

В частности, ферментационные бульоны по настоящему изобретению можно вводить или скармливать животному в количестве, эффективном для подавления и/или уменьшения роста патогенных бактерий в кишечнике животного. Такие патогенные бактерии включают Clostridia, Listeria, Salmonella, Enterococci, Staphylococci, Aeromonas, Streptococci, Campylobacter, Escherichia coli и Vibrio. Соответственно, способы по настоящему изобретению можно применять для уменьшения количества патогенных бактерий, выделяемых в фекалиях животных. Способы по настоящему изобретению также можно применять для поддержания или увеличения роста полезных бактерий, таких как молочнокислые бактерии, в кишечнике животного. Путем уменьшения количества патогенных бактерий и/или увеличения или поддержания количества полезных бактерий композиции по настоящему изобретению способны поддерживать в целом здоровую микрофлору кишечника.

Таким образом, дополнительным объектом настоящего изобретения является способ подавления и/или уменьшения роста вредных или патогенных бактерий и/или поддержания и/или увеличения роста полезных бактерий в кишечнике животного, при котором животным вводят ферментационные бульоны по настоящему изобретению, и при этом патогенные бактерии предпочтительно выбраны из Clostridia, в частности C. perfringens и C. difficile, Listeria, в частности L. monocytogenes, L. seeligeri и L. welshimeri, Salmonella, в частности S. enterica, S. gallinarum, S. pullorum, S. arizonae, S. typhimurium, S. enteritidis и S. bongori, Enterococci, в частности E. faecalis, E. faecium и E. cecorum, Staphylococcus, в частности S. aureus, Aeromonas, Streptococci, в частности S. suis и S. gallinaceus, Campylobacter, в частности C. jejuni и C. coli, Escherichia coli и Vibrio, в частности V. parahemolyticus и V. harveyi, а полезные бактерии предпочтительно выбраны из молочнокислых бактерий, в частности из Lactobacilli и Bifidobacteria.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения количество по меньшей мере одной патогенной бактерии, в частности, количество C. perfringens, уменьшают по меньшей мере на 0,5 log, более предпочтительно по меньшей мере на 1 log, 2 log или 3 log.

Таким образом, дополнительным объектом настоящего изобретения являются ферментационные бульоны по настоящему изобретению для подавления и/или уменьшения роста патогенных бактерий и/или для поддержания и/или увеличения роста полезных бактерий в кишечнике животного, при этом патогенные бактерии предпочтительно выбраны из Clostridia, в частности C. perfringens и C. difficile, Listeria, в частности L. monocytogenes, L. seeligeri и L. welshimeri, Salmonella, в частности S. enterica, S. gallinarum, S. pullorum, S. arizonae, S. typhimurium, S. enteritidis и S. bongori, Enterococci, в частности E. faecalis, E. faecium и E. cecorum, Staphylococcus, в частности S. aureus, Aeromonas, Streptococci, в частности S. suis и S. gallinaceus, Campylobacter, в частности C. jejuni и C. coli, Escherichia coli и Vibrio, в частности V. parahemolyticus и V. harveyi, а полезные бактерии предпочтительно выбраны из молочнокислых бактерий, в частности из Lactobacilli и Bifidobacteria.

Возникновение и/или увеличение роста патогенных бактерий приводит или может привести к вспышке определенных заболеваний. Например, возникновение и/или увеличение роста Clostridium perfringens может привести к вспышке заболеваний кишечника, в частности к вспышке некротического энтерита у птицы. Возникновение и/или увеличение роста Clostridium perfringens также может привести к вспышке дополнительных заболеваний, таких как бактериальный энтерит, гангренозный дерматит и колангиогепатит. Даже самая легкая форма заражения C. perfringens уже может сопровождаться диареей, которая приводит к намоканию подстилки и, как следствие, может привести к вторичным заболеваниям, таким как дерматит подушечек лап.

Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения является терапевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один упомянутый ранее ферментационный бульон по настоящему изобретению.

Следовательно, предпочтительным объектом настоящего изобретения в данном контексте является терапевтическая композиция для лечения и/или предупреждения развития некротического энтерита, в частности субклинического некротического энтерита, у животных, предпочтительно у птицы, содержащая по меньшей мере один упомянутый ранее ферментационный бульон по настоящему изобретению.

Следовательно, другим предпочтительным объектом настоящего изобретения в данном контексте является терапевтическая композиция для лечения и/или предупреждения развития бактериального энтерита, гангренозного дерматита, колангиогепатита, клостридиоза, диареи и/или дерматита подушечек лап у животных, предпочтительно у птицы, содержащая по меньшей мере один упомянутый ранее ферментационный бульон.

Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения также является лечение и/или предупреждение развития заболевания, в частности заболевания кишечника, предпочтительно некротического энтерита, в частности субклинического некротического энтерита, у птицы, при этом нуждающемуся в этом животному вводят по меньшей мере один ферментационный бульон по настоящему изобретению.

Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения также является лечение и/или предупреждение развития заболевания, предпочтительно заболевания птицы, выбранного из бактериального энтерита, гангренозного дерматита, колангиогепатита, клостридиоза, диареи и/или дерматита подушечек лап, при этом нуждающемуся в этом животному вводят по меньшей мере один ферментационный бульон по настоящему изобретению.

Ферментационные бульоны по настоящему изобретению можно вводить животным с кормом и/или с питьевой водой в течение нескольких дней, на протяжении всей жизни животного или на определенных стадиях или этапах жизни животного. Например, штаммы и/или композиции можно вводить только в стартовом рационе или только в финишном рационе сельскохозяйственных животных.

Композиции по настоящему изобретению, в частности кормовые, пищевые и фармацевтические композиции, а также питьевая вода или вода для вскармливания, предпочтительно содержат ферментационные бульоны по настоящему изобретению в количестве от 0,1 вес. % до 10 вес. %, более предпочтительно от 0,2 вес. % до 5 вес. %, в частности от 0,3 вес. % до 3 вес. %. Способы по настоящему изобретению можно применять для всех видов животных, в частности для всех видов животных, отличных от человека и отличных от насекомых, более предпочтительно для всех видов животных, таких как млекопитающие, водные животные и птицы.

К животным, для которых может быть полезно настоящее изобретение, относятся без ограничения сельскохозяйственные животные, домашние животные, экзотические животные, животные из зоопарков, водные животных, животные, используемые для занятий спортом, отдыха или работы.

Домашние животные предпочтительно выбраны из собак, кошек, домашних птиц и домашних экзотических животных.

Водные животные предпочтительно выбраны из рыб и ракообразных, которые предпочтительно предназначены для употребления человеком в пищу. Указанные выше включают, в частности, карпа, тиляпию, сома, тунца, лосося, форель, белого морского окуня, леща, окуня, треску, пресноводных креветок, омаров, крабов, глубоководных креветок и раков. Предпочтительными типами лосося в данном контексте являются атлантический лосось, нерка, лосось мазу, чавыча, кетовый лосось, кижуч, дунайский лосось, тихоокеанский лосось и горбуша.

Дополнительными предпочтительными водными животными являются разводимая рыба, которую впоследствии перерабатывают с получением рыбной муки или рыбьего жира. В связи с этим рыба предпочтительно представляет собой сельдь, минтай, менхэден, анчоусы, мойву или треску.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления животные представляют собой сельскохозяйственные животные, которых выращивают для потребления в пищу или в качестве производителей пищевых продуктов, такие как птица, свиньи и жвачные животные.

Птица может быть выбрана из продуктивной или домашней птицы, а также из декоративной птицы или дикой птицы. Предпочтительной продуктивной птицей в данном контексте являются куры, индюки, утки и гуси. Продуктивным поголовьем в данном контексте предпочтительно является птица, оптимизированная для производства молодняка, или птица, оптимизированная для выращивания мяса. Предпочтительными декоративными птицами или пернатой дичью являются павлины, фазаны, куропатки, кеклики, цесарки, перепела, глухари, тетерева, голуби и лебеди, причем особенно предпочтительными являются перепела. Другими предпочтительными птицами являются бескилевые, в частности страусы и эму, а также попугаи.

Жвачные животные в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно выбраны из крупного рогатого скота, коз и овец. В одном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению можно скармливать жвачным животным в дожвачный период для улучшения их здоровья и, в частности, для снижения частоты диареи у этих животных. Жвачные животные в дожвачный период являются жвачными животными, в том числе телятами, в возрасте от рождения до приблизительно двенадцати недель.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать по меньшей мере один носитель или типичные кормовые добавки или их комбинации.

Подходящими носителями являются инертные добавки к составу, добавляемые для улучшения восстановления, эффективности или физических свойств и/или для облегчения упаковки и введения. Такие носители можно добавлять по отдельности или в комбинации. Данные носители можно выбрать из средств против слеживания, средств против окисления, наполнителей и/или защитных средств. Примеры пригодных носителей включают полисахариды (в частности, виды крахмала, мальтодекстрины, виды метилцеллюлозы, виды камеди, хитозан и/или инулины), источники белка (в частности, сухое обезжиренное молоко и/или порошок сладкой сыворотки), пептиды, сахара (в частности, лактозу, трегалозу, сахарозу и/или декстрозу), липиды (в частности, лецитин, растительные масла и/или минеральные масла), соли (в частности, хлорид натрия, карбонат натрия, карбонат кальция, мел, известняк, карбонат магния, фосфат натрия, фосфат кальция, фосфат магния и/или цитрат натрия) и силикаты (в частности, глины, в частности беолитовую глину, аморфный диоксид кремния, виды коллоидального/осажденного диоксида кремния, цеолиты, фуллерову землю, байлит, клинтполит, монтмориллонит, диатомовую землю, тальк, бентониты и/или такие силикатные соли, как силикат алюминия, магния и/или кальция). Подходящие носители для кормовых добавок указаны в официальном издании American Feed Control Officials, Inc, которое публикуется ежегодно. См., например, официальное издание American Feed Control Officials, Sharon Krebs, editor, 2006 edition, ISBN 1-878341-18-9. Носители можно добавлять после концентрирования ферментационного бульона и/или во время и/или после высушивания. Предпочтительные носители в соответствии с настоящим изобретением выбраны из карбоната кальция, диатомовой земли и растительного масла.

