ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО СОСТАВА БОТУЛИНИЧЕСКОГО ТОКСИНА, ДОСТУПНАЯ ДЛЯ ДОЛГОСРОЧНОГО ХРАНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A61K9/19 A61K38/48 A61K47/42 A61K47/26 A61K47/40 

Область техники

[1] Настоящее изобретение относится к композиции лиофилизированной лекарственной формы ботулинического токсина, доступной для долгосрочного хранения, и, более конкретно, к композиции лиофилизированной лекарственной формы ботулинического токсина, доступной для долгосрочного хранения, включающей комплекс ботулинического токсина и протамина сульфата, изотонический агент и буферный агент.

[2]

Уровень техники

[3] Начиная с 1890-х годов были открыты разнообразные штаммы рода Clostridium, которые секретируют токсины, обладающие нейротоксичностью, и в последние 70 лет было получено описание токсинов, секретируемых указанными штаммами.

[4] Токсины, обладающие нейротоксичностью, полученные из штаммов рода Clostridium, а именно ботулинические токсины, делят на семь типов от А до G в зависимости от серологических характеристик. Каждый токсин содержит белок-токсин массой примерно 150 кДа и обычно состоит из комплекса, включающего разные нетоксичные белки. Средний комплекс (300 кДа) состоит из белка-токсина и нетоксического белка, отличного от гемагглютинина, а крупный (450 кДа) комплекс и очень крупный (900 кДа) комплекс имеют такую конфигурацию, при которой средний комплекс связан с гемагглютинином (Sugiyama, Н, Microbiol Rev., 44: 419, 1980). Известно, что функция указанных нетоксичных отличных от гемагглютинина белков заключается в защите токсинов от низкого рН и разных протеолитических ферментов в кишечнике.

[5] Токсин синтезируется в виде отдельного полипептида, имеющего молекулярную массу примерно 150 кДа, в клетках, а затем расщепляется по положению 1/3 от N-конца под действием внутриклеточного протеолитического фермента или путем искусственной обработки ферментом, таким как трипсин, и, таким образом, делится на две единицы, а именно легкую цепь (L: молекулярная масса: 50 кДа) и тяжелую цепь (Н: молекулярная масса: 100 кДа). Токсичность разделенного таким образом токсина значительно увеличивается по сравнению с отдельным полипептидом. Две единицы связаны друг с другом дисульфидной связью, и каждая имеет отличающуюся функцию. Тяжелая цепь связывает рецептор клетки-мишени и взаимодействует с биомембраной при низком рН (рН 4) с образованием канала (Mantecucco, С et al, TIBS, 18: 324, 1993), а легкая цепь обладает фармакологической активностью, тем самым достигается активность проникновения в клетку при использовании поверхностно-активного вещества или нарушается секреция нейротрансмиттеров при инъекции в клетки путем электропорации и т.д.

[6] Токсин ингибирует экзоцитоз ацетилхолина в холинергическом пресинапсе нервно-мышечного соединения, вызывая генерализованную астению. Считалось, что указанный токсин обладает некоторой ферментной активностью, поскольку токсичность проявляется даже при использовании в очень малом количестве.

[7] Недавно было обнаружено, что токсины обладают активностью металлопептидазы, и их субстратами являются синаптобревин, синтаксин и синаптосомный белок массой 25 кДа (SNAP25), которые являются белковыми элементами комплекса осуществления экзоцитоза. Каждый тип токсина использует один из указанных трех белков в качестве субстрата. Известно, что типы В, D, F и G, типы А и Е и тип С расщепляют синаптобревин, SNAP25 и синтаксин, соответственно, в определенных сайтах.

[8] В частности, известно, что ботулинический токсин типа А растворяется в разбавленном водном растворе при рН от 4,0 до 6,8. Известно, что при рН примерно 7 или более стабилизирующий нетоксичный белок отделяется от нейротоксина, что приводит к постепенной потере токсичности, в частности, к снижению токсичности с увеличением рН и температуры.

