ВЫСУШЕННЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12N11/14 A01N63/20 A01N63/27 

Область техники

Настоящее изобретение относится к высушенным и стабильным биологическим композициям с высоким содержанием колониеобразующих единиц и к способам их получения и применения.

Предпосылки создания настоящего изобретения

Микробные инсектициды, гербициды, фунгициды и активаторы роста, полезные вирусы, бактерии, дрожжи и грибы, направленные на определенные виды насекомых или растений, вызывают возрастающий интерес в сельскохозяйственной отрасли благодаря низкому воздействию на нецелевые виды и окружающую среду. Однако поддержание жизнеспособности таких продуктов, в основном, является сложной задачей в процессе хранения и обработки составов. В настоящее время микробные пестицидные продукты можно получать в виде жидких или высушенных составов. Жидкие составы обычно включают суспензии таких микроорганизмов в воде, маслах или эмульсиях для поддержания жизнеспособности и эффективности. Такие жидкие составы, однако, необходимо хранить и транспортировать при низкой температуре, что часто является затруднительным и нерентабельным. Сухие составы, с другой стороны, обычно включают переработку микроорганизмов в смачиваемые порошки, гранулы, крупнозернистые формы или формы с покрытием или кристаллизующиеся формы для упрощения хранения и транспортировки. Однако при получении составов таких микроорганизмов в высушенной форме для облегчения обращения с ними возникают проблемы в связи с нагреванием при высушивании при переработке состава.

В патенте US 8409822 (Trevino et al) описаны и заявлены композиции, предназначенные для переработки микроорганизмов в сухом режиме, включающем гранулы осажденного кремнезема с пористой структурой и микроорганизмы, включенные в поры гранул осажденного кремнезема, где композиция является пригодной для проникновения микроорганизмов в поры гранул осажденного кремнезема. Также в патенте US 9296989 (Trevino et al) описаны и заявлены композиции для доставки живых клеток в сухом режиме, включающем инертный носитель-подложку с порами, живые клетки, включенные в поры инертного носителя-подложки, и поверхностный слой, нанесенный на внешнюю поверхность инертного носителя-подложки, содержащего живые клетки, где поверхностный слой является проницаемым для молекул, которые способствуют росту живых клеток таким образом, что композиция является пригодной для обеспечения проникновения живых клеток в инертный носитель-подложку по сравнению с другой композицией, не содержащей поверхностного слоя. Несмотря на то, что композиции, раскрытые в патентах Trevino et al, заявлены как полученные в "сухом режиме", фактически они не являются высушенными, поскольку указано, что жидкости включающие живые микроорганизмы в значительной степени включены в поры осажденного кремнезема. Кремнезем, как описано в патентах Trevino et al, действует в качестве абсорбента и содержит от 25 до 75% живых микроорганизмов. При таком уровне загрузки загруженный кремнезем является сыпучим, но определен как сухой на ощупь. Такие композиции относительно ограничены в применении, поскольку концентрация организмов и содержание воды в кремнеземе не оптимизированы и возможна быстрая потеря активности, т.к. организмы все еще могут дышать.

Различные защитные вещества, такие как сульфоксиды, спирты, моносахариды, полисахариды, аминокислоты, пептиды, гликопротеины и другие добавки можно использовать для защиты микроорганизмов от повреждения при обезвоживании. В патенте US 5360607 (Eyal et al) описаны и заявлены улучшенные, стабильные, высушенные, крупнозернистые формы биопестицидных композиций на инертном носителе, способные поддерживать рост грибов, стимулировать споруляцию конидий и энтомогенную биомассу грибов, полученную методом глубинной ферментации изолята грибов Paecilomyces fumosoroeus. В данном способе, однако, используется альгинат для инкапсулирования природных крупнозернистых форм, которые подвержены изменениям, предпочтительно по содержанию влаги (например, по уровню активности воды (A_w)), благодаря которому микроорганизмы сохраняют способность выживать и дышать.

Все еще существует необходимость в данной области техники получения микроорганизмов в высушенной стабильной форме в высокой концентрации.

Краткое описание настоящего изобретения

Авторами настоящего изобретения неожиданно было установлено, что микроорганизмы, такие как споры плесени и бактерий, могут быть получены и высушены при определенной температуре на поверхности различных субстратов, с получением высушенных биологических композиций с улучшенной выживаемостью и концентрацией или количеством колониеобразующих единиц ("КОЕ"), превышающих известные в данной области техники уровни. Для обеспечения требуемого уровня КОЕ таких высушенных биологических композиций (концентрированные высушенные биологические композиции) в настоящем изобретении определены несколько взаимосвязанных параметров для создания оптимальной окружающей среды для микроорганизмов, которая предназначена для нанесения на них, без снижения выживаемости. Во-первых, субстрат выбран из группы пористых частиц с удельной поверхностью по методу Брюнера-Эммета-Теллера (BET) от 10 до 400 м²/г. Во-вторых, микроорганизмы высушивают на таком субстрате до требуемой общей концентрации воды от приблизительно 0,01 мас. % до приблизительно 15 мас. %. При достижении требуемой общей концентрации воды в комбинации с особым параметром субстрата, создается определенная активность воды (A_w), поскольку активность воды зависит как от общего количества воды, так и от относительной доступности воды, контролируемой особым субстратом. Способность адаптировать идеальную поверхностную активность воды позволяет стабилизировать биологический материал в требуемом состоянии покоя, которое описывается небольшим изменением дополнительного времени колониеобразующей единицы ("КОЕ").

Следовательно, в первом объекте настоящего изобретения предлагается высушенная биологическая композиция (композиция I), в основном включающая, а в предпочтительном варианте, состоящая из (i) субстрата и (ii) микроорганизмов, нанесенных на поверхность указанного субстрата, где общее содержание влаги в композиции составляет от приблизительно 0,01 мас. % до приблизительно 15 мас. %. Неожиданно было установлено, что микроорганизмы можно перерабатывать в форму, в которой они могут выживать на определенном субстрате в состоянии покоя с высокой концентрацией и при хорошей выживаемости, что обеспечивается полученным уровнем поверхностной активности воды. Предпочтительно в первом объекте настоящего изобретения предлагается следующая композиция I:

1.1 Композиция I, в которой общее содержание влаги в композиции составляет от приблизительно 0,01 мас. % до приблизительно 8 мас. %;

1.2 Композиция I или 1.1, в которой общее содержание влаги в композиции составляет от приблизительно 3 мас. % до приблизительно 8 мас. %; предпочтительно от 5 мас. % до 8 мас. %, еще более предпочтительно выбрано из значений 3 мас. %, 5 мас. % и 7 мас. %;

1.3 Композиция I, или 1.1 или 1.2, в которой величина активности воды (A_w) в композиции составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,6, предпочтительно от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,6, еще более предпочтительно от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,5;

1.4 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.3, где композиция характеризуется значением более приблизительно 10⁷ КОЕ/г, предпочтительно приблизительно 10⁸ КОЕ/г или более, более предпочтительно приблизительно 10⁹ КОЕ/г или более, еще более предпочтительно приблизительно 10¹⁰ КОЕ/г или более, более предпочтительно приблизительно 10¹¹ КОЕ/г или более, наиболее предпочтительно приблизительно 10¹² КОЕ/г или более;

1.5 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.4, где субстрат выбран из группы, состоящей из кремнезема (например, осажденного кремнезема, предпочтительно гидрофильного кремнезема, например, кремнезема SIPERNAT® 22), диатомовой земли, силикагеля, силикатов (например, алюминосиликатов, таких как ZEOLEX® 301, или глин) и водонерастворимого природного волокнистого материала, такого как целлюлоза;

1.6. Композиция I или любая из композиций 1.1-1.5, в которой субстратом является кремнезем;

1.7 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.6, в которой субстратом является осажденный кремнезем;

1.8 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.7, в которой субстратом является гидрофильный кремнезем, например кремнезем SIPERNAT® 22;

1.9 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.5, в которой субстратом является водонерастворимый природный волокнистый материал, такой как целлюлоза;

1.10 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.5, в которой субстратом является диатомовая земля;

1.11 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.5, в которой субстратом является силикагель;

1.12 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.5, в которой субстратом являются силикаты (например, алюминосиликаты, такие как ZEOLEX® 301), или глины;

1.13 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.13, в которой размер частиц (d50) субстрата составляет приблизительно 5-200 мкм, предпочтительно приблизительно 8-160 мкм, более предпочтительно приблизительно 9-150 мкм, еще более предпочтительно приблизительно 50-150 мкм, более предпочтительно приблизительно 50-130 мкм, наиболее предпочтительно выбран из группы, состоящей из значений приблизительно 50 мкм, приблизительно 85 мкм и приблизительно 120 мкм;

1.14 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.14, в которой площадь поверхности BET субстрата составляет приблизительно 2-400 м²/г, предпочтительно приблизительно 5-400 м²/г, более предпочтительно приблизительно 10-400 м²/г, еще более предпочтительно приблизительно 30-400 м²/г, более предпочтительно приблизительно 30-300 м²/г, еще более предпочтительно приблизительно 40-200 м²/г, наиболее предпочтительно приблизительно 180 м²/г;

1.15 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.14, в которой площадь поверхности BET субстрата составляет приблизительно 2 м²/г, предпочтительно приблизительно 5 м²/г;

1.16 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.14, в которой площадь поверхности BET субстрата составляет приблизительно 180 м²/г;

1.17 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.16, в которой объем пор субстрата составляет приблизительно 0,01-1,20 см³/г, предпочтительно приблизительно 0,05-1,20 см³/г, более предпочтительно приблизительно 0,10-1,00 см³/г, еще более предпочтительно приблизительно 0,20-0,95 см³/г;

1.18 Композиция I или одна из композиций 1.1-1.17, в которой указанная композиция включает осажденный кремнезем, площадь поверхности BET которого составляет приблизительно 50-200 м²/г, предпочтительно приблизительно 180 м²/г, а содержание общей влаги в указанной композиции составляет от приблизительно 5 мас. % до приблизительно 8 мас. %;

1.19 Композиция I или одна из композиций 1.1-1.18, в которой указанная композиция включает осажденный кремнезем, площадь поверхности BET которого составляет приблизительно 50-200 м²/г, предпочтительно приблизительно 180 м²/г, размер частиц составляет приблизительно 5-200 мкм, более предпочтительно приблизительно 120 мкм, а содержание общей влаги в указанной композиции составляет от приблизительно 5 мас. % до приблизительно 8 мас. %;

1.20 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.19, в которой конечная концентрация микроорганизмов составляет от приблизительно 4 до приблизительно 40 мас. %, предпочтительно от приблизительно 4 до приблизительно 20 мас. % в расчете на общую массу композиции;

1.21 Композиция I или одна из композиций 1.1-1.20, в которой микроорганизмы выбраны из группы, состоящей из Bacillus subtilis QST713, Pasteuria usgae; Beauveria bassiana, Coniothyrium minitans, Chondrostereum purpureum, Paecilomyces lilacinus, Aschersonia aleyrodis, Beauveria brongniartii, Hirsutella thompsonii, Isaria fumosorosea, Isaria sp., Lecanicillium longisporum, Lecanicillium muscarium, Lecanicillium sp., Metarhizium anisopliae, Metarhizium anisopliae var. acridum, Nomuraea rileyi Sporothrix insectorum; Cydia pomonella GV; Phytophthora palmivora, Lagenidium giganteum, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas fluorescens, Bradyrhizobium, Mycorrhiza, Clonostachys rosea, Bacillus spp. и Lactobacillus spp., или любых их комбинаций, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из Bacillus thuringiensis, Pseudomonas fluorescens, Bradyrhizobium, Mycorrhiza, Clonostachys rosea или любых их комбинаций;

1.22 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.21, в которой микроорганизмами являются Clonostachys rosea, в другом варианте Pseudomonas fluorescens;

1.23 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.22, которая дополнительно включает один или более эксципиентов, предпочтительно один или более агрохимически приемлемых эксципиентов;

1.24 Композиция 1.22 в форме таблетки, сыпучей концентрированной формы, например, для обработки семян, или в форме масляной дисперсии;

1.25 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.24, где для композиции не требуется экзогенный защитный агент, такой как инкапсулирование в альгинате;

1.26 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.25, где композиция дополнительно включает полимер, который выбран из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди, других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровая камедь (например, гидроксипропилгуаровая камедь) и полиэтиленгликоль;

1.27 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.26, где композиция дополнительно включает второй субстрат в качестве внешнего слоя;

1.28 Композиция 1.27, в которой второй субстрат выбран из осажденного кремнезема, такого как например кремнезем SIPERNAT® 50 S, или тонкодисперсного кремнезема, такого как кремнезем AEROSIL® 200, AEROSIL® R 972 или AEROSIL® R 812S;

1.29 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.28, в которой число колониеобразующих единиц на грамм композиции (КОЕ/г) остается на уровне приблизительно более 10⁷ КОЕ/г после хранения при комнатной температуре в течение 120 дней;

1.30 Композиция I или любая из композиций 1.11.29, в которой число колониеобразующих единиц на грамм композиции (КОЕ/г) остается на уровне приблизительно более 10⁷ КОЕ/г после хранения при 40°С в течение 40 дней;

1.31 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.30, в которой число колониеобразующих единиц на грамм композиции (КОЕ/г) остается на уровне приблизительно более 10⁷ КОЕ/г после хранения при относительной влажности 65% или менее в течение 40 дней;

1.32 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.31, где насыпная плотность композиции составляет более 150% в расчете на насыпную плотность очищенного материала субстрата;

1.33 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.32, где размер микроорганизмов больше диаметра пор субстрата или микроорганизмы наносят на поверхность субстратов;

1.34 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.24 или 1.27-1.33, где композиция дополнительно включает (i) полимер, выбранный из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди или других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровая камедь (например, гидроксипропилгуаровая камедь), полиэтиленгликоль и полиглицерин, или (ii) невосстанавливающиеся дисахариды, такие как трегалоза или сахароза, или (iii) обезжиренное молоко или диметилсульфоксид;

