Способ иммунологического прогнозирования внезапной коронарной смерти Российский патент 2023 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии и кардиологии, может быть использовано для предикции внезапной коронарной смерти.

По данным Всемирной организации здравоохранения (https://www.who.jnt/ru/health-topics/hypertension/cardiovascular-diseases#tab=tab_1), в мире каждый год от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) умирает 17,9 миллионов человек, более четырех из пяти смертей от ССЗ происходит в результате инфаркта и инсульта, треть из этих случаев отмечается среди людей в возрасте до 70 лет.

По данным Росстата (https://rosinfostat.ru/smertnost/), болезни системы кровообращения являются одними из основных причин смертности людей как в возрасте от 20 до 40 лет, так и старше 40 лет. Отмечено, что в 2018 году в России ишемическая болезнь сердца (ИБС) привела к 28,4% всех смертей, цереброваскулярные болезни (в том числе инсульт) - к 14,4%.

По статистике регионов России (Самородская И.В., Старинская М.А., Бойцов С.А. Динамика региональных показателей смертности от сердечнососудистых заболеваний и когнитивные нарушения в России 2019-2021 годах. - Российский кардиологический журнал. - 2023. - №28 (4). - С. 94-101), наибольшая доля смертей приходится на хронические заболевания, преимущественно связанные с атеросклерозом: атеросклеротическая болезнь сердца, атеросклеротическая сердечно-сосудистая болезнь, хроническая ИБС.

Отмечается, что разные подходы к определению первоначальной причины смерти (ППС) приводят к тому, что инфаркт миокарда зарегистрирован в качестве ППС в России в 12%, в Норвегии - в 63% смертей из группы ИБС (Timonin S., Shkolnikov V., Andreev Е., Magnus P. Evidence of large systematic differences between countries in assigning ischaemic heart disease deaths to myocardial infarction: the contrasting examples of Russia and Norway. - International Journal of Epidemiology. - 2022. - Vol. 50 (6). - P. 2082-2090).

К факторам, влияющим на исходы инфаркта миокарда, в 54% случаев относят нарушения ритма и проводимости сердца (Кириллов В.В. Догоспитальная летальность пациентов с ишемической болезнью сердца при острых коронарных синдромах. - Доктор.Ру. - 2016. - №2 (119). - С. 27-33).

Для оценки риска развития сердечно-сосудистых катастроф применяются шкалы оценки SCORE (Systematic Coronary Risk Evaluation), SCORE2 и SCORE2-OP по полу, возрасту, указанию в анамнезе на курение, значениям систолического артериального давления, холестерина (https://cardiograf.com/kalkulyator/score.html).

Также для прогнозирования развития сердечно-сосудистых катастроф (первый случай инфаркта миокарда, инсульт, смерть от ССЗ) рекомендациями Американской коллегии кардиологов и Американской ассоциации сердца 2013 года предложена оценка комбинации признаков: угол, возраст, анамнестические данные (курение, наличие сахарного диабета, прием антигипертензивных препаратов), значения систолического артериального давления, холестерина, холестерина-липопротеидов высокой плотности (https://www.lvrach.ru/medcalc/heart-risk).

Однако указанные шкалы не учитывают значения лабораторных маркеров сердечной недостаточности и эндотелиальной дисфункции.

Известен способ прогнозирования внезапной сердечной смерти по данным суточного мониторирования электрокардиограммы (ЭКГ) (RU 2485884, МПК А61В 5/024, опубл. 27.06.2013).

Однако предложенный способ имеет узкую направленность исследования (инфаркт миокарда) и не учитывает медиаторный компонент патогенеза вазокардиальных поражений.

Известен способ прогнозирования развития жизнеугрожающих желудочковых нарушений ритма сердца и внезапной сердечной смерти по определению плазменной концентрации галектина-3 (RU 2758120, МПК G01N 33/48, опубл. 26.10.2021).

Но применение указанного способа актуально у больных после имплантации кардиовертера-дефибриллятора, т.е. имеет ограничения.

