ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СТАБИЛИЗИРУЮЩАЯ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ ТОКСИН Российский патент 2024 года по МПК A61K9/08 A61K38/48 A61K47/18 A61K47/20 A61K47/26 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к стабилизирующей жидкой композиции, обладающей эффектом повышения стабильности ботулинического токсина, способу ее изготовления, и фармацевтической композиции для повышения стабильности ботулинического токсина, которая включает стабилизирующую жидкую композицию.

Заявка испрашивает приоритет и преимущество корейской патентной заявки № 10-2018-0151983, поданной 30 ноября 2018 г., и корейской патентной заявки № 10-2019-0101723, поданной 20 августа 2019 г., раскрытия которых включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей своей полноте.

Предпосылки создания изобретения

Существует 127 или более видов, классифицируемых по морфологии и функциям в роду Clostridium. Анаэробные грамположительные бактерии Clostridium botulinum генерируют сильный полипептидный нейротоксин, такой как ботулинический токсин (далее в настоящем документе взаимозаменяемо используется также термин «токсин»), вызывающий у людей и животных нейропаралитическое заболевание, известное как ботулизм. Симптомы отравления ботулитическим токсином могут включать нарушения походки, дисфагию, нарушения речи и паралич дыхательных мышц, что может привести к смерти.

Одна единица ботулинического токсина определяется как LD₅₀ при интраперитонеальной инъекции самкам мышей Swiss Webster весом приблизительно 18-20 г. Одна единица ботулинического токсина представляет собой количество ботулинического токсина, которое убивает 50% животных в группе самок мышей Swiss Webster.

Описано семь типов иммунологически различных ботулинических нейротоксинов, таких как серотипы A, B, C, D, E, F и G ботулинического нейротоксина, которые различают по нейтрализации типоспецифическим антителом. Различные серотипы ботулинического токсина различаются у видов животных, которых они поражают, а также степени тяжести и продолжительности вызываемого ими паралича. Ботулинический токсин, по-видимому, с высокой аффинностью связывается с холинергическими двигательными нейронами, перемещается в нейрон и блокирует пресинаптическое высвобождение ацетилхолина.

Ботулинический токсин использовали в клинических условиях для лечения нейромышечных расстройств, характеризующихся гиперактивностью скелетных мышц. Ботулинический токсин типа A одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для лечения эссенциального блефаропазма, страбизма и гемифациального спазма у пациентов старше 12 лет, а также одобрен для лечения цервикальной дистонии, глабеллярных (лицевых) морщин и гипергидроза. FDA также одобрило ботулотоксин типа B для лечения цервикальной дистонии, глабеллярных (лицевых) морщин.

Известно, что ботулинический токсин типа А растворим в разбавленном водном растворе при pH 4-6,8. Стабилизирующий нетоксичный белок отделяется от нейротоксина при pH приблизительно 7 или более, что приводит к постепенной утрате токсичности, особенно при повышении pH и температуры. Как это часто бывает с ферментами, биологическая активность ботулинического токсина (который представляет собой внутриклеточную пептидазу), по меньшей мере частично зависит от его трехмерной морфологии. Разбавление до раствора, содержащего токсин в количестве от миллиграмм до нанограмм на мл, сталкивается со значительными трудностями, например, тенденцией снижения количества доступного токсина за счет прилипания токсина к поверхности. Кроме того, токсин-содержащую фармацевтическую композицию иногда используют через месяцы или годы после изготовления, и в этом случае токсин может легко окисляться или разлагаться на мелкие фрагменты из-за природы белка. Поэтому необходимо стабилизировать токсин с помощью стабилизатора.

Обычно для решения этой проблемы в основном используют альбумин, сахарозу, трегалозу и/или желатин в качестве стабилизатора белка ботулинического токсина в фармацевтическом процессе.

Например, как описано ниже, для фармацевтической композиции, содержащей ботулинический токсин, в качестве стабилизатора используют альбумин.

Коммерчески доступная фармацевтическая композиция, содержащая ботулинический токсин, коммерчески доступна от компании Allergan, Inc (Irvine, CA) под торговой маркой BOTOX® (ботулинический токсин типа A, комплекс очищенного нейротоксина). Каждая ампула со 100 единицами BOTOX® состоит из примерно 5 нг комплекса очищенного ботулинического токсина типа A, 0,5 мг сывороточного альбумина человека и 0,9 мг хлорида натрия, и содержимое представлено в виде высушенного в вакууме порошка и предназначено для восстановления стерильным физиологическим раствором без консерванта (инъекция с 0,9% раствором хлорида натрия). Другие коммерчески доступные фармацевтические композиции, содержащие ботулинический токсин, могут включать Dysport® (комплекс токсина Clostridium botulinum типа A и гемагглютинина с лактозой и сывороточным альбумином человека в фармацевтической композиции с ботулиническим токсином, коммерчески доступный от Ipsen Limited, Berkshire, UK, в виде порошка для восстановления 0,9% раствором хлорида натрия перед использованием) и MyoBloc^TM (раствор для инъекций, включающий ботулинический токсин типа B, сывороточный альбумин человека, сукцинат натрия и хлорид натрия при pH примерно 5,6, коммерчески доступный от Solstice Neurosciences, San Diego, CA). Комплексы нейротоксического компонента (молекула токсина 150 кДа) и ботулинического токсина (от 300 кДа до 900 кДа) могут быть получены, например, у List Biological Laboratories, Inc (Campbell, CA); Centre for Applied Microbiology and Research (Porton Down, UK); и Wako (Osaka, Japan), а также у Sigma Chemicals (Saint Louis, MI).