1.35 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.24 или 1.27-1.33, где композиция дополнительно включает невосстанавливающиеся дисахариды, такие как трегалоза или сахароза;

1.36 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.24 или 1.27-1.33, где композиция дополнительно включает полимер, такой как полиглицерин, в частности сверхразветвленный полимер полиглицерина;

1.37 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.36, в которой указанный вторичный субстрат представляет собой тонкодисперсные гидрофобные или гидрофильные частицы, где поверхность таких частиц обработана, например, силанами или силиконовым маслом для модификации смачиваемости или тенденции образцов к абсорбции воды;

1.38 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.37, в которой указанный вторичный субстрат представляет собой кремнезем или глину, поверхность таких кремнезема или глины обработана, например, силанами или силиконовым маслом для модификации смачиваемости или тенденции образцов к абсорбции воды;

1.39 Композиция I или любая из композиции 1.1-1.38, в которой второй субстрат характеризуется высокой площадью поверхности BET, например от 50 до 750 м²/г, предпочтительно 50-380 м²/г;

1.40 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.39, в которой второй субстрат представляет собой гидрофобный кремнезем;

1.41 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.40, в которой второй субстрат представляет собой осажденный кремнезем;

1.42 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.41, в которой второй субстрат представляет собой осажденный кремнезем с высокой площадью поверхности BET, например от 50 до 750 м²/г, предпочтительно 50-380 м²/г;

1.43 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.42, в которой второй субстрат представляет собой кремнезем SIPERNAT® 50 или ZEOFREE®, предпочтительно кремнезем SIPERNAT® 50,

1.44 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.40, в которой второй субстрат представляет собой тонкодисперсный кремнезем;

1.45 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.44, в которой второй субстрат представляет собой тонкодисперсный кремнезем;

1.46 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.44, в которой второй субстрат представляет собой гидрофобный тонкодисперсный кремнезем;

1.47 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.44, в которой второй субстрат представляет собой гидрофобный тонкодисперсный кремнезем, площадь поверхности BET которого составляет от 180 до 220 м²/г с содержанием углерода от 3,5 до 5%, такой как кремнезем AROSIL® R202;

1.48 Композиция I или любая из композиций 1.1-1.6, 1.13, 1.17 или 1.20-1.47, в которой первый субстрат представляет собой кремнезем, площадь поверхности BET которого составляет 400-600 м²/г, предпочтительно 500 м²/г;

1.49 Композиция 1.48, в которой объем пор указанного кремнезема составляет более 1 см³/г, предпочтительно 1,4 см³/г или более на основании модели Баррета-Джойнера-Халенды, или более 2 см³/г, предпочтительно 2,2 по данным ртутной порометрии;

1.50 Композиция 1.49, в которой кремнезем представляет собой кремнезем SIPERNAT® 50.

Во втором объекте настоящего изобретения предлагается способ получения высушенной биологической композиции, включающей, в предпочтительном варианте по существу состоящей из субстрата и микроорганизмов, нанесенных на субстрат, где содержание влаги композиции составляет от приблизительно 0,01 мас. % до приблизительно 15 мас. %, где в предпочтительном варианте способ по существу включает, а в другом предпочтительном варианте состоит из следующих стадий: (1) объединение смеси, раствора или суспензии, содержащих микроорганизмы, с субстратом, и (2) высушивание смеси субстрат-микроорганизм для достижения общего содержания влаги от приблизительно 0,01 до приблизительно 15 мас. % (способ I). Предпочтительно, в настоящем изобретении предлагается способ I, как описано ниже:

2.1 Способ I, где микроорганизмы собирают с поверхности семени путем механического растирания или полирования поверхности семени (стадия (а)), с получением тонкоизмельченной фракции, содержащей микроорганизмы, предпочтительно содержащей споры грибов, и некоторые части семени. Предпочтительно, выход микроорганизмов в тонкодисперсной фракции составляет более 10⁹ КОЕ/г исходно растертого или полированного семени. Более предпочтительно способ включает просеивание (стадия (б)), с получением тонкодисперсной фракции для получения порошка с требуемым распределением частиц по размеру для последующих стадий процесса. Предпочтительно порошок используют для получения смеси, раствора или суспензии микроорганизмов (стадия в);

2.2 Способ 2.1, где стадия (а) включает растирание с использованием шлифовального камня для отделения семени от тонкодисперсной фракции;

2.3 Способ 2.1, где стадия (а) включает растирание с использованием вращающегося вала внутри защитной трубы щелевидного сита в условиях под давлением с последующим просеиванием и фильтрованием для отделения семени от тонкодисперсной фракции;

2.4 Способ I или любой из способов 2.1-2.3, где просеивание тонкодисперсной фракции со стадии (б) включает просеивание через сито с отверстиями размером от 20 до 800 мкм, предпочтительно от 100 мкм до 300 мкм;

2.5 Способ I, где микроорганизмы собирают с поверхности семени путем смывания их водой и отделения семени и жидкого раствора или суспензии микроорганизмов. Предпочтительно, семена перемешивают в воде в течение от 1 до 20 мин. Более предпочтительно отделение твердых частиц от жидкости проводят в нутч-фильтре под давлением, еще более предпочтительно размер отверстий нутч-фильтра под давлением составляет от 1 до 3 мм. Еще более предпочтительно время обезвоживания в нутч-фильтре под давлением составляет 20-200 с. Еще более предпочтительно фильтрационное давление в нутч-фильтре составляет от 1 до 3 бар. Еще более предпочтительно раствор или суспензию микроорганизмов концентрируют путем отделения микроорганизмов от жидкости в поле центробежных сил. Еще более предпочтительно стадия концентрирования включает разделение в тарельчатом сепараторе. Еще более предпочтительно стадию концентрирования повторяют с разбавлением концентрата водой и последующем втором концентрировании в поле центробежных сил для отделения растворимых частей от микроорганизмов;

2.6 Способ I или любой из способов 2.1-2.5, где на стадии (2) смесь субстрат-микроорганизм высушивают до общего содержания влаги от приблизительно 0,01 мас. % до приблизительно 15 мас. %, предпочтительно от приблизительно 0,01 мас. % до приблизительно 8 мас. %, более предпочтительно от приблизительно 3 мас. % до приблизительно 8 мас. %, еще более предпочтительно от приблизительно 5 мас. % до приблизительно 8 мас. %, наиболее предпочтительно выбран из значений 3 мас. %, 5 мас. % и 7 мас. %;

2.7 Способ I или любой из способов 2.1-2.6, где стадия высушивания (2) включает высушивание смесей субстрата и микроорганизмов в псевдоожижженном слое;

2.8 Способ I или любой из способов 2.1-2.6, где стадия высушивания (2) включает высушивание с распылением смесей субстрата и микроорганизмов;

2.9 Способ I или любой из способов 2.1-2.6, где стадия высушивания (2) включает контактное высушивание смесей субстрата и микроорганизмов;

2.10 Способ I или любой из способов 2.1-2.6, где стадия высушивания (2) включает высушивание замораживанием смесей субстрата и микроорганизмов;

2.11 Способ I или любой из способов 2.1-2.10, где температура воздуха для высушивания составляет приблизительно 130°С или менее, предпочтительно приблизительно 90°С или менее, более предпочтительно приблизительно 80°С или менее, еще более предпочтительно приблизительно 30°-50°С, более предпочтительно приблизительно 40°-50°С, еще более предпочтительно приблизительно 40°-45°С, наиболее предпочтительно приблизительно 43°С;

2.12 Способ I или любой из способов 2.1-2.11, где порошкообразный слой поддерживают при температуре приблизительно 35°С или менее, предпочтительно приблизительно 30°С или менее, более предпочтительно от приблизительно 25°С до 35°С;

2.13 Способ I или любой из способов 2.1-2.7, где скорость распыления составляет приблизительно 2 мл/г субстрата;

2.14 Способ I или любой из способов 2.1-2.13, где величина активности воды (Aw) полученной композиции составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,6, предпочтительно от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,6, более предпочтительно от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,5;

2.15 Способ I или любой из способов 2.1-2.14, где число колониеобразующих единиц микроорганизмов на грамм композиции (КОЕ/г), составляет, например, более 10⁷ КОЕ/г, предпочтительно приблизительно 10⁸ колониеобразующих единиц на грамм (КОЕ/г) или более, более предпочтительно приблизительно 10⁹ КОЕ/г или более, еще более предпочтительно приблизительно 10¹⁰ КОЕ/г или более, более предпочтительно приблизительно 10¹¹ КОЕ/г или более, наиболее предпочтительно приблизительно 10¹² КОЕ/г или более;

2.16 Способ I или любой из способов 2.1-2.15, где субстрат выбран из группы, состоящей из кремнезема (например, осажденного кремнезема, предпочтительно гидрофильного кремнезема, например, кремнезема SIPERNAT® 22), диатомовой земли, силикагеля, силикатов (например, алюминосиликатов, таких как ZEOLEX® 301, или глины) и водонерастворимого природного волокнистого материала, такого как целлюлоза;

2.17 Способ I или любой из способов 2.1-2.16, где субстрат представляет собой кремнезем;

2.18 Способ I или любой из способов 2.1-2.17, где субстрат представляет собой осажденный кремнезем;

2.19 Способ I или любой из способов 2.1-2.18, где субстрат представляет собой гидрофильный кремнезем, например, кремнезем SIPERNAT® 22;

2.20 Способ I или любой из способов 2.1-2.16, где субстрат представляет собой водонерастворимый природный волокнистый материал, такой как целлюлоза;

2.21 Способ I или любой из способов 2.1-2.16, где субстрат представляет собой диатомовую землю;

2.22 Способ I или любой из способов 2.1-2.16, где субстрат представляет собой силикагель;

2.23 Способ I или любой из способов 2.1-2.16, где субстрат представляет собой силикаты (например, алюминосиликаты, такие как ZEOLEX® 301, или глины);

2.24 Способ I или любой из способов 2.1-2.23, где размер частиц (d50) субстрата составляет приблизительно 5-200 мкм, предпочтительно приблизительно 8-160 мкм, более предпочтительно приблизительно 9-150 мкм, еще более предпочтительно приблизительно 50-150 мкм, более предпочтительно приблизительно 50-130 мкм, наиболее предпочтительно выбран из группы, состоящей из значений приблизительно 50 мкм, приблизительно 85 мкм и приблизительно 120 мкм;

2.25 Способ I или любой из способов 2.1-2.24, где площадь поверхности BET субстрата составляет приблизительно 2-400 м²/г, предпочтительно приблизительно 5-400 м²/г, более предпочтительно приблизительно 10-400 м²/г, еще более предпочтительно приблизительно 30-400 м²/г, более предпочтительно приблизительно 30-300 м²/г, еще более предпочтительно приблизительно 40-200 м²/г, наиболее предпочтительно приблизительно 180 м²/г;

2.26 Способ I или любой из способов 2.1-2.25, где площадь поверхности субстрата BET составляет приблизительно 2 м²/г, предпочтительно приблизительно 5 м²/г;

2.27 Способ I или любой из способов 2.1-2.25, где площадь поверхности субстрата BET составляет приблизительно 180 м²/г;

2.28 Способ I или любой из способов 2.1-2.25, где объем пор субстрата составляет приблизительно 0,01-1,20 см³/г, предпочтительно приблизительно 0,5-1,20 см³/г, более предпочтительно приблизительно 0,10-1,0 см³/г, еще более предпочтительно 0,20-0,95 см³/г;

2.29 Способ I или любой из способов 2.1-2.28, где указанная композиция включает осажденный кремнезем, площадь поверхности BET которого составляет приблизительно 50-200 м²/г, предпочтительно приблизительно 180 м²/г, а общее содержание влаги указанной композиции составляет от приблизительно 5 мас. % до приблизительно 8 мас. %;

2.30 Способ I или любой из способов 2.1-2.29, где указанная композиция включает осажденный кремнезем, площадь поверхности BET которого составляет приблизительно 50-200 м²/г, предпочтительно приблизительно 180 м²/г, размер частиц составляет приблизительно 5-200 мкм, предпочтительно приблизительно 120 мкм, а общее содержание влаги указанной композиции составляет от приблизительно 5 мас. % до приблизительно 8 мас. %;

2.31 Способ I или любой из способов 2.1-2.30, где стадия (1) включает нанесение от приблизительно 4 до приблизительно 40 мас. %, предпочтительно от приблизительно 4 до приблизительно 20 мас. % в расчете на общую массу композиции;

2.32 Способ I или любой из способов 2.1-2.31, где стадия (1) дополнительно включает добавление полимера, выбранного из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди и других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровая камедь (например, гидроксипропилгуаровая камедь) и полиэтиленгликоля;

2.33 Способ I или любой из способов 2.1-2.32, где стадия (1) дополнительно включает второй субстрат в качестве внешнего слоя;

2.34 Способ 2.33, где второй субстрат выбран из осажденного кремнезема, такого как, например, кремнезем SIPERNAT® 50 S, или прокаленного кремнезема, такого как кремнезем AEROSIL® 200, AEROSIL® R 972 или AEROSIL® R 812S;

2.35 Способ I или любой из способов 2.1-2.34, где микроорганизмы выбран из группы, состоящей из Bacillus subtilis QST713, Pasteuria usgae; Beauveria bassiana, Coniothyrium minitans, Chondrostereum purpureum, Paecilomyces lilacinus, Aschersonia aleyrodis, Beauveria brongniartii, Hirsutella thompsonii, Isaria fumosorosea, Isaria sp., Lecanicillium longisporum, Lecanicillium muscarium, Lecanicillium sp., Metarhizium anisopliae, Metarhizium anisopliae var. acridum, Nomuraea rileyi Sporothrix insectorum; Cydia pomonella GV; Phytophthora palmivora, Lagenidium giganteum, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas fluorescens, Bradyrhizobium, Mycorrhiza, Clonostachys rosea, Bacillus spp.и Lactobacillus spp., или любых их комбинаций;

