КОМПОЗИЦИЯ ПРЕДШЕСТВЕННИКА ГИДРОГЕЛЯ И СПОСОБ ЕЁ ПРИГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 2015 года по МПК C08G65/00 C08G79/00 C08G81/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции предшественника гидрогеля, способу ее приготовления, а также к готовому набору, содержащему указанную композицию, и способу получения гидрогеля с использованием указанной композиции.

Уровень техники

Общепризнанно, что трехмерные каркасы для клеточных линий обеспечивают паттерны экспрессии генов и других активностей клеток, имитирующие живые организмы в намного большей степени, чем обычные двухмерные клеточные культуры в чашках.

Это привело к разработке новых семейств синтетических полимерных гидрогелей, которые часто обозначаются термином искусственные ЕСМ (внеклеточные матриксы) (аЕСМ), поскольку они имитируют многие аспекты внеклеточного матрикса. Основной проблемой является создание химической технологии, которая сделает возможной сшивку матрикса в присутствии клеток или биомолекул, а также стабильное связывание биомолекул с самим матриксом.

В последние годы были разработаны различные механизмы, обеспечивающие образование гелей в присутствии клеток или биомолекул. Например, были предложены механизмы, основанные на самосборке низкомолекулярных строительных блоков, таких как пептиды (Estroff et al.: Water gelation by small organic molecules; Chem. Rev. 2004; 104(3); 1201-18), (Zhang S.: Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly; Nat. Biotechnol. 2003; 21(10); 1171-8), и амфифильные блок-сополимеры со средней молекулярной массой (см., например, Hartgerink el al.: Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials; Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2002; 99(8); 5133-8).

WO 00/454808 описывает новые биоматериалы (главным образом для образования гидрогелей), показывающие химию поперечной сшивки на основе реакции присоединения по Михаэлю между нуклеофилом и конъюгированной ненасыщенной связью или группой, которая делает возможным образование геля в присутствии клеток или биомолекул. Более того, в матрикс геля посредством специфической реакции могут встраиваться специфические сигнальные молекулы.

Основным недостатком этой системы является то, что она базируется на ручном смешивании по меньшей мере двух компонентов предшественника перед гелеобразованием. На практике использование растворов из большого числа компонентов может служить источником ошибки вследствие непреднамеренных отклонений (i) условий ресуспендирования различных компонентов в порошкообразной форме, (ii) соотношений смешивания растворов предшественника, что усложняет использование и создает проблемы с воспроизводимостью композиций гелей. В дополнение к этому, масштабирование способа получения гелеобразной системы, который требует смешивания нескольких растворов, является более дорогостоящим, чем масштабирование способа получения геля, требующего использования только одного раствора.

Раскрытие изобретения

Таким образом, целью настоящего изобретения является устранение недостатков известных композиций гидрогелей и, в частности, обеспечение композиции предшественника гидрогеля, которая удобна в употреблении и которая делает возможным получение гидрогелей с использованием легко воспроизводимых композиций. Указанная цель достигается с помощью предшественника гидрогеля по пункту 1 формулы изобретения.

Композиция предшественника гидрогеля согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одно структурное соединение и по меньшей мере одно линкерное (линкерные) соединение. Структурное и линкерные соединения полимеризуются посредством селективной реакции между нуклеофилом и конъюгированной ненасыщенной связью или группой. Композиция предшественника гидрогеля имеет форму нереагировавшего порошка.

Преимуществом композиции является то, что порошок можно просто ресуспендировать, предпочтительно в буфере, для запуска реакции гелеобразования. Не требуется смешивания различных компонентов, благодаря чему значительно уменьшается вероятность ошибочных соотношений между по меньшей мере одним структурным соединением и по меньшей мере одним линкерным соединением. Таким образом, это повышает воспроизводимость гидрогелей, полученных из указанных предшественников гидрогелей. Более того, предшественник гидрогеля согласно настоящему изобретению удобен в употреблении.

