Способ изготовления препаратов зубов для морфологических исследований структуры цемента в атомно-силовом микроскопе Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, в частности стоматологии, морфологии, гистологии, и может применяться для исследования морфологической структуры цемента зуба, которая имеет отличительные особенности строения в топографии, направлении и упаковке коллагеновых волокон, элементы которых визуализируются в атомно-силовом микроскопе, а зондирование поверхности осуществляется в нанодиапазоне, необходимом для контролируемого исследования клеточного и бесклеточного участков, коллагеновых структур, их взаимоотношений между собой и другими твердыми тканями путем продольного распила зуба.

Известен способ препарирования, представляющий собой комбинацию методов фиксации тканей в плотный компаунд эпоксидной смолы с известными техническими приемами изготовления шлифов зубов (Костиленко Ю.П., Бойко И.В. Журнал «Стоматология», №5, 2005).

Зубы после экстракции промывают в физиологическом растворе, дегидратируют и пропитывают эпоксидной смолой, помещают в нее. После полимеризации полученный блок разрезают сепаровочным диском, шлифуют торцевые поверхности до получения ровного шлифа. Затем частично протравливают эмаль в хелатообразующем агенте (трилон Б) и наносят на препарат слой электропроводящего вещества. На данном этапе препарат пригоден для изучения в сканирующем электронном микроскопе. Для исследования препарата в трансмиссионном электронном микроскопе при помощи нитроклетчатки снимают отпечатки, с которых готовят угольные реплики путем напыления в вакууме спектрально чистого графита. Реплики наносят на предметные сетки и исследуют (Костиленко Ю.П., Бойко И.В. Метод изготовления препаратов прижизненно сохранных зубов для многоцелевых исследований. Клиническая анатомия и оперативная хирургия 2004; 3:5:63-65).

Недостатком данного способа является низкая разрешающая способность исследования структуры клеточного цемента, направления и упаковки коллагеновых волокон из-за неконтролируемого протравливания исследуемой поверхности.

Известен способ приготовления препаратов для исследования зубов с применением сканирующего акустического микроскопа. Зубы распиливают при помощи алмазной пилы диаметром 50 мм, толщиной 0,5 мм при скорости 1500 об/мин. Поверхность спила обрабатывают на чугунных планшайбах с применением свободного абразива - корундового порошка со средней величиной зерна 40 мкм (М40). После предварительного выравнивания поверхности образцы дошлифовывают вручную на стеклянных пластинах с использованием абразивных порошков меньшего размера зерна - вплоть до 5 мкм (М5). (Л.А. Денисова. Акустическая гистология тканей зуба. http://www.mediasphera.ru/journals/stomo/detail/261/3954).

Недостатком данного способа является большая вероятность получения множества искажений и артефактов при его применении из-за использования процедуры ручного шлифования на заключительном этапе.

Известен способ приготовления препаратов зубов для исследования с применением атомно-силового и инвертированного микроскопов. Препарат шлифуют на шлифовально-полировальном станке шлифовальными кругами «hermes». После шлифования промывают его струей дистиллированной воды в течение 2 минут, затем полируют на шлифовально-полировальном станке «Нейрис» с использованием полиэтиленового полировального круга с алмазной суспензией и охлаждают под струей дистиллированной воды в течение 2 минут, высушивают препарат с использованием горелки ГП при температуре 35°С в течение 3 минут. Травят поверхность препарата 37% ортофосфорной кислотой Н₃РО₄ в течение 2 секунд и промывают под струей дистиллированной воды в течение 2 секунд. Высушивают препарат с использование горелки ГП при температуре 39°С в течение 5 минут и укладывают его на предметный стол АСМ или предметный стол икинвертированного микроскопа для исследования (Патент RU 2458975 С1 от 04.05.2011 г.).

Недостатки данного способа заключаются в том, что его применение невозможно при исследовании различных участков цемента. Для получения шлифов других слоев необходимо повторно подготавливать образец, что является трудоемким и затруднительным для исследования серийных групп. Данный метод взят нами за прототип.

Заявляемый способ изготовления препаратов цемента зубов для морфологических исследований в атомно-силовом микроскопе прост и удобен в применении, отличается высокой точностью и позволяет изготавливать и одновременно исследовать максимально качественные образцы цемента различных участков на продольном распиле зуба.

Техническим результатом заявленного изобретения является усовершенствованием способа изготовления препаратов зубов для морфологических исследований ультраструктуры цемента в различных участках на атомно-силовом микроскопе, под точным и объективным контролем сошлифовывания необходимой толщины твердых тканей, позволяющего исследовать клеточный и бесклеточный цемент по всей поверхности корневой части зуба.