2.36 Способ I или любой из способов 2.1-2.34, где микроорганизмы выбраны из группы, состоящей из Bacillus thuringiensis, Pseudomonas fluorescens, Bradyrhizobium, Mycorrhiza, Clonostachys rosea;

2.37 Способ I или любой из способов 2.1-2.34, где микроорганизмы представляют собой Clonostachys rosea;

2.38 Способ I или любой из способов 2.1-2.34, где для полученной композиции не требуется внешний защитный агент, такой как инкапсулирование альгинатом;

2.39 Способ I или любой из способов 2.1-2.38, где число колониеобразующих единиц на грамм композиции (КОЕ/г) остается на уровне приблизительно более 10⁷ КОЕ/г после хранения при комнатной температуре в течение 120 дней;

2.40 Способ I или любой из способов 2.1-2.39, где число колониеобразующих единиц на грамм композиции (КОЕ/г) остается на уровне приблизительно более 10⁷ КОЕ/г после хранения при 40°С в течение 40 дней;

2.41 Способ I или любой из способов 2.1-2.40, где число колониеобразующих единиц на грамм композиции (КОЕ/г) остается на уровне приблизительно более 10⁷ CFU/г после хранения при относительной влажности 65% или в течение менее 40 дней;

2.42 Способ I или любой из способов 2.1-2.41, где насыпная плотность композиции составляет более 150% в расчете на насыпную плотность материала чистого субстрата;

2.43 Способ I или любой из способов 2.1-2.31 или 2.33-2.37 или 2.39-2.42, где композиция дополнительно включает (i) полимер, выбранный из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди, или других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровой камеди (например, гидроксипропилгуаровой камеди), полиэтиленгликоля и полиглицерина, или (ii) невосстанавливающиеся дисахариды, такие как трегалоза или сахароза или (iii) обезжиренное молоко или диметилсульфоксид;

2.44 Способ I или любой из способов 2.1-2.31 или 2.33-2.37 или 2.39-2.42, где композиция дополнительно включает невосстанавливающиеся дисахариды, такие как трегалоза или сахароза;

2.45 Способ I или любой из способов 2.1-2.31 или 2.33-2.37 или 2.39-2.42, где композиция дополнительно включает полимер, такой как полиглицерин, предпочтительно сверхразветвленный полимер полиглицерина;

2.46 Способ I или любой из способов 2.1-2.33 или 2.35-2.45, где указанный второй субстрат представляет собой тонкодисперсные гидрофобные или гидрофильные частицы, где поверхность указанных частиц обрабатывают, например, силанами или силиконовым маслом для модификации смачиваемости или тенденции образцов к абсорбции воды;

2.47 Способ I или любой из способов 2.1-2.33 или 2.35-2.45, где указанный второй субстрат представляет собой кремнезем или глину, где поверхность такого кремнезема или глины обработана, например, силанами или силиконовым маслом для модификации смачиваемости или тенденции образцов к абсорбции воды;

2.48 Способ I или любой из способов 2.1-2.33 или 2.35-2.45, где указанный второй субстрат характеризуется высокой площадью поверхности BET, например, от 50 до 750 м²/г, предпочтительно 50-380 м²/г;

2.49 Способ I или любой из способов 2.1-2.33 или 2.35-2.48, где второй субстрат представляет собой гидрофобный кремнезем;

2.50 Способ I или любой из способов 2.1-2.33 или 2.35-2.49, где второй субстрат представляет собой осажденный кремнезем;

2.51 Способ I или любой из способов 2.1-2.33 или 2.35-2.50, где второй субстрат представляет собой осажденный кремнезем с высокой площадью поверхности BET, например, от 50 до 750 м²/г, предпочтительно 50-380 м²/г;

2.52 Способ I или любой из способов 2.1-2.33 или 2.35-2.50, где второй субстрат представляет собой кремнезем SIPERNAT® 50 или ZEOFREE®, предпочтительно кремнезем SIPERNAT® 50;

2.53 Способ I или любой из способов 2.1-2.33 или 2.35-2.45-2.45, где второй субстрат представляет собой гидрофобный тонкодисперсный кремнезем, площадь поверхности BET которого составляет от 180 до 220 м²/г и с содержанием углерода от 3,5 до 5%, такой как кремнезем AROSIL® R202;

2.54 Способ I или любой из способов 2.1-2.33 или 2.35-2.45, где второй субстрат представляет собой кремнезем Aerosil® R202;

2.55 Способ I или любой из способов 2.1-2.18, 2.24, 2.28, 2.31-2.54, где площадь поверхности BET первого субстрата составляет 400-600 м²/г, предпочтительно 500 м²/г;

2.56 Способ 2.55, где объем пор указанного субстрата составляет более 1 см³/г, предпочтительно 1,4 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенда, или более 2 см³/г, предпочтительно 2,2 по данным ртутной порометрии;

2.57 Способ I или любой из способов 2.33-2.56, где второй субстрат добавляют в суспензию микроорганизмов перед указанной стадией высушивания (2);

2.58 Способ I или любой из способов 2.33-2.56, где второй субстрат добавляют в суспензию микроорганизмов во время указанной стадии высушивания (2);

2.59 Способ I или любой из способов 2.33-2.56, где второй субстрат добавляют в суспензию микроорганизмов после указанной стадии высушивания (2);

2.60 Способ I или любой из способов 2.32-2.59, где полимер или полисахарид или невосстанавливающийся полисахарид добавляют в суспензию микроорганизмов перед указанной стадией высушивания (2);

2.61 Способ I или любой из способов 2.32-2.59, где полимер или полисахарид или невосстанавливающийся полисахарид добавляют в суспензию микроорганизмов во время указанной стадии высушивания (2);

2.62 Способ I или любой из способов 2.32-2.59, где полимер или полисахарид или невосстанавливающийся полисахарид добавляют в суспензию микроорганизмов после указанной стадии высушивания (2);

2.63 Способ I или любой из предыдущих способов, где микроорганизмы собирают с поверхности семени путем механического растирания или полирования поверхности семени (стадия (а)) с получением тонкодисперсной фракции, включающей микроорганизмы, предпочтительно содержащей споры грибов, и некоторые части семени. Предпочтительно, выход микроорганизмов в тонкодисперсной фракции составляет более 10⁹ КОЕ/г исходно растертого или полированного семени. Более предпочтительно способ включает просеивание (стадия (б)) полученной тонкодисперсной фракции с получением порошка с требуемым распределением частиц по размеру для последующих стадий процесса. Предпочтительно порошок используют для получения смеси, раствора или суспензии микроорганизмов (стадия в);

2.64 Способ 2.63, где стадия (а) включает растирание с использованием шлифовального камня для отделения семени от тонкодисперсной фракции;

2.65 Способ 2.63, где стадия (а) включает растирание с использованием вращающегося вала внутри защитной трубы щелевидного сита в условиях под давлением с последующими просеиванием и фильтрованием для отделения семени от тонкодисперсной фракции;

2.66 Способ 2.63, где просеивание тонкодисперсной фракции на стадии (б) включает просеивание через сито с отверстиями размером от 20 до 800 мкм, предпочтительно от 100 мкм до 300 мкм;

2.67 Способ I или любой из способов 2.1-2.63, где микроорганизмы собирают с поверхности семени путем промывки их водой и отделения семени и жидкого раствора или суспензии микроорганизмов. Предпочтительно, семена перемешивают в воде в течение от 1 до 20 мин. Более предпочтительно отделение твердого вещества от жидкости проводят в нутч-фильтре под давлением, более предпочтительно размер отверстий нутч-фильтра под давлением составляет от 1 до 3 мм. Еще более предпочтительно время обезвоживания в нутч-фильтре под давлением составляет 20-200 с. Предпочтительно фильтрационное давление в нутч-фильтре составляет от 1 до 3 бар. Еще более предпочтительно раствор или суспензию микроорганизмов концентрируют путем отделения микроорганизмов от жидкости в поле центробежных сил. Предпочтительно стадия концентрирования включает разделение в тарельчатом сепараторе. Еще более предпочтительно стадию концентрирования повторяют с разбавлением концентрата водой и последующем втором концентрировании в поле центробежных сил для отделения растворимых частей от микроорганизмов;

2.68 Способ I или любой из предыдущих способов, где стадия высушивания (2) включает высушивание смесей субстрат-микроорганизм в псевдоожижженном слое;

2.69 Способ I или любой из предыдущих способов, где стадия высушивания (2) включает высушивание с распылением смесей субстрат-микроорганизм;

2.70 Способ I или любой из предыдущих способов, где стадия высушивания (2) включает контактное высушивание смесей субстрат-микроорганизм;

2.71 Способ I или любой из предыдущих способов, где стадия высушивания (2) включает высушивание замораживанием смесей субстрат-микроорганизм;

2.72 Способ I или любой из предыдущих способов, где температура воздуха для высушивания составляет приблизительно 130°С или менее, предпочтительно приблизительно 90°С или менее, более предпочтительно приблизительно 80°С или менее, еще более предпочтительно 50°С или менее, еще более предпочтительно приблизительно 30°-50°С, более предпочтительно приблизительно 40°-50°С, еще более предпочтительно приблизительно 40°-45°С, наиболее предпочтительно приблизительно 43°С;

2.73 Способ I или любой из предыдущих способов, где псевдоожижженный слой поддерживают при температуре приблизительно 35°С или менее, предпочтительно от приблизительно 25°С до приблизительно 35°С;

2.74 Способ I или любой из предыдущих способов, где величина активности воды (Aw) полученной композиции составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,6, предпочтительно от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,6, более предпочтительно от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,5;

2.75 Способ I или любой из предыдущих способов, где число колониеобразующих единиц микроорганизмов на грамм полученной композиции (КОЕ/г), составляет, например, более 10⁷ КОЕ/г, предпочтительно приблизительно 10⁸ колониеобразующих единиц на грамм (КОЕ/г) или более, более предпочтительно приблизительно 10⁹ КОЕ/г или более, еще более предпочтительно приблизительно 10¹⁰ КОЕ/г или более, более предпочтительно приблизительно 10¹¹ КОЕ/г или более, наиболее предпочтительно приблизительно 10¹² КОЕ/г или более;

2.76 Способ I или любой из предыдущих способов, где температура воздуха для высушивания составляет приблизительно 130°С или менее, предпочтительно приблизительно 90°С или менее, более предпочтительно приблизительно 80°С или менее, еще более предпочтительно приблизительно 30°-50°С или менее, более предпочтительно приблизительно 40°-50°С, еще более предпочтительно приблизительно 40°-45°С, наиболее предпочтительно приблизительно 43°С;

2.77 Способ I или любой из предыдущих способов, где псевдоожижженный слой поддерживают при температуре приблизительно 35°С или менее, предпочтительно от приблизительно 25°С до приблизительно 35°С;

2.78 Способ I или любой из предыдущих способов, где величина активности воды (Aw) полученной композиции составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,6, предпочтительно от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,6, более предпочтительно от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,5;

2.79 Способ I или любой из предыдущих способов, где число колониеобразующих единиц микроорганизмов на грамм полученной композиции (КОЕ/г), составляет, например, более приблизительно 10⁷ КОЕ/г, предпочтительно приблизительно 10⁸ колониеобразующих единиц на грамм (КОЕ/г) или более, более предпочтительно приблизительно 10⁹ КОЕ/г или более, еще более предпочтительно приблизительно 10¹⁰ КОЕ/г или более, более предпочтительно приблизительно 10¹¹ КОЕ/г или более, наиболее предпочтительно приблизительно 10¹² КОЕ/г или более.

В третьем объекте настоящего изобретения предлагается высушенная биологическая композиция (композиция II'), полученная способом I или любым из способов 2.1-2.79 по настоящему изобретению. В другом варианте третьего объекта в настоящем изобретении предлагается высушенная биологическая композиция (композиция II-А), полученная способом I или любым из способов 2.1-2.42 настоящего изобретения. В еще одном варианте третьего объекта в настоящем изобретении предлагается высушенная биологическая композиция (композиция II-В), полученная способом I или любым из способов 2.43-2.79 настоящего изобретения.

Композиции по настоящему изобретению являются также пригодными для защиты семян от вредных насекомых или для обеспечения микроорганизмов биостимулирующей функцией, такой как высвобождение фосфора или доставка азота. Следовательно, в четвертом объекте настоящего изобретения предлагается композиция I или любая из композиций 1.1-1.50 или композиция II' или полученная согласно 2.1-2.79, дополнительно включающая, а в предпочтительном варианте, по существу состоящая из семени, предназначенном для обработки (композиция III'). В другом варианте четвертого объекта настоящего изобретения предлагается композиция I или любая из композиций 1.1-1.33 или композиция II-А, дополнительно включающая, а в предпочтительном варианте, по существу состоящая из семени, предназначенного для обработки (композиция III-А). В еще одном варианте четвертого объекта настоящего изобретения предлагается композиция I или любая из композиций 1.34-1.50 или композиция II-В, дополнительно включающая, а в предпочтительном варианте, по существу состоящая из семени, предназначенном для обработки (композиция III-В). Такие композиции необязательно могут включать краситель.

В пятом объекте настоящего изобретения предлагается способ борьбы с насекомыми, грибами или нематодами на поверхности, предназначенной для обработки, включающий необязательное разбавление концентрированной высушенной биологической композиции по настоящему изобретению (т.е. любой композиции I или любой из композиций 1.1-1.50, или композиции II' или полученной согласно 2.1-2.79 или композиции III') и нанесение эффективного количества (необязательно разбавленной) концентрированной высушенной биологической композиции по настоящему изобретению на обрабатываемую область. В другом варианте пятого объекта настоящего изобретения предлагается способ борьбы с насекомыми, грибами или нематодами на обрабатываемой поверхности, включающий необязательное разбавление концентрированной высушенной биологической композиции по настоящему изобретению (т.е. любой композиции I или любой из композиций 1.1-1.33, или композиции II-А или композиции III-А) и нанесение эффективного количества (необязательно разбавленной) концентрированной высушенной биологической композиции по настоящему изобретению на обрабатываемую область. В еще одном варианте пятого объекта настоящего изобретения предлагается способ борьбы с насекомыми, грибами или нематодами на обрабатываемой поверхности, включающий необязательное разбавление концентрированной высушенной биологической композиции по настоящему изобретению (т.е. любой композиции I или любой из композиций 1.34-1.50, или композиции II-В или полученной согласно 2.43-2.79 или композиции III-В) и нанесение эффективного количества (необязательно разбавленной) концентрированной высушенной биологической композиции по настоящему изобретению на обрабатываемую область. В одном варианте обрабатываемая область представляет собой часть растения, включая без ограничения перечисленным, черенки, корни, луковицы, клубни, стволы, плоды, цветы и/или листья растений, например, кукурузы, пшеницы, сорго, сои, цитрусовых и нецитрусовых плодов, ореховых деревьев и им подобным. В другом варианте обрабатываемая область представляет собой почву или семена или их смеси.