Как описано выше, причина, по которой в основном используют альбумин, заключается в том, что альбумин может не только стабилизировать белковый активный ингредиент в фармацевтической композиции, но также может обладать преимуществом незначительной иммуногенности при введении пациентам-людям. Однако продукты крови, такие как альбумин, могут представлять потенциальный риск инфицирования пациента происходящим из крови патогеном или инфекционным микроорганизмом и, в частности, опосредование заболеваний, таких как болезнь Крейтцфельдта-Якоба, вызванная вирусной инфекцией или вирусным белком, может быть не полностью устранено, и может также иметься риск инфицирования пациента неизвестным до сих пор патогеном. Следовательно, когда в качестве стабилизатора используют вышеописанный альбумин, в процессе подготовки осуществляют выбор донора или места донорства, и выполняют удаление и/или инактивацию инфекционного материала, чтобы снизить риск его распространения.

Кроме того, иногда используют желатин. Однако, поскольку он также является белком, выделенным из животного, он может вызывать заболевание, подобно альбумину, и поэтому не может быть рекомендован для применения в фармацевтическом процессе.

В зарегистрированном корейском патенте № 10-0799400 раскрыт способ применения фармацевтического препарата рекомбинантного альбумина (rSA), продуцируемого дрожжами, в качестве технологии использования стабилизатора, не имеющего животное происхождение, в фармацевтическом процессе для белка ботулинического токсина. Однако, поскольку новая антигенная структура, неоэпитоп, образуется в ходе производства, выделения и изолирования рекомбинантного альбумина (rSA), нельзя полностью избежать возможности индукции иммунного ответа у реципиента лекарственного средства.

Кроме того, в корейском зарегистрированном патенте № 10-0665469 раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая ботулинический токсин, полисахарид (включая гидроксиэтилкрахмал) и лизин, глицин, гистидин или аргинин в качестве аминокислоты. Однако фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет собой композицию для лиофилизированного состава, и ее условия хранения ограничены замораживанием или охлаждением. Лиофилизированный ботулинический токсин требует процесса размораживания или разведения замороженного состава непосредственно перед применением, и в этом процессе может возникнуть ошибка. Кроме того, лиофилизированный ботулинический токсин неудобен в применении и имеет проблему невозможности разработки в виде предварительно заполненного шприца.

Что касается композиции для стабилизации ботулинического токсина, в публикации нерассмотренной патентной заявки США № 2007-0134199 раскрыта композиция, содержащая неионогенное поверхностно-активное вещество, содержащее полисорбат, и глутамин и глутаминовую кислоту или аспарагин и аспарагиновую кислоту в качестве аминокислот. Когда ботулинический токсин разводят в жидкой композиции по настоящему изобретению и хранят в условиях охлаждения при 4°С, он является стабилизированным в течение 8 месяцев, но когда ботулинический токсин хранят при комнатной температуре, например, 37°С, его активность снижается в течение одного месяца, поэтому существует предел для стабилизации фармацевтической жидкой композиции, содержащей ботулинический токсин, при комнатной температуре.

Раскрытие

Техническая проблема

Настоящее изобретение направлено на обеспечение стабилизирующей жидкой композиции, которая безопасна для человека, поскольку она не получена из животного источника, и повышает стабильность раствора ботулинического токсина для поддержания активности ботулинического токсина при комнатной температуре, и раствора ботулинического токсина с повышенной стабильностью.

Однако технические проблемы, которые должны быть решены в настоящем изобретении, не ограничиваются вышеописанными проблемами, и другие проблемы, которые не описаны в настоящем документе, будут полностью понятны специалистам в данной области техники из следующих описаний.

Техническое решение

Для достижения вышеописанных целей настоящее изобретение обеспечивает жидкую композицию для стабилизации ботулинического токсина, которая включает полисорбат 80 и серин в качестве активных ингредиентов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения в композиции соотношение полисорбата 80 и серина составляет 1 (мг/мл): 5 (мМ) или более.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция дополнительно включает метионин.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения в композиции соотношение полисорбата 80, серина и метионина составляет 1 (мг/мл): 5-50 (мМ): 0,2 (мМ).

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, выполненную в жидкой лекарственной форме, которая включает жидкую композицию для стабилизации ботулинического токсина; и ботулинический токсин в качестве активных ингредиентов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация полисорбата 80 составляет 0,001 мг или более на 40 единиц ботулинического токсина.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация серина составляет 5 мМ или более на 40 единиц ботулинического токсина.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация метионина составляет менее 0,5 мМ на 40 единиц ботулинического токсина.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения ботулинический токсин выбран из группы, состоящей из ботулинического токсина типа A, B, C, D, E, F и G.