[9] Так как ботулинический токсин смертелен для организма человека в небольших количествах и легко доступен для массового производства, этот токсин может быть отнесен к четырем основным видам биотеррористического оружия наряду с Bacillus anthracis, Yersinia pestis и вирусом оспы. Тем не менее, в частности, было обнаружено, что ботулинический токсин типа А может парализовать местные мышцы в месте инъекции при инъекции в количестве, равном дозе, которая не оказывает системное воздействие на организм человека, или более низком по сравнению с ней. С учетом указанных характеристик ботулинический токсин типа А может служить средством для удаления морщин и терапевтическим средством при спастической гемиплегии и церебральном параличе, и, таким образом, потребность в нем быстро растет, и для удовлетворения указанной потребности проводятся углубленные исследования способов получения ботулинического токсина.

[10] В настоящее время типовым коммерчески доступным продуктом является БОТОКС^® производства компании Allergan (очищенный комплекс ботулинического нейротоксина типа А), и пробирка со 100 единицами БОТОКСА^® содержит примерно 5 нг очищенного комплекса ботулинического токсина типа А, 0,5 мг человеческого сывороточного альбумина и 0,9 мг хлорида натрия, при этом содержимое обеспечено в высушенной в вакууме форме и требует перерастворения с использованием стерильного физиологического раствора без добавления консервантов (инъекция 0,9% хлорида натрия). Другие коммерчески доступные продукты включают Диспорт^® производства Ipsen, UK (комплекс токсин Clostridium botulinum типа А-гемагглютинин с лактозой и человеческим сывороточным альбумином в фармацевтической композиции ботулинического токсина, который перерастворяют в 0,9% хлориде натрия перед использованием) и МиоБлок^® производства Solstice Neurosciences (инъекционный раствор, содержащий ботулинический токсин типа В, человеческий сывороточный альбумин, сукцинат натрия и хлорид натрия, рН примерно 5,6).

[11] Ботулинический токсин реализуется преимущественно в виде лиофилизированного состава, и было проведено множество исследований на предмет поддержания стабильности лиофилизированного состава в течение длительного периода времени. Например, в патенте США 7744904 В1 описана попытка улучшения стабильности ботулинического токсина путем образования комплекса циклодекстрин-ботулинический токсин простым смешением альфа-, бета- и гамма-циклодекстринов с ботулиническим токсином в фосфатном буферном растворе. В случае альфа-, бета- и гамма-циклодекстринов допускается пероральное введение, но, тем не менее, существуют проблемы, заключающиеся в том, что они не подходят в качестве вспомогательного вещества для ботулинического токсина, который используют, главным образом, для инъекций, вследствие их ограниченной растворимости и почечной токсичности. Кроме того, если ботулинический токсин, имеющий неоднородный размер частиц, вводят в организм путем инъекции, то он не функционирует надлежащим образом в организме, таким образом, желаемые терапевтические или косметические эффекты могут быть не достигнуты, что вызывает разные побочные эффекты.

[12] Таким образом, авторы настоящего изобретения предприняли попытки для разработки лиофилизированного состава, в котором ботулинический токсин равномерно гранулирован, а также имеет повышенную стабильность, и, таким образом, установили, что при получении лиофилизированного состава ботулинического токсина, содержащего протамина сульфат в качестве вспомогательного вещества, протамина сульфат и ботулинический токсин образуют комплекс, в результате чего эффективность ботулинического токсина может сохраняться в течение 6 месяцев или дольше по сравнению с доступными до настоящего времени 3 месяцами, и могут быть получены однородные частицы ботулинического токсина, имеющие PDI 0,3 или менее, что тем самым явилось основой настоящего изобретения.

[13]

[14] Список цитирований

[15] Патентная литература

[16] (Патентный документ 1) патент США №7744904 В1

[17]

[18] Раскрытие сущности изобретения

[19] Задачей настоящего изобретения является обеспечение новой композиции лиофилизированного состава ботулинического токсина с однородным размером частиц ботулинического токсина и улучшенной стабильностью при длительном хранении и способа ее получения.

[20] Для решения приведенной выше задачи в настоящем изобретении предложена композиция лиофилизированного состава ботулинического токсина, включающая комплекс ботулинического токсина и протамина сульфата, изотонический агент и буферный агент.

[21] Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ получения лиофилизированного состава ботулинического токсина, включающий:

[22] (а) получение комплекса ботулинического токсина и протамина сульфата смешением ботулинического токсина и протамина сульфата;

[23] (b) получение маточного раствора ботулинического токсина путем добавления по меньшей мере одного вспомогательного вещества, выбранного из группы, состоящей из полисорбата 20, гидроксипропил-бета-циклодекстрина, человеческого сывороточного альбумина и маннита, изотонического агента и буферного агента, к комплексу ботулинического токсина и протамина сульфата; и

[24] (с) лиофилизацию маточного раствора ботулинического токсина.

