ПРИМЕНЕНИЕ ТОТАРОЛА И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ТОТАРОЛ Российский патент 2024 года по МПК A61K31/05 A61P15/02 A61K9/02 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к применению тотарола для профилактики нарушения состава влагалищной бактериальной флоры и к фармацевтической композиции, содержащей тотарол в качестве активного ингредиента. Композиция предназначена для применения в гинекологии и акушерстве в ходе антибактериальной, противогрибковой, противопротозойной и смешанной терапии, и в качестве средства регулирования кислотности влагалищной среды. Композиция может применяться в качестве фармацевтического препарата или медицинского продукта.

Уровень техники

Бактериальный вагиноз (БВ), представляющий собой нарушение естественной бактериальной микрофлоры, является воспалительным состоянием, наиболее часто встречающимся в женских родовых путях. По имеющимся оценкам частота возникновения этой нозологической единицы у женщин в период полового созревания составляет 10-40%. В ходе течения БВ происходит уменьшение численности или даже полное сокращение популяции палочковидных бактерий рода Lactobacillus, что приводит к неконтролируемому размножению строго анаэробных бактерий. Тип палочковидных бактерий рода Lactobacillus, их содержание и количество гликогена, хранящегося в эпителиальных клетках влагалища, превращаемого этими бактериями в молочную кислоту, регулируют и отвечают за поддержание надлежащего уровня значения рН влагалищной среды. Реакция влагалищной среды зависит от общего количества органических кислот, продуцируемых этими бактериями, наиболее важной из которых является молочная кислота, упомянутая выше. Контролируемая продукция этих кислот вызывает значение рН влагалищной среды ниже 4,5, что необходимо для адгезии бактерий рода Lactobacillus к эпителию влагалища и позволяет поддерживать правильную микрофлору в качественном и количественном отношении. Таким образом, правильная микрофлора подавляет рост микроорганизмов, для которых необходима среда со значением рН>4,5. Таким образом, физиологическая микрофлора защищает от заражения патогенными микроорганизмами, в том числе путем конкуренции за питательные вещества и сайты рецепторов на клеточной поверхности, и стимулирует иммунную систему половых путей продуцировать антитела, перекрестно реагирующие с другими микроорганизмами.

Наиболее часто патогенный микроорганизм, являющийся основной причиной БВ, представляет собой Gardnerella vaginalis, встречающийся почти у всех женщин, страдающих этим состоянием, также, как и другой анаэроб, Atopobium vaginae, также встречающийся в 50% случаев БВ, вызванных палочковидными бактериями Mobiluncus spp. Способность к размножению патогенных бактерий с образованием мультибактериальной биопленки, прикрепляющейся к эпителию влагалища, является особенно важным характерным признаком, препятствующим терапии в ходе течения БВ. Колонии бактерий, формирующих биопленку, содержащую в качестве основных компонентов Gardnerella vaginalis и Atopobium vaginae, обладают способностью прикрепляться к влажным поверхностям и друг к другу. Целью формирования матрикса биопленки является защита микроорганизмов, формирующих его, от разрушительного воздействия естественных факторов влагалищной среды и от воздействия фармакологических средств, в том числе антибиотиков. Компактную структуру биопленки очень трудно удалить со стенок влагалища. У женщин, страдающих от БВ, при биопсии было показано присутствие биопленки, прикрепленной к эпителиальным клеткам, в которой бактерии Gardnerella vaginalis составляли 90%.

Явление формирования биопленки патогенными микроорганизмами, отсутствие признаков воспаления при БВ, случаи неправильной диагностики БВ, достигающие 61% (идентификация БВ по критериям Амселя является недорогостоящей, простой и возможной для проведения практически в каждом гинекологическом кабинете; однако она имеет недостатки, связанные с субъективностью оценки и более низким коэффициентом повторяемости, зависящими от опыта врача), и группа пациентов, у которых БВ несет бессимптомный характер, приводят к рецидивам у большинства получивших лечение пациентов через 12 месяцев.

Описанные выше характерные признаки и механизмы, возникающие в течение БВ, чрезвычайно важны с медицинской точки зрения, вследствие того, что бактериальная вагинальная инфекция рассматривается как один из этиологических факторов самопроизвольных абортов, преждевременных родов, внутриутробных инфекций, преждевременного излитая амниотической жидкости, задержки внутриутробного развития (IUGR), воспалений слизистой оболочки матки и органов малого таза. Кроме того, БВ может быть причиной других перинатальных инфекций, опасных в равной степени для инфицированной матери и новорожденного.

Другое состояние, связанное с нарушениями качественного и количественного состава влагалищной микрофлоры, состоит в воспалении влагалища, вызванном микроорганизмами, существующими при аэробных условиях, называемом аэробным вагинитом (АВ). При АВ также наблюдается уменьшение количества или отсутствие бактерий рода Lactobacillus, а также рост смешанной влагалищной флоры, в составе которой преобладают шаровидные бактерии грамположительные стрептококки группы В: Streptococcus agalactiae, Enterococcus fecalis, Staphylococcus aureus, и палочковидные грамотрицательные бактерии: Escherichia coli. Как и в случае БВ, в случае аэробного вагинита также наблюдаются идентичные изменения. Концентрация лактатов в составе влагалищной микрофлоры уменьшается, значение рН влагалищной среды возрастает до >6,0, а также увеличивается концентрация провоспалительных цитокининов. Из-за отсутствия однозначных диагностических показателей и одновременного возникновения других инфекций, таких как микоз и трихомониаз, частота возникновения АВ точно не определена.

Возникновение нарушений в составе влагалищной микрофлоры является причиной воспалений в половых путях, которые могут быть вызваны двумя совершенно разными видами патогенных бактерий, существующих при совершенно несопоставимых кислородных условиях. Аномальный биоценоз и воспаления могут также привести к развитию воспалительных послеоперационных осложнений, в частности гинекологических, акушерских и урологических. Они также представляют огромную угрозу для плода, чей организм лишен контакта с микроорганизмами в период внутриутробного развития, однако, при проходе через родовой канал он колонизируется влагалищной микрофлорой матери.