Композиция предшественника гидрогеля согласно настоящему изобретению имеет форму порошка. Порошок может включать частицы любого размера и формы. Альтернативно, порошок может также обеспечиваться в виде спрессованной таблетки или пилюли. Наиболее предпочтительно порошок предлагается в форме стабильной компактной лепешки, например, на дне контейнера.

Порошок является нереагировавшим, что означает, что почти ни одно из по меньшей мере одного структурного соединения не вступало в селективную реакцию с по меньшей мере одним линкерным соединением. Предпочтительно более 70%, более предпочтительно - более 85%, наиболее предпочтительно - более 95% соединений не подвергались селективной реакции.

Селективная реакция - это реакция между нуклеофилом и конъюгированной ненасыщенной связью или группой путем нуклеофильного присоединения. Такие реакции известны так же как реакции присоединения по Михаэлю.

Структурное соединение имеет функциональность по меньшей мере три, но наиболее предпочтительно структурное соединение имеет функциональность четыре или более. Под "функциональностью" имеется в виду количество реакционноспособных сайтов на молекуле.

Линкерное соединение предпочтительно выбирается из группы, состоящей из олигомеров, полимеров, биосинтетических или природных белков либо пептидов и полисахаридов. Предпочтительно линкерное соединение является полимером, выбранным из группы, состоящей из поли(этиленгликоля), поли(этиленоксида), поливинилового спирта), сополимера полиэтилена с виниловым спиртом, поли(акриловой кислоты), сополимера полиэтилена с акр иловой кислотой, поли(этилоксазолина), поли(винилпирролидона), сополимера полиэтилена с винилпирролидоном, поли(малеиновой кислоты), сополимера полиэтилена с малеиновой кислотой, поли(акриламида) или блок-сополимеров поли(этиленоксида) с поли(пропиленоксидом) либо их смесей. Более предпочтительно структурное соединение является поли(этиленгликолем), наиболее предпочтительно - разветвленным поли(этиленгликолем) с тремя, четырьмя или более ответвлениями.

Линкерное соединение имеет функциональность по меньшей мере два и выбрано из группы, состоящей из олигомеров, полимеров, биосинтетических или природных белков либо пептидов и полисахаридов или их смесей. Предпочтительно линкерное соединение является пептидной последовательностью, наиболее предпочтительно содержащей участок адгезии, участок связывания фактора роста или участок связывания протеазы.

Нуклеофил предпочтительно является сильным нуклеофилом, таким как тиол или тиолсодержащая группа. Нуклеофил может также быть любым другим типом нуклеофила, известным в уровне техники, при условии, что он является достаточно сильным, чтобы подвергаться селективной реакции, например, таким как амин. Далее, конъюгированная ненасыщенная группа предпочтительно является акрилатом, акриламидом, хиноном или винилпиридином. Наиболее предпочтительно ненасыщенная группа является винилсульфоном.

В дополнение к этому, композиция предшественника гидрогеля согласно настоящему изобретению может включать по меньшей мере одно биоактивное соединение, предпочтительно содержащее RGD-пептидную последовательность, способную к образованию конъюгатов со структурным соединением в ходе селективной реакции между нуклеофилом и конъюгированной ненасыщенной связью или группой.

Биоактивное соединение может содержать участок адгезии, такой как RGD-последовательность из фибронектина или YISG-последовательность из ламинина; участок связывания фактора роста, такой как участок связывания гепарина; участок связывания протеазы или терапевтически активное соединение. Предпочтительно биоактивное соединение содержит участок клеточной адгезии, наиболее предпочтительно - RGD-последовательность.

Биоактивное соединение содержит по меньшей мере одну активную группу, способную подвергаться самоселективной реакции. Более предпочтительно биоактивное соединение содержит по меньшей мере одну нуклеофильную группу, наиболее предпочтительно - тиоловую группу.