[25]

[26] Осуществление изобретения

[27] Если отсутствуют иные определения, то все технические и научные термины в настоящем документе имеют значения, общепринятые специалистами в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. В целом, номенклатура, используемая в настоящем документе, хорошо известна и является типичной в данной области техники.

[28]

[29] В настоящем изобретении было подтверждено, что если комплекс ботулинического токсина и протамина сульфата получают и включают в состав лиофилизированной формы, то стабильность лиофилизированного состава при длительном хранении может быть улучшена при сохранении равномерного размера.

[30]

[31] Соответственно, один из аспектов настоящего изобретения относится к композиции лиофилизированного состава ботулинического токсина, содержащей комплекс ботулинического токсина и протамина сульфата, изотонический агент и буферный агент.

[32] В настоящем изобретении отрицательно заряженный ботулинический токсин и положительно заряженный протамина сульфат образуют ионный комплекс при приведении во взаимодействие в растворе, который, в частности, выполнен с возможность связывания протамина сульфата с высокомолекулярным белком ботулиническим токсином посредством ионного связывания. Таким образом, уровень связывания протамина сульфата с ботулиническим токсином может варьироваться в зависимости от концентрации добавляемого протамина сульфата, и поверхность ботулинического токсина, с которой связывается протамина сульфат, может быть положительно заряжена, тем самым образуется дополнительный комплекс с ботулиническим токсином.

[33] Таким образом, для получения комплекса с улучшенной стабильностью при длительном хранении для лиофилизированного состава согласно настоящему изобретению концентрация протамина сульфата согласно настоящему изобретению может составлять от 1,72 нМ до 0,22 мМ, предпочтительно от 1,72 нМ до 17,2 нМ, более предпочтительно от 1,72 нМ до 6,98 нМ, намного более предпочтительно от 1,72 нМ до 3,44 нМ, но не ограничивается указанными значениями.

[34] Кроме того, в настоящем изобретении ботулинический токсин и протамина сульфат могут образовывать комплекс при массовом отношении от 1:3 до 1:20, предпочтительно от 1:5 до 1:20, более предпочтительно от 1:5 до 1:10, наиболее предпочтительно 1:5, но настоящее изобретение не ограничено указанными значениями.

[35] В настоящем изобретении композиция может дополнительно включать по меньшей мере одно вспомогательное вещество, выбранное из группы, состоящей из полисорбата 20, гидроксипропил-бета-циклодекстрина, человеческого сывороточного альбумина и маннита, и предпочтительно дополнительно включает гидроксипропил-бета-циклодекстрин, человеческий сывороточный альбумин и маннит, но настоящее изобретение не ограничено указанными вспомогательными веществами.

[36] В настоящем изобретении концентрация гидроксипропил-бета-циклодекстрина может составлять от 1 до 30% (масс./об.), предпочтительно от 2 до 25% (масс./об.), более предпочтительно от 5 до 20% (масс./об.), например, от 5 до 15% (масс./об.), от 5 до 10% (масс./об.), от 8 до 15% (масс./об.), от 8 до 10% (масс./об.), от 10 до 20% (масс./об.) или от 15 до 20% (масс./об.), но не ограничена указанными значениями.

[37] В настоящем изобретении концентрация человеческого сывороточного альбумина может составлять от 0,1 до 1,0% (масс./об.), предпочтительно от 0,2 до 0,7% (масс./об.), более предпочтительно от 0,2 до 0,5% (масс./об.), наиболее предпочтительно от 0,35 до 0,5% (масс./об.), но не ограничена указанными значениями.

[38] В настоящем изобретении маннит функционирует в качестве криопротектора, и вместо него можно применять сахарозу, глицерин, трегалозу или лактозу, но настоящее изобретение не ограничено указанными веществами. Количество криопротектора может составлять от 0,1 до 8% (масс./об.) в пересчете на общее количество композиции, но не ограничено указанными значениями.

[39] В настоящем изобретении криопротектор предпочтительно представляет собой маннит, и концентрация маннита может составлять от 0,1 до 10% (масс./об.), предпочтительно от 0,1 до 8% (масс./об.), более предпочтительно от 4 до 8% (масс./об.), но не ограничена указанными значениями.