Большинство применяемых в настоящее время схем лечения основаны главным образом на метронидазоле, тинидазоле и, в случае БВ, клиндамицине. Эти вещества повсеместно и согласно обычной практике применяют перорально или внутривлагалищно. Фундаментальные преимущества метронидазола состоят в его активности в отношении как аэробных, так и анаэробных бактерий, а также в том, что анаэробные молочнокислые палочковидные бактерии рода Lactobacillus полностью резистентны к этому антибиотику. Кроме того, этот лекарственный препарат является недорогостоящим, легко доступным и обычно хорошо переносится пациентами. К сожалению, в мировой научной литературе все чаще появляются сообщения о резистентности Gardnerella vaginalis к действию этого химиотерапевтического средства, что указывает также на увеличение процента резистентных штаммов этого вида. Исследования, проведенные Goldstein et al. в 1993 г., показали процент резистентных к метронидазолу штаммов на уровне 20%, тогда как уже в 2002 г. та же группа исследователей обнаружила увеличение процента резистентных штаммов до уровня 29%. Самые последние сообщения указывают на то, что процесс приобретения резистентности к метронидазолу усиливается со значительной скоростью. В исследованиях резистентности к лекарственному препарату, проведенных и опубликованных в 2007 году, наблюдалось, что резистентность штаммов Gardnerella vaginalis к метронидазолу достигает даже 70%. Исследования, проведенные в Польше на коллекции из 67 штаммов, выделенных у группы из 604 женщин, подтвердили, что для 68,7% (46 из 67) исследованных штаммов свойственна резистентность к метронидазолу. Вызывающее тревогу увеличение числа анаэробных штаммов, связанных с БВ, проявляющих описанный механизм резистентности к метронидазолу, может привести к необходимости изменения схем лечения бактериального вагиноза через несколько лет.

По сравнению с метронидазолом клиндамицин отличается более высокой эффективностью против анаэробных грамотрицательных палочковидных бактерий и, в то же время, ограниченной активностью в отношении бактерий, существующих при аэробных условиях. Кроме того, отрицательное последствие применения этого лекарственного препарата связано с его высокой активностью в отношении бактерий рода Lactobacillus и способность ингибировать рост бактерий рода Lactobacillus, что может привести к нарушению процесса регенерации нормальной экосистемы влагалища и, вследствие этого, привести к вторичным грибковым инфекциям наружных женских половых органов и влагалища, вызываемым сахаромицетами вида Candida albicans и Candida glabrata.

Амоксициллин с клавулановой кислотой предложен в качестве лекарственного препарата второго ряда при лечении БВ. К сожалению, в литературе отсутствуют данные по оценке эффективности этого антибиотика при лечении вагинальных инфекций, вызванных анаэробными бактериями.

Несмотря на высокую эффективность описанных антибиотиков, рецидивы вагинальных инфекций и инфекций родовых путей бактериального происхождения наблюдаются довольно часто. Это явление в частности наблюдается у пациентов с БВ. По имеющимся оценкам около 30% женщин сталкиваются с возобновлением клинических симптомов БВ через 3 месяца и около 80% - в течение первого года после завершения терапии. В качестве одной из основных причин рецидивов указывают резистентность штаммов анаэробных бактерий к применяемым антибиотикам, которые в то же время обладают высокой антибактериальной активностью в отношении молочнокислых палочковидных бактерий рода Lactobacillus, естественным образом существующих в микрофлоре влагалища и необходимых для его нормального функционирования.

Важная проблема состоит в изменениях в структурах бактерий, являющихся основной причиной инфекций слизистых оболочек влагалища. Масштаб изменений, происходящих в патогенных микроорганизмах, нацеленных на развитие новых механизмов резистентности, является разнонаправленным и многоуровневым. Часто один патогенный микроорганизм использует несколько механизмов для защиты от широкого спектра обычно применяемых терапевтических препаратов.

Таким образом, в настоящее время трудно прогнозировать спектр антибактериальной активности данного вещества, активного в отношении патогенных микроорганизмов со столь вариабельной структурой, несмотря на его общеизвестную активность в отношении уже протестированных патогенных микроорганизмов. Наблюдалось, что активность терапевтического вещества может изменяться со временем, а в некоторых случаях даже затухать под воздействием вновь возникающих защитных механизмов патогенного микроорганизма.

Поэтому изменение активности, включая ее полное затухание, и ограничение спектра активности в отношении патогенных микроорганизмов различных типов являются серьезными проблемами применяемых в настоящее время терапий, как в случае инфекций типа БВ, так и в случае инфекций типа АВ. Возрастающая частота возникновения резистентности бактерии Gardnerella vaginalis к метронидазолу ограничивает возможности эффективного лечения БВ и, вероятно, способствует увеличению частоты возобновления клинических симптомов.

Важную роль в лечении воспалений слизистых оболочек влагалища, особенно воспалений смешанного характера: БВ+АВ или БВ вместе с сопутствующей вторичной грибковой инфекцией, могут играть соединения природного происхождения. Широкий спектр антибактериальной активности, как в отношении аэробных, так и в отношении анаэробных бактерий, является необходимым условием, определяющим терапевтическую полезность при лечении резистентных случаев или смешанных инфекций. Кроме того, необходимо принимать во внимание влияние нового вещества на физиологичный компонент естественной бактериальный микрофлоры влагалища, а именно на молочнокислые бактерии рода Lactobacillus.

Антибактериальной активностью обладает трициклический дитерпен с непатентованным названием "тотарол", имеющий химическую структуру, представленную формулой 1.

Это соединение природного происхождения, обнаруженное в эндемичных древесных породах Podocarpus totara (красное дерево), которое встречается на территории Новой Зеландии.