Композиции, в частности кормовые композиции, по настоящему изобретению могут также содержать пробиотики в качестве дополнительных кормовых добавок, при этом пробиотики предпочтительно выбраны из перечня упомянутых ранее пробиотиков, т.е. из Bacillus, в частности B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. clausii, B. coagulans, B. flexus, B. fusiformis, B. lentus, B. megaterium, B. mesentricus, B. mojavensis, B. polymixa, B. pumilus, B. smithii, B. toyonensis и B. vallismortis, Enterococcus, в частности E. faecium и E. faecalis, Geobacillus, в частности G. stearothermophilus, Clostridium, в частности C. butyricum и Streptococcus, в частности S. faecalis, S. faecium, S. gallolyticus, S. salivarius, подвид thermophilus, и S. bovis, Lactobacillus, в частности L. acidophilus, L. amylolyticus, L. amylovorus, L. alimentarius, L. aviaries, L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. cellobiosus, L. coryniformis, L. crispatus, L. curvatus, L. delbrueckii, L. farciminis, L. fermentum, L. gallinarum, L. gasseri, L. helveticus, L. hilgardii, L. johnsonii, L. kefiranofaciens, L. kefiri, L. mucosae, L. panis, L. collinoides, L. paracasei, L. paraplantarum, L. pentosus, L. plantarum, L. pontis, L. reuteri, L. rhamnosus, L. sakei, L. salivarius и L. sanfranciscensis, Pediococcus, в частности P. acidilactici, P. dextrinicus и P. pentosaceus, Streptococcus, в частности S. lactis и S. thermophiles, Bifidibacterium, в частности S. adolescentis, B. animalis, B. bifidum, B. breve и B. longum, при этом в очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментационные бульоны получены из пробиотических микроорганизмов из рода Bacillus, в частности выбраны из следующих штаммов и их комбинаций: B. subtilis DSM 32315, B. subtilis DSM 32540, B. subtilis DSM 32592, B. licheniformis DSM 32314, B. pumilus DSM 32539, B. amyloliquefaciens CECT 5940. Дополнительные подходящие пробиотики выбраны из Bacillus subtilis PB6 (описанного в патенте США № 7247299 и депонированного под номером ATCC PTA-6737), который продается компанией Kemin под торговой маркой CLOSTAT®, Bacillus subtilis C-3102 (описанного в патенте США № 4919936 и депонированного под номером FERM BP-1096 институтом Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science и Technology, в Японии), продаваемого компанией Calpis под названием CALSPORIN®, Bacillus subtilis DSM 17299, продаваемого компанией Chr. Hansen под торговой маркой GalliPro®, Bacillus licheniformis DSM 17236, продаваемого компанией Chr. Hansen под торговой маркой GalliProTect®, смеси спор Bacillus licheniformis DSMZ 5749 и Bacillus subtilis DSMZ 5750, продаваемой компанией Chr. Hansen под торговой маркой BioPlus®YC, B. subtilis DSM 29784, продаваемого компаниями Adisseo/Novozymes под торговой маркой Alterion®, Bacillus subtilis, продаваемого компанием Chr. Hansen под торговой маркой PORCBOOST®, или штаммов Bacillus coagulans, которые описаны в патенте США № 6849256. В композициях по настоящему изобретению также можно применять и другие отличные от Bacillus пробиотики, такие как Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae или Hansenula.

К подходящим типичным кормовым добавкам для животных, которые также могут содержаться в композициях в соответствии с настоящим изобретением и/или которые можно применять в приготовлении кормовых композиций, исходя из концентрированных или высушенных ферментационных бульонов в соответствии с настоящим изобретением, относятся одно или несколько из следующего: белки, углеводы, жиры, пребиотики, ферменты, витамины, иммуномодуляторы, заменители молока, минералы, аминокислоты, кокцидиостатики, продукты на основе кислот и/или лекарственные средства, такие как антибиотики.

Содержащие углеводы компоненты, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой, например, фураж, грубый корм, пшеничную муку, подсолнечную муку или соевую муку и их смеси.

Содержащие белки компоненты, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой, например, соевый белок, гороховый белок, пшеничный глютен или кукурузный глютен и их смеси.

Содержащие жиры компоненты, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой, в частности, масла как животного, так и растительного происхождения, например, соевое масло, рапсовое масло, подсолнечное масло, льняное масло или пальмовое масло, рыбий жир и их смеси.