[40] В настоящем изобретении применяемый изотонический агент может представлять собой хлорид натрия, глицерин, маннит, сахарозу, хлорид калия или декстрозу, но не ограничен указанными веществами. Количество изотонического агента может составлять от 0,7 до 0,95% (масс/об.) в пересчете на общее количество композиции, но не ограничено указанными значениями.

[41] В настоящем изобретении изотонический агент предпочтительно представляет собой хлорид натрия, и концентрация хлорида натрия может составлять от 0,7 до 1,0% (масс./об.), предпочтительно от 0,7 до 0,95% (масс./об.), более предпочтительно от 0,8 до 0,95% (масс./об.), наиболее предпочтительно 0,9% (масс./об.), но не ограничена указанными значениями.

[42] Композиция согласно настоящему изобретению может содержать буферный агент, который является физиологически совместимым и имеет рН, равный изоэлектрической точке или превышающий ее, что тем самым обеспечивает долгосрочную стабильность.

[43] В настоящем изобретении рН буферного агента, который является физиологически совместимым, должен поддерживаться в диапазоне от 6,0 до 7,0, предпочтительно от 6,4 до 6,6, и наиболее предпочтительно применяют буферный агент, который обеспечивает рН примерно 6,5.

[44] В настоящем изобретении применяемый физиологически совместимый буферный агент может представлять собой цитрат натрия, янтарную кислоту, фосфорную кислоту, одноосновный фосфат калия, ацетат натрия или хлорид натрия, но не ограничен указанными веществами.

[45] В настоящем изобретении концентрация буферного агента, подходящего для лиофилизации, может составлять от 10 до 35 мМ, предпочтительно от 10 до 30 мМ, наиболее предпочтительно от 15 до 25 мМ в пересчете на общую концентрацию композиции.

[46] Предпочтительно, буферный агент имеет рН от 6,0 до 7,0 и концентрацию от 10 до 35 мМ, но настоящее изобретение не ограничено указанными значениями.

[47] В одном из вариантов реализации в качестве физиологически совместимого буферного агента может присутствовать фосфорная кислота, имеющая рН 6,5, в 20 мМ концентрации в пересчете на общую концентрацию композиции.

[48] Композиции лиофилизированного состава согласно настоящему изобретению придают гидрофобные свойства за счет образования комплекса ботулинического токсина и протамина сульфата и последующего добавления гидроксипропил-бета-циклодекстрина и человеческого сывороточного альбумина. Кроме того, растворимость ботулинического токсина может быть повышена с использованием изотонического агента, предпочтительно хлорида натрия.

[49] В настоящем изобретении протамина сульфат представляет собой молекулу, содержащую большое количество положительно заряженной аминокислоты, и образует комплекс с ботулиническим токсином, что придает стабильность ботулиническому токсину.

[50] В настоящем изобретении гидроксипропил-бета-циклодекстрин (который может использоваться взаимозаменяемо с «Бетадексом») содержит сахарную цепь, имеющую циклическую структуру, и обладает амфипатическими свойствами, схожими с полисорбатом 20 или полисорбатом 80, что придает стабильность ботулиническому токсину.

[51] В настоящем изобретении «ботулинический токсин» может включать не только нейротоксины (NTX), вырабатываемые штаммами Clostridium botulinum или их вариантами, но также модифицированные, рекомбинантные, гибридные и химерные ботулинические токсины. В настоящем изобретении рекомбинантный ботулинический токсин может иметь легкую цепь и/или тяжелую цепь, рекомбинантно вырабатываемые видами, отличными от Clostridium. В настоящем изобретении ботулинический токсин включает чистый ботулинический токсин (т.е. нейротоксичную молекулу массой примерно 150 кДа), а также комплексы ботулинического токсина (т.е. комплексы 300, 600 и 900 кДа).

[52] В настоящем изобретении ботулинический токсин может быть выбран из группы, состоящей из серотипов А, В, С, D, Е, F и G, но не ограничивается указанными.

[53] Предпочтительно, ботулинический токсин, содержащийся в лиофилизированной композиции согласно настоящему изобретению, представляет собой ботулинический токсин типа А. Композиция согласно настоящему изобретению может содержать примерно от 10 до 200 единиц/мл, предпочтительно примерно от 20 до 150 единиц/мл, более предпочтительно примерно от 40 до 100 единиц/мл ботулинического токсина, но настоящее изобретение не ограничено указанными значениями.