Предпочтительно ботулинический токсин находится в форме, которая не содержит комплексообразующий белок или сложную форму, которая содержит комплексообразующий белок.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ стабилизации ботулинического токсина, который включает смешивание жидкой композиции, содержащей полисорбат 80 и серин, с ботулиническим токсином.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает применение жидкой композиции, содержащей полисорбат 80 и серин, для стабилизации ботулинического токсина.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает применение полисорбата 80 и серина для получения лекарственного средства, используемого для стабилизации ботулинического токсина.

Благоприятные эффекты

В настоящем изобретении используют стабилизатор, который не получен из животного источника, и, таким образом, пациенту, которому вводят фармацевтическую композицию, содержащую ботулинический токсин, может быть гарантирована безопасность от потенциального риска инфицирования происходящим из крови патогеном или инфекционным микроорганизмом. Кроме того, настоящее изобретение может гарантировать стабильность при хранении и распределении, поскольку активность ботулинического токсина сохраняется в течение длительного времени при комнатной температуре. Кроме того, настоящее изобретение обладает повышенным удобством изготовления, поскольку отсутствует необходимость в процессе сушки вымораживанием.

Описание чертежей

ФИГ. 1 представляет собой график, показывающий изменение показателя смертности при введении раствора ботулинического токсина в зависимости от изменения концентрации полисорбата 80.

ФИГ. 2 представляет собой график, показывающий изменение показателя смертности при введении раствора бутулинического токсина в зависимости от изменения концентрации серина.

ФИГ. 3 представляет собой график, показывающий изменение показателя смертности при введении раствора ботулинического токсина в зависимости от изменения концентрации серина из-за добавления метионина.

Способы по изобретению

Далее в настоящем документе, для содействия пониманию настоящего изобретения будут предложены иллюстративные примеры. Однако следующие примеры приведены лишь для облегчения понимания настоящего изобретения, а не для ограничения настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина, которая включает полисорбат 80 и серин в качестве активных ингредиентов; и фармацевтической композиции, выполненной в жидкой лекарственной форме, которая включает жидкую композицию для стабилизации ботулинического токсина и ботулинический токсин в качестве активных ингредиентов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности ботулинического токсина с использованием полисорбата 80 и серина.

Авторы изобретения провели эксперимент по обеспечению стабилизатора, который является безопасным, поскольку не используется белок животного происхождения, и имеет длительную стабильность при комнатной температуре или даже при хранении в холодильнике, в качестве альтернативы жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина. состоящей из комбинации метионина и полисорбата 20. В результате было получено подтверждение того, что комбинация серина и полисорбата 80 обладает превосходным эффектом поддержания активности ботулинического токсина при комнатной температуре в течение длительного времени, и настоящее изобретение было завершено.

В настоящем изобретении «стабильность или стабилизация» означает, что активность ботулинического токсина поддерживается и, например, активность ботулинического токсина поддерживается на уровне 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40 % или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, или 100%, предпочтительно 50% или более и наиболее предпочтительно 100% по сравнению с активностью до эксперимента или в определенных условиях. Например, по сравнению с количеством субъектов, которым вводили ботулинический токсин, величина, полученная как (количество умерших субъектов среди субъектов, которым вводили ботулинический токсин / количество субъектов, которым вводили ботулинический токсин) x 100, поддерживается на уровне 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, или 100%, предпочтительно 50% или более и наиболее предпочтительно 100%. Активность ботулинического токсина может быть оценена в соответствии с различными способами, известными в данной области, и, например, оценивается со ссылкой на способ анализа летальности, описанный в работе PearceL.B.et al 1994. Measurement of Botulinum Toxin Activity: Evaluation of the Lethality Assay. Toxicology and Applied Pharmacology' 128: 69-77'. В соответствии с экспериментальным примером настоящего изобретения 0,1 мл (3 или 4 единицы/0,1 мл/мышь) изготовленной жидкой композиции ботулинического токсина вводили интраперитонеально пяти или десяти 4-недельным ICR (Institute of Cancer Research, USA) самкам мышей, а затем наблюдали в течение 72 часов, чтобы подтвердить показатель смертности. Кроме того, условие «стабильность или стабилизация» может относиться к стабильности при хранении или распределении при комнатной температуре, но настоящее изобретение этим не ограничивается. В соответствии с конкретным вариантом осуществления условие стабильности или стабилизации может представлять собой условие 35-45°С/50-80% относительной влажности (RH), и предпочтительно 40°С/70% RH.

Жидкая композиция для стабилизации ботулинического токсина в соответствии с настоящим изобретением включает полисорбат 80 и серин в качестве активных ингредиентов.

Кроме того, фармацевтическая композиция, выполненная в жидкой лекарственной форме, в соответствии с настоящим изобретением включает жидкую композицию для стабилизации ботулинического токсина и ботулинический токсин в качестве активных ингредиентов. То есть фармацевтическая композиция, выполненная в жидкой лекарственной форме, включает полисорбат 80 и серин; и ботулинический токсин в качестве активных ингредиентов.