Содержащими белки компонентами, которые дополнительно содержат жиры, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, являются, например, рыбная мука, мука из криля, мука из моллюсков, мука из кальмаров или раковины креветок, а также их комбинации.

Пребиотиками, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно являются олигосахариды, в частности, выбранные из галактоолигосахаридов, силаилолигосахаридов, лактулозы, лактосахарозы, фруктоолигосахаридов, палатинозных или изомальтозных олигосахаридов, гликозилсахарозы, мальтоолигосахаридов, изомальтоолигосахаридов, циклодекстринов, гентиоолигосахаридов, соевых олигоолигосахаридов, ксилоолигосахаридов, декстранов, пектинов, полигалактуронана, рамногалактуронана, маннана, гемицеллюлозы, арабиногалактана, арабинана, арабиноксилана, резистентного крахмала, мехбиозы, хитозана, агарозы, инулина, тагатозы, полидекстрозы и альгината.

Ферменты, которые можно применять в кормовых композициях в соответствии с настоящим изобретением и которые могут способствовать перевариванию корма, предпочтительно выбраны из фитаз (EC 3.1.3.8 или 3.1.3.26), ксиланаз (EC 3.2.1.8), галактаназ (EC 3.2.1.89), галактозидаз, в частности альфа-галактозидаз (EC 3.2.1.22), протеаз (EC 3.4), фосфолипаз, в частности фосфолипаз A1 (EC 3.1.1.32), A2 (EC 3.1.1.4), C (EC 3.1.4.3) и D (EC 3.1.4.4), лизофосфолипаз (EC 3.1.1.5), амилаз, в частности альфа-амилаз (EC 3.2.1.1); лизоцимов (EC 3.2.1.17), глюканаз, в частности бета-глюканаз (EC 3.2.1.4 или EC 3.2.1.6), глюкоамилаз, целлюлаз, пектиназ или любых их смесей.

Примеры коммерчески доступных фитаз включают фитазу Bio-Feed™ (Novozymes), Ronozyme® P и HiPhos™ (DSM Nutritional Products), Natuphos™ (BASF), Finase® и Quantum® Blue (AB Enzymes), Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) и Axtra® PHY (DuPont). Другие предпочтительные фитазы включают фитазы, описанные, например, в WO 98/28408, WO 00/43503 и WO 03/066847.

Примеры коммерчески доступных ксиланаз включают Ronozyme® WX и G2 (DSM Nutritional Products), Econase® XT и Barley (AB Vista), Xylathin® (Verenium) и Axtra® XB (ксиланаза/бета-глюканаза, DuPont). Примеры коммерчески доступных протеаз включают Ronozyme® ProAct (DSM Nutritional Products).

Витаминами, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, являются, например, витамин A, витамин D3, витамин E, витамин K, например витамин K3, витамин B12, биотин, холин, витамин B1, витамин B2, витамин B6, ниацин, фолиевая кислота и пантотенат, например Ca-D-пантотенат, или их комбинации.

Иммуномодуляторами, которые можно применять, являются, например, антитела, цитокины, высушенная распылением плазма, интерлейкины или интерфероны или их комбинации.

Минералами, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, являются, например, бор, кобальт, хлорид, хром, медь, фторид, йод, железо, марганец, молибден, селен, цинк, кальций, магний, калий или натрий или их комбинации.

Аминокислоты, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой, например, лизин, аланин, треонин, метионин, валин или триптофан или их комбинации.

Таким образом, дополнительным вариантом осуществления настоящего изобретения является способ получения кормовой композиции для животных, предусматривающий смешивание по меньшей мере одного ферментационного бульона, в частности высушенного ферментационного бульона, или смеси ферментационных бульонов в соответствии с настоящим изобретением, в частности, в количестве, эффективном для улучшения состояния здоровья животного, с кормовыми добавками, такими как белки, липиды и/или углеводы, и необязательно дополнительными полезными веществами, предпочтительно упомянутыми ранее, с получением кормового продукта. Данный способ может предусматривать, например, также стадию гранулирования.

Можно применять стандартные способы гранулирования, известные специалистам в данной области, в том числе экструзионную обработку сухих или полувлажных кормов. Предпочтительные значения температуры гранулирования составляют от приблизительно 65°C до приблизительно 120°C.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения при получении кормовой композиции согласно настоящему изобретению ферментационный бульон(бульоны) согласно настоящему изобретению добавляют на последующей стадии в уже полученный кормовой продукт, в частности в кормовую гранулу, при этом добавление ферментационного бульона(бульонов) к уже полученному кормовому продукту, в частности к кормовой грануле, предпочтительно осуществляют путем распыления или нанесения покрытия в вакууме. Данный способ обладает особым преимуществом, заключающимся в том, что можно полностью избежать термического разрушения ферментов, содержащихся в ферментационном бульоне(бульонах).