Краткое описание фигур

На Фиг. 1 представлен график зависимости логарифма КОЕ от времени для примеров 12-23 при хранении при 40°С. Образцы промаркированы добавками.

На Фиг. 2 представлено время десятикратного уменьшения в неделях для примеров 12-23 при хранении при 40°С. Планки ошибки представляют собой стандартную ошибку коэффициента регрессии.

На Фиг. 3 представлено уменьшение логарифма (КОЕ) со временем для примеров 12-23 при хранении при повышенной влажности.

На Фиг. 4 представлено время десятикратного уменьшения для каждого образца при хранении при повышенной влажности. Планки ошибки представляют собой стандартную ошибку коэффициента регрессии.

Подробное описание вариантов осуществления настоящего изобретения

В настоящем изобретении предлагается система для доставки микроорганизмов (например, микробиологических пестицидов, таких как споры плесени и другие бактерии) в высушенной и стабильной форме и с высоким содержанием КОЕ по сравнению с известными в данной области техники. Было установлено, что микроорганизмы можно высушить на определенных субстратах, например, с использованием методов, описанных здесь, до требуемой общей концентрации воды от приблизительно 0,01 мас. % до приблизительно 15 мас. %, для создания поверхности, пригодной для поддержания биологического материала в состоянии покоя. Типичный субстрат, пригодный для настоящего изобретения, включает, но не ограничивается только им, кремнезем, в предпочтительном варианте осажденный кремнезем, в более предпочтительном варианте гидрофильный кремнезем, и в особом варианте кремнезем SIPERNAT® 22. Другие типичные субстраты включают также диатомовую землю, силикагель, силикаты (например, алюминосиликаты, такие как ZEOLEX® 301, или глину) и водонерастворимый природный волокнистый материал, такой как целлюлоза. В еще одном варианте субстрат представляет собой кремнезем, площадь поверхности BET которого составляет 400-600 м²/г, предпочтительно 500 м²/г. В другом варианте объем пор указанного кремнезема составляет более 1 см³/г, предпочтительно 1,4 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенда, или более 2 см³/г, предпочтительно 2,2 по данным ртутной порометрии, предпочтительно кремнезем SIPERNAT® 50.

Типичный размер частиц субстрата композиций по настоящему изобретению d50 составляет приблизительно 5-200 мкм, предпочтительно приблизительно 8-160 мкм, предпочтительно приблизительно 9-150 мкм, более предпочтительно приблизительно 50-150 мкм, еще более предпочтительно приблизительно 50-130 мкм, наиболее предпочтительно выбран из группы, состоящей из значений приблизительно 50 мкм, приблизительно 85 мкм и приблизительно 120 мкм. Размер частиц кремнезема можно измерить любым известным методом, например, таким как анализ размера сухих частиц с использованием лазерного светорассеяния или сканирующей электронной микроскопии (SEM).

Типичная площадь поверхности BET субстратов композиции по настоящему изобретению составляет приблизительно 2-400 м²/г, предпочтительно приблизительно 5-400 м²/г, предпочтительно приблизительно 10-400 м²/г, более предпочтительно приблизительно 30-400 м²/г, более предпочтительно приблизительно 30-300 м²/г, еще более предпочтительно приблизительно 40-200 м²/г, наиболее предпочтительно приблизительно 180 м²/г. Площадь поверхности BET субстрата на основе кремнезема составляет приблизительно 10-400 м²/г, предпочтительно приблизительно 30-400 м²/г, предпочтительно приблизительно 30-300 м²/г, более предпочтительно приблизительно 40-200 м²/г, еще более предпочтительно приблизительно 180 м²/г. Природный волокнистый субстрат может характеризоваться меньшей площадью поверхности BET, такой как приблизительно 2 м²/г, предпочтительно приблизительно 5 м²/г. В другом варианте площадь поверхности BET субстратов композиций и способов по настоящему изобретению составляет более 350 м²/г, предпочтительно приблизительно 500 м²/г. Предпочтительно кремнезем с площадью поверхности BET от средней (от 150 до 350 м²/г) до высокой (350 м²/г или более) является пригодным для композиций и способов по настоящему изобретению. Предполагается, что такой кремнезем характеризуется лучшим контролем активности воды и лучшим сохранением КОЕ. Следовательно, в еще одном варианте субстрат представляет собой кремнезем, площадь поверхности BET которого составляет 400-600 м²/г, предпочтительно 500 м²/г. Если композиции или способы по настоящему изобретению включают субстрат с высокой площадью поверхности по BET, такой как кремнезем SIPERNAT® 50 S, то указанные композиции и способы дополнительно включают (i) полимер, выбранный из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди и других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровой камеди (например, гидроксипропилгуаровой камеди), полиэтиленгликоля и полиглицерина, или (ii) невосстанавливающиеся дисахариды, такие как трегалоза или сахароза, или (iii) обезжиренное молоко или диметилсульфоксид. Кремнеземы с низкой площадью поверхности BET (например, от 50 до 150 м²/г) также являются пригодными для композиций по настоящему изобретению.

Типичный объем пор субстратов композиций по настоящему изобретению составляет приблизительно 0,01-1,20 см³/г, предпочтительно приблизительно 0,05-1,20 см³/г, более предпочтительно приблизительно 0,10-1,0 см³/г, еще более предпочтительно приблизительно 0,20-0,95 см³/г. Субстраты, такие как кремнезем, с объемом пор приблизительно 0,05-1,20 см³/г, предпочтительно приблизительно 0,10-1,0 см³/г, более предпочтительно приблизительно 0,20-0,95 см³/г, являются пригодными для применения по настоящему изобретению. Субстраты, такие как целлюлоза, с меньшим объемом пор, таким как 0,01-1,2 см³/г, являются пригодными для применения по настоящему изобретению. Величину таких объемов пор измеряют на основе модели Баррета-Джойнера-Халенды. В другом варианте субстратом по настоящему изобретению является кремнезем с объемом пор более 1 см³/г, предпочтительно 1,4 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенды, или более 2 см³/г, предпочтительно 2,2 по данным ртутной порометрии.

Субстраты, описанные здесь, обеспечивают пригодную поверхность для наносимых микроорганизмов и их можно эффективно высушивать в сушильном шкафу с достижением требуемого общего содержания воды, как описано здесь, исключая длительное воздействия тепла, снижающее выживаемость организмов и жизнеспособность организмов после хранения. Предпочтительно микроорганизмы высушивают на поверхности указанного субстрата, например, с использованием способов, описанных здесь, до достижения требуемого общего содержания воды от приблизительно 0,01 мас. % до приблизительно 15 мас. %, предпочтительно от приблизительно 0,01 мас. % до приблизительно 8 мас. %, более предпочтительно от приблизительно 5 мас. % до приблизительно 8 мас. %, наиболее предпочтительно выбранного из значений приблизительно 3 мас. %, приблизительно 5 мас. % и приблизительно 7 мас. %. Уровень содержания влаги определяет количество жидкости, присутствующей в определенном продукте, и может быть измерен способами, известными в данной области техники, например, с помощью измерения потерь количества воды (мас. %) на грамм продукта, при приблизительно 100°С в течение периода времени до постоянной массы (т.е. потери при высушивании).

Выбор субстрата по настоящему изобретению вместе с требуемым уровнем содержания влаги, описанным здесь, создает оптимальные условия: требуемый уровень активности воды (A_w) от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,6, предпочтительно от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,6, более предпочтительно от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,5, от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,5, при этом предполагается, что микроорганизмы находятся в состоянии покоя, но являются все еще живыми, таким образом, обеспечивая сухую и стабильную систему для доставки таких микроорганизмов, не снижая их жизнеспособность. Активность воды означает отношение парциального давления паров воды в продукте к парциальному давлению паров чистой воды в стандартном состоянии. Активность воды (A_w) определяет равновесное количество воды, доступное для гидратации частиц материала (т.е. доступность воды). Некоторые вещества с одинаковым содержанием влаги могут характеризоваться различным уровнем активности воды. Уровень активности воды (A_w) можно измерять с использованием способов, известных в данной области техники, таких как с использованием резистивных электролитических гигрометров (REH), емкостных гигрометров и гигрометров температуры конденсации.

В настоящем изобретении предлагается концентрирование микроорганизмов на субстрате при высоком уровне числа колониеобразующих единиц (КОЕ), в предпочтительном варианте микроорганизмы концентрируются на субстрате (предпочтительно кремнеземе) в форме корки. Следовательно, композиции по настоящему изобретению содержат более приблизительно 10⁷ КОЕ/г, предпочтительно приблизительно 10⁸ колониеобразующих единиц на грамм (КОЕ/г) или более, более предпочтительно приблизительно 10⁹ КОЕ/г или более, еще более предпочтительно приблизительно 10¹⁰ КОЕ/г или более, более предпочтительно приблизительно 10¹¹ КОЕ/г или более, наиболее предпочтительно приблизительно 10¹² КОЕ/г или более. Композиции по настоящему изобретению являются предпочтительно стабильными, и в одном варианте число колониеобразующих единиц на грамм композиции (КОЕ/г) остается на уровне приблизительно более 10⁷ КОЕ/г после хранения при комнатной температуре в течение 120 дней, а в другом варианте остается приблизительно более 10⁷ КОЕ/г после хранения при 40°С в течение 40 дней, в еще одном варианте остается на уровне приблизительно более 10⁷ КОЕ/г после хранения при относительной влажности 65% или менее в течение 40 дней. В предпочтительном варианте композиции по настоящему изобретению характеризуются снижением КОЕ менее 5 log, предпочтительно менее 3 log, более предпочтительно менее 2 log, наиболее предпочтительно менее 1 log в течение 10 недель при температуре окружающей среды, например, при 25°С. В другом предпочтительном варианте композиции по настоящему изобретению характеризуются снижением КОЕ менее 5 log, предпочтительно менее 3 log, более предпочтительно менее 2 log, наиболее предпочтительно менее 1 log в течение 10 недель при температуре окружающей среды (например, при 25°С) и повышенной влажности, например, при относительной влажности 70%.

Микроорганизмы, пригодные для настоящего изобретения, включают природные или рекомбинантные микроорганизмы, которые действуют как хищники и вмешиваются в жизненный цикл других нежелательных микроорганизмов, или обеспечивают положительный эффект на обрабатываемую область, или могут продуцировать биологически активное вещество, которое действует как пестицид. Примеры микроорганизмов, пригодных для настоящего изобретения, включают микроорганизмы, которые можно использовать в сельском хозяйстве, включающие, но не ограничиваются только ими, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas fluorescens, Bradyrhizobium, Mycorrhiza, Clonostachys rosea и т.п., или любые их комбинации. Другие микроорганизмы, пригодные для настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются только ими, бактерии, такие как Bacillus subtilis QST713 и Pasteuria usage, грибы, такие как Beauveria bassiana, Coniothyrium minitans, Chondrostereum purpureum, Paecilomyces lilacinus, Aschersonia aleyrodis, Beauveria brongniartii, Hirsutella thompsonii, Isaria fumosorosea, Isaria sp., Lecanicillium longisporum, Lecanicillium muscarium, Lecanicillium sp., Metarhizium anisopliae, Metarhizium anisopliae var. acridum, Nomuraea rileyi и Sporothrix insectorum, вирусы, такие как Cydia pomonella GV, и оомицеты, такие как Phytophthora palmivora, Lagenidium giganteum, Bacillus spp. и Lactobacillus spp., или любые их комбинации. Другие примеры грибов и подсемейств, пригодных для настоящего изобретения, описаны в статье Faria et al, Biological Control, 43, 237-256 (2007), содержание которой в полном объеме включено в настоящее описание в качестве ссылки. Данный список не является избыточным и может включать другие микроорганизмы, которые можно использовать в сельском хозяйстве и в других областях, таких как пищевая промышленность, медицина и фармацевтика, чистящие средства и энергетика.

Для смеси субстрат-микроорганизм по настоящему изобретению не требуется никаких экзогенных защитных агентов, таких как инкапсулирование альгинатом, но ее можно необязательно обрабатывать полимерами или другими материалами, такими как высокодисперсный кремнезем (например, Aerosil®) или комбинацией полимеров с тонкодисперсным кремнеземом для обеспечения дополнительной защиты от влаги и изоляции от высокой температуры при хранении. Следовательно, в одном варианте композиция дополнительно включает (i) полимер, выбранный из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди, или других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровой камеди (например, гидроксипропилгуаровой камеди), полиэтиленгликоля или полиглицерина, или (ii)

невосстанавливающиеся дисахариды, такие как трегалоза или сахароза, или (iii) обезжиренное молоко или диметилсульфоксид. В другом варианте композиции по настоящему изобретению дополнительно включают полимер, выбранный из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди, или других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровой камеди (например, гидроксипропилгуаровой камеди) и полиэтиленгликоля. В еще одном варианте полимер представляет собой полиглицерин, например, сверхразветвленный полимер полиглицерина. В еще одном варианте композиции по настоящему изобретению дополнительно включают невосстанавливающиеся дисахариды, такие как трегалоза или сахароза. В еще одном варианте композиция дополнительно включает комбинацию полимеров и второго субстрата, как описано ниже. Количество указанных полимеров может составлять приблизительно 0,1-3 мас. %, в предпочтительном варианте приблизительно 0,1-1 мас. %, в более предпочтительном варианте приблизительно 1-1,5 мас. % в расчете на суспензию микроорганизмов. Следует отметить, что полимер или полисахарид или невосстанавливающийся дисахарид, как описано здесь, можно добавлять до, во время или после стадии высушивания (2).