Ранее выявлены прямые взаимосвязи желудочковых аритмий у больных артериальной гипертензией с концентрациями провоспалительных интерлейкина (ИЛ)-6, фактора некроза опухоли (ФИО), С-реактивного белка (СРБ) (Василец Л.М., Туев А.В., Аршин Е.В., и др. Желудочковые нарушения ритма при артериальной гипертензии: роль биомаркеров воспаления в развитии аритмий. - Вестник Российской академии медицинских наук. -2012. - Т. 67. - №10. - С. 12-17).

Недостатком представленной модели является узкая направленность исследования и неучитывание маркеров миокардиальной и эндотелиальной дисфункции.

Считается, что при гибели кардиомиоцитов и разрушении тропомиозиновых комплексов тропонины поступают в периферический кровоток. Повышенные уровни тропонинов ассоциированы с поражением коронарных артерий, со степенью тяжести миокардиальной ишемии и свидетельствуют о неблагоприятном прогнозе (Белинова А.В., Полупанов А.Г., Сабиров И.С. Роль высокочувствительного тропонина-I в развитии и прогрессировании сердечно-сосудистых заболеваний. - Вестник КРСУ. 2021. Том 21. №5. - С. 12-18).

Ранее установлено, что при инфаркте миокарда концентрации тропонина-I превышают 0,1 нг/мл. Но ценность маркера для прогнозирования внезапной коронарной смерти не исследовалась, в отличие от предлагаемого способа.

Известен способ прогнозирования неблагоприятного исхода у больных острым коронарным синдромом с сопутствующим сахарным диабетом 2 типа, когда исследуют уровни СРБ, ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНОα, маркера дестабилизации атеросклеротической бляшки - растворимую форму CD40 лиганда (sCD40L) и маркеров эндотелиальной дисфункции -патрийуретического пропептида С-типа (CNP) и ангиотензина-II в сыворотке крови, строят многофакторную модель прогноза на основании логистической регрессии и рассчитывают коэффициент прогнозирования риска развития неблагоприятного исхода (RU 2573499, МПК G01N 33/53, опубл. 2016.01.20).

Но данное изобретение требует исследования девяти параметров, что приводит к высоким финансовым затратам при проведении анализа и не может быть широко использовано для иммуной предикции.

Известно, что увеличение количества N-терминального фрагмента предшественника мозгового натрийуретического пептида (NTproBNP) ассоциировано с прогрессированием сердечной недостаточности и риском летального исхода (ШАХНОВИЧ P.M. Маркеры воспаления, NT-proBNP и инфекционный фактор у больных с острым коронарным синдромом и значение из определения для прогноза исходов заболевания. Автореф. дисс. д.м.н. Москва, 2010). У здоровых лиц дискриминационный уровень не должен превышать 200 пг/мл.

Однако сведений о прогностической ценности NT-proBNP при внезапной коронарной смерти не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа.

Исследование концентрации васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) для прогнозирования внезапной коронарной смерти ранее не проводилось, хотя имеет патофизиологическое обоснование.

Анализируя источники информации, авторами не найдено прототипа способа иммунологического прогнозирования внезапной коронарной смерти.

Техническим результатом изобретения является малоинвазивный, не требующий больших материальных затрат, способ иммунологического прогнозирования внезапной коронарной смерти.

Сущность изобретения заключается в том, что способ включает исследование электрокардиографических показателей и иммунологических параметров крови. Для этого проводят ЭКГ и определяют в сыворотке крови количественные уровни VEGF, NTproBNP, тропонина I. При комбинации электрокардиографических признаков нарушений ритма и проводимости сердца и значений VEGF больше 450 пг/мл, NTproBNP больше 310 пг/мл, тропонина I больше 0,13 нг/мл прогнозируют развитие внезапной коронарной смерти.

Преимущества предлагаемого способа: улучшение прогнозирования и предупреждение внезапной сердечной смерти; повышение специфичности и чувствительности применяемых параметров.