Биоактивное соединение способно к образованию конъюгата со структурным соединением посредством собственной селективной (автоселективной) реакции между нуклеофилом и конъюгированной ненасыщенной связью или группой. Наиболее предпочтительно эта автоселективная реакция является такой же реакцией, что и самоселективная реакция между структурным соединением и линкерным соединением, особенно между таким же типом нуклеофила и конъюгированной ненасыщенной связью или группой. Альтернативно, биоактивное соединение может конъюгироваться со структурным соединением посредством автоселективной реакции перед полимеризацией линкерного соединения со структурным соединением.

Структурное соединение предпочтительно является сильно разветвленным поли(этиленгликолем) (PEG) с функционализированными концевыми группами. Более предпочтительно концевые группы функционализированы винилсульфоном. Наиболее предпочтительно структурное соединение является PEG-три(винилсульфоном) или PEG-тетра(винилсульфоном). Функционализация винилсульфоном спиртовых групп PEG может проводиться с помощью любой подходящей реакции, известной в уровне техники. За счет использования разветвленного PEG с тремя, четырьмя или более ответвлениями можно получать структурные соединения с функциональностью три, четыре или более.

Предпочтительно линкерное соединение содержит по меньшей мере две нуклеофильные группы, предпочтительно - тиоловые группы. Тиолы являются сильными нуклеофилами, легко вступающими в реакции присоединения по Михаэлю с ненасыщенными связями или группами при физиологическом рН. Более того, тиолы обычно содержатся в биологических системах, так что их использование не вызывает проблемы в плане токсичности.

Линкерное соединение предпочтительно является пептидом, содержащим по меньшей мере два цистеина, предпочтительно локализующихся вблизи N- и С-концов пептида. Синтез пептидов с двумя или более цистеиновыми остатками является прямым синтезом. Кроме того, можно ввести в пептид специфические участки связывания протеазы с тем, чтобы получить способные к распаду гидрогели, например, для использования in vivo. Помимо этого, за счет варьирования аминокислот, соседствующих с цистеинами, можно изменять значение рКа тиоловой группы.

Предпочтительно цистеины локализуются при N- и С-концах пептида, что позволяет получать пептиды с общей структурой H₂N-CXXXXXXXXC-COOH (SEQ ID NO:1), предпочтительно с ацетилированным N-концом (Ас) и амидированным С-концом (NH₂), где С - однобуквенное обозначение цистеина, Х обозначает любую аминокислоту, за исключением цистеина. Пептид может быть любой длины, поэтому число Х (X_n) может быть любым числом. Предпочтительно длина пептида составляет 16 аминокислот. Альтернативно, цистеины могут локализоваться через одну или более аминокислот от N-или С-конца, что позволяет получать, например, пептиды с общей структурой H₂N-XmCXnCXp-COOH (SEQ ID NO:2), где m, n и р могут быть любым целым числом, включая ноль.

Наиболее предпочтительно линкерное соединение является пептидом с последовательностью NH₂-GCRE-XXXXXXXX-ERCG-COOH (SEQ ID NO:3). Глицин (G) служит в качестве спейсера, аргинин (R) повышает реактивность тиоловой группы соседнего цистеина, а глутаминовая кислота (Е) улучшает растворимость пептида в водных растворах.

Наиболее предпочтительно последовательностью линкерного соединения является последовательность NH₂-GCRE-GPQGIWGQERCG-COOH [SEQ ID NO:4] или NH₂-GCREGDQGIAGFERCG-COOH [SEQ ID NO:5] опять же предпочтительно с ацетилированным N-концом и амидированпым С-концом.

Пептиды для линкерного и биоактивного соединений должны синтезироваться и обрабатываться в кислотных растворителях, наиболее предпочтительно - в растворах, содержащих трифторацетат (TFA). Остаточный TFA, связанный с порошком пептида после синтеза пептида, оказывает эффект снижения рН водной суспензии, содержащей соответствующий пептид, до рН ниже 4.

Структурное соединение и/или линкерное соединение выбираются таким образом, чтобы скорость селективной реакции между структурным соединением и линкерным соединением в условиях смешивания предупреждалась или сильно понижалась. Предпочтительно скорость реакции сильно понижается при рН 4 или ниже по сравнению с рН 7 или выше.