Смесь субстрат-микроорганизм по настоящему изобретению можно также обрабатывать вторым субстратом, таким как неорганический материал для обеспечения дополнительной защиты от влажности при хранении. В одном варианте второй субстрат выбран из осажденного кремнезема, такого как кремнезем SIPERNAT® 50 S, например, в количестве менее 3% в качестве внешнего слоя. В другом варианте композиции по настоящему изобретению дополнительно включают добавление второго субстрата, такого как тонкодисперсный кремнезем AEROSIL® 200, AEROSIL® R 972 или AEROSIL® R 812S, например, в количестве менее 2% в качестве внешнего слоя. В еще одном варианте второй субстрат представляет собой гидрофобный тонкодисперсный кремнезем с площадью поверхности BET от 180 до 220 м²/г и содержанием углерода от 3,5 до 5%, такой как кремнезем AROSIL® R202. Количество указанного второго субстрата может составлять приблизительно 0,1-3 мас. %, в предпочтительном варианте приблизительно 0,1-1 мас. %, в предпочтительном варианте приблизительно 0,1 мас. % в расчете на массу всей композиции. В предпочтительном варианте композиции по настоящему изобретению включают микроорганизм и субстрат, такой как кремнезем с площадью поверхности BET 350 или более, например, площадью поверхности BET равной 400-600 м²/г, предпочтительно 500 м²/г, где на такой субстрат нанесено покрытие из одного или более следующих компонентов (i) полимер, выбранный из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди или других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровой камеди (например, гидроксипропилгуаровой камеди), полиэтиленгликоля и полиглицерина, или (ii) невосстанавливающиеся дисахариды, такие как трегалоза или сахароза, или (iii) обезжиренное молоко или диметилсульфоксид. В еще одном варианте композиции по настоящему изобретению включают один или более микроорганизмов и субстрат, где такой микроорганизм-субстрат дополнительно включает второй субстрат (как описано ниже, такой как гидрофобный тонкодисперсный кремнезем с площадью поверхности BET от 180 до 220 м²/г и содержанием углерода от 3,5 до 5%, такой как кремнезем AEROSIL® R202) и необязательно один или более следующих компонентов: (i) полимеры, выбранные из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди или других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровой камеди (например, гидроксипропилгуаровой камеди), полиэтиленгликоля и полиглицерина, или (ii) невосстанавливающиеся дисахариды, такие как трегалоза или сахароза, или (iii) обезжиренное молоко или диметилсульфоксид. В еще одном другом варианте композиции по настоящему изобретению включают микроорганизм, первый субстрат кремнезем, второй субстрат кремнезем и один или более полимеров из группы, состоящей из следующих компонентов: (i) полимеры, выбранные из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди, или других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровой камеди (например, гидроксипропилгуаровой камеди), полиэтиленгликоля и полиглицерина, или (ii) невосстанавливающиеся дисахариды, такие как трегалоза или сахароза, или (iii) обезжиренное молоко или диметилсульфоксид. В другом варианте композиции по настоящему изобретению включают микроорганизмы, субстрат гидрофильный кремнезем (например, гидрофильный осажденный кремнезем, такой как кремнезем SIPERNAT® 22), второй субстрат кремнезем (например, гидрофильный или гидрофобный тонкодисперсный кремнезем, такой как кремнезем AEROSIL® R202 или 200) и необязательно один или более следующих компонентов: (i) полимер, выбранный из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди, или других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровой камеди (например, гидроксипропилгуаровой камеди), полиэтиленгликоля и полиглицерина, или (ii) невосстанавливающиеся дисахариды, такие как трегалоза или сахароза, или (iii) обезжиренное молоко или диметилсульфоксид. В предпочтительном варианте второй субстрат добавляют после стадии высушивания (2).

Композиции по настоящему изобретению можно наносить напрямую на обрабатываемую область, такую как растения, семена или насекомые, или их можно перерабатывать в биологический состав, например, для нанесения на такие обрабатываемые области. Традиционно, представляет проблему стабильность водных составов, содержащих микробы или другие биологические активные материалы в течение срока хранения в виде суспендированных концентрированных составов. Композиции, описанные в настоящем изобретении, предназначены для снижения общих требований для создания составов. В настоящем изобретении описаны подходы к созданию биологической композиции, которая характеризуется как высоким уровнем активности (КОЕ), так и стабильностью (КОЕ практически не изменяется с течением времени). Более стабильные композиции снижают требования для получения используемого продукта, пригодного для применения в сельском хозяйстве. Преимущества композиций по настоящему изобретению позволяют получать их как в виде жидкого, так и сухого агрохимических составов. Примеры таких составов включают, но не ограничиваясь только ими, WP (смачиваемый порошок), WG (диспергируемые в воде гранулы), SC (концентрированная суспензия), OD (масляная дисперсия), FS (состав для обработки семян). Таким образом, в другом объекте настоящего изобретения предлагается биологический состав, включающий композицию по настоящему изобретению, например, композицию I или любую из композиций 1.1-1.33 или 1.34-1.50, и один или более эксципиентов. Поскольку микроорганизм по настоящему изобретению можно использовать в сельском хозяйстве, то предполагается использование агрохимически приемлемых эксципиентов или адьювантов, таких как смачивающие агенты. Кроме того, можно использовать комбинации с другими агрохимически активными ингредиентами.

Составы на основе воды для получения SC могут включать один или более диспергирующих агентов, полимеры, клейкие вещества, ПАВ, красители, и/или добавки, предохраняющие от замораживания. Выбор конкретных средств для составов хорошо известен специалистам в данной области техники.

Сухие составы включают порошки (DP), порошки для протравливания семян (DS), гранулы (GR), микрогранулы (MG), диспергируемые в воде гранулы (WG), смачиваемые порошки (WP) и могут включать один или более связующих агентов, диспергирующих и смачивающих агентов. Выбор конкретных средств для составов хорошо известен специалистам в данной области техники.

Композиции по настоящему изобретению можно использовать, в частности, в форме таблеток в составах типа ST (водорастворимые таблетки) и ТВ (таблетки). Следовательно, в предпочтительном варианте настоящего изобретения предлагается биологическая таблетка, включающая композицию по настоящему изобретению, например, композицию I или любую из композиций 1.1-1.33 или любую из композиций 1.34-1.50 и один или более эксципиентов. Эксципиент, пригодный для состава таблетки по настоящему изобретению может включать один или более смазывающих веществ, связующих агентов, дезинтегрирующих агентов и наполнителей. Пригодные смазывающие вещества включают, но не ограничиваются только ими, тальк, стеарат магния, стеарат кальция, стеариновую кислоту, борную кислоту, полиэтиленгликоль и стеарилфумарат натрия. Пригодные связующие агенты включают, но не ограничиваются только ими, микрокристаллическую целлюлозу, ацетат целлюлозы, карагинан, декстрин, глюкозу, этилцеллюлозу и поливинилпирролидон. Пригодный наполнитель включает, но не ограничивается только ими, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, натриевую соль крахмала, гликолят, амилозу, примогель, кросповидон и натриевую соль кроскармелозы. Пригодные дезинтегрирующие агенты включают, но не ограничиваются только ими, силикаты кальция. Типичные таблетки можно получить с использованием порошка микроорганизмов, содержащего от 2 до 30% и 10⁹ КОЕ на г организмов. Таблетки массой 2 г прессуют при 20 КН. Таблетки можно быстро дезинтегрировать с использованием 7,5% FM1000.

Состав масляной дисперсии по настоящему изобретению включает композицию по настоящему изобретению, например, композицию I или любую из композиций 1.1-1.33 или 1.34-1.50, диспергированную в неводной или нерастворимой в воде жидкостью, такой как минеральное, парафиновое или растительное масло, и может содержать один или более диспергирующих агентов, эмульгаторов, полимеров, клейких веществ, ПАВ. Выбор конкретных средств для составов хорошо известен специалистам в данной области техники.

Сельскохозяйственные масла, пригодные для состава по настоящему изобретению, включают парафиновые масла, такие как октан, нонан, декан, ундекан, додекан, тридекан, тетрадекан, пентадекан, гексадекан и их смеси или такое масло, смешанное с высококипящими гомологами, такими как гепта-, окта-, нонадекан, эйкозан, генэйкозан, докозан, трикозан, тетракозан, пентакозан, и их изомеры с разветвленными цепями, растительные масла, такие как оливковое масло, масло капока, касторовое масло, масло папай, масло камелии, пальмовое масло, кунжутное масло, кукурузное масло, масло из рисовых отрубей, арахисовое масло, хлопковое масло, соевое масло, рапсовое масло, льняное масло, тунговое масло, подсолнечное масло, сафлоровое масло или продукты их переэтерификации, такие как метиловый эфир рапсового масла или этиловый эфир рапсового масла, животный жир, такой как китовый жир, жир печени трески или норковый жир, другие масла такие как бутанол, н-октанол, изо-октанол, додеканол, циклопентанол, циклогексанол, циклооктанол, этиленгликоль, пропиленгликоль или бензиловый спирт, капроевая кислота, каприновая кислота, каприловая кислота, нонановая кислота, янтарная кислота, глутаровая кислота, бензойная кислота, фенилуксусная кислота, салициловая кислота и фталевая кислота, бензилацетат, этиловый эфир капроевой кислоты, этиловый эфир нонановой кислоты, метиловый или этиловый эфир бензойной кислоты, метиловый, пропиловый или бутиловый эфир салициловой кислоты, диэфиры фталевой кислоты насыщенного ряда, диметиловый эфир, дибутиловый эфир, диизооктиловый эфир фталевой кислоты и любые их комбинации.

В настоящем изобретении также предлагается композиция по настоящему изобретению для обработки или протравливания семян. Следовательно, в одном варианте предлагаются композиции по настоящему изобретению в форме сыпучего концентрата, например, для обработки семян (форма FS), которую можно получить смешением композиции I или любой из композиций 1.1-1.33 или любой из композиций 1.34-1.50 с одним или более диспергирующими агентами, пленкообразующими полимерами, клейкими веществами, ПАВ и красителями, и добавлением смеси к семени. Можно включать также ингредиенты для ускорения склеивания состава с семенем, укрепления покрытия и снижения пыльности. Выбор конкретных средств для составов хорошо известен специалистам в данной области техники.

В другом объекте настоящего изобретения предлагаются способы получения высушенных биологических композиций, включающий, а в предпочтительном варианте, по существу состоящий из следующих стадий: (1) объединение смеси, раствора или суспензии, содержащих микроорганизмы, с субстратом, и (2) высушивание смеси субстрат-микроорганизм с достижением содержания общей влаги от приблизительно 0,01 до приблизительно 15 мас. %, предпочтительно от приблизительно 3 мас. % до приблизительно 8 мас. %, более предпочтительно от приблизительно 5 мас. % до приблизительно 8 мас. %, наиболее предпочтительно выбранного из значений 3 мас. %, 5 мас. % и 7 мас. %. В еще одном варианте на стадии (2) способа по настоящему изобретению композицию высушивают до конечной величины активности воды (A_w) от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,6, предпочтительно от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,6, более предпочтительно от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,5.

Микроорганизмы, предназначенные для применения в композициях по настоящему изобретению, можно получать различными способами. В одном варианте микроорганизмы можно собирать с поверхности семени при промывке семени водой, например, в соотношении вода/семя 1:1. В другом варианте микроорганизмы можно собирать с поверхности семени при механическом растирании или полировании поверхности семени (стадия (а)), приводящем к получению тонкодисперсной фракции, содержащей микроорганизмы), в предпочтительном варианте содержащей споры грибов, и некоторые части семени. В предпочтительном варианте выход микроорганизмов в тонкодисперсной фракции составляет более 10⁹ КОЕ/грамм исходного измельченного или полированного семени. В предпочтительном варианте способ включает просеивание (стадия (б)) конечной тонкодисперсной фракции для получения порошка с требуемым распределением частиц по размеру для последующих стадий способа. В предпочтительном варианте порошок используют для получения смеси микроорганизма, раствора или суспензии (стадия в). В предпочтительном варианте стадия (а) включает измельчение с использованием шлифовального камня для отделения семени от мелкодисперсной фракции. В другом предпочтительном варианте стадия (а) включает полирование с использованием вращающегося вала внутри защитной трубы щелевидного сита под давлением с последующим просеиванием и фильтрованием для отделения семян от тонкодисперсной фракции. Просеивание тонкодисперсной фракции на стадии (б) может включать просеивание через сито с размером отверстий от 20 до 800 мкм, предпочтительно от 100 мкм до 300 мкм.

В другом варианте микроорганизмы можно собирать с поверхности семени путем промывки их водой и отделении семени и жидкого раствора или суспензии микроорганизмов. В предпочтительном варианте семена перемешивают в воде в течение от 1 до 20 мин. Более предпочтительно разделение смеси твердое вещество-жидкость проводят в нутч-фильтре под давлением, еще более предпочтительно размер отверстий нутч-фильтра под давлением составляет от 1 до 3 мм. Еще более предпочтительно время обезвоживания в нутч-фильтре под давлением составляет 20-200 с. Еще более предпочтительно фильтрационное давление в нутч-фильтре составляет от 1 до 3 бар. Еще более предпочтительно раствор или суспензию микроорганизмов концентрируют при отделении микроорганизмов от жидкости в поле центробежных сил. Еще более предпочтительно стадия концентрирования включает разделение в тарельчатом сепараторе. Еще более предпочтительно стадию концентрирования повторяют с разбавлением концентрата водой и последующем втором концентрировании в поле центробежных сил для отделения растворимых частей от микроорганизмов.