На фиг. 1 показана зависимость изменений VEGF и NTproBNP у кардиологических больных, у которых в последствии развилась внезапная коронарная смерть; на фиг. 2 изображена зависимость изменений VEGF и тропонина I; на фиг. 3 показана зависимость изменений NTproBNP и тропонина I; на фиг. 4 изображены ROC кривые зависимости развития внезапной коронарной смерти от количеств VEGF, NTproBNP, тропонина I; в таблице 1 отражено количество VEGF, NTproBNP, тропонина I в сыворотке крови здоровых лиц и больных с нарушениями ритма и проводимости сердца; в таблице 2 представлены количественные изменения VEGF, NTproBNP, тропонина I в сыворотке крови больных в зависимости от формы нарушения ритма и проводимости сердца; таблица 3 демонстрирует диагностическую ценность VEGF, NTproBNP, тропонина I при нарушениях ритма и проводимости сердца с летальным исходом.

Способ осуществляют следующим образом: проводят ЭКГ; забор крови для исследования проводят в утренние часы натощак из локтевой вены в объеме 5 мл в сухую стерильную пробирку, отделяют сыворотку с помощью центрифугирования при скорости 1500 оборотов в минуту в течение 10-15 минут. Определение количественного уровня сывороточных VEGF, NTproBNP, тропонина I проводят с помощью иммуноферментного анализа.

В работе использовали наборы ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), следуя инструкциям.

Для определения количественного уровня VEGF во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора для разведения образцов, затем последовательно вносят по 100 мкл калибровочных образцов, контрольного образца, исследуемых образцов сыворотки крови. Заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 18-25°С в течение 120 мин при интенсивности встряхивания 700 об/мин. После 1-й инкубации лунки планшета тщательно промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл конъюгата №1, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 18-25°С в течение 60 мин при интенсивности встряхивания 700 об/мин. После 2-й инкубации лунки планшета промывают 5 раз, внося по 350 мкл промывочного раствора, затем вносят по 100 мкл конъюгата №2, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 18-25°С в течение 30 мин при интенсивности встряхивания 700 об/мин. После 3-й инкубации содержимое лунок планшета удаляют и промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл раствора тетраметилбензидина плюс и инкубируют в темноте при температуре 18-25°С в течение 25 мин. Для остановки реакции во все лунки вносят по 100 мкл стоп-реагента, содержимое лунок окрашивается в желтый цвет. Через 2-3 мин после остановки реакции измеряют оптическую плотность в лунках с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм.

Для исследования количества NTproBNP или тропонина I во все лунки планшета последовательно вносят по 100 мкл калибровочных образцов, контрольного образца, исследуемых образцов сыворотки крови. Затем вносят по 50 мкл рабочего раствора конъюгата. Заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 37°С в течение 60 мин при интенсивности встряхивания 650 об/мин. После инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем в лунки вносят по 100 мкл раствора тетраметилбензидина и инкубируют в термостатируемом шейкере в темноте при температуре 37°С в течение 15 мин при интенсивности встряхивания 650 об/мин. Для остановки реакции во все лунки вносят по 100 мкл стоп-реагента, содержимое лунок окрашивается в желтый цвет. Через 2-3 мин после остановки реакции измеряют оптическую плотность в лунках с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм.

Сывороточную концентрацию исследуемых параметров определяют при построении соответствующих калибровочных графиков на прилагаемых трафаретах. Достоверность результатов анализа оценивают по количествам показателей в контрольных образцах.

Способ апробирован на 120 больных кардиологического профиля и 30 здоровых добровольцах (контрольная группа). Нарушения ритма и проводимости сердца у больных сочетались с артериальной гипертензией и/или ишемической болезнью сердца. Учитывая коморбидность больных, разделение на группы осуществляли в зависимости от формы нарушения сердечного ритма и проводимости. В 1 группу вошли 30 пациентов с фибрилляцией предсердий (пароксизмальная форма), во 2 группу - 30 пациентов с фибрилляцией предсердий (персистирующая форма), в 3 группу - 30 пациентов с наджелудочковой и желудочковой тахиаритмиями, в 4 группу - 30 пациентов с нарушениями проводимости. Статистически значимых возрастных и тендерных различий среди больных и здоровых лиц не наблюдалось.

