Способ получения конъюгированных гидрогелей на основе поли-N-изопропилакриламида, растворимой фракции гликопротеинов и гликозаминогликанов эндометриального внеклеточного матрикса и тромбоцитарного лизата Российский патент 2023 года по МПК A61L27/36 A61L27/44 A61L27/50 A61L27/52 

Изобретение относится к области трансляционной медицины, а именно к способу получения жидкого термочувствительного, то есть с регулируемой температурой фазового перехода (она же нижняя критическая температура раствора, НКТР) биоинженерного эндометрия, при согревании застудневающего с хорошей адгезией к теплой поверхности. Нами предложен способ синтеза конъюгированного гидрогеля на основе поли -N-изопропилакриламида, растворимой фракции гликопротеинов и гликозаминогликанов эндометриального внеклеточного матрикса (эВКМ) и тромбоцитарного лизата (ТЛ), отличающийся тем, что его проводят в две стадии:

Синтез поли- N- изопропилакриламида (ПНИПААм), включающий радикальную полимеризацию N-изопропилакриламида в деионизованной воде (ДВ) с сопротивлением 18 мегаОм, при использовании в качестве инициатора персульфата калия (ПСК) и мета-бисульфита натрия в качестве инициатора окисления-восстановления и со-инициатора соответственно, для чего N-изопропилакриламид (НИПААм) растворяют в ДВ в концентрации 5 масс. %, помещают в реактор и дегазируют в ультразвуковой ванне 2-3 минуты, затем вносят в систему инициатор полимеризации ПСК и мета-бисульфит натрия в концентрации по 0,05 масс. % каждого, барботируют реакционную смесь в течение 5 минут в реакторе аргоном для удаления остатков кислорода и полимеризуют при 20°С в течение 8 часов при интенсивном перемешивании со скоростью 350-400 об/мин с помощью верхнеприводной мешалки

Получение конъюгированных гидрогелей на основе ПНИПААм, эндометриального внеклеточного матрикса и тромбоцитарного лизата, включающее внесение ПНИПААм в реакционную смесь до концентрации 2 масс. %, эВКМ 0.2 масс. % и ТЛ 0,1 масс. % в 0,05÷0,2% раствор глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере, барботирование реакционной смеси в реакторе аргоном для удаления остатков кислорода в течение 3-5 минут и интенсивное перемешивание при 37±1°С в течение 8 часов со скоростью 500-600 об/мин.

Техническая задача, решаемая в предлагаемом изобретении, заключается в создании термочувствительной системы, включающей агенты, имитирующие основные регуляторные свойства эВКМ для находящихся в контакте с ним клеточных элементов, помимо того обладая еще и дополнительно повышенной биологической активностью а счет факторов роста (ФР) ТЛ, активизирующих регенерацию, а сам гель должен представлять из себя золь с низкой вязкостью, при попадании в маточную полость под влиянием температуры тела за счет резкого увеличения динамической вязкости при превышении НКТР немедленно застудневающий в областях контакта с теплыми стенками с хорошей адгезией к теплой поверхности. Во избежание образования слишком толстого слоя застывшей ткани (более 1-1,5 мм) непосредственно после орошения лишнюю незастывшую жидкость необходимо немедленно удалить (вымыть холодным физиологическим раствором).

Спустя несколько дней новообразованная ткань самоорганизуется, васкуляризуется, и в течение нескольких недель ее ВКМ постепенно заменяется нативным.