Антибактериальная активность тотарола раскрыта в ряде научных работ и патентных публикаций. В публикации "Antibacterial activity of totarol and its potentiation" Journal of Natural Products Vol.55, No. 10, pp.1436-1440, October 1992, описана высокая эффективность тотарол-содержащих экстрактов в отношении грамположительных бактерий: Bacillus subtilis, Brevibacterium ammoniagenes, Streptococcus mutans, Propionibacterium acnes и Staphylococcus aureus. В публикации "Clinical report on the Efficacy of Totarol and Totarol in Combination with Tea Tree Oil as an Antimicrobial Against Gram-negative Bacteria" prepared for Mende-DEK Ltd. November 2003, подтверждена эффективность тотарола в отношении четырех грамотрицательных бактерий: Salmonella menston, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, и одной грамположительной бактерии: Enterococcus fecalis. В публикации "The synthesis and antibacterial activity of totarol derivatives. Part 1: modifications of ring-C and pro-drugs" Bioorganic & Medicinal Chemistry 1999, 7(9): 1953-1964, описана его активность в отношении грамположительной бактерии Streptococcus pneumoniae. В цитированных выше публикациях раскрыта информация о бактериях, в отношении которых тотарол активен, а также указана довольно большая группа патогенных бактерий, в отношении которых тотарол не проявляет какой-либо антибактериальной активности. Последние часто являются патогенными микроорганизмами того же рода, в отношении которого была обнаружена активность тотарола, что свидетельствует о неочевидности и индивидуальности воздействия на соответствующие микробные штаммы.

Согласно описанию заявки на патент Японии №JP 01311019 раскрыта активность тотарола в отношении грамположительных бактерий в препаратах, предназначенных для наружного применения. В свою очередь, в описании заявки WO2005073154 представлен способ экстракции тотарола из растительного сырья, и препарат, полученный из тотарола, полученный описанным способом. В этом описании было доказано, что тотарол действует также в отношении грамотрицательных бактерий. Состав препарата, его форма и применение были раскрыты в этой заявке в очень общем виде, без указания его конкретного назначения. В описание заявки WO2014137231 раскрывается применение тотарол-содержащих препаратов для лечения воспаления молочной железы, воспаления матки и ран. В описание заявки CN104027260 раскрывается применение препаратов в форме зубной пасты или жидкости для полоскания рта для лечения ран в ротовой полости.

На данный момент не была доказана антибактериальная активность тотарола в отношении патогенных бактерий, являющихся основными причинами инфекций слизистых оболочек влагалища. Они представляют собой грамвариабельную анаэробную бактерию Gardnerella vaginalis, вызывающую инфекции БВ, и грамположительную аэробную бактерию Streptococcus agalactie, вызывающую инфекции типа АВ.

В результате исследований с использованием клинических штаммов, выделенных из женских родовых путей, проведенных авторами настоящего изобретения, оказалось, что тотарол проявляет необычно высокую активность в отношении указанных патогенных микроорганизмов при очень низкой минимальной ингибирующей концентрации (MIC). Активность как в отношении клинического штамма патогенной анаэробной бактерии Gardnerella vaginalis, так и в отношении клинического штамма аэробной бактерии Streptococcus agalactie, приводит к тому, что - что является весьма ценным - спектр активности тотарола перекрывается со спектром активности метронидазола, в отношении которого существует резко возрастающая резистентность упомянутых выше микроорганизмов, что ограничивает или даже исключает эффективное медицинское использование последнего.

До настоящего времени также было неизвестно влияние тотарола на молочнокислые палочковидные бактерии рода Lactobacillus. Впервые такое исследование было проведено авторами настоящего изобретения. Совершенно неожиданно было обнаружено, что несмотря на то, что палочковидные бактерии рода Lactobacillus, такие как Gardnerella vaginalis, представляют собой анаэробные бактерии, существует значительная приблизительно 10-ти кратная разница в значениях концентраций MIC для этих микроорганизмов, что наилучшим образом проиллюстрировано в следующей Таблице.

Данная неочевидная и в то же время имеющая решающее значение для объекта настоящего изобретения разница между эффективными концентрациями для отдельных бактерий одного и того же рода определяет уникальность и исключительное качество тотарола в описываемой заявке.

Новые и уникальные свойства тотарола, впервые обнаруженные авторами настоящего изобретения, определяют его огромный медицинский потенциал для применения, являющегося задачей настоящего изобретения. Низкие концентрации MIC одновременно с высокой антибактериальной эффективностью в отношении бактерий, являющихся основной причиной как БВ, так и АВ, не проявляют активности в отношении анаэробных бактерий рода Lactobacillus и, таким образом, не оказывают неблагоприятного воздействия на анаэробные бактерии рода Lactobacillus, являющиеся основным компонентом физиологически правильной микрофлоры влагалища. Этот уникальный механизм действия тотарола определяет его огромную терапевтическую полезность при лечении вагинальных инфекций бактериального происхождения. Отсутствие активности в отношении молочнокислых палочковидных бактерий в соответствующем диапазоне MIC предотвращает дополнительную стерилизацию микрофлоры влагалища, в то же время создавая оптимальные условия для роста этих бактерий. Увеличение концентрации молочнокислых палочковидных бактерий обеспечивает естественное восстановление защитного барьера влагалища, таким образом предотвращая возобновление клинических симптомов и защищая влагалищную среду от вторичных грибковых инфекций, которые сопровождают классическую терапию с применением клиндамицина.

Помимо вышеупомянутых новых и неожиданных свойств тотарола, его огромный терапевтический потенциал определяется отсутствием механизма резистентности, возникающего в случае метронидазола.

Авторами настоящего изобретения была дополнительно подтверждена высокая терапевтическая полезность и безопасность при применении в гинекологии путем впервые проведенных исследований на тканях, в ходе которых оценивается воздействие тотарола на вагинальные эпителиальные клетки человека с использованием клеточной линии А-431. Проведенные тесты не подтвердили апоптотическое и некротическое действие тестируемого вещества на вагинальные эпителиальные клетки человека А-431 в широком диапазоне периодов инкубации (2-24 часа).