Диагноз определяли на основании клинических данных, результатов ЭКГ, суточного мониторирования ЭКГ.

Кровь для исследования брали при получении информированного согласия обследуемых лиц. В качестве сравнения использовали серологические показатели, полученные в контрольной группе у здоровых добровольцев (n=30), средний возраст которых составил 32,14±1,84 года, из них 16 (53,3%) мужчин и 14 (46,7%) женщин.

Определение сывороточных концентраций VEGF, NTproBNP, тропонина I у здоровых добровольцев позволило установить интервал нормы (таблица 1).

Анализ изменений сывороточных уровней VEGF, NTproBNP, тропонина I у обследованных больных выявил увеличение их содержания, зависящее от формы нарушения ритма и проводимости сердца, превышение дискриминационного уровня маркеров наблюдалось в 68,33%, 46,67%) и 44,17% случаев соответственно (таблицы 1, 2).

В течение 2-х лет у обследованных больных проводился анализ клинических исходов сердечно-сосудистых заболеваний.

Развитие внезапной коронарной смерти было отмечено у 6 (20%) больных в 1 группе, 5 (16,67%) во 2 группе, 7 (23,33%) в 3 группе, 1 (3,33%) в 4 группе. У данных больных наблюдались сходные предшествующие количественные изменения иммунных параметров: диапазон сывороточных уровней VEGF составлял 490-1400 пг/мл, NTproBNP – 315-440 пг/мл, тропонина I - 0,15-0,3 нг/мл.

Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют прогнозировать развитие внезапной коронарной смерти по результатам ЭКГ и сывороточным уровням VEGF, NTproBNP, тропонина I.

Пример 1. Больная Д., 73 лет, поступила на стационарное лечение в кардиологическое отделение для лечения больных с нарушением сердечного ритма и проводимости №16 Республиканской клинической больницы №4 04.08.2022 г. с жалобами на давящие боли в области сердца с иррадиацией в левую руку, одышку при ходьбе в обычном темпе, учащенное сердцебиение, набухание шейных вен, слабость и потливость, головные боли, головокружение. После обследования выставлен диагноз: ИБС. Стенокардия напряжения, II ФК. Нарушение ритма по типу пароксизмальной формы фибрилляции предсердий. Гипертоническая болезнь, 3 ст.

ЭКГ от 04.08.2022 г.: Брадисистолическая форма фибрилляции предсердий со средней ЧСС=53 уд/мин. ЭОС горизонтальная. Преобладание биопотенциалов левого желудочка, изменения в миокарде в виде регистрации -/+зубца Т в I, aVL, слабо отрицательный зубец Т в V4-V6 -изменения по типу хронической коронарной недостаточности переднебоковой области.

ЭХО-КС от 05.08.2022 г.: Уплотнение стенок аорты, створок аортального и митрального клапанов, аортальная регургитация 2 ст., митральная регургитация 1 ст.Выраженная гипертрофия миокарда левого желудочка. Дилатация полости левого и правого предсердий. Дилатация легочной артерии. Гипокинез нижних сегментов левого желудочка на базальном и среднем уровнях. Глобальная сократительная функция миокарда левого желудочка умеренно снижена (ФВ=43%). Признаки умеренного гидроперикарда.

Иммунологическое исследование от 05.08.2022 г.: количество VEGF - 730 Ед/мл, NTproBNP - 360 пг/мл, тропонина I-0,15 пг/мл.

Развитие внезапной коронарной смерти произошло на 3-й день госпитализации.

Пример 2. Больная И., 62 лет, поступила на стационарное лечение в кардиологическое отделение с электрокардиостимуляцией №10 Республиканской клинической больницы №4 27.07.2022 г. с жалобами на одышку при незначительной физической нагрузке, перебои в работе сердца, повышение давления до высоких цифр на фоне регулярного приема препаратов, головные боли, головокружение, шум в ушах. После проведенного обследования выставлен диагноз: ИБС. Стенокардия напряжения, III ФК. Нарушение ритма по типу постоянной формы фибрилляции предсердий, тахисистолия. Гипертоническая болезнь, 3 ст.