Технический результат достигается тем, что в способе изготовления препаратов зубов для морфологических исследований цемента различных участков в атомно-силовом микроскопе (АСМ) производится дозированное шлифование с дополнительной ультразвуковой обработкой поверхности и комбинированное полирование кругами с алмазной пастой W3.53000grit и алмазной суспензией Akasel 1 микрон, поверхность которой получают 14Б класса чистоты и протравливают 37% ортофосфорной кислотой в течение 15 секунд, под точным и объективным контролем сошлифовывания необходимой толщины цемента. Метод позволяет подготовить поверхность для исследования цемента различных участков корневой части зуба с точным определением клеточных, бесклеточных структур и коллагеновых волокон. Применение алмазной пасты W7 1500 позволяет устранить микротрещины и сколы, возникающие во время механической обработки, исключить дополнительное загрязнение за счет мелкодисперсной структуры и других красящих компонентов. Ультразвуковая очистка улучшает качество подготовки препаратов, позволяет произвести максимальную очистку исследуемой поверхности зубов.

Способ изготовления препаратов зубов для морфологических исследований цемента различных участков осуществляют следующим образом. Зуб после экстракции помещают в 40% раствор формальдегида, затем его фиксируют в столярной струбцине таким образом, чтобы линия распила проходила строго через все участки цемента от пришеечного до апикального, с помощью алмазного диска диаметром 20 мм проводят распил с охлаждением дистиллированной водой. Далее осуществляют вертикальную сепарацию зуба, тем самым получают продольный срез. Готовят патрон из полипропиленовой трубы с внутренним диметром 30 мм, толщиной стенки 5 мм, путем отрезания фрагмента с помощью ножниц для резки труб ПВХ, получают заготовку высотой 10 мм, внутренним диаметром 30 мм, толщиной стенки 5 мм, алмазным надфилем убирают неровности заготовки, штангенциркулем контролируют высоту и параллельность. Подготовленный ранее фрагмент зуба помещают в патрон, размещенный на ровной горизонтальной поверхности, срезом вниз, заливают двухкомпонентной эпоксидной смолой на 24 часа, получают препарат.

На втором этапе препарат шлифуют на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» шлифовальными кругами «Dexter» зернистостью 1000 grit в течение2 минут с охлаждением дистиллированной водой, при этом сошлифовывают0,5 мм препарата. Контроль сошлифованного слоя осуществляют с помощью штангенциркуля. После чего производят последовательную обработку шлифовальными кругами «Dexter» зернистостью 1500, 2000, 2500grit в течение1 минуты каждым с охлаждением дистиллированной водой, при этом сошлифовывают еще 0,5 мм препарата. После шлифования и контроля толщины препарат очищают в ультразвуковой ванне 1 минуту, затем полируют на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием фланелевого полировального круга с алмазной пастой W3.53000grit2 минуты, охлаждают дистиллированной водой, затем проводят окончательное полирование на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием полировального круга из плюша с алмазной суспензией Akasel 1 микрон 1 минуту. После полирования препарат очищают в ультразвуковой ванне 2 минуты. Высушивают препарат с использованием целлюлозной салфетки до исчезновения видимых следов влаги. Протравливают поверхность препарата 37% ортофосфорной кислотой H₃PO₄ 15 секунд. Далее промывают под струей дистиллированной воды 15 секунд. Высушивают препарат с использованием целлюлозной салфетки до исчезновения видимых следов влаги и укладывают на предметный стол АСМ для исследования. Применение описанного способа подготовки цемента зуба позволяет изготовить качественный препарат различных участков цемента на продольном шлифе для исследования в АСМ. Применение алмазной пасты W3.53000grit и алмазной суспензии Akasel 1 микрон позволяет сократить время полирования препарата, улучшить качество и характер поверхности, минимизируя вероятность загрязнения красящими компонентами.

Возникающий в процессе подготовки рельеф пригоден для эффективного зондирования поверхности цемента в необходимом нанодиапазоне. Полученные данным способом препараты позволяют исследовать структуру различных участков клеточного и бесклеточного цемента, расположение и упаковку коллагеновых структур по всей полированной поверхности. Данный способ помогает изготавливать более 10 препаратов за один лабораторный день одним препаратором, что делает возможным контролируемое исследование морфологии цемента на значительных выборках.

Пример 1. Пациентка Т., 24 года.

Жалобы: обратилась с целью подготовки к ортодонтическому лечению.

План лечения: 1. Санация рта. 2. Удаление зуба 38. 3. Подготовка и морфологическое исследование препарата зуба 38 в атомно-силовом микроскопе.