Результаты теста, подтверждающие широкий спектр антибактериальной активности для специфических строго определенных концентраций MIC тотарола одновременно с отсутствием активности в отношении молочнокислых бактерий рода Lactobacillus и отсутствием неблагоприятного воздействия на вагинальные эпителиальные клетки человека, впервые полученные авторами настоящего изобретения, стали основой для применения тотарола согласно настоящему изобретению. Применение в соответствии с настоящим изобретением является результатом исследований, проведенных авторами настоящего изобретения, показывающих, что тотарол активен в отношении клинических штаммов Gardnerella vaginalis и Streptococcus agalactie, выделенных из женского родового пути. Исследования проводились на основе методологии, описанной в документе "Determination of the Minimum Concentration of Totarol & Antibiotics Required to Inhibit and Kill Growth of Staphylococcus aureus in Broth Cultures" (Project NZC-MEND-1312). Результаты и способы проведения описанных исследований представлены более подробно в примерах настоящего изобретения.

Однако тотарол имеет ограничения из-за физико-химических свойств вещества. Гидрофобный характер его молекулы, приводящий к полному отсутствию растворимости в воде, является фундаментальной технологической проблемой, препятствующей эффективному применению вещества в гинекологических композициях. Из-за целевой области применения фармацевтической композиции, а именно слизистой оболочки влагалища, использование большинства органических растворителей, растворяющих тотарол, оказалось невозможным. Растворители, относящиеся к спиртам, как например этанол, или многоатомным спиртам, как например пропиленгликоль, оказывают сильное раздражающее действие, а добавление к ним воды приводит к осаждению растворенного тотарола. Применение в качестве растворителей производных галогенов, таких как, например, метиленхлорид или хлороформ, также невозможно из-за их токсического характера. Эмбриотоксические и тератогенные свойства N,N-диметилформамида не позволяют использовать его в качестве компонента фармацевтических композиций. DMI, применяемый в исследованиях in vitro, используют в фармацевтической промышленности, но только при производстве лекарственных препаратов для наружного применения, таких как стероидные мази.

Поскольку состав микрофлоры влагалища может изменяться под влиянием применяемых антибиотиков, эндокринно или иммунологически активных средств во время беременности или при менопаузе, рекомендуется применять молочную кислоту в форме вагинального геля, особенно после завершения фармакологического лечения БВ.

В польском патенте №166898 раскрывается способ получения комплекса метилцеллюлоза-молочная кислота, предусматривающий сольватацию метилцеллюлозы молочной кислотой в форме раствора, состоящего из 5-25 мас. частей молочной кислоты и 10-20 мас. частей 95%-ого этилового спирта. Раствор распыляют на 75-95 мас. частей метилцеллюлозы при непрерывном перемешивании, а затем продукт подвергают сушке, удаляя этиловый спирт. Полученный порошок гранулируют. Молочная кислота связывает метилцеллюлозу, образуя бинарный комплекс. Метилцеллюлоза, сольватированная молочной кислотой, обладает свойствами быстрой фиксации воды, образуя гель с вязкостью, адгезионными и покрывающими свойствами, аналогичными свойствам слизи, образующейся во влагалище при физиологических условиях. Композиции, в которых применяется только молочная кислота, обладающие действием, основанным на регулировании значения рН, являются недостаточными в случае лечения вагинальных инфекций и могут использоваться только в профилактических целях или для поддержания хорошей гигиены родовых путей здоровых женщин.

Из польских патентов №№194437, 201868 и 201869 известны способ получения и композиции, в которых применяется комплекс метилцеллюлоза-молочная кислота, где отдельные штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jenseni, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus дополнительно применяются в качестве активных веществ в форме лиофилизата. Композиция содержит от 75 до 95 мас. частей метилцеллюлозы, от 0,5 до 5 мас. частей молочной кислоты, от 0,5 до 5 мас. частей основного полимера, предпочтительно Eudragit или хитозана, или поливинилпирролидона, или их смесей, и от 0,5 до 5 мас. частей бактериального лиофилизата Lactobacillus, причем стехиометрическое отношение молочной кислоты к основному полимеру находится в диапазоне от 1:1 до 8:1. Предпочтительно композиция содержит культуральную среду в количестве от 5 до 10 мас. частей, в форме моносахаридов или полисахаридов. Способ производства этой известной композиции предусматривает получение бинарного компонента путем растворения основного полимера в растворе молочной кислоты при стехиометрическом отношении к свободным аминогруппам в основном полимере в диапазоне от 1: 1 до 8: 1, перемешивание до полного растворения основного полимера, а затем добавление этилового спирта в количестве не менее 5 мас. частей, перемешивание до полной гомогенности и распыление полученной таким образом смеси на метилцеллюлозу, и перемешивание до достижения ее равномерного смачивания. Полученный продукт подвергают сушке, в ходе которой этиловый спирт испаряется, и к полученному таким образом сухому порошку добавляют бактериальный лиофилизат Lactobacillus.

Целью вагинального введения отдельных штаммов, упомянутых выше, является обеспечение оптимальных условий для полного восстановления физиологической бактериальной флоры влагалища. Одновременно авторы упомянутых описаний к патентам подчеркивают, что репродуктивные органы, как и другие анатомические области человека, имеют многочисленные «экологические ниши», и, следовательно, свод влагалища, канал шейки матки, наружная стенка шейки матки и передняя часть влагалища все имеют различную бактериальную флору. Описанные различия в составе бактериальной флоры вызывают снижение эффективности описанных композиций, содержащих один штамм палочковидных бактерий рода Lactobacillus. Использование большего количества штаммов в одной композиции не является предпочтительным в свете современных исследований, поскольку это может привести к слишком высокой концентрации этих бактерий, что в результате является причиной цитолитического вагиноза, который часто ошибочно диагностируют и лечат как вагинальный кандидоз.