ЭКГ от 27.07.2022 г.: Тахисистолическая форма фибрилляции предсердий со средней ЧСС 120 уд/мин. ЭОС горизонтальная. Признаки гипертрофии миокарда левого желудочка. Изменения в миокарде в виде косонисходящей депрессии сегмента ST (до 2 мм) с переходом в -/+зубец Т в II, III, aVF, V5, V6 - вероятно по типу хронической коронарной недостаточности нижнебоковой области.

ЭХО-КС от 27.07.2022 г.: исследование проводилось на фоне фибрилляции предсердия. Аорта не расширена. Уплотнение стенок аорты, кальциноз створок аортального и митрального клапанов. Начальные признаки дилатации левого желудочка. Митральная регургитация 2 ст., трикуспидальная регургитация - 1-2 ст.Тенденция к легочной гипертензии. Диастолическая функция миокарда левого желудочка не определяется на фоне нарушения ритма. Невыраженная гипертрофия миокарда левого желудочка. Гипокинез нижних сегментов левого желудочка на базальном и среднем уровнях. Фракция выброса левого желудочка умеренно снижена - 45%.

Иммунологическое исследование от 28.07.2022 г.: количество VEGF -1110 Ед/мл, NTproBNP - 355 пг/мл, тропонина I - 0,2 пг/мл.

Развитие внезапной коронарной смерти произошло на 4-й день госпитализации.

Пример 3. Больной Д., 68 лет, поступил на стационарное лечение в кардиологическое отделение для лечения больных с нарушением сердечного ритма и проводимости №16 Республиканской клинической больницы №4 06.12.2021 г. с жалобами на давящие боли в области сердца с иррадиацией в левую руку, одышку при ходьбе в обычном темпе, учащенное сердцебиение, головные боли, головокружение. После обследования выставлен диагноз: ИБС. Стенокардия напряжения, II ФК. Нарушение ритма по типу пароксизмальной формы наджелудочковой и желудочковой тахикардии. Гипертоническая болезнь, 3 ст.

ЭКГ от 06.12.2021 г.: Ускоренный синусовый ритм с ЧСС=94 уд/мин. ЭОС горизонтальная. Частые (n=5) одиночные мономорфные желудочковые экстрасистолы, одиночная наджелудочковая экстрасистола.

ЭХО-КС от 07.12.2021 г.: Уплотнение стенок аорты, кальциноз основания створок аортального и митрального клапанов, митральная регургитация 1 ст., трикуспидальная регургитация 1 ст. Дилатация полости правого предсердия. Незначительная гипертрофия миокарда левого желудочка, его диастолическая дисфункция по I типу. Признаки начальной легочной гипертензии. Глобальная сократительная функция миокарда левого желудочка незначительно снижена (ФВ - 54%).

Иммунологическое исследование от 07.12.2021 г.: количество VEGF - 295 Ед/мл, NTproBNP - 186 пг/мл, тропонина I - 0,05 пг/мл.

После проведенного лечения пациент выписан с улучшением состояния, в течение периода диспансерного наблюдения значимых ухудшений не отмечено.

Пример 4. Больной М., 35 лет, поступил на стационарное лечение в кардиологическое отделение для лечения больных с нарушением сердечного ритма и проводимости №16 Республиканской клинической больницы №4 20.12.2021 г. с жалобами на колющие боли в области сердца без иррадиации, сердцебиение, сильные головные боли, головокружение, потливость. После обследования выставлен диагноз: Гипертоническая болезнь, 2 ст. Нарушение проводимости по типу АВ блокады 1 степени. Неполная блокада левой ножки пучка Гиса.

ЭКГ от 20.12.2021 г.: Синусовый ритм с ЧСС 73 уд/мин. ЭОС отклонена влево. АВ блокада 1 степени. Неполная блокада левой ножки пучка Гиса. Признаки гипертрофии левого желудочка.