Пациентке проведено удаление зуба 38, который после поместили в 40% раствор формалина. Зуб фиксировали в столярной струбцине таким образом, чтобы линия распила проходила строго через все участки цемента от пришеечного до апикального, с помощью алмазного диска диаметром 20 мм с охлаждением дистиллированной водой произвели вертикальную сепарацию зуба, тем самым получили продольный срез. Изготовили патрон, с помощью ножниц для резки труб ПВХ отрезали от полипропиленовой трубы с внутренним диаметром 30 мм, толщиной стенок 5 мм, заготовку высотой 10 мм с внутренним диаметром 30 мм, толщиной стенок 5 мм, алмазным надфилем сошлифовали неровности, провели контроль толщины и параллельности заготовки с помощью штангенциркуля. Патрон разместили на ровной горизонтальной поверхности, в него поместили фрагмент зуба срезом вниз, залили двухкомпонентной эпоксидной смолой на 24 часа.

Провели поэтапное и последовательное шлифование препарата на станке «МР-1BGrinderPolisher» шлифовальными кругами «Dexter» зернистостью 1000, 1500, 2000, 2500 grit с охлаждением дистиллированной водой и точным контролем снимаемого слоя поверхности препарата с помощью штангенциркуля, при этом шлифовальным кругом «Dexter» зернистостью 1000 grit, сошлифовали 0,5 мм препарата, обработали шлифовальными кругами «Dexter» зернистостью 1500, 2000, 2500 grit, сошлифовали еще 0,5 мм препарата, произвели очистку препарата в ультразвуковой ванне 1 минуту, провели полирование на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием фланелевого полировального круга с алмазной пастой W3.53000grit 2 минуты, охладили и промыли дистиллированной водой, провели окончательное полирование на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием полировального круга из плюша с алмазной суспензией Akasel 1 микрон 1 минуту, очистили в ультразвуковой ванне2 минуты, высушили препарат с использованием целлюлозной салфетки до исчезновения видимых следов влаги, протравливали поверхность препарата 37% ортофосфорной кислотой H₃PO₄ 15 секунд, промыли под струей дистиллированной воды 15 секунд, высушили препарат с использованием целлюлозной салфетки до исчезновения видимых следов влаги.

Полученный препарат зуба 38 поместили в поле зрения атомно-силового микроскопа NTEGRA, получили ряд изображений, описали морфологическую структуру цемента зуба 38. Полученное описание позволило подтвердить наличие дисплазии соединительной ткани тяжелой степени.

Следовательно, предложенный способ подготовки препаратов зубов для морфологических исследований цемента в атомно-силовом микроскопе позволяет подготовить высококачественные препараты для исследования с максимальным сохранением рельефа за более кроткие сроки.

Пример 2. Пациентка С, 19 лет.

Жалобы: обратилась с целью санации рта, профилактического осмотра.

План лечения: 1. Санация рта. 2. Удаление зуба 48. 3. Подготовка и морфологическое исследование препарата зуба 48 в атомно-силовом микроскопе.

Пациентке проведено удаление зуба 48, который после поместили в 40% раствор формалина. Зуб фиксировали в столярной струбцине таким образом, чтобы линия распила проходила строго через все участки цемента от пришеечного до апикального, с помощью алмазного диска диаметром 20 мм с охлаждением дистиллированной водой произвели вертикальную сепарацию зуба, тем самым получили продольный срез.

Изготовили патрон, с помощью ножниц для резки труб ПВХ отрезали от полипропиленовой трубы с внутренним диаметром 30 мм, толщиной стенок 5 мм, заготовку высотой 10 мм с внутренним диаметром 30 мм, толщиной стенок 5 мм, алмазным надфилем сошлифовали неровности, провели контроль толщины и параллельности заготовки с помощью штангенциркуля. Патрон разместили на ровной горизонтальной поверхности, в него поместили фрагмент зуба срезом вниз, залили двухкомпонентной эпоксидной смолой на 24 часа.

Провели поэтапное и последовательное шлифование препарата на станке «МР-1BGrinderPolisher» шлифовальными кругами «Dexter» зернистостью 1000, 1500, 2000, 2500 grit с охлаждением дистиллированной водой и точным контролем снимаемого слоя поверхности препарата с помощью штангенциркуля, при этом шлифовальным кругом «Dexter» зернистостью 1000 grit, сошлифовали 0,5 мм препарата, обработали шлифовальными кругами «Dexter» зернистостью 1500, 2000, 2500 grit, сошлифовали еще 0,5 мм препарата, произвели очистку препарата в ультразвуковой ванне 1 минуту, провели полирование на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием фланелевого полировального круга с алмазной пастой W3.53000 grit 2 минуты, охладили и промыли дистиллированной водой, провели окончательное полирование на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием полировального круга из плюша с алмазной суспензией Akasel 1 микрон 1 минуту, очистили в ультразвуковой ванне2 минуты, высушили препарат с использованием целлюлозной салфетки до исчезновения видимых следов влаги, протравливали поверхность препарата 37% ортофосфорной кислотой H₃PO₄ 15 секунд, промыли под струей дистиллированной воды 15 секунд, высушили препарат с использованием целлюлозной салфетки до исчезновения видимых следов влаги.