Такой выбор соединений позволяет обеспечить композицию предшественника, которая способна легко подвергаться реакции гелеобразования в физиологических условиях, но в то же время позволяет приготавливать ее при таких условиях, при которых селективная реакция не происходит или почти не происходит.

Предпочтительно структурное и/или линкерное соединение выбираются таким образом, чтобы скорость автоселективной реакции при рН 7,5 была по меньшей мере вдвое выше, чем при рН 7,0.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение способа приготовления композиции предшественника гидрогеля. Эта проблема решается способом по пункту 8 формулы изобретения.

Способ включает стадии:

- обеспечения первого раствора А, содержащего по меньшей мере одно структурное соединение;

- обеспечения второго раствора В, содержащего по меньшей мере одно линкерное соединение;

- смешивания растворов А и В и

- лиофилизации полученного раствора предшественника.

По меньшей мере одно структурное соединение и по меньшей мере одно линкерное соединение полимеризуются посредством селективной реакции между нуклеофилом и конъюгированной ненасыщенной связью или группой. Оба раствора А и В смешиваются при условиях, которые препятствуют селективной реакции.

Этот способ позволяет приготавливать композицию предшественника гидрогеля в форме порошка, содержащего как структурное соединение, так и линкерное соединение. Условия смешивания необходимо подбирать таким образом, чтобы они препятствовали автоселективной реакции. Это означает, что скорость реакции должна быть достаточно низкой с тем, чтобы очень большая фракция соединений обоих растворов А и В не вступала в автоселективную реакцию перед лиофилизацией. Предпочтительно более 70%, более предпочтительно - более 85%, наиболее предпочтительно - более 90% молекул в обоих растворах не подвергаются селективной реакции перед стадией лиофилизации.

Условия смешивания могут выбираться из условий с регулированием рН, концентраций различных соединений, продолжительности способа, температуры или с применением растворителя. Наиболее предпочтительно смешивание проводится при рН 4 или ниже. В том случае, если в качестве нуклеофила используется тиол, рН 4 или ниже в достаточной степени препятствует автоселективной реакции. Смешивание предпочтительно проводится при комнатной температуре.

Важно, чтобы раствор А добавлялся к раствору В, поскольку рН раствора А составляет около 7, в то время как рН раствора В - ниже 4. Если раствор В добавляется к раствору А, то автоселективная реакция полимеризации начинается уже на стадии смешивания. При добавлении раствора А к раствору В рН общего раствора обычно составляет ниже 4, что препятствует реакции.

Раствор А предпочтительно содержит от 5% до 10% (масса/объем) по меньшей мере одного структурного соединения. Наиболее предпочтительно раствор А содержит 7,5% (масса/объем) по меньшей мере одного структурного соединения.

Далее, раствор В предпочтительно содержит от 0,1% до 2% (масса/объем) по меньшей мере одного линкерного соединения. Наиболее предпочтительно раствор В содержит 1% (масса/объем) по меньшей мере одного линкерного соединения. Указанная концентрация линкерного соединения обеспечивает хорошую растворимость соединения в растворе.

Применение вышеупомянутых концентраций структурного и линкерного соединений в обоих растворах А и В приводит к образованию компактного порошка после стадии лиофилизации. Этот компактный порошок образует слой в виде лепешки на дне контейнера, который является предпочтительным. Вдобавок использование этих относительно низких концентраций обоих соединений в ходе способа приготовления дополнительно снижает вероятность нежелательных преждевременных реакций между структурным и линкерным соединениями. Кроме того, материальные потери на последующих стадиях способа сокращаются при этих концентрациях по сравнению с более высокими концентрациями.