В настоящем изобретении «серин» представляет собой соединение, представленное химической формулой HO₂CCH(NH₂)CH₂OH, и включает его стереоизомер. «Серин» может быть получен с помощью различных способов, известных в данной области, которые включают способ химического синтеза, способ отделения серина, синтезированного в организме животного, или способ получения коммерчески доступного соединения, и например, серин может быть получен с помощью способа удаления 3-фосфосерина и группы фосфорной кислоты путем реакции переноса аминогруппы с глутаминовой кислотой, начиная с окисления 3-фосфоглицерата, образованного из 3-фосфогидроксипирувата и никотинамидадениндинуклеотида (NADH), но настоящее изобретение этим не ограничивается. В настоящем изобретении концентрация серина, включенного в фармацевтическую композицию, выполненную в жидкой лекарственной форме, может составлять 5 мМ или более на 40 единиц ботулинического токсина, предпочтительно 5-100 мМ на 40 единиц ботулинического токсина, более предпочтительно 15-100 мМ на 40 единиц ботулинического токсина и наиболее предпочтительно 15-50 мМ на 40 единиц ботулинического токсина. При концентрации менее 5 мМ на 40 единиц ботулинического токсина стабилизация ботулинического токсина, вызванная серином, может проявляться на более низком уровне, чем предварительно определенный уровень, при длительном хранении, и при концентрации более 100 мМ на 40 единиц ботулинического токсина, синергетический эффект, вызванный избыточным количеством серина, может больше не проявляться, и может быть неэкономичным.

В настоящем изобретении «полисорбат 80» представляет собой соединение, представленное химической формулой C₆₄H₁₂₄O₂₆, представляет собой неионогенное поверхностно-активное вещество и является растворимым. Полисорбат 80 называют полиоксиэтиленсорбитаном моноолеиновой кислоты, моноолеатом полиоксиэтиленсорбитана, эмазолом 4130, твином 80 или твином 79 и используется в качестве пищевой или косметической добавки, например, в качестве пластификатора, гелеобразующего агента, поверхностно-активного вещества, основы, препарат с сахарным покрытием, водостойкого агента, антиадгезивного агента, вспомогательного вещества, диспергирующего агента, разрыхлителя, смачивающего агента, стабилизатора, смягчающего агента, буфера, растворителя, солюбилизирующего агента, эмульгирующего агента, энтеросолюбильного покрывающего агента, покрывающего агента, отбеливающего агента, суспендирующего агента или смазывающего вещества. Полисорбат 80 может быть получен различными способами, известными в данной области, и может быть выделен в природе или синтезирован химическим путем. В настоящем изобретении концентрация полисорбата 80, включенного в фармацевтическую композицию, выполненную в жидкой лекарственной форме, может составлять 0,001 мг или более на 40 единиц ботулинического токсина, предпочтительно от 0,1 до 5 мг на 40 единиц ботулинического токсина, более предпочтительно от 0,1 до 2 мг на 40 единиц ботулинического токсина и наиболее предпочтительно от 0,5 до 2 мг на 40 единиц ботулинического токсина. При менее 0,001 мг на 40 единиц ботулинического токсина стабилизация ботулинического токсина полисорбатом 80 может проявляться на уровне ниже предварительно определенного при длительном хранении, а при более чем 5 мг на 40 единиц ботулотоксина синергетический эффект, вызванный избытком полисорбата 80, может больше не проявляться, и может быть неэкономичным.

В жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина по настоящему изобретению соотношение полисорбат 80 : серин на 20 единиц ботулинического токсина может составлять 1 (мг/мл) : 5 (мМ) или более, предпочтительно 1 (мг/мл) : 5-50 (мМ) и более предпочтительно 1 (мг/мл) : 15-50 (мМ). Когда в композиции соотношение полисорбат 80 : серин составляет 1 (мг/мл) : менее 5 (мМ), стабилизация ботулинического токсина может проявляться на уровне ниже предварительно определенного при длительном хранении.

В настоящем изобретении «ботулинический токсин» может быть случайным образом выбран из группы, состоящей из ботулинического токсина типа A, B, C, D, E, F и G, и предпочтительно ботулинического токсина типа A. Ботулинический токсин может включать как форму, которая не содержит комплексообразующего белка, так и сложную форму, которая содержит комплексообразующий белок. Молекулярная масса белка ботулинического токсина, полученного из Clostridium botulinum типа A, B, C, D, E, F или G, который не содержит встречающийся в природе комплексообразующий белок, составляет приблизительно 150 кДа. Однако, когда белок токсина продуцируется Clostridium botulinum, белок ботулинического токсина образуется путем формирования различных комплексов с несколькими белками гемагглютинина, которые помогают и защищают действие белка ботулинического токсина и негемагглютининовых белков. Ботулинический токсин типа A, содержащий встречающийся в природе комплексообразующий белок, представляет собой комплекс, имеющий молекулярную массу приблизительно 900 кДа, 500 кДа или 300 кДа, ботулинические токсины типов B и C представляют собой комплексы, имеющие молекулярную массу приблизительно 500 кДа, ботулинический токсин типа D представляет собой комплекс, имеющий молекулярную массу приблизительно 300 кДа или 500 кДа, а ботулинические токсины типов E и F представляют собой комплексы, имеющие молекулярную массу приблизительно 300 кДа. В настоящем изобретении 1 единица ботулинического токсина может быть определена как LD₅₀, при которой показатель смертности, вызванной интраперитонеальной инъекцией самкам мышей Swiss Webster весом 18-20 г, составляет 50%.