Полученный препарат зуба 48 поместили в поле зрения атомно-силового микроскопа NTEGRA, получили ряд изображений, описали морфологическую структуру цемента зуба 48. Полученное описание позволило подтвердить наличие дисплазии соединительной ткани средней степени.

Следовательно, предложенный способ подготовки препаратов зубов для морфологических исследований цемента в атомно-силовом микроскопе позволяет подготовить высококачественные препараты для исследования с максимальным сохранением рельефа за более кроткие сроки.

Изобретение относится к медицине, в частности стоматологии, и может применяться для исследования морфологической структуры цемента зуба. Способ изготовления препаратов зубов для морфологических исследований структуры цемента в атомно-силовом микроскопе осуществляют следующим образом. После экстракции зуб фиксируют с возможностью проведения распила через все участки цемента от пришеечного до апикального. Далее с помощью алмазного диска диаметром 20 мм проводят распил с охлаждением дистиллированной водой и осуществляют вертикальную сепарацию зуба. Полученный фрагмент зуба помещают в патрон, размещенный на горизонтальной поверхности, срезом вниз и заливают двухкомпонентной эпоксидной смолой на 24 ч. Затем полученный препарат шлифуют на станке «МР-1BGrinderPolisher» с охлаждением дистиллированной водой шлифовальными кругами «Dexter» с зернистостью 1000 grit в течение 2 мин, при этом сошлифовывают 0,5 мм препарата, и с зернистостью 1500, 2000, 2500 grit в течение 1 мин каждым, при этом сошлифовывают еще 0,5 мм препарата, контроль снимаемого слоя поверхности препарата осуществляют с помощью штангенциркуля. Далее препарат очищают в ультразвуковой ванне 1 мин, затем полируют на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием фланелевого полировального круга с алмазной пастой W3.53000 grit 2 мин с охлаждением дистиллированной водой. После этого проводят полирование на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием полировального круга из плюша с алмазной суспензией Akasel 1 мкм в течение 1 мин. Затем препарат очищают в ультразвуковой ванне 2 мин, высушивают с использованием целлюлозной салфетки до исчезновения видимых следов влаги, протравливают поверхность 37% ортофосфорной кислотой 15 с, промывают под струей дистиллированной воды 15 с и окончательно высушивают поверхность с использованием целлюлозной салфетки. Достигается возможность морфологического исследования структуры цемента в различных участках зуба на атомно-силовом микроскопе под точным и объективным контролем сошлифовывания необходимой толщины твердых тканей, позволяющего исследовать клеточный и бесклеточный цемент по всей поверхности корневой части зуба. 2 пр.

Способ изготовления препаратов зубов для морфологических исследований структуры цемента в атомно-силовом микроскопе осуществляют следующим образом, после экстракции зуб фиксируют с возможность проведения распила через все участки цемента от пришеечного до апикального, далее с помощью алмазного диска диаметром 20 мм проводят распил с охлаждением дистиллированной водой и осуществляют вертикальную сепарацию зуба, полученный фрагмент зуба помещают в патрон, размещенный на горизонтальной поверхности, срезом вниз и заливают двухкомпонентной эпоксидной смолой на 24 ч, полученный препарат шлифуют на станке «МР-1BGrinderPolisher», с охлаждением дистиллированной водой, шлифовальными кругами «Dexter» с зернистостью 1000 grit в течение 2 мин, при этом сошлифовывают 0,5 мм препарата, с зернистостью 1500, 2000, 2500 grit в течение 1 мин каждым, при этом сошлифовывают еще 0,5 мм препарата, контроль снимаемого слоя поверхности препарата осуществляют с помощью штангенциркуля, далее препарат очищают в ультразвуковой ванне 1 мин, затем полируют на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием фланелевого полировального круга с алмазной пастой W3.53000 grit 2 мин, с охлаждением дистиллированной водой, после этого проводят полирование на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием полировального круга из плюша с алмазной суспензией Akasel 1 мкм, в течение 1 мин, затем препарат очищают в ультразвуковой ванне 2 мин, затем высушивают с использованием целлюлозной салфетки до исчезновения видимых следов влаги, протравливают поверхность 37% ортофосфорной кислотой 15 с и промывают под струей дистиллированной воды 15 с, окончательно высушивают поверхность с использованием целлюлозной салфетки.