Известны сополимеры, состоящие из биосовместимого гидрофильного полиэтиленгликоля (PEG) и биоразлагаемого полиэфирного гидрофобного компонента с различной макромолекулярной архитектурой: триблок-сополимер PEG-b-PLGA-b-PEG или графт-сополимеры вида PEG-g-PLGA и PLGA-g-PEG, где PLGA - DL-молочная кислота-согликолевая кислота. Графт-сополимеры имеют в воде разную структуру мицелл. В PEG-g-PLGA сердцевину образуют гидрофобные боковые ветви PLGA, а оболочку -скелетные гидрофильные цепи PEG. Поверхностно-активные свойства привитых сополимеров служат дополнительным фактором, увеличивающим растворимость гидрофобного терапевтического средства, (патент US. 6,841,617). В биомедицинских приложениях важно, чтобы компоненты носителя были биосовместимы, а биоразлагаемая компонента не индуцировала орошение соседних тканей продуктами разложения. Последние оказывают негативное денатурирующее воздействие на протеин/полипептидные лекарства, которые с развитием генной инженерии становятся обычным терапевтическим средством. Поэтому возникает необходимость в создании носителей лекарств с различным сроком стабильности. Свойства короткоживущих (меньше недели) носителей проявляют гели графт-сополимера PEG-g-PLGA, а долговременных (один-два месяца) - гели PLGA-g-PEG. Примечательно, что изменение соотношения между PEG и PLGA в сополимерах влияет на следующие важные свойства растворенного сополимера: скорость выделения лекарства из геля, термочувствительность к гелеобразованию, вязкость раствора при комнатной температуре и плотность геля выше физиологических температур. Например, вязкость 22% водного раствора графт-сополимера PEG-g-PLGA (47 мол. % PEG, Mw=11000) при 20°С составляет 22 мПа⋅с, и раствор легко набирается в шприц со стандартной иглой. НКТР, ассоциируемая с резким возрастанием динамической вязкости, для этой системы была оценена в 30°С и мало зависела от концентрации в пределах 20-25 мас. %. Реальная часть комплексной динамической вязкости 22% водного раствора в результате термотропного перехода увеличивается в 103 раз с 0,05 до 50 Па⋅с, а модуль упругости достигает 10-100 Па. Согласно фазовой диаграмме критическая концентрация гелеобразования (ККГ), выше которой в растворе появляется гель-фаза, составляет 16 мас. %. Ниже ККГ наблюдается течение, даже когда вязкость растет с увеличением температуры. При увеличении температуры сверх НКТР гель проявляет синерезис - макрофазовое разделение, когда некоторое количество воды выделяется из гель-фазы. Присутствие гель-фазы вблизи температуры тела делает эту систему подходящей для доставки лекарств путем инъекции, в месте которой образующийся гель удерживает биоактивные агенты, способные медленно выделяться. Компактный гель сохраняется одну неделю, (патент U.S. 7,087,244) Недостатком данных гелей является сложность их получения и связанная с этим дороговизна конечного продукта, что неприемлемо в странах с низкими доходами населения.

Известен СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО РАДИОФАРМПРЕПАРАТА (патент 2665140 RU), который представляет собой раствор интерполимерного носителя радионуклида, включающего следующие стадии:

1) синтез сополимера-носителя на основе N-изопропилакриламида и аллиламина;

2) этерификацию аминных групп сополимера-носителя диангидридом диэтилентриаминпентауксусной кислоты;

3) мечение радионуклидом 153Sm;

4) выделение радиоактивной сополимерной фракции из реакционного объема смеси меченой полимерной путем элюирования ацетатным буфером в хроматографической колонке;

5) смешивание выделенной фракции с сополимером-носителем водного раствора полимера-загустителя поли-N-изопропилакриламида, причем произведение характеристической вязкости [η]пз в дл/г и концентрации Спз поли-N-изопропилакриламида в воде в г/дл отвечает безразмерному соотношению 5<Спз*[η]пз<10.

Недостатком для нерадиоактивного применения термочувствительного геля является наличие радиоактивных материалов в его составе.

Кроме того, гель не обладает регенеративными свойствами.

Нами предложен способ синтеза конъюгированного гидрогеля на основе поли -N-изопропилакриламида, растворимой фракции гликопротеинов и гликозаминогликанов эндометриального внеклеточного матрикса (эВКМ) и тромбоцитарного лизата (ТЛ), отличающийся тем, что его проводят в две стадии:

Синтез поли- N- изопропилакриламида (ПНИПААм), включающий радикальную полимеризацию N-изопропилакриламида в деионизованной воде (ДВ) с сопротивлением 18 мегаОм, при использовании в качестве инициатора персульфата калия (ПСК) и мета-бисульфита натрия в качестве инициатора окисления-восстановления и со-инициатора соответственно, для чего N-изопропилакриламид (НИПААм) растворяют в ДВ в концентрации 5 масс. %, помещают в реактор и дегазируют в ультразвуковой ванне 2-3 минуты, затем вносят в систему инициатор полимеризации ПСК и мета-бисульфит натрия в концентрации по 0,05 масс. % каждого, барботируют реакционную смесь в течение 5 минут в реакторе аргоном для удаления остатков кислорода и полимеризуют при 20°С в течение 8 часов при интенсивном перемешивании со скоростью 350-400 об/мин с помощью верхнеприводной мешалки

Получение конъюгированных гидрогелей на основе ПНИПААм, эВКМ и ТЛ, включающее внесение ПНИПААм в реакционную смесь до концентрации 2 масс. %, Получение конъюгированных гидрогелей на основе ПНИПААм, эндометриального внеклеточного матрикса 0.2 масс. % и тромбоцитарного лизата 0,1 масс. % в 0,05÷0,2% раствор глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере, барботирование реакционной смеси в реакторе аргоном для удаления остатков кислорода в течение 3-5 минут и интенсивное перемешивание при 37±1°С в течение 8 часов со скоростью 500-600 об/мин.

Полученный гидрогель обладает высокой биосовместимостью, способствует регенерации за счет ФР ТЛ, имитирует основные регуляторные свойства эВКМ для находящихся в контакте с ним клеточных элементов, чем выгодно отличается от прототипа.