В качестве активного ингредиента жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина в соответствии с настоящим изобретением может быть дополнительно включен метионин в дополнение к серину и полисорбату 80.

В настоящем изобретении концентрация метионина, включенного в фармацевтическую композицию, выполненную в жидкой лекарственной форме, может составлять менее 0,5 мМ на 40 единиц ботулинического токсина и более предпочтительно 0,2-0,4 мМ на 40 единиц ботулинического токсина, но настоящее изобретение этим не ограничивается.

В жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина по настоящему изобретению соотношение в композиции полисорбат 80 : серин : метионин на 20 единиц ботулинического токсина может составлять 1 (мг/мл) : 2,5-50 (мМ) : 0,2 (мМ), предпочтительно 1 (мг/мл) : 5-50 (мМ) : 0,2 (мМ), более предпочтительно 1 (мг/мл) : 7,5-30 (мМ) : 0,2 (мМ), и еще более предпочтительно 1 (мг/мл) : 7,5-25 (мМ) : 0,2 (мМ). Когда в композиции соотношение полисорбат 80 : серин : метионин составляет 1 (мг мл) : менее 2,5 или более 50 (мМ) : 0,2 (мМ), стабилизация ботулинического токсина может проявляться на уровне ниже предварительно определенного при длительном хранении.

В соответствии с настоящим изобретением жидкая композиция для стабилизации ботулинического токсина и/или включающая ее фармацевтическая композиция, выполненная в жидкой лекарственной форме, может включать фармацевтически приемлемый носитель в дополнение к активным ингредиентам. В настоящем документе фармацевтически приемлемый носитель обычно используется при изготовлении и включает лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, камедь акации, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло, но настоящее изобретение ими не ограничивается. Кроме того, жидкая композиция для стабилизации ботулинического токсина и/или фармацевтическая композиция, выполненная в жидкой лекарственной форме, по настоящему изобретению может дополнительно включать смазывающее вещество, смачивающий агент, подслащивающий агент, вкусовой агент, эмульгирующее вещество, суспендирующий агент или консервант, в дополнение к описанным выше ингредиентам.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, интраперитонеально или местно) желаемым способом, а доза может быть подходящим образом выбрана специалистами в данной области с учетом состояния и массы тела пациента, тяжести заболевания, дозированной формы, способа и продолжительности введения.

Композицию в соответствии с настоящим изобретением вводят в фармацевтически эффективном количестве. В настоящем изобретении «фармацевтически эффективное количество», используемое в настоящем документе, относится к количеству, достаточному для лечения заболевания с разумным соотношением польза/риск, применимым к медицинскому лечению, и эффективная доза может определяться параметрами, включающими тип заболевания пациента, тяжесть, активность лекарственного средства, чувствительность к лекарственному средству, время введения, путь введения и скорость выведения, продолжительность лечения и одновременно применяемые лекарственные средства, а также другими параметрами, хорошо известными в области медицины.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с другими терапевтическими агентами, и можно вводить последовательно или одновременно с общепринятым терапевтическим агентом, или вводить в виде одной или нескольких доз. Принимая во внимание все вышеупомянутые параметры, важно достичь максимального эффекта с минимальной дозой без побочного эффекта, и такая доза может быть легко определена специалистом в данной области. Препарат для совместного введения не ограничен и, например, вторая композиция может представлять собой антибиотик на основе аминогликозидов или лекарственное средство, которое влияет на мышечную и нейротрансмиссию (миорелаксант на основе тубокуралина).

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ стабилизации ботулинического токсина, который включает смешивание жидкой композиции, включающей полисорбат 80 и серин, с ботулиническим токсином.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает применение жидкой композиции, включающей полисорбат 80 и серин, для стабилизации ботулинического токсина, и применение полисорбата 80 и серина для изготовления лекарственного средства, используемого для стабилизации ботулинического токсина.

Кроме того, используемый в настоящем документе термин «субъект» относится к мишени, нуждающейся в введении ботулинического токсина, и более конкретно включает млекопитающее, такое как человек или примат, не являющийся человеком, мышь, крысу, собаку, кошку, лошадь или корову.

Используемый в настоящем документе термин «введение» относится к обеспечению жидкой композицией, включающей полисорбат 80 и серин; и ботулинический токсин, субъекта с помощью подходящего способа.

Жидкую композицию для стабилизации ботулинического токсина в соответствии с настоящим изобретением получают путем смешивания серина и полисорбата 80.

Кроме того, фармацевтическую композицию, выполненную в жидкой лекарственной форме, в соответствии с настоящим изобретением изготавливают путем получения жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина путем смешивания серина и полисорбата 80; и смешивания жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина и ботулинического токсина.