Далее, раствор А и/или раствор В предпочтительно являются растворами по меньшей мере одного структурного соединения или по меньшей мере одного линкерного соединения, соответственно, в дистиллированной воде. То есть оба соединения присутствуют в незабуферированном растворе. Вследствие адгезии трифторуксусной кислоты с линкерным соединением пептида раствора В рН этого раствора будет снижаться. Это приведет к рН, который предпочтительно составляет ниже 4 для общей смеси растворов А и В. Более предпочтительно рН общего раствора составляет около 3,5.

Альтернативно, перед смешиванием с раствором В раствор А может смешиваться с дополнительным раствором С, содержащим биологически активное соединение, которое способно димеризоваться со структурным соединением посредством селективной реакции между нуклеофилом и конъюгированной ненасыщенной связью или группой. Это биоактивное соединение может содержать сайт адгезии, такой как RGD-последовательность из фибронектина или YISG-последовательность из ламинина; сайт связывания фактора роста, такой как сайт связывания гепарина; сайт связывания протеазы или терапевтически активное соединение. Предпочтительно биоактивное соединение содержит сайт клеточной адгезии, наиболее предпочтительно - RGD-последовательность.

Предпочтительно раствор С содержит от 0,1% до 10% (масса/объем) биологически активного соединения. Более предпочтительно раствор С содержит от 0,1% до 5%, наиболее предпочтительно - от 0,1% до 2% биологически активного соединения.

Изменение соответствующих количеств структурного соединения в растворе А и биологически активного соединения в необязательном растворе С, а также концентрация и природа (напр., аминокислотная последовательность) линкерного соединения в растворе В позволяет приготавливать композиции предшественника гидрогеля с различными характеристиками.

Хотя возможностей варьирования концентрации соединений в каждом из растворов А и В много, предпочитается проводить выбор концентрации соединений таким образом, чтобы молярное отношение нуклеофила к конъюгированной ненасыщенной связи или группе обеспечивало оптимальные физико-химические свойства, такие как максимальный модуль упругости при сдвиге и минимальные характеристики набухания готовых гелей. Обычно оптимальное отношение нуклеофила к конъюгированной ненасыщенной связи или группе составляет от 0,8:1 до 1,3:1. Это гарантирует получение гидрогеля, в котором почти все активные группы подверглись селективной реакции, так что побочные реакции любой из реактивных групп существенно сократились.

Затем раствор предшественника может подвергаться фильтрации перед стадией лиофилизации. Фильтрация предпочтительно является стерильной фильтрацией. Перед стадией лиофилизации из смеси могут удаляться любые не растворившиеся соединения, а также бактериальные загрязнения.

Затем предпочтительно отбираются аликвотные количества предварительно смешанного раствора предшественника и заливаются в контейнеры, предпочтительно в стерильные контейнеры, перед стадией лиофилизации. Это дает возможность подготовить единичные контейнеры, содержащие определенное количество композиции предшественника гидрогеля. Контейнеры могут быть изготовлены из любого подходящего материала, такого как пластик или стекло. Предпочтительно контейнеры представляют собой флаконы.

Контейнеры предпочтительно заполняются стерильным газом азотом и укупориваются колпачками сразу после стадии лиофилизации. Это защищает порошок предшественника гидрогеля от контакта с влагой и/или кислородом, которые могут привести к преждевременной полимеризации или окислению нуклеофилов.

Другой целью настоящего изобретения является применение описанной здесь композиции предшественника гидрогеля для получения гидрогеля.

Следующей целью настоящего изобретения является обеспечение простой в использовании системы для получения гидрогелей с высоковоспроизводимыми результатами. Эта проблема решается с помощью готового набора по пункту 20 4юрмулы изобретения.

Набор настоящего изобретения включает по меньшей мере один контейнер, наполненный описанной здесь композицией предшественника гидрогеля, и контейнер с реакционным буфером. Контейнер предпочтительно содержит некоторое количество порошка предшественника гидрогеля, которое при ресуспендировании в определенном количестве реакционного буфера дает гель с заданными характеристиками.