Кроме того, в кормовой продукт, в частности в кормовую гранулу, можно добавлять другие чувствительные материалы, такие как масла и/или ферменты, путем распыления или нанесения покрытия в вакууме.
Ферментационные бульоны по настоящему изобретению можно получить путем культивирования штаммов по настоящему изобретению в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники, в том числе путем использования среды, условий и способов, которые описаны, например, в US 6060051, EP0287699, US2014/0010792 или FAO Report 179 (2016): Probiotics in Animal Nutrition. Традиционные способы крупномасштабного культивирования микроорганизмов включают глубинную ферментацию, твердофазную ферментацию или культивирование на поверхности жидкости. К концу ферментации, когда истощены запасы питательных веществ, клетки штаммов Bacillus начинают переход от фазы роста к фазе споруляции, так что конечным продуктом ферментации в основном являются споры, метаболиты и остаточная среда для ферментации. Споруляция является частью естественного жизненного цикла этих штаммов и обычно инициируется клеткой в ответ на ограничение питательных веществ. С помощью ферментации можно получать высокие уровни колониеобразующих единиц пробиотических клеток и стимулировать споруляцию.

Предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением в вариантах осуществления настоящего изобретения всегда применяют эффективное количество ферментационных бульонов по настоящему изобретению. Термин "эффективное количество" относится к количеству, которое оказывает по меньшей мере один благоприятный эффект на животное и/или окружающую среду, в частности, в отношении упомянутых ранее признаков, по сравнению с животным, которому не был введен ферментационный бульон по настоящему изобретению, но, помимо этого, ему был назначен тот же рацион (включая корм и другие соединения).

В случае терапевтических вариантов применения предпочтительно применяют терапевтическое количество ферментационных бульонов по настоящему изобретению. Термин "терапевтическое количество" относится к количеству, достаточному для облегчения, обратного развития или предупреждения развития болезненного состояния у животного. Оптимальные уровни дозировки для различных животных могут быть легко определены специалистами в данной области техники путем оценки, среди прочего, способности композиции (i) подавлять или уменьшать количество патогенных бактерий в кишечнике при различных дозах, (ii) повышать или поддерживать уровни полезных бактерий и/или (iii) улучшать состояние здоровья животного при различных дозах.

Описание графических материалов

На фиг. 1 показана целлюлазная активность а) вегетативных клеток B. subtilis штамма DSM 32540; b) вегетативных клеток B. amyloliquefaciens штамма CECT 5940; c) подвергнутого стерилизующей фильтрации невысушенного супернатанта ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940; d) подвергнутого стерилизующей фильтрации невысушенного супернатанта ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940. Целлюлазная активность приводит к осветлению на чашке с агаром вокруг зоны гидролиза целлюлозы.

На фиг. 2 показана целлюлазная активность а) вегетативных клеток B. subtilis штамма DSM 32540; b) подвергнутого стерилизующей фильтрации супернатанта ферментации B. subtilis DSM 32540; c) подвергнутого стерилизующей фильтрации невысушенного супернатанта ферментации B. subtilis DSM 32540; d) не подвергнутого стерилизующей фильтрации невысушенного супернатанта ферментации B. subtilis DSM 32540; e) не подвергнутого стерилизующей фильтрации супернатанта ферментации B. subtilis DSM 32540. Целлюлазная активность приводит к осветлению на чашке с агаром вокруг зоны гидролиза целлюлозы.

На фиг. 3 показана целлюлазная активность а)-d) подвергнутого стерилизующей фильтрации (высушенного сублимацией и растворенного) супернатанта ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940; e) вегетативных клеток B. amyloliquefaciens CECT 5940. Целлюлазная активность приводит к осветлению на чашке с агаром вокруг зоны гидролиза целлюлозы.

На фиг. 4 показана ксиланазная активность а) вегетативных клеток B. amyloliquefaciens CECT 5940; b) вегетативных клеток B. subtilis DSM 32540; c) подвергнутого стерилизующей фильтрации невысушенного супернатанта ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940; d) подвергнутого стерилизующей фильтрации невысушенного супернатанта ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940. Ксиланазная активность приводит к осветлению на чашке с агаром вокруг зоны гидролиза ксилана.

На фиг. 5 показана амилазная активность а)-d) подвергнутого стерилизующей фильтрации (высушенного сублимацией и растворенного) супернатанта ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940; e) вегетативных клеток B. amyloliquefaciens штамма CECT 5940. Амилазная активность приводит к осветлению на чашке с агаром вокруг зоны гидролиза крахмала.

На фиг. 6 показана протеазная активность а) вегетативных клеток B. subtilis DSM 32540; b) вегетативных клеток B. amyloliquefaciens CECT 5940; c) подвергнутого стерилизующей фильтрации невысушенного супернатанта ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940; d) подвергнутого стерилизующей фильтрации невысушенного супернатанта ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940. Протеазная активность приводит к осветлению на чашке с агаром вокруг зоны гидролиза субстрата.