При необходимости, в дополнение к вышеописанным стадиям, могут быть дополнительно включены одна или несколько стадий, и последовательность не имеет значения. Например, жидкая композиция для стабилизации ботулинического токсина может включать дополнительное смешивание метионина на стадии смешивания серина и полисорбата 80.

Пример

1. Изготовления жидкой композиции, содержащей ботулинический токсин

Жидкую композицию, содержащую ботулинический токсин, изготавливали путем разбавления раствора ботулинического токсина с использованием жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина, доведенной до надлежащей концентрации, и, в заключение, регулирования концентрации раствора ботулинического токсина до надлежащей концентрации.

Экспериментальные примеры

1. Тест для выбора жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина

Для выбора стабилизатора токсина Clostridium botulinum типа А проводили эксперимент по выбору состава жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина с использованием различных стабилизаторов.

Используя жидкую композицию для стабилизации ботулинического токсина, имеющую состав, показанный в таблице 1 ниже, готовили раствор ботулинического токсина с концентрацией 300 Ед/мл.

Как и запатентованный состав Innotox, контроль готовили путем растворения 20 мМ метионина и 2 мг/мл полисорбата 20 в 10% солевом растворе. Кроме того, экспериментальные группы (примеры 1-7) изготавливали путем растворения 20 мМ стабилизатора в изотоническом растворе хлорида натрия и растворения 2 мг/мл полисорбата 80 в 10% солевом растворе.

Изготовленный раствор ботулинического токсина хранили в камере для испытания на стабильность в условиях, включающих 40°С/70% RH, и отбирали пробы через регулярные интервалы времени. Раствор для инъекций (изотонический раствор хлорида натрия) в объеме 9 мл добавляли к 1 мл отобранного раствора ботулинического токсина, чтобы разбавить раствор в 10 раз, и разбавленный образец вводили интраперитонеально пяти 4-недельным ICR (Institute of Cancer Research, USA) самкам мышей при 3 Ед/0,1 мл (1 Ед = LD₅₀). При наблюдении в течение 72 часов после интраперитонеальной инъекции оценивали количество умерших мышей и соответствующий показатель смертности.

В результате, как показано в таблице 1, за исключением примеров 1 и 4, и контроля, было подтверждено резкое снижение стабильности. То есть активность ботулотоксина длительное время сохранялась только в примерах 1 и 4, и контроле.

Из приведенного выше результата можно видеть, что комбинация серина и полисорбата 80 представляет собой стабилизатор, который может заменить комбинацию метионина и полисорбата 80.

Таблица 1

Классификация Жидкая композиция для стабилизации ботулинического токсина Показатель смертности ( %) Стабильность Стабилизатор (20 мМ) Полисорбат
(2 мг/мл) 0 неделя 1-ая неделя 2-ая неделя Контроль Метионин Твин 20 100% 100% 100% O Пример 1 Метионин Твин 80 100% 100% 100% O Пример 2 Глицин Твин 80 100% 100% 0% X Пример 3 Цистеин Твин 80 100% 0% 0% X Пример 4 Серин Твин 80 100% 100% 100% O Пример 5 Zn (50 мМ) Твин 80 100% 40% 0% X Пример 6 Лейцин Твин 80 80% 60% 0% X Пример 7 Витамин C Твин 80 80% 0% 0% X

Однако эксперимент на стабильность выполняли на живых мышах, и из-за его особенностей, даже когда эксперимент на стабильность выполняли с использованием жидкой композиции ботулинического токсина, имеющей одинаковый состав, могут быть получены разные результаты в зависимости от состояния мыши.

2. Тест на стабильность ботулинического токсина в зависимости от изменения концентрации полисорбата 80

В качестве состава жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина выбирали комбинацию серина и полисорбата 80, и проводили эксперимент на стабильность ботулинического токсина в соответствии с изменением концентрации полисорбата 80.

Используя жидкую композицию для стабилизации ботулинического токсина, имеющую состав, описанный в таблице 2 ниже, получали раствор ботулинического токсина с концентрацией 40 единиц/мл. Экспериментальную группу готовили путем растворения 5 мМ серина и 0,001-2 мг/мл полисорбата 80 в 10% изотоническом растворе хлорида натрия. Конкретный экспериментальный способ осуществляли, как описано в экспериментальном примере 1. Однако в этом способе использовали 10 мышей, а концентрация для интраперитонеальной инъекции составляла 4 единицы/0,1 мл.

Результат эксперимента на стабильность ботулинического токсина в зависимости от изменения концентрации полисорбата 80 показан в таблице 2 и на фиг. 1. При концентрации полисорбата 80, составляющей 0,1 мг/мл или более, при каждой концентрации была продемонстрирована некоторая или более высокая степень стабильности. При концентрации полисорбата 80, составляющей 0,1 мг/мл, 0,5 мг/мл и 2 мг/мл, показатель смертности составил 50% или более до 6^-й недели, и при концентрации полисорбата 80, составляющей 0,5 мг/мл или 2 мг/мл, показатель смертности составил 10% до 10^-й недели.