Сырье в форме бактериальных лиофилизатов имеет многочисленные серьезные ограничения, обусловленные специфичностью материала, содержащего живые организмы, и его применение в технологических условиях связано с рядом трудностей. Параметры пробиотического сырья характеризуются высокой вариабельностью, строго зависящей от многочисленных параметров осуществления процесса ферментации. Получение конечного сырья высокой чистоты требует использования веществ, повышающих жизнеспособность микроорганизмов и стабилизирующих процесс ферментации, а также сложных и дорогих способов очистки и лиофилизации. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в насыпной массе получаемого сырья строго зависит как от вида бактериального штамма, так и от способа и параметров осуществления всего процесса получения. Это количество постоянно уменьшается со временем, поскольку стабильность и жизнеспособность пробиотических штаммов зависят от температуры, условий хранения и содержания в них воды. Это отрицательно влияет на эффективность и стабильность бактериальных свойств в ходе хранения и распространения пробиотических продуктов.

Процесс производства готовых к применению фармацевтических средств, содержащих пробиотическое сырье, должен осуществляться на отдельных производственных линиях с использованием специализированного оборудования, поскольку системы контроля качества и руководства GMP (Руководство по надлежащей производственной практике), обязательные для фармацевтической промышленности, классифицируют это сырье как серьезный источник микробиологического загрязнения. Необходимость использования специализированного производственного оборудования является следствием высокого риска колонизации и того факта, что регулярно используемые процедуры очистки не гарантируют достижения надлежащей чистоты. Это может быть достигнуто только путем использования передовых и дорогостоящих способов очистки и стерилизации, которые включают демонтаж отдельных рабочих элементов, контактирующих с производимым продуктом. Процедуры очистки и стерилизации проходят сложную процедуру валидации, подтверждающую их эффективность и воспроизводимость, а также отсутствие даже небольшого количества применяемых агрессивных чистящих веществ в оборудовании для очистки.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является решение изложенных выше проблем.

Сущность настоящего изобретения состоит в применении тотарола для получения препарата для лечения воспалений слизистой оболочки влагалища бактериального происхождения и для облегчения симптомов при таком лечении. В частности, применение согласно настоящему изобретению относится к бактериальному вагинозу (БВ) и аэробному вагиниту (АВ).

Предпочтительно тотарол при применении согласно настоящему изобретению применяют в форме композиции, содержащей от 75 до 95 мас. частей производного целлюлозы, предпочтительно метилцеллюлозы, от 0,5 до 5 мас. частей молочной кислоты, от 0,5 до 5 мас. частей основного полимера, предпочтительно акрилового полимера, наиболее предпочтительно сополимера метакриловой кислоты и этилакрилата или хитозана, или поливинилпирролидона, или их смесей, где стехиометрическое отношение молочной кислоты к основному полимеру находится в диапазоне от 1:1 до 8:1. Согласно настоящему изобретению активным веществом в композиции является тотарол в количестве 0,001 до 5 мас. частей

Композиция также может содержать культуральную среду для пробиотических бактерий в количестве от 5 до 10 мас. частей в форме моносахаридов или полисахаридов. Композиция также может содержать дополнительные активные компоненты в количестве от 0,001 до 10 мас. %, в зависимости от типа компонента.

Композицию согласно настоящему изобретению получают способом, известным из уровня техники (PL 194437, PL201868, PL201869), согласно которому тотарол добавляют к спирту. Более подробно, основной полимер растворяют в растворе молочной кислоты при стехиометрическом отношении к свободным аминогруппам в основном полимере в диапазоне от 1:1 до 8:1, раствор перемешивают до полного растворения основного полимера, затем первичный спирт добавляют в количестве не менее 5 мас. частей вместе с растворенным тотаролом, перемешивают до полной гомогенности, и отделенную смесь наносят на поверхность частиц производного целлюлозы, перемешивая до равномерного смачивания. Полученный продукт подвергают сушке, в ходе которой первичный спирт удаляется, и затем продукт дозируют в контейнеры или подвергают дальнейшей обработке до желаемой формы.

«Тотарол» чрезвычайно активен в отношении клинических штаммов патогенных анаэробных бактерий Gardnerella vaginalis и Enterococcus faecalis, а также клинического штамма аэробных бактерий Streptococcus agalactia с очень низкой минимальной ингибирующей концентрацией (МIС)».

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - с левой стороны: некротические клетки (увеличение 400×) после 8 часов инкубации с Н₂О₂; с правой стороны: некротические клетки (увеличение 400×) после 24 часов инкубации с Н₂О₂.

Фиг. 2-е левой стороны: отсутствие апоптоза и некроза в эпителиальных клетках (увеличение 400×) после 8 часов инкубации - отрицательный контроль; с правой стороны: отсутствие апоптоза и некроза в эпителиальных клетках (увеличение 400×) после 24 часов инкубации - отрицательный контроль.

Фиг.3-е левой стороны: отсутствие апоптоза и некроза в эпителиальных клетках (увеличение 400×) после 8 часов инкубации - контроль-растворитель; с правой стороны:

отсутствие апоптоза и некроза в эпителиальных клетках (увеличение 400×) после 24 часов инкубации - контроль-растворитель.

Фиг. 4-е левой стороны: отсутствие апоптоза и некроза в эпителиальных клетках (увеличение 400×) после 8 часов инкубации - тотарол; с правой стороны: отсутствие апоптоза и некроза в эпителиальных клетках (увеличение 400×) после 24 часов инкубации - тотарол.

Осуществление изобретения

Композиция согласно настоящему изобретению предназначена для использования при профилактике и лечении воспалений слизистой оболочки влагалища. Она отличается высокой эффективностью и селективностью антибактериальной активности, благодаря применению строго определенного количества тотарола в качестве активного вещества. Кроме того, композиция может содержать вещества, проявляющие противогрибковую и противопротозойную активность.