Субстрат, используемый на стадии (1) способа по настоящему изобретению, можно выбрать из группы, состоящей из кремнезема (например, осажденного кремнезема, в предпочтительном варианте гидрофильного кремнезема, например, кремнезема SIPERNAT® 22), диатомовой земли, силикагеля, силикатов (например, алюминосиликатов, таких как ZEOLEX® 301, или клеев) и водонерастворимого природного волокнистого материала, такого как целлюлоза. В одном варианте субстрат на стадии (1) способа по настоящему изобретению представляет собой кремнезем, в другом варианте осажденный кремнезем, где например размер частиц (d50) субстрата составляет приблизительно 5-200 мкм, предпочтительно приблизительно 8-160 мкм, более предпочтительно приблизительно 9-150 мкм, еще более предпочтительно приблизительно 50-150 мкм, более предпочтительно приблизительно 50-130 мкм, наиболее предпочтительно выбран из группы, состоящей из значений приблизительно 50 мкм, приблизительно 85 мкм и приблизительно 120 мкм. В одном варианте субстрат на стадии (1) способа по настоящему изобретению представляет собой осажденный гидрофильный кремнезем. В другом варианте (i) площадь поверхности BET указанного кремнезема на стадии (1) способа по настоящему изобретению составляет приблизительно 2-600 м²/г, в другом варианте 500 м²/г, в еще одном варианте 2-400 м²/г, предпочтительно приблизительно 5-400 м²/г, более предпочтительно приблизительно 10-400 м²/г, еще более предпочтительно приблизительно 30-400 м²/г, более предпочтительно приблизительно 30-300 м²/г, еще более предпочтительно приблизительно 40-200 м²/г, наиболее предпочтительно приблизительно 180 м²/г, и/или (ii) объем пор составляет приблизительно 0,01-1,20 см³/г, предпочтительно приблизительно 0,05-1,20 см³/г, более предпочтительно приблизительно 0,10-1,00 см³/г, еще более предпочтительно приблизительно 0,20-0,95 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенды, и/или (iii) объем пор составляет более 1 см³/г, предпочтительно более 1,4 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенды, или более 2 см³/г, предпочтительно 2,2 по данным ртутной порометрии. В другом варианте субстрат на стадии (1) выбран из кремнезема SIPERNAT® 22 или SIPERNAT® 50 S.

Способ по настоящему изобретению, описанный здесь, может дополнительно включать добавление после стадии (1), но в одном варианте перед стадией (2), в другом варианте, во время стадии (2) и в еще одном варианте после стадии (2), (i) полимера, выбранного из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди, или других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровой камеди (например, гидроксипропилгуаровой камеди), полиэтиленгликоля и полиглицерина, или (ii) невосстанавливающихся дисахаридов, таких как трегалоза или сахароза, или (iii) обезжиренного молока или диметилсульфоксида, в предпочтительном варианте поливинилового спирта или полиглицерина (например, сверхразветвленного полимера полиглицерина), и/или (ii) второго субстрата в качестве внешнего слоя. В предпочтительном варианте второй субстрат выбран из осажденного кремнезема, такого как кремнезем SIPERNAT® 50 S, или тонкодисперсного кремнезема, такого как кремнезем AEROSIL® 200, AEROSIL® R 972, AEROSIL® R 812S или AEROSIL® 202, предпочтительно AEROSIL® 200 или R202, более предпочтительно кремнезем AEROSIL® R202. Полимер, описанный здесь, можно добавлять без второго субстрата. В другом варианте полимер, описанный здесь, можно добавлять в смеси со вторым субстратом и можно добавлять до или после второго субстрата. Полимер и/или второй субстрат можно добавлять перед стадией высушивания (2) или во время стадии высушивания (2) или после стадии высушивания (2).

Стадию высушивания (2) по способу по настоящему изобретению можно проводить путем высушивания в псевдоожижженном слое, высушивания при распылении или высушивания замораживанием. Высушивание в псевдоожижженном слое можно проводить при температуре воздуха во входном отверстии приблизительно 90°С или менее, предпочтительно приблизительно 80°С или менее, боле предпочтительно приблизительно 50°С или менее, еще более предпочтительно приблизительно 30°-50°С, более предпочтительно приблизительно 40°-50°С, еще более предпочтительно приблизительно 40°-45°С, наиболее предпочтительно приблизительно 43°С. В предпочтительном варианте стадию высушивания (2) способа по настоящему изобретению можно осуществить при предварительном нагревании распылительной сушки при очень низкой скорости вращения вентилятора при температуре воздуха во входном отверстии приблизительно 50°С, предпочтительно приблизительно 30°-50°С, более предпочтительно приблизительно 40°-50°С, еще более предпочтительно приблизительно 40°-45°С и распылении смеси микроорганизма в камере на субстрат. Предпочтительно скорость подачи субстрата в лабораторном масштабе составляет 1 мл/мин, предпочтительно 2 мл/мин. Необязательно стадия высушивания (2) также включает высушивание при пониженном давлении (например, при 0,1 бар).

Высушивание путем распыления можно осуществлять при обеспечении температуры воздуха во входном отверстии приблизительно 130°С или менее, предпочтительно приблизительно 110°С или менее, более предпочтительно приблизительно 100°С или менее, еще более предпочтительно приблизительно 90°С или менее, более предпочтительно приблизительно 80°С или менее, еще более предпочтительно приблизительно 50°С или менее, наиболее предпочтительно приблизительно 30°-50°С. Высушивание путем распыления можно проводить в потоке газа.

Предпочтительно стадия высушивания (2) способа по настоящему изобретению включает поддержание температуры псевдоожижженного слоя приблизительно 35°С или менее, предпочтительно приблизительно 30°С или менее, более предпочтительно приблизительно 25°С и 35°С.

Предполагается, что время высушивания пропорционально площади поверхности кремнезема, и контроль активности воды обратно пропорционален площади поверхности кремнезема. Следовательно, в одном варианте кремнезем с площадью поверхности BET от средней величины (такой как от 150 до 350 м²/г) до высокой (более 350 м²/г, такой как 400-600 м²/г, например, 500 м²/г BET, приводит к улучшенному контролю активности воды и улучшенному сохранению КОЕ. В другом варианте применение кремнезема с высокой площадью поверхности BET (более 350 м²/г, такая как 400-600 м²/г, например, 500 м²/г) в смеси с увлажнителями или полимерами или полисахаридами также приводит к хорошему контролю активности воды и сохранению КОЕ в течении долгого периода времени. Предпочтительно кремнеземы с высокой площадью поверхности BET высушивают в течение более короткого периода времени и при более высокой температуре, например, с использованием сушки с распылением при 100°С в течение более короткого периода времени (например, в течение 2-80 c).

Смесь или раствор или суспензию микроорганизмов на стадии (1) способа по настоящему изобретению можно инкубировать в ферментере периодического действия с мешалкой при добавлении Сахаров и других питательных веществ в реактор периодического действия, который либо вентилируется, либо поддерживается в анаэробных условиях для размножения организмов и достижения оптимального состояния для их сбора в зависимости от природы организма. В другом объекте организмы можно растить в твердой среде, такой как целлюлозный материал, семена и другие твердые материалы, суспендированные в реакторе с перемешиванием. В еще одном варианте микроорганизмы можно растить на твердой среде в сухой, но увлажненной среде, и при необходимости отмывать от семян.

Для целей настоящего изобретения кремнезем AEROSIL® 200 относится к гидрофильному кремнезему с площадью поверхности BET равной 200 м²/г. AEROSIL® R 202, R 972, R 812 относятся к гидрофильным тонкодисперсным кремнеземам.

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же самое значение, известное специалистам в данной области техники. В случае конфликта настоящий документ, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя на практике или при тестировании настоящего изобретения можно использовать способы или материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, в полном объеме включены в данное описание в качестве ссылок. Материалы, способы и примеры, описанные здесь, представлены только для иллюстрации и не ограничивают объем настоящего изобретения.

Термины "включает(ют)", "содержит(ат)", "имеет(ют)", "может(гут)", "состоит(ят)" и их варианты, использованные здесь, являются универсальными переходными фразами, терминами или словами, которые не исключают возможность дополнительных действий или структур. Слова или термины в единственном числе включают слова или термины во множественном числе, если не указано иное. Настоящее изобретение включает также другие варианты терминов "включающий", "состоящий из" и "по существу состоящий из", вариантов и элементов, описанных здесь, независимо от того, изложены ли они в явном виде или нет.

Союз "или" включает любые или все комбинации одного или более перечисленных элементов, связанных союзом. Например, словосочетание "аппарат, включающий А или В", может означать аппарат включающий А, где В отсутствует, аппарат включающий В, где А отсутствует, или аппарат где присутствуют оба А и В. Словосочетание "по меньшей мере один из А, В, … и N" или "по меньшей мере один из А, В, … N, или их комбинаций" означает в самом широком смысле один или более элементов, выбранных из группы, включающей А, В, … и N, другими словами, любую комбинацию одного или более элементов А, В, … или N, включая только один элемент или в комбинации с одним или более других элементов, которые также могут включать элемент в комбинации с дополнительными не перечисленными элементами.

Наречие "приблизительно", использованное в сочетании с количеством, включает указанную величину и имеет значение, диктуемое контекстом (например, включает по меньшей мере степень ошибки, связанной с измерением определенного количества). Наречие "приблизительно" следует также рассматривать как включающее интервал, определенный абсолютными величинами двух предельных значений. Например, словосочетание "от приблизительно 2 до приблизительно 4" также включает интервал "от 2 до 4". Термин "приблизительно" может означать плюс или минус 10% от указанного числа. Например, словосочетание "приблизительно 10%" может означать интервал от 9 до 11% и словосочетание "приблизительно 1" может означать интервал от 0,9 до 1,1. Другие значения термина "приблизительно" могут быть очевидными из контекста, такого как округление, и тогда, например, термин "приблизительно 1" может также означать интервал от 0,5 до 1,4.

Примеры

Предыдущее описание представляется более очевидным при ссылке на следующие примеры, которые представлены с иллюстративными целями и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Примеры 1-10

Высушенная в псевдоожижженном слое композиция по настоящему изобретению

Приблизительно 50 г суспензии, полученной после промывки семян водой (1:1), содержащей Chlonostachys Rosea, наносили при распылении на приблизительно 25 г субстрата в сушилке с псевдоожижженным слоем. Скорость насоса, давление распыляемого воздуха и скорость вентилятора устанавливали соответствующим образом (например, при скорости насоса 1 мл/мин и давлении распыляемого воздуха 0,1 бар), чтобы обеспечить высушивание смеси субстрат-споры при температуре во входном отверстии приблизительно 45°С и температуре порошкообразного слоя менее 28°С. Образцы нагревали до достижения требуемой влажности. Образцы анализировали с использованием приведенных ниже методов.

Измерение размеров сухих частиц

Измерение размера частиц субстрата проводили в анализаторе со светорассением HORIBA Laser Scarttering Dry Particle Size Distribution Analyzer LA-950 по углу отраженного излучения лазера.

Измерение содержания общей влаги

Измерение влажности высушенных порошков субстрат/микроорганизм проводили на приборе Sartorius Moisture Balance. Порошкообразный образец массой 0,1 г взвешивали и помещали на алюминиевую пластину. При нагревании образца до температуры 105°С до постоянной массы, обычно в течение 2 мин, выполняли три повтора.

Активность воды

Активность воды (A_w) исследуемых образцов измеряли при помещении образца в устройство для измерения активности воды, которое состоит из зеркала, расположенного над исследуемым образцом в закрытой камере для образца. При достижении относительной влажности равновесия зеркало охлаждалось до образования на нем конденсата вследствие точки росы. Эту температуру можно рассчитать как уровень активности воды.

Изображения, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM)

Для получения изображений смесей субстрат/микроорганизм по настоящему изобретению для определения морфологии и состава частиц продукта использовали электронный микроскоп Hitachi ТМ 3000. Изображения свидетельствовали о том, что клетки спор присоединены к частицам кремнезема.

Измерение объема и диаметра пор методом ртутной порометрии

Объем пор, заполненных ртутью (Hg), измеряли ртутной порометрией с использованием прибора Micromeritics AutoPore IV 9520. Диаметр пор можно рассчитать по уравнению Вашберна с использованием контактного угла, тета (Θ), равного 130°, и поверхностного натяжения, гамма, равного 485 дин/см. Ртуть под давлением проникала в пустоты частиц и для каждого заданного давления рассчитывали объем ртути, проникшей в поры 1 грамма образца. Объем пор, приведенный здесь, представляет собой кумулятивный объем ртути, проникшей в поры под давлением от 171 до 18000 фунтов на кв. дюйм.

Проникшая ртуть при таких давлениях соответствует диаметру пор от 1000 до 10 нм. Приращение объема (см³/г) при каждом значении давления наносили на график в зависимости от диаметра пор, соответствующего возрастанию давления. Максимум на кривой зависимости объема проникшей ртути от радиуса пор или диаметра соответствует режиму распределения пор по размеру и определяет наиболее распространенный объем пор в образце. Более конкретно, размер образца доводили до достижения объема ствола 25-75% в порошковом пенетрометре с луковицей объемом 5 мл и объемом ствола приблизительно 1,1 мл. Образцы вакуумировали до давления 50 мкм. рт.ст. и выдерживали в течение 5 мин. Ртуть заполняла поры при давлении от 1,5 до 60000 фунт/кв.дюйм, а время второго уравновешивания составляло 10 с при каждой точке сбора данных (всего 103 точки).

Площадь поверхности BET и объем пор

Площадь поверхности BET субстратов (например, частиц кремнезема или силикатов) определяли на приборе Micromeritics TriStar 3020 методом адсорбции азота BET, как описано в статье Brunaur et al, J. Am. Chem. Soc, 60, 309 (1938), известного в области исследования зернистых материалов, таких как материалы на основе кремнезема и силикатов. Изотермы адсорбции-десорбции азота получали при 77К. Перед измерением порошкообразные образцы массой 50-100 мг дегазировали при 105°С в течение 2 ч. Для расчета объема пор и площади поверхности BET использовали модели Баррета-Джойнера-Халенды (BJH).