Реакционный буфер предпочтительно имеет рН выше 7. Более предпочтительно реакционный буфер имеет рН в диапазоне от 7 до 8. Буфер предпочтительно включает HEPES [4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту], предпочтительно в концентрации 0,3 М, с рН, доведенным до значения в диапазоне от 7 до 8. Это обеспечивает достаточно быструю реакцию полимеризации.

Следующей целью настоящего изобретения является обеспечение удобного в использовании способа получения гидрогеля. Эта цель достигается способом по пункту 22 формулы изобретения.

Способ получения гидрогеля включает стадии:

- ресуспендирования описанной здесь композиции предшественника гидрогеля в буфере, имеющем рН 7, более предпочтительно - в буфере, имеющем рН в диапазоне от 7 до 8;

- при необходимости добавления суспензии клеточной культуры к суспензии предшественника;

- формования предшественника геля с суспензией предшественника и

- полимеризации предшественника геля в течение по меньшей мере 30 минут, предпочтительно - в течение от 30 до 45 минут, предпочтительно в инкубаторе при 37°С.

Композиция предшественника гидрогеля согласно настоящему изобретению способна полимеризоваться в физиологических условиях, что делает возможным добавление клеточной культуры к суспензии предшественника таким образом, чтобы клетки могли равномерно распределиться в суспензии перед гелеобразованием. Это не представляется возможным в случае любой другой системы предшественника.

Дальнейшие детали и выгодные преимущества настоящего изобретения станут очевидны из нижеследующих фигур и примеров.

Фиг.1. Схематическое представление одного варианта осуществления способа приготовления композиции предшественника гидрогеля согласно настоящему изобретению.

Фиг.2. Схематическое представление второго варианта осуществления способа приготовления композиции предшественника гидрогеля согласно настоящему изобретению.

Фиг.3. Схематическое представление третьего варианта осуществления способа приготовления композиции предшественника гидрогеля согласно настоящему изобретению.

Фиг.1 показывает схематическое представление одного варианта осуществления способа приготовления композиции предшественника гидрогеля согласно настоящему изобретению. Раствор А, содержащий 7,5% (масса/объем) разветвленного PEG с 4 ответвлениями, функционализированными винилсульфоном, добавляется к раствору В, содержащему 1% (масса/объем) пептидной последовательности с двумя цистеинами -одним вблизи С-конца и другим вблизи N-конца, на стадии смешивания 1.

Например, 275 мл раствора А, содержащего 7,5% (масса/объем) функционализированного PEG, добавляются к 425 мл раствора В, содержащего 1% (масса/объем) линкерного пептида.

Растворы А и В готовятся путем суспендирования соответствующих соединений в дистиллированной воде. Для приготовления раствора В пептидное линкерное соединение предпочтительно добавляется к воде малыми порциями. Смешивание проводится при непрерывном перемешивании магнитной мешалкой при 400 об/мин. Полученный таким путем раствор предшественника 4 подвергается последующей стадии стерильной фильтрации 5, например, через фильтр Mini Kleenpak (PALL Corp.) c PTFE (политетрафторэтиленовой) мембраной, пропускающей частицы с предельным размером 0,2 мкм, с выходом фильтрованного раствора предшественника 6. Этот раствор подвергается затем стадии лиофилизации 7 с получением композиции предшественника гидрогеля 8 в форме порошка. Полученный порошок имеет форму стабильной компактной лепешки.

Стадия лиофилизации 7 может проводиться путем начального замораживания раствора на полке при -50°С в течение 150 мин с последующей первой стадией сушки при -10°С в течение 570 мин при давлении 0,26 мбар. Вторая стадия сушки проводится при температуре 20°С в течение 180 мин при давлении 0,02 мбар.

На фиг.2 схематически показан второй вариант осуществления способа приготовления композиции предшественника гидрогеля согласно настоящему изобретению. В этом варианте раствор А, содержащий 7,5% (масса/объем) разветвленного PEG с 4 ответвлениями, функционализированными винилсульфоном, смешивается с раствором С, содержащим 2% (масса/объем) пептида, содержащего RGD-последовательность, на стадии смешивания 2.