Таблица 2

Раствор ботулинического токсина Показатель смертности (%) Жидкая композиция для стабилизации ботулинического токсина Токсин (Ед/мл) 0 нед 1^-ая нед 2^-ая нед 4^-ая нед 6^-ая нед 8^-ая нед 10^-ая нед 12^-ая нед Полисорбат 80 (мг/мл) серин (мМ) 0,001 5 40 100% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0,01 100% 100% 80% 60% 0% 0% 0% 0% 0,1 100% 100% 90% 90% 60% 30% 0% 0% 0,5 100% 90% 80% 70% 100% 40% 10% 0% 2 100% 70% 100% 70% 70% 40% 10% 0%

3. Тест на стабильность ботулинического токсина в зависимости от изменения концентрации серина

Эксперимент на стабильность ботулинического токсина в зависимости от изменения концентрации серина проводили с использованием комбинации серина и полисорбата 80, выбранной в качестве состава жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина.

Используя жидкую композицию для стабилизации ботулинического токсина, имеющую состав, как описано в таблице 3 ниже, готовили раствор ботулинического токсина с концентрацией 40 Ед/мл. Контрольный образец готовили путем растворения 20 мМ метионина и 2 мг/мл полисорбата 20 в 10% солевом растворе, как в запатентованном составе Innotox. Экспериментальную группу готовили путем растворения 0,1 мг/мл полисорбата 80 и 5-50 мМ серина в 10% изотоническом растворе хлорида натрия. Специфический экспериментальный способ осуществляли, как описано в экспериментальном примере 1. Однако в этом способе использовали 10 мышей, а концентрация для внутрибрюшинной инъекции составляла 4 Ед/0,1 мл.

Результат эксперимента на стабильность ботулинического токсина в зависимости от изменения концентрации серина показан в таблице 3 и на фиг. 2. При концентрации серина 5 мМ, 15 мМ или 50 мМ показатель смертности составил 50% или более до 6^-й недели, демонстрируя, что активность ботулинического токсина сохраняется. В частности, при концентрации серина 50 мМ показатель смертности составил 50% или более до 12^-й недели, демонстрируя, что стабильность ботулинического токсина сохраняется в течение длительного времени по сравнению с комбинацией 20 мМ метионина и 2 мг/мл полисорбата 20.

Таблица 3

Жидкая композиция для стабилизации ботулинического токсина Показатель смертности (%) Серин (мМ) Полисорбат 80 (мг/мл) 0 нед 1-^ая нед 2-^ая нед 4-^ая нед 6-^ая нед 8-^ая нед 10-^ая нед 12-^ая нед 5 0,1 100% 90% 90% 100% 80% 20% 0% 0% 15 100% 90% 100% 100% 70% 40% 0% 20% 50 100% 80% 100% 80% 90% 70% 50% 50% 20 мМ метионина, 2 мг/мл полисорбата 20 100% 90% 80% 100% 90% 90% 20% 20%

4. Тест на стабильность ботулинического токсина в зависимости от добавления метионина

Эксперимент на стабильность ботулинического токсина в зависимости от добавления метионина проводили с комбинацией серина и полисорбата 80, выбранной в качестве состава жидкой композиции для стабилизации ботулинического токсина.

Используя жидкую композицию для стабилизации ботулинического токсина, имеющую состав, как описано в таблице 4 ниже, готовили раствор ботулинического токсина с концентрацией 40 Ед/мл. Контрольный образец готовили путем растворения 20 мМ метионина и 2 мг/мл полисорбата 20 в 10% солевом растворе, как в запатентованном составе Innotox. Экспериментальную группу готовили путем растворения 2 мг/мл полисорбата 80, 5-50 мМ серина и 0,4 мМ метионина в 10% изотоническом растворе хлорида натрия. Осуществляли конкретный экспериментальный способ, как описано в экспериментальном примере 1. Однако в этом способе использовали 10 мышей, а концентрация для интраперитонеальной инъекции составила 4 Ед/0,1 мл.

Таблица 4

Раствор ботулинического токсина Показатель смертности (%) Стабильность Жидкая композиция для стабилизации ботулинического токсина Токсин (Ед/мл) 0 нед 2^-ая нед 4^-ая нед 6^-ая нед 8^-ая нед 10^-ая нед 12^-ая нед Метионин (мМ) Серин (мМ) Полисорбат 80 (мг/мл) 0,4 5 2 40 100 100 70 70 80 70 70 Δ 0,4 15 2 100 100 80 90 80 80 70 Δ 0,4 50 2 100 100 80 80 90 80 80 ○ Метионин 20 мМ, полисорбат 20 2 мг/мл 100 100 80 90 80 60 60 Δ

В результате, как показано в таблице 4 и на фиг. 3 можно видеть, что стабильность раствора ботулинического токсина была улучшена с помощью комбинации метионина, серина и полисорбата 80 во всех составах по сравнению с контролем.

Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что приведенное выше описание настоящего изобретения является иллюстративным, и иллюстративные варианты осуществления, раскрытые в настоящем документе, могут быть легко модифицированы в другие конкретные формы без отступления от технической сущности или существенных особенностей настоящего изобретения. Следовательно, описанные выше в качестве примера варианты осуществления следует интерпретировать как иллюстративные и не ограничивающиеся каким-либо аспектом.