[54] В настоящем изобретении лиофилизированная композиция может дополнительно содержать антиоксидант, и антиоксидант может представлять собой альфа-токоферол, но не ограничен указанными веществом.

[55]

[56] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения лиофилизированного состава ботулинического токсина, включающему:

[57] (а) получение комплекса ботулинического токсина и протамина сульфата смешением ботулинического токсина и протамина сульфата;

[58] (b) получение маточного раствора ботулинического токсина путем добавления по меньшей мере одного вспомогательного вещества, выбранного из группы, состоящей из полисорбата 20, гидроксипропил-бета-циклодекстрина, человеческого сывороточного альбумина и маннита, изотонического агента и буферного агента, к комплексу ботулинического токсина и протамина сульфата; и

[59] (с) лиофилизацию маточного раствора ботулинического токсина.

[60]

[61] Настоящее изобретение может стать более понятным после изучения последующих примеров. Указанные примеры представлены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения и не должны быть истолкованы как ограничивающие объем настоящего изобретения, что будет очевидно специалистам в данной области техники.

[62]

[63] Экспериментальный пример 1. Получение комплекса ботулинический токсин/протамина сульфат и измерение его размера

[64] Для поддержания стабильности ботулинического токсина получали комплекс ботулинический токсин/протамина сульфат с использованием положительно заряженного протамина сульфата. Использовали относительно отрицательно заряженный ботулинический токсин в буферном растворе с рН 6 или более для получения комплекса с протамина сульфатом с рН примерно 6. В качестве буферного раствора использовали 20 мМ фосфатный буферный раствор (рН 6,5). Получали ботулинический токсин типа А (900 кДа, Daewoong Co., Ltd.) в концентрации 0,1 мг/мл и растворяли протамина сульфат в концентрации 0,5, 1,0 и 2,0 мг/мл в 20 мМ фосфатном буферном растворе (рН 6,5), затем смешивали в отношении 1:1 (об./об.), после чего оставляли для получения комплекса при комнатной температуре примерно на 30 минут.

[65] Для подтверждения возможного образования комплекса измеряли размер частиц ботулинического токсина или комплекса ботулинический токсин/протамина сульфат при помощи анализатора размера наночастиц (Zetasizer ZSP, Malvern). Анализатор размера наночастиц представляет собой устройство, которое измеряет размер частиц путем облучения образца световым пучком и измерения показателя преломления при отражении светового пучка. На основании результатов испытания, как показано ниже в таблице 1, было определено, что размер частиц ботулинического токсина типа А составлял примерно 19 нм, а размер комплекса ботулинический токсин/протамина сульфат при отношении 1:5 составлял примерно 182 нм. Соответствующие размеры, определенные при отношениях 1:10 и 1:20, составляли примерно 335 и 481 нм. Также, согласно результатам измерения индекса полидисперсности (PDI), при образовании комплекса ботулинического токсина типа А и протамина сульфата при отношении 1:5 значение PDI составляло 0,3 или менее, это указывает на то, что комплекс при соответствующем отношении имел однородный размер частиц. Таким образом, было обнаружено, что приведенное выше относительное содержание является наиболее предпочтительным, чтобы отдельные комплексы могли оказывать одинаковое действие при инъекции в организм.

[66]

[67]

[68]

[69] Экспериментальный пример 2. Скрининг вспомогательных веществ в композиции лиофилизированного состава, включающей ботулинический токсин в качестве основного ингредиента, и оценка стабильности в жестких условиях

[70] Проводили скрининг композиции вспомогательных веществ в отношении стабильности лиофилизированного состава ботулинического токсина, включающего комплекс ботулинический токсин/протамина сульфат 1:5 в качестве основного компонента композиции. Для композиции лиофилизированного состава, включающей комплекс ботулинический токсин/протамина сульфат, в которой использовали 20 мМ фосфатный буферный раствор (рН 6,5) в качестве основного растворителя, проводили скрининг разных вспомогательных веществ, таких как стабилизаторы, антиоксиданты, криопротекторы и изотонические агенты, и подтверждали стабильность ботулинического токсина.