ЭХО-КС от 21.12.2021 г.: Уплотнение стенок аорты, створок аортального клапана с аортальной регургитацией I-II ст. Уплотнение створок митрального клапана с митральной регургитацией I ст., трикуспидальная регургитация 1 ст. Незначительная гипертрофия миокарда левого желудочка, его диастолическая дисфункция по I типу. Нарушений локальной сократимости левого желудочка не выявлено. Глобальная сократительная функция миокарда левого желудочка сохранена (ФВ - 65%).

Иммунологическое исследование от 21.12.2021 г.: количество VEGF -160 Ед/мл, NTproBNP - 140 пг/мл, тропонина I - 0,08 пг/мл.

После проведенного лечения пациент выписан с улучшением состояния, в течение периода диспансерного наблюдения значимых ухудшений не наблюдалось.

При корреляционном анализе результатов определены статистически значимые сильные и умеренные положительные взаимосвязи развития внезапной коронарной смерти с иммунными параметрами: коэффициент корреляции Пирсона составил для VEGF 0,7939, NTproBNP 0,5969, тропонина I 0,7294. Между исследуемыми маркерами у кардиологических больных, у которых впоследствии развилась внезапная коронарная смерть, также были выявлены сильные положительные взаимосвязи: между VEGF и NTproBNP (коэффициент корреляции Пирсона 0,8045; фиг. 1), между VEGF и тропонином I (0,7389; фиг. 2), между NTproBNP и тропонином I (0,6723; фиг. 3).

Регрессионный анализ полученных результатов установил чувствительность, специфичность показателей (табл. 3), способствовал построению receiver operating characteristic (ROC) кривых (фиг. 4) с определением индекса согласованности модели по площади (area) под (under) ROC кривыми (AUC).

Способ предусматривает сочетанное определение электрокардиографических показателей и сывороточной концентрации васкулоэндотелиального фактора роста, N-терминального фрагмента предшественника мозгового натрийуретического пептида, тропонина I. При комбинации электрокардиографических признаков нарушений ритма и проводимости сердца и значений VEGF больше 450 пг/мл, NTproBNP больше 310 пг/мл, тропонина I больше 0,13 нг/мл прогнозируют развитие внезапной коронарной смерти. Данный способ может быть использован для иммунодиагностики, прогнозирования течения и развития осложнений сердечно-сосудистых заболеваний, а также при проведении профилактических осмотров работников различных учреждений, подверженные действию факторов риска. Применение предлагаемого способа позволит своевременно назначить или скорректировать персонализированную терапию больным, способствуя увеличению длительности и улучшению качества жизни.

Изобретение создано за счет средств Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (соглашение №17065ГУ/2021 от 01.11.2021 г.).

Изобретение относится к медицине, а именно, к клинической иммунологии и кардиологии, может быть использовано для предикции внезапной коронарной смерти. Способ включает исследование электрокардиографических показателей и иммунологических параметров сыворотки крови: васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF), натрийуретического (NTproBNP), тропонина I. При комбинации электрокардиографических признаков нарушений ритма и проводимости сердца и значений VEGF больших 450 пг/мл, NTproBNP больших 310 пг/мл, тропонина I больших 0,13 нг/мл прогнозируют развитие внезапной коронарной смерти. Способ, являясь малоинвазивным, не требующим больших материальных затрат, позволяет прогнозировать и предупреждать риск внезапной коронарной смерти, с повышенной специфичностью и чувствительностью применяемых параметров. 4 ил., 3 табл., 4 пр.

Способ иммунологического прогнозирования внезапной коронарной смерти, включающий исследование электрокардиографических показателей и иммунологических параметров крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют содержание васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF), N-терминального фрагмента предшественника мозгового натрийуретического пептида (NTproBNP), тропонина I, и при комбинации электрокардиографических признаков нарушений ритма и проводимости сердца и значений VEGF больше 450 пг/мл, NTproBNP больше 310 пг/мл, тропонина I больше 0,13 нг/мл прогнозируют развитие внезапной коронарной смерти.