Промышленная применимость

Ожидается, что полисорбат 80 и серин в соответствии с настоящим изобретением будут эффективно использованы в композиции для улучшения стабильности и простоты введения жидкого ботулинического токсина.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к жидкой композиции для применения в стабилизации ботулинического токсина, содержащей (i) полисорбат 80 и серин или (ii) полисорбат 80, серин и метионин в качестве активных ингредиентов, где (i) соотношение полисорбат 80 : серин составляет 1 мг/мл : 5 мМ или более, или (ii) соотношение полисорбат 80 : серин : метионин составляет 1 мг/мл : 5-50 мМ : 0,2 мМ, и где композиция содержит 0,001 мг/мл или более полисорбата 80 на 40 Ед/мл ботулинического токсина, также относится к фармацевтической композиции, выполненной в жидкой лекарственной форме, для блокирования пресинаптического высвобождения ацетилхолина, содержащей жидкую композицию и ботулинический токсин в качестве активных ингредиентов, также относится к способу стабилизации ботулинического токсина, включающему: смешивание жидкой композиции, содержащей (i) полисорбат 80 и серин или (ii) полисорбат 80, серин и метионин, с ботулиническим токсином, где (i) соотношение полисорбат 80 : серин составляет 1 мг/мл : 5 мМ или более, или (ii) соотношение полисорбат 80 : серин : метионин составляет 1 мг/мл : 5-50 мМ : 0,2 мМ, и где композиция содержит 0,001 мг/мл или более полисорбата 80 на 40 Ед/мл ботулинического токсина, и также относится к применению жидкой композиции, содержащей (i) полисорбат 80 и серин или (ii) полисорбат 80, серин и метионин, для стабилизации ботулинического токсина, где (i) соотношение полисорбат 80 : серин составляет 1 мг/мл : 5 мМ или более, или (ii) соотношение полисорбат 80 : серин : метионин составляет 1 мг/мл : 5-50 мМ : 0,2 мМ, и где композиция содержит 0,001 мг/мл или более полисорбата 80 на 40 Ед/мл ботулинического токсина. Группа изобретений обеспечивает получение жидкой композиции, содержащей стабилизатор, который не получен из животного источника, и, таким образом, пациенту, которому вводят фармацевтическую композицию, содержащую ботулинический токсин, может быть гарантирована безопасность от потенциального риска инфицирования происходящим из крови патогеном или инфекционным микроорганизмом, и обеспечение стабильности при хранении и распределении, поскольку активность ботулинического токсина сохраняется в течение длительного времени при комнатной температуре. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 табл., 3 ил.

1. Жидкая композиция для применения в стабилизации ботулинического токсина, содержащая (i) полисорбат 80 и серин или (ii) полисорбат 80, серин и метионин в качестве активных ингредиентов, где (i) соотношение полисорбат 80 : серин составляет 1 мг/мл : 5 мМ или более, или (ii) соотношение полисорбат 80 : серин : метионин составляет 1 мг/мл : 5-50 мМ : 0,2 мМ, и где композиция содержит 0,001 мг/мл или более полисорбата 80 на 40 Ед/мл ботулинического токсина.

2. Фармацевтическая композиция, выполненная в жидкой лекарственной форме, для блокирования пресинаптического высвобождения ацетилхолина, содержащая жидкую композицию по п. 1 и ботулинический токсин в качестве активных ингредиентов.

3. Фармацевтическая композиция по п. 2, где концентрация серина составляет 5 мМ или более на 40 Ед/мл ботулинического токсина.

4. Фармацевтическая композиция по п. 2, где концентрация метионина составляет менее 0,5 мМ на 40 Ед/мл ботулинического токсина.

5. Фармацевтическая композиция по п. 2, где ботулинический токсин выбран из группы, состоящей из ботулинического токсина типа A, B, C, D, E, F и G.

6. Фармацевтическая композиция по п. 2, где ботулинический токсин представляет собой форму, которая не содержит комплексообразующий белок, или сложную форму, которая содержит комплексообразующий белок.

7. Способ стабилизации ботулинического токсина, включающий:

смешивание жидкой композиции, содержащей (i) полисорбат 80 и серин или (ii) полисорбат 80, серин и метионин, с ботулиническим токсином, где (i) соотношение полисорбат 80 : серин составляет 1 мг/мл : 5 мМ или более, или (ii) соотношение полисорбат 80 : серин : метионин составляет 1 мг/мл : 5-50 мМ : 0,2 мМ, и где композиция содержит 0,001 мг/мл или более полисорбата 80 на 40 Ед/мл ботулинического токсина.

8. Применение жидкой композиции, содержащей (i) полисорбат 80 и серин или (ii) полисорбат 80, серин и метионин, для стабилизации ботулинического токсина, где (i) соотношение полисорбат 80 : серин составляет 1 мг/мл : 5 мМ или более, или (ii) соотношение полисорбат 80 : серин : метионин составляет 1 мг/мл : 5-50 мМ : 0,2 мМ, и где композиция содержит 0,001 мг/мл или более полисорбата 80 на 40 Ед/мл ботулинического токсина.