[71] Таким образом, проводили эксперимент с использованием 40 Ед/мл ботулинического токсина и получали конечный маточный раствор, содержащий композицию вспомогательных веществ, показанную ниже в таблице 2, вводили 50 Ед/пробирка и лиофилизировали. После лиофилизации проводили испытание на стабильность в жестких условиях для опосредованного подтверждения долгосрочной стабильности. Хранили образцы в течение 12 недель в камере в жестких условиях при 40°С, и подтверждали стабильность токсина при хранении путем измерения изменения титра. В частности, оценивали стабильность ботулинического токсина в исследовании титра у животных с использованием мышей ICR возрастом 4 недели (Koatech, Корея) в течение указанного конкретного периода времени, разводили исследуемое вещество физиологическим раствором, а затем разбавляли с получением семи концентраций, вводили разбавленный раствор в дозе 0,1 мл/мыши, отслеживали гибель животных в течение 3 дней и определяли значение LD₅₀ для вычисления титра. Проводили эксперимент, исследуя по 10 мышей при каждой концентрации, и результаты представлены как среднее значение для данных экспериментов.

[72] В данном случае титр каждого состава после получения принимали за 100%. Тем не менее, так как ботулинический токсин является белком и на него влияет состав вспомогательных веществ, внешняя среда, параметры лиофилизации и т.д., то после выдерживания в течение первого дня в жестких условиях измеренный титр снова принимали за 100%, после чего вычисляли изменение титра. Таким образом, титр считали подходящим, если он находился в пределах ±20% от принятого за 100% начального значения титра.

[73]

[74]

[75] Таким образом, при использовании человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) в качестве стабилизатора и маннита в качестве криопротектора (пример сравнения 1) и при использовании Бетадекса и человеческого сывороточного альбумина в качестве стабилизаторов и хлорида натрия в качестве изотонического агента (пример сравнения 2) был сделан вывод о том, что примеры сравнения 1 и 2 оба были неприемлемыми согласно результатам измерения титра ботулинического токсина после выдерживания в течение 12 недель в жестких условиях. Тем не менее при использовании Бетадекса и человеческого сывороточного альбумина в качестве стабилизаторов, хлорида натрия в качестве изотонического агента и маннита в качестве криопротектора (пример 1) был определен наилучший титр ботулинического токсина после выдерживания в течение 12 недель в жестких условиях. Кроме того, при использовании полисорбата, человеческого сывороточного альбумина и Бетадекса в качестве стабилизаторов, хлорида натрия в качестве изотонического агента и маннита в качестве криопротектора (пример 2) и при добавлении к ним добавки альфа-токоферола в качестве антиоксиданта (пример 3) титр после выдерживания в течение 12 недель в жестких условиях оценивали как приемлемый. Тем не менее, с учетом приведенных выше экспериментальных результатов и экономических затрат на вспомогательные вещества в качестве базовой композиции вспомогательных веществ был выбран пример 1 и были проведены дальнейшие исследования.

[76]

[77] Экспериментальный пример 3. Оптимизация композиции вспомогательных веществ и оценка стабильности в жестких условиях

[78] В качестве базовой композиции использовали комплекс ботулинический токсин/протамина сульфат 1:5 и использовали фиксированные количества 0,9% хлорида натрия и 20 мМ фосфатного буферного раствора (рН 6,5), и для подтверждения эффекта в разных диапазонах концентраций с содержанием 0,35-0,5% (масс/об.) человеческого сывороточного альбумина, 5-20% (масс./об.) Бетадекса и 4-8% (масс./об.) маннита получали три дополнительные композиции, как показано ниже в таблице 3. Все композиции получали одинаковыми способами за исключением концентрации вспомогательного вещества. После получения вводили композиции в 10 мл пробирки и лиофилизировали, и оценивали стабильность ботулинического токсина в жестких условиях в течение 12 недель.