На фиг. 7 показана протеазная активность а)-d) подвергнутого стерилизующей фильтрации (высушенного сублимацией и растворенного) супернатанта ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940; e) вегетативных клеток B. amyloliquefaciens CECT 5940. Протеазная активность приводит к осветлению на чашке с агаром вокруг зоны гидролиза субстрата.

На фиг. 8 показано изображение SDS-PAGE экстрактов соевого белка, обработанных в течение 24 ч. с помощью подвергнутых стерилизующией фильтрации невысушенных супернатантов ферментации B. subtilis DSM 32540.

На фиг. 9 показано изображение SDS-PAGE экстрактов соевого белка, обработанных в течение 24 ч. с помощью подвергнутых стерилизующией фильтрации невысушенных супернатантов ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940. Указанные полосы белка были идентифицированы с помощью nLC/MS-анализов как: альфа'-цепь 1-бета-конглицинина Glycine max; альфа-субъединица 2-бета-конглицинина Glycine max; альфа-субъединица 3-бета-конглицинина Glycine max; 4-глицинин Glycine max; основная альфа-субъединица 5-бета-конглицинина Glycine max; основная альфа-субъединица 6-бета-конглицинина Glycine max; альфа-субъединица 7-бета-конглицинина Glycine max.

Демонстрационные примеры

Пример 1. Качественная и количественная оценка расщепляющей ферментативной активности

Супернатанты ферментации в стандартной среде пробиотических штаммов B. subtilis DSM 32540 и B. amyloliquefaciens CECT 5940 оценивали в отношении расщепляющей ферментативной активности, в частности, аэробной целлюлитической (фиг. 1-3), ксиланолитической (фиг. 4), амилазной (фиг. 5) и протеолитической активности (фиг. 6-7).

Для оценки целлюлазной активности 3 мкл подвергнутого стерилизующей фильтрации невысушенного и/или высушенного сублимацией и растворенного супернатанта ферментации пробиотических Bacillus наносили каплями на агаровую среду LB, содержащую 5 г/л целлюлозы Sigmacell. Для скрининга протеазной активности 3 мкл подвергнутого стерилизующей фильтрации невысушенного и/или высушенного сублимацией и растворенного супернатанта ферментации пробиотических штаммов Bacillus наносили каплями на агаровую среду LB, содержащую 10% обезжиренного молока. Ксиланазную активность анализировали аналогичным образом на агаровой среде LB, содержащей 0,5% ксилана; амилазную активность анализировали на агаровой среде LB, содержащей 10 г/л растворимого крахмала.

В качестве положительного контроля анализировали ферментативные активности вегетативных клеток соответствующих пробиотических штаммов. Для этого 3 мкл жидкой культуры наносили каплями непосредственно на соответствующие чашки с агаром, которые выдерживали при 37°C в аэробных условиях. Считываемым параметром было появление зон гидролиза, образующихся в результате ферментативной активности. Среды, использованные в анализе целлюлазной и амилазной активности, окрашивали йодным раствором Люголя (фиг. 1-3; 5).

Результаты качественных анализов расщепляющей ферментативной активности свидетельствовали о том, что соответствующие активности могут быть обнаружены в подвергнутых стерилизующей фильтрации супернатантах, а также в высушенных сублимацией и растворенных подвергнутых стерилизующей фильтрации супернатантах.

Кроме того, количественно оценивали протеолитическую активность подвергнутых стерилизующей фильтрации невысушенных супернатантов ферментации штамма Bacillus. 10 мкл подвергнутого стерилизующей фильтрации супернатанта добавляли к 20 мкл 0,5% раствора казеина с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC; C3777, Sigma-Aldrich) с 20 мкл буфера, состоящего из 20 мМ фосфата натрия (двухосновного, безводного) со 150 мМ хлорида натрия (все компоненты от Sigma- Aldrich), затем выдерживали в течение 1 ч при 37°C. После добавления 150 мкл 10% (об./об.) трихлоруксусной кислоты (Sigma-Aldrich) и еще одного выдерживания в течение 30 мин при 37°C образцы центрифугировали при 19000 об/мин в течение 15 мин, затем 2 мкл супернатанта переносили в 200 мкл 500 мМ раствора TRIS и HCl (Trizma BaseTRIS, Sigma-Aldrich). Флуоресценцию растворимых пептидов вследствие протеолитического высвобождения определяли (TECAN GENios Microplate Reader, Tecan Group Ltd., Männedorf, Швейцария) при длине волны возбуждения 494 нм, длине волны испускания 518 нм. Анализ проводили за два независимых цикла, затем усредняли в миллиединицах на микролитр раствора. Результаты можно найти в таблице 1.

Таблица 1. Протеазная активность подвергнутых стерилизующей фильтрации супернатантов ферментационного бульона B. subtilis DSM 32540 и B. amyloliquefaciens CECT 5940.

При прямом сравнении супернатант ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940 характеризовался более чем 10-кратным увеличением протеазной активности, чем супернатант ферментации B. subtilis DSM 32540.