Существенное преимущество использования нашего биоинженерного эндометрия по сравнению с существующими методами заключается в отсутствии необходимости принимать дополнительные меры по обеспечению плотного контакта с подлежащими тканями, что затруднительно при применении прочих типов биоинженерных тканей и их аналогов. Как правило, для этого требуется механическая фиксация (швами или скобами хирургического степлера) по всей площади контакта, провоцирующая образование фиброзной ткани, а при недостаточности -карманов и экссудативных затеков.

Применение такого типа биоинженерной ткани отнюдь не ограничивается эндометрием, а потенциально пригодно для восстановления практически любого типа эпителия. Так, модификации предложенной методики можно использовать для лечения ожогов пищевода, кожи, и в качестве инновационного раневого покрытия

Настоящее изобретение относится к способу получения конъюгированного гидрогеля на основе поли-N-изопропилакриламида, растворимой фракции гликопротеинов и гликозаминогликанов эндометриального внеклеточного матрикса (эВКМ) и тромбоцитарного лизата (ТЛ), включающему, собственно, синтез поли-N-изопропилакриламида и его конъюгацию с биологически активными компонентами и отличающемуся тем, что его проводят в две стадии: - синтез поли-N-изопропилакриламида (ПНИПААм), включающий радикальную полимеризацию N-изопропилакриламида в деионизованной воде (ДВ) с сопротивлением 18 мегаОм, при использовании в качестве инициатора персульфата калия (ПСК) и мета-бисульфита натрия в качестве инициатора окисления-восстановления и со-инициатора соответственно, для чего N-изопропилакриламид (НИПААм) растворяют в ДВ в концентрации 5 масс. %, помещают в реактор и дегазируют в ультразвуковой ванне 2-3 минуты, затем вносят в систему инициатор полимеризации ПСК и метабисульфит натрия в концентрации по 0,05 масс. % каждого, барботируют реакционную смесь в течение 5 минут в реакторе аргоном для удаления остатков кислорода и полимеризуют при 20°С в течение 8 часов при интенсивном перемешивании со скоростью 350 - 400 об/мин с помощью верхнеприводной мешалки; - получение конъюгированных гидрогелей на основе ПНИПААм, эВКМ и ТЛ, включающее внесение ПНИПААм в 0,05÷0,2% раствор глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере до концентрации 2 масс. %, эВКМ 0,2 масс. % и ТЛ 0,1 масс. %, барботирование реакционной смеси в реакторе аргоном для удаления остатков кислорода в течение 3-5 минут и интенсивное перемешивание при 37±1°С в течение 8 часов со скоростью 500-600 об/мин. Настоящее изобретение обеспечивает создание термочувствительной системы, включающей агенты, имитирующие основные регуляторные свойства эВКМ для находящихся в контакте с ним клеточных элементов, помимо того обладая еще и дополнительно повышенной биологической активностью за счет факторов роста (ФР) ТЛ, активизирующих регенерацию, а сам гель должен представлять из себя золь с низкой вязкостью, при попадании в маточную полость под влиянием температуры тела за счет резкого увеличения динамической вязкости при превышении нижней критической температуры раствора (НКТР) немедленно застудневающий в областях контакта с теплыми стенками с хорошей адгезией к теплой поверхности.

Способ получения конъюгированного гидрогеля на основе поли -N-изопропилакриламида, растворимой фракции гликопротеинов и гликозаминогликанов эндометриального внеклеточного матрикса (эВКМ) и тромбоцитарного лизата (ТЛ), включающий, собственно, синтез поли-N-изопропилакриламида и его конъюгацию с биологически активными компонентами и отличающийся тем, что его проводят в две стадии:

синтез поли-N-изопропилакриламида (ПНИПААм), включающий радикальную полимеризацию N-изопропилакриламида в деионизованной воде (ДВ) с сопротивлением 18 мегаОм, при использовании в качестве инициатора персульфата калия (ПСК) и мета-бисульфита натрия в качестве инициатора окисления-восстановления и со-инициатора соответственно, для чего N-изопропилакриламид (НИПААм) растворяют в ДВ в концентрации 5 масс. %, помещают в реактор и дегазируют в ультразвуковой ванне 2-3 минуты, затем вносят в систему инициатор полимеризации ПСК и метабисульфит натрия в концентрации по 0,05 масс. % каждого, барботируют реакционную смесь в течение 5 минут в реакторе аргоном для удаления остатков кислорода и полимеризуют при 20°С в течение 8 часов при интенсивном перемешивании со скоростью 350 - 400 об/мин с помощью верхнеприводной мешалки;

получение конъюгированных гидрогелей на основе ПНИПААм, эВКМ и ТЛ, включающее внесение ПНИПААм в 0,05÷0,2% раствор глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере до концентрации 2 масс. %, эВКМ 0,2 масс. % и ТЛ 0,1 масс. %, барботирование реакционной смеси в реакторе аргоном для удаления остатков кислорода в течение 3-5 минут и интенсивное перемешивание при 37±1°С в течение 8 часов со скоростью 500-600 об/мин.