Наиболее важное уникальное преимущество композиции согласно настоящему изобретению в ее описанной форме состоит в том, что высокоселективная антибактериальная активность тотарола, направленная против патогенных бактерий, не нарушает правильный биоценоз и не разрушает молочнокислые палочковидные бактерии рода Lactobacillus, являющиеся наиболее значимым компонентом физиологической флоры. Дополнительным агентом, стимулирующим рост и восстановление правильной флоры влагалища, является молочная кислота, которая, благодаря своей регулирующей функции понижения значения рН, образует барьер от микробов, чувствительных к кислой среде, и создает благоприятные условия для роста бактерий рода Lactobacillus.

В растворах, применяемых в настоящее время, терапевтическое вещество в форме антибиотика нарушает патогенную флору, одновременно нарушая физиологическую флору и молочнокислые палочковидные бактерии, являющиеся ее основным компонентом. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению, благодаря присутствию антибактериально активной концентрации тотарола, определяемой экспериментально, действует специфическим и селективным образом только на патогенные бактерии, являющиеся причиной воспаления, вызванного БВ или АВ. Эта концентрация была определена в результате процесса исследования, впервые проведенного авторами настоящего изобретения. Дополнительное присутствие молочной кислоты в композиции, буферизованной основным полимером, подкисляет среду и поддерживает рост и развитие существующих бактерий Lactobacillus. Благодаря этому композиция проявляет очень высокую эффективность при одновременном отсутствии неблагоприятных воздействий на физиологический биоценоз, что ограничивает рецидивы заболевания, регистрируемые у большинства пациентов после излечения БВ или АВ, возникающие в случае применения классических методов лечения. В то же время в композиции может применяться известная возможность точного регулирования значения рН путем изменения отношения молочной кислоты к основному полимеру. Композиция хорошо прикрепляется ко всей поверхности слизистых оболочек, что продлевает время ее пребывания во влагалище и обеспечивает равномерный контакт с антибактериальным средством в форме тотарола.

Композиция, подлежащая применению в случае смешанных инфекций, может быть получена путем дополнения основного состава композиции веществами, обладающими профилированной противогрибковой или противопаразитарной активностью, при выборе значения рН, подходящего для лечения. Композиция может применяться также в профилактических целях или в качестве продукта для ежедневной интимной гигиены. Композицию в форме сыпучего порошка можно использовать для прямой гинекологической обработки в виде присыпки или для получения препаратов в других формах, таких как гели или вагинальные растворы, после добавления надлежащим образом выбранного количества очищенной воды, или для получения таблеток после смешивания с известными веществами, которые способствуют таблетированию, или вагинальных суппозиториев. Целевой состав всех указанных конечных препаратов может быть дополнен веществами, проявляющими противогрибковую или противопротозойную активность.

Способом согласно настоящему изобретению получают композицию с селективной антибактериальной активностью, направленной только в отношении патогенных бактерий. Благодаря равномерному нанесению тотарола на частицы химически модифицированного производного целлюлозы, достигается эффект развития поверхности контакта активного вещества со слизистой оболочкой во всем объеме применяемого препарата. Кроме того, это решение позволило значительно ограничить, а, в некоторых случаях, исключить необходимость использования больших количеств смешивающихся с водой органических растворителей в конечных продуктах, чтобы растворить гидрофобный тотарол. В то же время в результате буферизующего действия основного полимера достигается эффект постепенного и пролонгированного высвобождения активного вещества вместе с молочной кислотой, регулирующей значение рН влагалищной среды. Описанную активность было невозможно получить с использованием комплекса, известного из описаний польских патентов №№166898, 194437, 201868 и 201869. Композиция, полученная способом согласно настоящему изобретению, проявляет свою хорошую адгезию ко всей поверхности слизистых оболочек, что продлевает время пребывания внутри влагалища и обеспечивает равномерный контакт с антибактериальным средством в форме тотарола.

Настоящее изобретение также относится к композиции, определенной выше, для получения препарата для поддерживающего лечения и облегчения симптомов при лечении воспалений слизистой оболочки влагалища бактериального происхождения. Композиция, в частности, полезна в случае рецидива инфекций слизистой оболочки влагалища. Настоящее изобретение представлено более подробно в примерах.

Пример 1.

Тестирование антибактериальной активности тотарола с применением DMI (диметилизосорбида) в качестве растворителя.

Суспензию 0,5 McF в физиологическом растворе (плотность суспензии 10⁸ КОЕ/мл) получали из 24-х часовой культуры стандартного штамма. 1 мл суспензии собирали в 9 мл бульона TSB (разведение 10^-1). Суспензии с разведением 10^-6 получали описанным способом. Для дальнейших исследований была выбрана суспензия с плотностью клеток 10⁵ КОЕ/мл. Для каждого штамма было приготовлено два 96-луночных планшета: первый предназначался для измерения OD, второй - для количественного культивирования на твердой среде.

А/ в лунки B1-D1, B2-D2 и B-D 4-11 добавляли 100 пл бульона; В/ в лунки B3-D3 добавляли 200 пл бульона добавляли; С/ в лунки B1-D1 добавляли 1 пл сток-раствора I; D/ в лунки B2-D2 добавляли 1 пл сток-раствора II; Е/ в лунки B3-D3 добавляли 2 пл сток-раствора III.

Применяя многоканальную пипетку, 100 пл образца собирали из каждой из лунок B3-D3 и помещали в лунки B4-D4 (перемешивая путем всасывания содержимого и высвобождения его 5 раз). Наконечники пипеток заменяли, и 100 мкл содержимого собирали из лунок B4-D4 и помещали в лунки B5-D5, перемешивая как описано ранее. Эти операции повторяли до лунок B11-D11. Содержимое в лунках В11-D11 смешивали, и 100 мкл жидкости собирали и отбрасывали. Таким способом была получена серия разведений образцов тотарола в DMI в диапазоне от 0,32% до 0,0004%. Затем 100 пл соответствующей бактериальной культуры добавляли в лунки В, С, D 1-11. В результате достигали изменение конечного диапазона концентрации до 0,16% -0,0002%.