Например, 275 мл раствора А, содержащего 7,5% (масса/объем) функционализированного PEG с четырьмя ответвлениями, смешиваются с 5 мл раствора С, содержащего 2% (масса/объем) биоактивного соединения. Этот раствор смешивается затем с раствором В, содержащим 1% (масса/объем) линкерного пептида с двумя цистеинами - одним вблизи С-конца и другим вблизи N-конца, на стадии смешивания 1.

Полученный таким путем раствор предшественника 4 подвергается последующей стадии стерильной фильтрации 5 с получением фильтрованного раствора предшественника 6. Этот раствор подвергается затем стадии лиофилизации 7 с получением композиции предшественника гидрогеля 8 в форме порошка.

Фиг.3 показывает третий вариант осуществления способа приготовления композиции предшественника гидрогеля согласно настоящему изобретению. Раствор А, содержащий 7,5% (масса/объем) разветвленного PEG с 4 ответвлениями, функционализированными винилсульфоном, смешивается с раствором В, содержащим 1% (масса/объем) пептидной последовательности (в качестве линкерного соединения) с цистеинами вблизи С- и N-концов на стадии смешивания 1. Растворы А и В готовятся путем суспендирования соответствующих соединений в дистиллированной воде. Смешивание проводится при непрерывном перемешивании магнитной мешалкой при 400 об./мин. Полученный таким путем раствор предшественника 4 подвергается последующей стадии стерильной фильтрации 5 с выходом фильтрованного раствора предшественника 6. Далее аликвотные количества этого раствора разливаются в контейнеры на стадии отбора аликвотных количеств 9. Каждый контейнер может содержать только небольшое количество - предпочтительно 0,3-0,4 мл. Контейнеры герметично укупориваются и предпочтительно изготовлены из стекла. Аликвотные количества раствора предшественника 10 подвергаются лиофильной сушке на стадии лиофилизации 7 с получением порошка композиции предшественника 8.

Изобретение относится к композиции предшественника гидрогеля, ее применению, способу ее приготовления, к набору, содержащему указанную композицию, к способу получения гидрогеля с использованием указанной композиции. Композиция предшественника гидрогеля содержит по меньшей мере одно структурное соединение и по меньшей мере одно линкерное соединение, в которой указанное структурное соединение и указанное линкерное соединение способны к полимеризации посредством селективной реакции между нуклеофилом и конъюгированной ненасыщенной связью или группой, отличается тем, что композиция предшественника гидрогеля имеет форму нереагировавшего порошка. Технический результат - обеспечение композиции предшественника гидрогеля, которая удобна в употреблении и которая делает возможным получение гидрогелей с использованием легко воспроизводимых композиций. 5 н. и 17 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Композиция предшественника гидрогеля, содержащая по меньшей мере одно структурное соединение и по меньшей мере одно линкерное соединение, в которой указанное структурное соединение и указанное линкерное соединение способны к полимеризации посредством селективной реакции между нуклеофилом и конъюгированной ненасыщенной связью или группой, отличающаяся тем, что композиция предшественника гидрогеля имеет форму нереагировавшего порошка.

2. Композиция предшественника гидрогеля по п.1, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно биоактивное соединение, предпочтительно включающее RGD-пептидную последовательность, которая способна димеризоваться со структурным соединением в ходе селективной реакции между нуклеофилом и конъюгированной ненасыщенной связью или группой.

3. Композиция предшественника гидрогеля по п.1 или 2, отличающаяся тем, что структурное соединение является сильно разветвленным полиэтиленгликолем с винилсульфоновыми концевыми группами, предпочтительно PEG-три(винилсульфон) или PEG-тетра(винилсульфон).

4. Композиция предшественника гидрогеля по п.1 или 2, отличающаяся тем, что линкерное соединение содержит по меньшей мере две нуклеофильные группы, предпочтительно тиоловые группы.