Пример 2. Подавление патогенов супернатантами ферментации пробиотических штаммов Bacillus

Подавление патогенов супернатантом посредством вторичных метаболитов, вырабатываемых пробиотическими штаммами Bacillus во время ферментации, оценивали с помощью диффузионных тестов на антагонизм в лунке (Parente et al. 1995).

Проводили диффузионный тест на антагонизм в лунке с различными патогенами, штаммом ATCC 13124 типа Clostridium perfringens от Teo and Tan (2005) и Streptococcus suis ATCC 43765 (анализ проводили с высушенным сублимацией, растворенным, подвергнутым стерилизующей фильтрации супернатантом). Как известно, штамм ATCC 13124 является альфа-токсигенным штаммом типа A, который служит типовым штаммом для Clostridia.

S. suis является важным патогеном у свиней и одной из наиболее значимых причин бактериальной смертности у поросят после отъема, вызывая сепсис, менингит и многие другие инфекции (Goyette-Desjardins et al. 2014). ATCC 43765 принадлежит к серологической группе: R; серовар 2, и был выделен из свиней.

Патогенные штаммы выращивали в подходящих условиях в виде жидкой культуры до оптической плотности на 600 нм, составлявшей по меньшей мере 1, затем 130 мкл распределяли стерильной палочкой на поверхности чашек с агаром. Для всех патогенов использовали чашки с агаром TSBYE. В высушенных средах вырезали лунки диаметром 9 мм. 1-ю лунку использовали в качестве контрольной неинокулированной среды без культуры, остальные лунки инокулировали с помощью 100 мкл подвергнутого стерилизационной фильтрации супернатанта (с термообработкой или без нее) ферментации пробиотических штаммов Bacillus. После 24 ч. выдерживания в подходящих условиях при 37°C определяли зону осветления в мм, измеряя от края вырезанной лунки до границы осветленного "газона". Каждую колонию измеряли дважды (по горизонтали, вертикали), а затем результаты измерений усредняли. Результаты можно найти в представленных далее таблицах 2 и 3.

Таблица 2. Результаты сравнения подвергнутого и не подвергнутого термообработке, подвергнутого стерилизующей фильтрации невысушенного супернатанта ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940 в отношении способности подавлять патогенный штамм Clostridium perfringens в дифузионных анализах антагонизма в лунке на среде TSBYE, значения представлены в мм осветления патогена

Из данных видно, что невысушенный супернатант ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940, который также подвергнут термообработке, очень эффективно подавлял рост C. perfringens.

Таблица 3. Результаты сравнения подвергнутого и не подвергнутого термообработке, подвергнутого стерилизующей фильтрации супернатанта ферментации B. subtilis DSM 32540 в отношении способности подавлять патогенный штамм S. Suis в дифузионных анализах антагонизма в лунке на среде TSBYE, значения представлены в мм осветления патогена

Из данных видно, что супернатант ферментации B. subtilis DSM 32540, который также подвергнут термообработке, очень эффективно подавлял рост S. suis ATCC 43765. Кроме того, подавляющий эффект также все еще наблюдали и после сублимационной сушки.

Teo, A. Y.-L. and Tan, H.-M. (2005). Inhibition of Clostridium perfringens by a novel strain of Bacillus subtilis from the gastrointestinal tracts of healthy chickens. Appl. Environm. Microbiol., 71:4185-90.

Parente, E., Brienza, C., Moles, M., & Ricciardi, A. (1995). A comparison of methods for the measurement of bacteriocin activity. Journal of microbiological methods, 22(1), 95-108.

Goyette-Desjardins, G., Auger, J.P., Xu, J., Segura, M. and Gottschalk, M. (2014). Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerg Microbes Infect. 2014 Jun; 3(6):e45.

Пример 3. Оценка гидролитической активности подвергнутых стерилизующей фильтрации супернатантов ферментации пробиотических Bacillus на антипитательные факторы из соевого шрота

Белки экстрагировали из обезжиренного соевого шрота с использованием способа, адаптированного из способа по Iwabuchi and Yamauchi (1987). Обезжиренный соевый шрот подвергали экстракции с использованием 100 мл 0,03 М Tris-HCl (pH 8), содержащего 10 мМ β-меркаптоэтанола, при перемешивании в течение 1 ч при комнатной температуре. Образцы центрифугировали, супернатант подвергали стерилизующей фильтрации и хранили образцы при -20°C.

Подвергнутые стерилизующей фильтрации невысушенные супернатанты ферментации пробиотических B. subtilis DSM 32540 и B. amyloliquefaciens CECT 5940 выдерживали в соотношении 2:1 с экстрактами соевого белка при 37°C. Отбирали образцы через 0 ч, 6 ч и 24 ч., центрифугировали, и супернатант хранили при -20°C до дальнейших анализов. Параллельно анализировали контрольные образцы с добавлением неотработанной среды.