Расчеты общего объема пор проводили с использованием общего объема азота, адсорбированного при парциальном давлении (Р/P_o), равном 0,99.

Определение числа КОЕ

Концентрацию микроорганизмов определяли методом посева на чашках Петри с использованием методики серийных разбавлений. Порошок микроорганизм/субстрат перемешивали в стерильной воде, содержащей ПАВ-тритон, присутствующий для мобилизации микроорганизмов. Полученную суспензию микроорганизмов последовательно разбавляли несколько раз и получали серию 10-кратных разбавлений. Каждое разбавление образца высеивали на стерильные чашки с агаром и инкубировали. Через несколько дней присутствие организмов проявляется в виде точек на агаре. При последнем разбавлении, которого еще достаточно для снижения числа точек на чашке до количества, которое можно подсчитать, число колоний подсчитывали и умножали на фактор разбавления для определения количества в исходной популяции.

С использованием методов анализа, описанных выше или аналогичных им, измеряли физические свойства различных субстратов и суммировали их в приведенной ниже Таблице 1.

С использованием способов, описанных выше или аналогичных им, измеряли содержание общей влаги и уровень активности воды (A_w) в исследуемых образцах после высушивания в псевдоожижженном слое и суммировали их в Таблице 2, площадь поверхности BET, время высушивания, конечное содержание влаги, активность воды (A_w) и исходное значение КОЕ исследуемых образцов приведено в Таблице 3, влияние зависимости активности воды (A_w) от содержания влаги на КОЕ/г через 5 месяцев при 25°С представлено в Таблице 4.

Данные, приведенные выше в Таблицах, неожиданно указывают на то, что субстрат с высокой площадью поверхности BET и большим объемом пор, такой как SIPERNAT® 50, быстро не высыхает в сушилке с псевдоожижженным слоем, что приводит к чрезмерному длительному воздействию на организм в сушилке. Субстраты с меньшей площадью BET и объемом пор высыхают быстрее в сушилке с псевдоожижженном слоем, что позволяет снизить нагрузку на организмы и повысить КОЕ/г после высушивания, что может привести к потенциальной экономии затрат на КОЕ/г вследствие меньших затрат на высушивание. Данные Таблицы 4 также свидетельствуют о том, что чем выше общее содержание влаги, тем сильнее уменьшение КОЕ/г при хранении. Кремнезем должен поддерживать низкую влажность при хранении для поддержания высокого КОЕ/г.Таким образом, в настоящем изобретении было установлено, что выбор субстратов с оптимальной площадью поверхности BET и объемом пор приводит к низкому содержанию общей влаги с более быстрым высыханием, что обеспечивает меньшую нагрузку на микроорганизмы, и следовательно, высокое исходное значение КОЕ/г, а также к более высоким значениям КОЕ/г через 5 месяцев.

Пример 11

Композиции по настоящему изобретению, высушенные при распылении

Бактериальную биомассу Pseudomonas fluorescens собирали из ночной культуры во встряхиваемой колбе центрифугированием при 8000g в течение 10 мин. Клеточный осадок ресуспендировали в растворе хлорида натрия (0,9% мас./мас.) и добавляли в суспензию субстрата кремнезема Sibernat® 50 и аравийской камеди. Полученная суспензия содержала приблизительно 8% кремнезема, 7% аравийской камеди, 3% сухой биомассы и 81% воды. Затем суспензию высушивали при распылении в лабораторной сушке с распылением Büchi В-290 при температуре газа во входном отверстии 78°С. Распыление осуществляли с использованием двухлоточной форсунки при давлении распыления приблизительно 1,35 бар. Скорость потока осушающего воздуха составляла 38 м³/ч. Скорость распыления составляла приблизительно 5 мл/мин. Заданные параметры обеспечивают температуру во входном отверстии 53°С и остаточную влажность продукта 6.3%. Значение КОЕ конечного порошка составляет 3,4×10⁷ КОЕ/г.

Водный сбор спор грибов

Промывку исходных семян со спорами грибов на поверхности массой 15 г осуществляли водой, при этом масса воды в 3-10 раз превышала массу семян. Полученные суспензии фильтровали через фильтры с размером отверстий 3 мм после перемешивания с использованием мешалки (дисковая мешалка) в течение 20 мин. Суспензию фильтровали с использованием нагнетательного лабораторного нутч-фильтра объемом 380 мл. Рабочие условия включали комнатную температуру и давление 1 бар (абс). Время обезвоживания составляло 120 с. Фильтрат анализировали методом анализа с использованием подсчета спор. Последующее концентрирование фильтрата проводили при разделении на лабораторной центрифуге при 2100g в течение 5 мин для снижения уровня воды перед использованием при распылении в псевдоожижженном слое.

Сухой сбор спор грибов

Семена со спорами грибов на поверхности массой 100 г измельчали на мельнице с вращающимся шлифовальным камнем в течение 20 с. Мелкоизмельченную фракцию получали при полировании поверхности семян и собирали отдельно от остатков семян, взвешивали и определяли число КОЕ в образце. Величина КОЕ мелкоизмельченной фракции составляла 5×10⁹ КОЕ на грамм семян. Полученную мелкоизмельченную фракцию просеивали через сито с диаметром отверстий 300 мкм. Полученный порошок смешивали с водой, при этом получали суспензию для последующего распыления и высушивания в псевдоожижженном слое.

Примеры 12-23

Примеры, приведенные ниже, предназначены для оценки действия добавок на улучшение термостабильности и влагоустойчивости микроорганизмов.

Процедура промывки

Семена фильтровали при смешении семян с равной массой воды до появления светло-коричневого окрашивания воды. Суспензию спор отфильтровывали от семян до получения половины от исходного объема, и при необходимости собрать конечный объем, который включает добавленный объем из концентрированных растворов, добавляли дополнительное количество воды. Добавку смешивали непосредственно с суспензией (кремнезем AEROSIL® 200 и HPG) или с исходным концентрированным раствором (PVA) в количестве (г) 2% от конечного объема (мл).

Высушивание в псевдоожижженном слое

Собранную суспензию спор распыляли со скоростью от приблизительно 4 г/мин на кремнезем SIPERNAT® 22 при равной массе распыляемой суспензии. Частота вращения вентилятора составляла 8 Гц, температура воздуха во входном отверстии составляла 45°С для образцов без добавок в суспензии, и 55°С для образцов с добавкой(ами). Исходная температура порошка составляла 28°С. Порошок считался сухим при быстром повышении температуры от исходной (28°С) через несколько минут, что указывало на его сухое состояние.

Определение числа КОЕ

Число КОЕ, или колониеобразующих единиц, представляет собой число живых спор на 1 грамм продукта. Порошок спор смешивали с раствором тритона и с использованием метода серийного разбавления и нанесения картофельного агара с декстрозой, содержащей 0,1% стрептомицин, инкубировали при комнатной температуре в течение 5 дней. Число КОЕ определяли при подсчете чашек с 30-300 спорами, умноженными на фактор разбавления.

Последующее добавление кремнезема AEROSIL® R 202

Кремнезем AEROSIL® R 202 добавляли в конечный порошок в количестве 1% (г/г) для выбранных образцов. Полученный продукт перемешивали в турбулентном смесителе низкой энергии в течение 5 мин для равномерного покрытия порошка спор.

Термостабильность

Порошок спор с достаточно низкой активностью воды хранили в сушильном шкафу при 40°С, число КОЕ определяли в различные периоды времени для измерения уменьшения плотности живых клеток на порошке.

Влагоустойчивость

Порошок спор хранили во влажной камере (Associated Environmental Systems) при относительной влажности 70% при 25°С в малопористых пакетах Tubulin, которые проницаемы для паров воды и непроницаемы для спор. Число КОЕ измеряли в различные периоды времени для оценки изменений количества микроорганизмов.

Активность воды

Активность воды определяли как давление пара воды в закрытом образце. Давление пара измеряли по точке росы на холодном зеркале в закрытой камере по температуре капель на зеркале. Активность воды измеряли на приборе AquaLab model 3.

Время десятикратного уменьшения

Время десятикратного уменьшения означает время уменьшения живой популяции микробов на 90%. Его рассчитывали по обратному наклону кривой выживания, которая представляет собой график зависимости log КОЕ от времени.

Результаты

Сначала отбирали образцы, использованные в экспериментах по стабильности, которые характеризовались высоким КОЕ и низкой активностью воды. Образцы, не удовлетворявшие данным требованиям, отбрасывали и перерабатывали. Активность воды в каждом образце представлена в Таблице 6. Образцы, которые удовлетворяли двум требованиям, разделяли на две части, одну часть смешивали с кремнеземом AEROSIL® R 202. Полученные порошки затем хранили в сушильном шкафу при 40°С или во влажной камере при 25°С/70% относительной влажности.

Образцы, предназначенные для исследования на термоустойчивость, хранили в сушильном шкафу в течение 10 недель. КОЕ измеряли в различные периоды времени, как показано на Фиг. 1. Время десятикратного уменьшения (величина D) рассчитывали, как показано на Фиг. 2. Как указано на Фигурах, в течение первых 6 недель значения отличаются незначительно. Однако, через 10 недель образцы, смешанные с кремнеземом AEROSIL® R 202, оказались более стабильными по сравнению с образцами, не содержащими указанный кремнезем. Образцы, не обработанные кремнеземом AEROSIL® R 202, характеризовались низкой величиной КОЕ в данный момент времени, слишком низкой для точного подсчета. Это свидетельствует о том, что добавление кремнезема AEROSIL® R 202 способствует улучшению стабильности порошка спор и увеличивает срок хранения порошка. Комбинация PVA и кремнезема AEROSIL® R 202 приводит к наибольшей стабильности в течение долгого периода времени. PVA, однако, характеризуется более низким исходным значением КОЕ. В то время как некоторые из этих данных можно объяснить различными условиями обработки, суспензия спор также является более разбавленной, потому что PVA характеризуется плохой растворимостью, и поэтому его добавляют в суспензию спор в виде исходного концентрированного раствора.

В то время как большинство образцов характеризуются сопоставимыми свойствами, контрольный образец характеризуется ухудшенной термостабильностью. Образец без каких-либо добавок также характеризуется низким исходным КОЕ. Образец, содержащий только кремнезем AEROSIL® R 202, также характеризуется низким исходным КОЕ, однако его стабильность значительно улучшается. Такие изменения КОЕ в зависимости от времени представлены на Фиг. 3.

Как показано на Фиг. 4, лучшие результаты получены для образцов, содержащих HPG. Образец, содержащий только кремнезем AEROSIL® R 202, также характеризуется аналогичным временем десятикратного уменьшения. Для образцов с добавками, смешанными с раствором спор (кремнезем AEROSIL® 200, HPG, PVA) не наблюдалось дополнительного улучшения при смешении с кремнеземом AEROSIL® R 202. Хотя кремнезем AEROSIL® R 202 действительно улучшает влагоустойчивость по сравнению с контролем, она не улучшается при его добавлении к другим добавкам. Можно предположить, что добавки в составе образцов в большей степени не позволяют влаге проникать в споры во влажных условиях.

Добавление кремнезема AEROSIL® R 202 приводит к отчетливому улучшению термостабильности по сравнению с образцами без него. Аналогичным образом, кремнезем AEROSIL® R 202 также улучшает влагоустойчивость, но не улучшает дополнительно влагоустойчивость при использовании в сочетании с другими добавками. Следовательно, добавление диоксида кремния AEROSIL® R 202 является наиболее эффективным способом улучшения долгосрочной термостабильности и влагоустойчивости.

Получение образцов представлено ниже в примерах 24-25.

Пример 24

Пример 24

Биомассу Pseudomonas fluorescens получали в ферментере в минимальной среде и собирали с использованием дисковой центрифуги, при этом получали концентрированную клеточную суспензию. Получали физиологический солевой раствор и смешивали с трегалозой, аравийской камедью и кремнезем Sipernat® 50. Полученную клеточную суспензию смешивали с суспензией трегалоза/аравийская камедь/кремнезем Sipernat®. Компоненты суспензии (см. пример 24) после смешения составляли: 8% кремнезема, 7% аравийской камеди, 3% сухой биомассы, 77% раствора хлорида натрия и 5% трегалозы. Компоненты смешения (см. Пример 25) после смешения составляли: 4% кремнезема, 4% аравийской камеди, 8% сухой биомассы, 75% раствора хлорида натрия и 9% трегалозы. Суспензии (см. Примеры 24 и 25) сушили в отдельности при распылении в сушке с распылением Niro Minor с использованием двухлоточной форсунки при давлении распыления 2,3 бар. Температура газа во входном отверстии составляла 100°С и расход массы суспензии составлял 0,9 кг/ч (пример 24) и температура газа во входном отверстии составляла 110°С и расход массы суспензии составлял 1,6 кг/ч (пример 25). В результате температура в выходном отверстии составляла 50°С (Примеры 24 и 25). Расход осушающего газа составил 45 м³/ч (Примеры 24 и 25). Содержание влаги в продуктах, полученных в Примерах 24 и 25, составило 7 мас. %, а активность воды 0,3. Число КОЕ конечного продукта, полученного в Примере 24, составило 2×10¹⁰ КОЕ/г, в Примере 25 - 3,6×10¹⁰ КОЕ/г.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены высушенная биологическая композиция для доставки микроорганизмов, которые можно использовать в сельском хозяйстве (варианты); способ получения высушенной композиции и способ борьбы с насекомыми, грибами или нематодами на обрабатываемой поверхности, включающий нанесение эффективного количества необязательно разбавленной композиции на обрабатываемую область. Композиция включает субстрат кремнезем и микроорганизмы Clonostachys rosea или Pseudomonas fluorescens, нанесенные на поверхность субстрата, с содержанием общей влаги от приблизительно 0,01 мас.% до приблизительно 15 мас.%; объем пор субстрата составляет приблизительно 0,01-1,20 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенда, или площадь поверхности BET субстрата составляет приблизительно 400-600 м²/г и объем пор составляет более 1 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенда, или более 2 см³/г по данным ртутной порометрии. Изобретения обеспечивают получение микроорганизмов в высушенной стабильной форме с повышенным содержанием колониеобразующих единиц. 4 н. и 37 з.п. ф-лы, 4 ил., 8 табл., 25 пр.