Получение контроля:

Отрицательный контроль: 100 пл бульона+1 пл DMI добавляли в лунку А1. Положительный контроль (I): 100 пл бульона с бактериальной культурой добавляли в лунки E1-G1.

Положительный контроль-разбавитель (II): 100 пл бульона с бактериальной культурой+1 пл DMI добавляли в лунки E2-G2.

Значение OD в отдельных лунках получали при длине волны 620 нм (время снятия показаний 0). Из второго 96-луночного планшета культуру инокулировали количественным методом из каждого разведения в лунку с подходящей твердой средой и инкубировали в течение 24 часов при 37°С в аэробных или анаэробных условиях, в зависимости от штамма. Планшеты инкубировали в аэробных условиях или в атмосфере с повышенной концентрацией СО₂ (для штаммов, нуждающихся в ней) в инкубаторе при 37°С. Значения OD получали через 8, 16 и 24 часа соответственно. Перед каждым измерением OD содержимое лунок осторожно перемешивали. Параллельно со снятием результатов значений OD культуры инокулировали из второго 96-луночного планшета, из каждого разведения, в планшеты с подходящей твердой средой и инкубировали в течение 24 часов при 37°С в аэробных или анаэробных условиях.

Для анализа результатов эксперимента брали среднее значение измерений OD, полученное для трех повторений в отдельные моменты времени (0, 8, 16 и 24 ч) для отдельных микробов (Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Lactobacillus gasseri/plantarum). Кроме того, учитывали количество бактерий, выращенных на твердой среде. Результаты представлены в таблицах 1, 2, 3, 4 и 5. Результаты тестов подтверждают специфическую зависимую от концентрации селективность и высокую антибактериальную эффективность тотарола в отношении штамма патогенных микроорганизмов: Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, при низких значениях MIC для бактерий рода Lactobacillus.

Пример 2

Тестирование воздействия тотарола на вагинальные эпителиальные клетки человека клеточной линии А-431(АТСС® CRL-1555™)

Исследование проводили с применением следующего теста: Annexin-V-Fluos (Roche, Mannheim, Germany) в ходе инкубации в течение 2, 8 и 24 часов, в условиях in vitro, согласно инструкциям производителя теста. Образец тотарола получали посредством растворения 3 мг тотарола в 3 мл 100%-ого DMI.

Период культивирования клеточной линии А-431 составлял 20 дней. Культивирование проводили при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 10% СО₂, на культуральной среде DMEM (Institute of Immunology and Experimental Therapy PAS [IITD PAN], Wroclaw), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Sigma-Aldrich). Культуральную жидкость заменяли регулярно каждые 48 часов. После достижения отделяемой выращенной культуры или так называемого «монослоя» клетки пассировали с использованием (в течение примерно 10 мин) 0,25% трипсина (Sigma-Aldrich). Затем полученную тканевую линию пассировали в 24-луночные планшеты (ТРР), корректируя их плотности до значения 5 × 10⁵ на лунку. Культивирование ткани исследуемых линий проводили в течение 3 последующих дней на поверхности стерильных предметных стекол микроскопа, помещенных на дно 24-луночного планшета, до тех пор, пока на поверхности предметных стекол микроскопа не была получена отделяемая выращенная культура. После получения так называемого «монослоя» клетки промывали PBS без ионов Са²⁺ и Mg²⁺ (IITD PAN, Wroclaw) и переливали в 700 мкл свежей среды DMEM с 10% FBS вместе с 300 мкл правильно приготовленного тотарола.

Отрицательный контроль: 1000 мкл свежей среды DMEM с 10% FBS.

Контроль-растворитель: 700 мкл свежей среды DMEM с 10% FBS+300 мкл растворителя DMI.

Положительный контроль некроза: 900 мкл свежей среды DMEM с 10% FBS+100 мкл Н₂O₂ (30%).

Правильное исследование с использованием теста Annexin-V-Fluos вызывает окрашивание апоптотических клеток в зеленый цвет. Для окрашивания некротических клеток использовали йодид пропидия (PI). Этот краситель обладает способностью свободно проникать внутрь клетки только через поврежденную клеточную мембрану, окрашивая ее внутри в красный цвет. В случае отсутствия повреждений клеточной мембраны йодид пропидия остается на поверхности клетки, образуя характерное красное «галогеновое» окружение клетки. После соответствующего времени исследования, то есть через 2, 8 и 24 часа, культуральную жидкость удаляли, содержимое дважды промывали PBS (предварительно нагретым до температуры 37°С). Затем 100 мкл смеси флуоресцентных окрашивающих веществ, включенных в набор Annexin-V-Fluos (Roche), наносили на поверхность каждого предметного стекла микроскопа (помещенного в лунку с культурой) и дополнительно использовали окрашивающее вещество Hoechst (окрашивающее клеточную ДНК). Процедуру окрашивания проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Культуру вместе с нанесенными на нее окрашивающими веществами инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Интенсивность света, испускаемого клетками, окрашенными отдельными окрашивающими веществами, наблюдали с использованием флуоресцентного микроскопа при длине волны 494-520 нм, используя 400-х кратное увеличение. Клетки подсчитывали в пяти полях зрения, и результаты были усреднены. Надежность проведенных испытаний подтверждали посредством пероксида водорода, применяемого в качестве положительного контроля, вызывающего явный процесс некроза уже после 2 часов инкубации. Анализ данных проводили на основе среднего количества клеток из пяти полей зрения в отдельные моменты времени (2, 8 и 24 ч). Результаты представлены в Таблице 6 и в виде фотодокументации - Фиг. 1, 2, 3, 4. Результаты тестов доказывают отсутствие апоптотического и некротического воздействия тотарола на вагинальные эпителиальные клетки человека А-431 в широком диапазоне времени инкубации (2-24 часа).