5. Композиция предшественника гидрогеля по п.1 или 2, отличающаяся тем, что линкерное соединение является пептидом, содержащим по меньшей мере два цистеина, предпочтительно локализующихся вблизи от N- и С-концов пептида.

6. Композиция предшественника по п.1 или 2, отличающаяся тем, что структурное соединение и/или линкерное соединение выбираются таким образом, чтобы предупредить селективную реакцию при рН 4,0 или ниже.

7. Композиция предшественника по п.6, отличающаяся тем, что скорость реакции при рН 7,5 по меньшей мере вдвое выше, чем при рН 7,0.

8. Способ приготовления композиции предшественника гидрогеля в форме порошка, в частности, по пп.1-7, включающий стадии:
- обеспечения первого раствора А, содержащего по меньшей мере одно структурное соединение;
- обеспечения второго раствора В, содержащего по меньшей мере одно линкерное соединение;
- смешивания (1) растворов А и В и
- лиофилизации (7) готового раствора предшественника, в котором по меньшей мере одно структурное соединение и по меньшей мере одно линкерное соединение способны к полимеризации посредством селективной реакции между нуклеофилом и конъюгированной ненасыщенной связью или группой, отличающийся тем, что растворы А и В смешиваются (1) в условиях, которые препятствуют селективной реакции.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что растворы смешиваются (1) при рН 4,0 или ниже, предпочтительно при рН 3,5.

10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что раствор А содержит от 5% до 10% (мас./об.) по меньшей мере одного структурного соединения, предпочтительно 7,5% (мас./об.).

11. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что раствор В содержит от 0,1% до 2% (мас./об.) по меньшей мере одного линкерного соединения, предпочтительно 1% (мас./об.).

12. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что раствор С, содержащий по меньшей мере одно биологически активное соединение, которое способно димеризоваться со структурным соединением в ходе селективной реакции между нуклеофилом и конъюгированной ненасыщенной связью или группой, добавляется (2) к раствору А перед смешиванием (1) растворов А и В.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что раствор С содержит от 0,1% до 10% (мас./об.) по меньшей мере одного активного соединения, предпочтительно 2%.

14. Способ по п.12 или 13, отличающийся тем, что раствор А, раствор В и/или раствор С являются растворами по меньшей мере одного структурного соединения, по меньшей мере одного линкерного соединения или по меньшей мере одного биологически активного соединения в дистиллированной воде.

15. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что концентрация соединений выбирается такой, чтобы молярное отношение нуклеофила к конъюгированной ненасыщенной связи или группе составляло в диапазоне от 0,8:1 до 1,3:1.

16. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что раствор предшественника подвергается фильтрации (5) перед стадией лиофилизации (7), предпочтительно стерильной фильтрации.

17. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что отбираются аликвотные количества (9) раствора предшественника, которые разливаются в контейнеры предпочтительно в стерильных условиях перед стадией лиофилизации (7).

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что контейнеры заполняются стерильным газом азотом и укупориваются колпачками сразу же после стадии лиофилизации (7).

19. Применение композиции предшественника гидрогеля по любому из предшествующих пп.1-7 для получения гидрогеля.

20. Набор, включающий по меньшей мере один контейнер с композицией предшественника гидрогеля по любому из предшествующих пп.1-7 и контейнер с реакционным буфером.

21. Набор по п.20, отличающийся тем, что реакционный буфер имеет рН, по меньшей мере, 7, предпочтительно реакционный буфер имеет рН в диапазоне от 7 до 8.

22. Способ получения гидрогеля, включающий стадии:
- ресуспендирования композиции предшественника гидрогеля по любому из предшествующих пп.1-7 в буфере, имеющем рН, по меньшей мере, 7,
- при необходимости добавления суспензии клеточной культуры к суспензии предшественника,
- формования по меньшей мере одного гидрогеля из суспензии предшественника,
- полимеризации по меньшей мере одного предшественника геля в течение по меньшей мере 30 минут, предпочтительно, в инкубаторе при 37°C.