1. Высушенная биологическая композиция для доставки микроорганизмов, которые можно использовать в сельском хозяйстве, включающая (1) субстрат и (2) микроорганизмы, нанесенные на поверхность указанного субстрата, где содержание общей влаги в композиции составляет от приблизительно 0,01 мас.% до приблизительно 15 мас.%, и объем пор субстрата составляет приблизительно 0,01-1,20 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенда, или площадь поверхности BET субстрата составляет приблизительно 400-600 м²/г и объем пор составляет более 1 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенда, или более 2 см³/г по данным ртутной порометрии, где субстратом является кремнезем и микроорганизмами являются Clonostachys rosea или Pseudomonas fluorescens.

2. Композиция по п. 1, в которой значение активности воды (A_w) в композиции составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,6, предпочтительно от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,6, более предпочтительно от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,5.

3. Композиция по п. 1 или 2, где композиция характеризуется значением более приблизительно 10⁷ КОЕ/г, предпочтительно приблизительно 10⁸ КОЕ/г или более, более предпочтительно приблизительно 10⁹ КОЕ/г или более, предпочтительно приблизительно 10¹⁰ КОЕ/г или более, еще более предпочтительно приблизительно 10¹¹ КОЕ/г или более, наиболее предпочтительно приблизительно 10¹² КОЕ/г или более.

4. Композиция по любому из пп. 1-3, в которой субстратом является осажденный кремнезем.

5. Композиция по любому из пп. 1-4, в которой субстратом является гидрофильный кремнезем.

6. Композиция по любому из пп. 1-5, в которой размер частиц (d₅₀) субстрата составляет приблизительно 5-200 мкм, предпочтительно приблизительно 8-160 мкм, более предпочтительно приблизительно 9-150 мкм, еще более предпочтительно приблизительно 50-150 мкм, также предпочтительно приблизительно 50-130 мкм, предпочтительно выбран из группы, состоящей из значений приблизительно 50 мкм, приблизительно 85 мкм и приблизительно 120 мкм.

7. Композиция по любому из пп. 1-6, в которой площадь поверхности BET субстрата составляет приблизительно 2-600 м²/г, предпочтительно приблизительно 2-400 м²/г, более предпочтительно приблизительно 5-400 м²/г, еще более предпочтительно приблизительно 10-400 м²/г, наиболее предпочтительно приблизительно 30-400 м²/г, также предпочтительно приблизительно 30-300 м²/г, более предпочтительно приблизительно 40-200 м²/г, еще более предпочтительно приблизительно 180 м²/г.

8. Композиция по любому из пп. 1-7, в которой площадь поверхности BET субстрата составляет приблизительно 2 м²/г, предпочтительно приблизительно 5 м²/г.

9. Композиция по любому из пп. 1-7, в которой площадь поверхности BET субстрата составляет приблизительно 180 м²/г.

10. Композиция по любому из пп. 1-9, в которой объем пор субстрата составляет предпочтительно приблизительно 0,05-1,20 см³/г, более предпочтительно приблизительно 0,10-1,0 см³/г, еще более предпочтительно приблизительно 0,20-0,95 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенда, или площадь поверхности BET субстрата составляет предпочтительно 500 м²/г, и объем пор составляет предпочтительно 1,4 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенда, или предпочтительно 2,2 см³/г по данным ртутной порометрии.

11. Композиция по любому из пп. 1-10, в которой конечная концентрация микроорганизмов составляет от приблизительно 4 мас.% до приблизительно 40 мас.%, предпочтительно от приблизительно 4 мас.% до приблизительно 20 мас.% в расчете на общую массу композиции.

12. Композиция по любому из пп. 1-11 в форме таблетки, сыпучей концентрированной формы, например для обработки семян, или в форме масляной дисперсии, дополнительно включающая один или более эксципиентов, предпочтительно один или более агрохимически приемлемых эксципиентов.

13. Композиция по любому из пп. 1-12, где для композиции не требуется экзогенный защитный агент, такой как инкапсулирование в альгинате.

14. Композиция по любому из пп. 1-13, где композиция дополнительно включает (i) полимер, выбранный из группы, состоящей из поливинилового спирта, ксантановой камеди, аравийской камеди или других полисахаридов, таких как мальтодекстрин, гуаровая камедь, полиэтиленгликоля и полиглицерина, или (ii) невосстанавливающиеся дисахариды, такие как трегалоза или сахароза, или (iii) обезжиренное молоко или диметилсульфоксид.

15. Композиция по любому из пп. 1-14, где композиция дополнительно включает второй субстрат в качестве внешнего слоя, предпочтительно второй субстрат выбран из (i) осажденного кремнезема, предпочтительно осажденного гидрофобного кремнезема, предпочтительно имеющий высокую площадь поверхности BET, предпочтительно 50-750 м²/г, предпочтительно 50-380 м²/г, предпочтительно кремнезема SIPERNAT® 50 S или ZEOFREE®, или (ii) пирогенного кремнезема, предпочтительно пирогенного кремнезема, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из кремнезема AEROSIL® 200, AEROSIL® R202, AEROSIL® R 972 и AEROSIL® R 812S.

16. Композиция по любому из пп. 1-15, в которой число колониеобразующих единиц на грамм композиции (КОЕ/г) остается на уровне приблизительно более 10⁷ КОЕ/г после хранения (а) при комнатной температуре в течение 120 дней, (б) при 40°С в течение 40 дней, (в) при относительной влажности 65% или менее в течение 40 дней.

17. Композиция по любому из пп. 1-16, в которой насыпная плотность композиции составляет более 150% в расчете на насыпную плотность очищенного материала субстрата.

18. Способ получения высушенной биологической композиции, включающий (1) объединение смеси, раствора или суспензии, содержащих микроорганизмы, с субстратом, и (2) высушивание смеси субстрат-микроорганизм для достижения содержания общей влаги от приблизительно 0,01 мас.% до приблизительно 15 мас.%, предпочтительно от приблизительно 0,01 мас.% до приблизительно 8 мас.%, более предпочтительно от приблизительно 3 мас.% до приблизительно 8 мас.%, еще более предпочтительно от приблизительно 5 мас.% до приблизительно 8 мас.%, наиболее предпочтительно выбрано из значений 3 мас.%, 5 мас.% и 7 мас.%.

19. Способ по п. 18, где микроорганизмы собирают с поверхности семени путем (а) механического растирания или полирования поверхности субстрата с получением тонкодисперсной фракции, содержащей микроорганизмы и некоторые части семени, и необязательно (б) просеивания полученной тонкодисперсной фракции с получением порошка с определенным распределением частиц по размеру для последующих стадий процесса.

20. Способ по п. 19, где стадия (а) включает растирание семени с использованием шлифовального камня для отделения семени от тонкодисперсной фракции.

21. Способ по п. 19, где стадия (а) включает растирание с использованием вращающегося вала внутри защитной трубы щелевидного сита в условиях под давлением с последующим просеиванием и фильтрованием для отделения семени от тонкодисперсной фракции.

22. Способ по п. 19, где стадия просеивания (б) тонкодисперсной фракции включает просеивание через сито с отверстиями размером от 20 мкм до 800 мкм, предпочтительно от 100 мкм до 300 мкм.

23. Способ по п. 18, где микроорганизмы собирают с поверхности семени путем смывания их водой и разделения семени и жидкого раствора или суспензии микроорганизмов, предпочтительно семена перемешивают в воде в течение от 1 до 20 мин, более предпочтительно отделение твердых частиц от жидкости проводят в нутч-фильтре под давлением, еще более предпочтительно размер отверстий нутч-фильтра под давлением составляет от 1 до 3 мм, более предпочтительно время обезвоживания в нутч-фильтре под давлением составляет 20-200 с, еще более предпочтительно фильтрационное давление в нутч-фильтре составляет от 1 до 3 бар, более предпочтительно раствор или суспензию микроорганизмов концентрируют путем отделения микроорганизмов от жидкости в поле центробежных сил, еще более предпочтительно стадия концентрирования включает разделение в тарельчатом сепараторе, еще более предпочтительно стадию концентрирования повторяют с разбавлением концентрата водой и последующим вторым концентрированием в поле центробежных сил для отделения растворимых частей от микроорганизмов.

24. Способ по любому из пп. 18-23, где стадия высушивания (2) включает высушивание смесей субстрат-микроорганизм в псевдоожижженном слое.

25. Способ по любому из пп. 18-23, где стадия высушивания (2) включает высушивание с распылением смесей субстрат-микроорганизм.

26. Способ по любому из пп. 18-23, где стадия высушивания (2) включает контактное высушивание смесей субстрат-микроорганизм.

27. Способ по любому из пп. 18-23, где стадия высушивания (2) включает высушивание замораживанием смесей субстрат-микроорганизм.

28. Способ по любому из пп. 18-27, где температура воздуха для высушивания составляет приблизительно 130°С или менее, предпочтительно приблизительно 90°С или менее, более предпочтительно приблизительно 80°С или менее, еще более предпочтительно приблизительно 50°С или менее, более предпочтительно приблизительно 30°-50°С, еще более предпочтительно приблизительно 40°-50°С, более предпочтительно приблизительно 40°-45°С, наиболее предпочтительно приблизительно 43°С.

29. Способ по любому из пп. 18-28, где порошкообразный слой поддерживают при температуре приблизительно 35°С или менее, предпочтительно от приблизительно 25°С до приблизительно 35°С.

30. Способ по любому из пп. 18-29, где значение активности воды (Aw) полученной композиции составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,6, предпочтительно от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,6, более предпочтительно от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,5.

31. Способ по любому из пп. 18-30, где число колониеобразующих единиц микроорганизмов на грамм полученной композиции (КОЕ/г), составляет, например, более 10⁷ КОЕ/г, предпочтительно приблизительно 10⁸ колониеобразующих единиц на грамм (КОЕ/г) или более, предпочтительно приблизительно 10⁹ КОЕ/г или более, более предпочтительно приблизительно 10¹⁰ КОЕ/г или более, еще более предпочтительно приблизительно 10¹¹ КОЕ/г или более, наиболее предпочтительно приблизительно 10¹² КОЕ/г или более.

32. Способ по любому из пп. 18-31, где субстратом является кремнезем, предпочтительно осажденный кремнезем, предпочтительно гидрофильный кремнезем.

33. Способ по любому из пп. 18-32, где субстрат выбран из материалов, площадь поверхности BET которых составляет приблизительно 400-600 м²/г, предпочтительно 500 м²/г, а объем пор составляет более 1 см³/г, предпочтительно 1,4 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенда, или более 2 см³/г, предпочтительно 2,2 см³/г по данным ртутной порометрии.

34. Способ по любому из пп. 18-32, где субстрат выбран из материалов, которые характеризуются следующими свойствами:

(i) размер частиц d₅₀ составляет приблизительно 5-200 мкм, предпочтительно приблизительно 8-160 мкм, более предпочтительно приблизительно 9-150 мкм, еще более предпочтительно приблизительно 50-150 мкм, более предпочтительно приблизительно 50-130 мкм, наиболее предпочтительно выбран из группы, состоящей из значений приблизительно 50 мкм, приблизительно 85 мкм и приблизительно 120 мкм;

(ii) площадь поверхности по BET составляет приблизительно 2-400 м²/г, предпочтительно приблизительно 5-400 м²/г, еще более предпочтительно приблизительно 10-400 м²/г, более предпочтительно приблизительно 30-400 м²/г, еще более предпочтительно приблизительно 30-300 м²/г, более предпочтительно приблизительно 40-200 м²/г, наиболее предпочтительно приблизительно 180 м²/г;

(iii) объем пор субстрата составляет приблизительно 0,01-1,20 см³/г, предпочтительно приблизительно 0,05-1,20 см³/г, более предпочтительно приблизительно 0,10-1,0 см³/г, наиболее предпочтительно приблизительно 0,20-0,95 см³/г;

(iv) или любой их комбинацией.

35. Способ по любому из пп. 18-34, где стадия (1) включает нанесение от приблизительно 4 мас.% до приблизительно 40 мас.%, предпочтительно от приблизительно 4 мас.% до приблизительно 20 мас.% в расчете на общую массу композиции.

36. Способ по любому из пп. 18-35, где микроорганизмами являются Clonostachys rosea или Pseudomonas fluorescens.

37. Способ по любому из пп. 18-36, где для полученной композиции не требуется экзогенный защитный агент, такой как инкапсулирование в альгинате.

38. Высушенная биологическая композиция для доставки микроорганизмов, которые можно использовать в сельском хозяйстве, включающая (1) субстрат и (2) микроорганизмы, нанесенные на поверхность указанного субстрата, где содержание общей влаги в композиции составляет от приблизительно 0,01 мас.% до приблизительно 15 мас.%, и объем пор субстрата составляет приблизительно 0,01-1,20 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенда, или площадь поверхности BET субстрата составляет приблизительно 400-600 м²/г и объем пор составляет более 1 см³/г на основании модели Баррета-Джойнера-Халенда, или более 2 см³/г по данным ртутной порометрии, где субстратом является кремнезем и микроорганизмами являются Clonostachys rosea или Pseudomonas fluorescens, полученная способом по любому из пп. 18-37.

39. Высушенная биологическая композиция по любому из пп. 1-17 или 38, которая предназначена для обработки семян.

40. Способ борьбы с насекомыми, грибами или нематодами на обрабатываемой поверхности, включающий необязательное разбавление сухой биологической композиции по любому из пп. 1-17 или 38, и нанесение эффективного количества необязательно разбавленной композиции на обрабатываемую область.

41. Способ по п. 40, где область, предназначенная для обработки, представляет собой часть растения, включая без ограничения, черенки, корни, луковицы, клубни, стволы, плоды, цветы и/или листья растений, например кукурузы, пшеницы, сорго, сои, цитрусовых и не цитрусовых плодов, ореховых деревьев и им подобным.