Концентрации белка определяли с помощью набора для анализа белков Bio-Rad (Bio-Rad, США). Гидролиз белка контролировали с помощью SDS-PAGE. Перед загрузкой на гель регулировали концентрации белков и денатурировали белки путем термообработки при 95°C в течение 5 мин. 20 мкг экстрагированных белков загружали в каждую лунку геля 10% Mini Protean TGX Precast SDS Gel. В качестве маркера использовали набор маркерных белков Precision Plus Protein™ Dual Color Standards (10-250 кДа). Белки разделяли при 40 мА в течение часа. Гели окрашивали раствором кумасси бриллиантового синего G250 и кумасси бриллиантового синего R250 и обесцвечивали раствором уксусной кислоты. Разрушение соевых белков можно было наблюдать по исчезновению полос белков с течением времени (фиг. 8 и 9).

Протеолитическое разрушение экстрактов соевого белка не поддавалось обнаружению в контрольных образцах, содержащих только среду и экстракт соевого белка. Гидролиз значимых белков можно было обнаруживать после 6 и 24 ч выдерживания экстракта соевого белка с подвергнутым стерилизующей фильтрации супернатантом ферментации B. subtilis DSM 32540 и ферментации B. amyloliquefaciens CECT 5940 соответственно. Увеличение количества пептидов меньшего размера (<25 кДа) сопровождалось уменьшением количества нескольких полос белков более крупного размера (25-75 кДа). Полосы белков, которые разрушались с течением времени, и конкретные полосы из контрольного образца соевого экстракта, выдержанного только со средой, анализировали с помощью нано-LC/MS и идентифицировали с помощью масс-спектрометрии с высоким разрешением как β-конглицинин и глицинин из Glycine max. Таким образом, антигенные белки β-конглицинина и глицинина сои разрушались в ходе выдерживания с невысушенным, подвергнутым стерилизующей фильтрации супернатантом ферментации Bacillus.

Iwabuchi, S. and Yamauchi, F. (1987): Determination of glycinin and β-conglycinin in soybean proteins by immunological methods. J. Agric. Food Chem. 35, 200-205.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения высушенного ферментационного бульона, предусматривающий следующие стадии: культивирование пробиотических микроорганизмов в среде для ферментации с получением ферментационного бульона, содержащего указанные пробиотические микроорганизмы; отделение по меньшей мере 90% микроорганизмов от ферментационного бульона; высушивание полученного таким образом ферментационного бульона путем сублимационной сушки, распылительной сушки, вакуумной сушки, сушки в псевдоожиженном слое или распылительной грануляции с получением высушенного ферментационного бульона. Изобретение позволяет улучшить свойства корма для животных или кормовой добавки, где корм для животных или кормовую добавку обрабатывают ферментационным бульоном после культивирования пробиотического микроорганизма, из которого было удалено по меньшей мере 90% микроорганизмов и который был высушен путем сублимационной сушки, распылительной сушки, вакуумной сушки, сушки в псевдоожиженном слое или распылительной грануляции. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 3 пр.

1. Способ получения высушенного ферментационного бульона, предусматривающий следующие стадии:

a) культивирование пробиотических микроорганизмов в среде для ферментации с получением ферментационного бульона, содержащего указанные пробиотические микроорганизмы;

b) отделение по меньшей мере 90% микроорганизмов от ферментационного бульона;

c) высушивание полученного таким образом ферментационного бульона путем сублимационной сушки, распылительной сушки, вакуумной сушки, сушки в псевдоожиженном слое или распылительной грануляции с получением высушенного ферментационного бульона.

2. Способ по п. 1, где пробиотические микроорганизмы выбраны из Bacillus, Enterococcus, Geobacillus, Clostridium, Streptococcus, Lactobacillus и Pediococcus.

3. Способ улучшения свойств корма для животных или кормовой добавки, где корм для животных или кормовую добавку обрабатывают ферментационным бульоном после культивирования пробиотического микроорганизма, из которого было удалено по меньшей мере 90% микроорганизмов и который был высушен путем сублимационной сушки, распылительной сушки, вакуумной сушки, сушки в псевдоожиженном слое или распылительной грануляции, где свойства, которые улучшают, выбраны из уменьшения количества антипитательных факторов (ANF), и/или разрушения микотоксинов, и/или увеличения полезности белков для животных, и/или увеличения сохранности корма или кормовой добавки, где кормовая добавка выбрана из кукурузы, сои, ячменя, риса, овса, сорго, соевого шрота, рапсового шрота и хлопкового шрота и, где корм для животных или кормовая добавка и ферментационный бульон смешивают в соотношении от 2:1 до 1:20 и выдерживают в течение по меньшей мере 1 ч.

4. Способ по п. 3, где ферментационный бульон выбран из ферментационных бульонов после культивирования пробиотических бактерий.

5. Способ по п. 3 или 4, где пробиотические бактерии выбраны из Bacillus, Enterococcus, Geobacillus, Clostridium, Streptococcus, Lactobacillus и Pediococcus.