Пример 3. Получение композиции в форме порошка Ингредиенты композиции:

1. тотарол 0,1 мас. частей

2. молочная кислота 1,0 мас. частей (2 моля)

3. Eudragit Е-100 1,5 мас. частей (1 моль)

4. метилцеллюлоза 97,4 мас. частей

Композицию получали путем растворения Eudragit в молочной кислоте при стехиометрическом соотношении, указанном в составе композиции, в смесителе, оборудованном механической мешалкой, перемешивая в течение 20 минут, затем оставляя всю смесь на 24 часа. По истечении этого времени полученный компонент растворяли в 95%-ом этиловом спирте, используя 10 мас. частей спирта и 0,1 мас. часть тотарола из расчета на общее количество ингредиентов. Всю смесь перемешивали до растворения компонента, затем полученный раствор распыляли через сопло на метилцеллюлозу, помещенную в смеситель распылительного сопла, и перемешивали до равномерного смачивания метилцеллюлозы, но не менее чем в течение 10 минут. Влажный продукт подвергали сушке при температуре 25°С в сушилке с принудительной циркуляцией воздуха и конденсатором растворителя. В ходе сушки этиловый спирт удалялся. Получали сыпучий порошок, который перемешивали до полной гомогенизации и дозировали в пластиковые или стеклянные контейнеры.

Пример 4. Получение композиции в форме геля Ингредиенты композиции:

1. тотарол 0,5 мас. частей

2. молочная кислота 0,5 мас. частей (1 моль)

3. хитозан 0,83 мас. частей (1 моль)

4. метилцеллюлоза 98,2 мас. частей

5. очищенная вода 25 мас. частей из расчета на общее количество ингредиентов

Композицию получали аналогично описанному в Примере 3, но добавляли воду при перемешивании к полученному сухому продукту в форме порошка и затем, после получения гомогенной смеси, оставляли на 30 мин без перемешивания. Полученный гель дозировали в пластиковые контейнеры с аппликаторами.

Пример 5. Получение композиции в форме таблеток Ингредиенты композиции:

1. тотарол 0,08 мас. частей

2. молочная кислота 0,5 мас. частей (1 моль)

3. поливинилпирролидон-90 5,0 мас. частей (1 моль)

4. метилцеллюлоза 94,4 мас. частей

Композицию получали подобным образом, как в Примере 3, но добавляли известные вещества, применяемые при таблетировании, с получением сухого продукта в форме порошка, при необходимости, и затем продукт таблетировали известным способом с получением подходящих терапевтических доз.

Пример 6. Получение композиции в форме вагинальных суппозиториев Ингредиенты композиции:

1. тотарол 0,5 мас. частей

2. молочная кислота 4,0 мас. частей (8 молей)

3. хитозан 0,83 мас. частей (1 моль)

4. метилцеллюлоза 94,4 мас. частей

Вспомогательные средства из расчета на общее количество ингредиентов композиции:

1. желатин 16,5 мас. частей

2. очищенная вода 83,5 мас. частей

Композицию получали подобным образом, как в Примере 3, но полученный сухой продукт в форме порошка растворяли в части воды, получая гель, к которому добавляли водный раствор желатина (полученный из остатка воды), нагретый до температура 90°С. Затем продукт перемешивали и разливали в формы, получая формованные вагинальные суппозитории.

Группа изобретений относится к области медицины, в частности к гинекологии, и раскрывает применение тотарола в качестве активного вещества в количестве от 0,001 до 5 мас. частей для получения препарата для лечения воспалений слизистой оболочки влагалища бактериального происхождения, для облегчения симптомов при таком лечении и для профилактики и предупреждения рецидивов таких воспалений, где указанное воспаление относится к анаэробному бактериальному вагинозу (БВ) и аэробному вагиниту (АВ). Также группа изобретений относится к фармацевтической композиции для лечения воспалений слизистой оболочки влагалища бактериального происхождения, для облегчения симптомов при таком лечении и для профилактики и предупреждения рецидивов таких воспалений, где указанное воспаление относится к анаэробному бактериальному вагинозу (БВ) и аэробному вагиниту (АВ). Техническим результатом группы изобретений является высокая терапевтическая полезность и безопасность, а также высокая антибактериальная эффективность в отношении бактерий, являющихся основной причиной как БВ, так и АВ, без неблагоприятного воздействия на анаэробные бактерии рода Lactobacillus. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 6 пр.

1. Применение тотарола в качестве активного вещества в количестве от 0,001 до 5 мас. частей для получения препарата для лечения воспалений слизистой оболочки влагалища бактериального происхождения, для облегчения симптомов при таком лечении и для профилактики и предупреждения рецидивов таких воспалений, где указанное воспаление относится к анаэробному бактериальному вагинозу (БВ) и аэробному вагиниту (АВ).

2. Фармацевтическая композиция для лечения воспалений слизистой оболочки влагалища бактериального происхождения, для облегчения симптомов при таком лечении и для профилактики и предупреждения рецидивов таких воспалений, где указанное воспаление относится к анаэробному бактериальному вагинозу (БВ) и аэробному вагиниту (АВ), содержащая от 75 до 95 мас. частей метилцеллюлозы, от 0,5 до 5 мас. частей молочной кислоты, от 0,5 до 5 мас.частей полимера, выбранного из сополимера метакриловой кислоты и этилакрилата, сополимера диметиламиноэтилметакрилата, бутилметакрилата, метилметакрилата в соотношении 2:1:1, хитозана, поливинилпирролидона или их смесей, где стехиометрическое отношение молочной кислоты и основного полимера лежит в диапазоне от 1:1 до 8:1, характеризующаяся тем, что она содержит тотарол в количестве от 0,001 до 5 мас. частей в качестве активного вещества.