[79]

[80]

[81] Таким образом, было экспериментально подтверждено, что стабильность ботулинического токсина поддерживалась в течение 8 недель или более, в частности, 12 недель, в жестких условиях в диапазонах концентраций с содержанием 0,35-0,5% человеческого сывороточного альбумина, 5-20% Бетадекса и 4-8% маннита. Основываясь на результатах традиционных исследований, авторы настоящего изобретения подтвердили, что стабильность может сохраняться в течение периода вплоть до примерно 6 месяцев при замораживании, если в жестких условиях стабильность была обеспечена в течение 2 недель, также стабильность может сохраняться в течение периода примерно 2 года или более при замораживании, если в жестких условиях стабильность была обеспечена в течение 8 недель. Таким образом, было обнаружено, что эффективность лиофилизированного состава ботулинического токсина, содержащего 0,35-0,5% человеческого сывороточного альбумина, 10-20% Бетадекса и 4-8% маннита, представлявшего собой оптимальную композицию с сохранением титра в диапазоне от 80 до 120% в течение периода вплоть до 12 недель в жестких условиях, сохраняется в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно 12 месяцев или более, наиболее предпочтительно 24 месяцев или более при коммерческой реализации.

[82]

[83] Экспериментальный пример 4. Оценка влияния вспомогательного вещества на основе циклодекстрина на стабильность ботулинического токсина

[84] Бетадекс является производным бета (β)-циклодекстрина и представляет собой материал с улучшенными гидрофильными свойствами благодаря встроенной гидроксильной функциональной группе и пропильной функциональной группе. Бетадекс в настоящее время представляет собой вспомогательное вещество, одобренное FDA, ЕС и т.д. в качестве фармацевтического вспомогательного вещества, и используется в качестве стабилизатора основного ингредиента фармацевтических средств. Циклодекстрины делят на три типа альфа (α), бета (β) и гамма (γ) в зависимости от структуры, и внутренняя структура с относительно гидрофобными свойствами стабилизируется благодаря включению основного ингредиента. Таким образом, оценивали влияние вспомогательных веществ на основе циклодекстрина, аналогичных Бетадексу, на стабильность ботулинического токсина.

[85] В данном случае, так как α-, β- и γ-циклодекстрины обладают почечной токсичностью и рассматриваются FDA и KFDA как неприемлемые вспомогательные вещества для инъекционных фармацевтических средств, они были исключены из данного эксперимента, и изучали возможность использования метил-бета-циклодекстрина, бета-циклодекстрина сульфата, сульфобутилового эфира бета-циклодекстрина натрия, гидроксиэтил-бета-циклодекстрина, гидроксипропил-гамма-циклодекстрина или гидроксипропил-альфа-циклодекстрина вместо Бетадекса (гидроксипропил-бета-циклодекстрин).

[86]

[87] Для этого в качестве базовой композиции использовали комплекс ботулинический токсин/протамина сульфат 1:5, использовали фиксированные количества 0,9% хлорида натрия, 20 мМ фосфатного буферного раствора (рН 6,5), 0,5% человеческого сывороточного альбумина и 4% маннита, и изменяли количества только вспомогательных веществ на основе циклодекстрина, и проводили эксперимент. В данном случае концентрацию вспомогательного вещества на основе циклодекстрина устанавливали на уровне 5%.

[88]

[89]

[90] Таким образом, как показано в таблице 4, было определено, что при использовании других вспомогательных веществ на основе циклодекстрина помимо Бетадекса (гидроксипропил-бета-циклодекстрин, пример 7) согласно настоящему изобретению стабильность ботулинического токсина при хранении в течение 4 недель в жестких условиях была неприемлемой, и стабильность титра не сохранялась даже в течение 6 недель или более в жестких условиях. Таким образом, было обнаружено, что если сравнивать с другими циклодекстринами, то применение Бетадекса в составе было крайне эффективным для криоконсервации ботулинического токсина согласно настоящему изобретению.

[91]

[92] Экспериментальный пример 5. Оценка влияния протамина сульфата на стабильность ботулинического токсина

[93] Протамина сульфат, который представляет собой положительно заряженный пептид, может образовывать комплекс с относительно отрицательно заряженным ботулиническим токсином посредством ионного связывания. Образование комплекса с ботулиническим токсином может являться фактором, поддерживающим белок ботулинический токсин в стабильном состоянии. Соответственно, проводили сравнительное исследование для подтверждения влияния присутствия/отсутствия протамина сульфата на стабильность ботулинического токсина.

[94]

[95] Для этого использовали фиксированные количества 0,9% хлорида натрия, 20 мМ фосфатного буферного раствора (рН 6,5), 0,5% человеческого сывороточного альбумина, 4% маннита и 10% Бетадекса, использовали или только ботулинический токсин или комплекс ботулинический токсин/протамина сульфат 1:5, и проводили сравнительный эксперимент.

[96]

[97]

[98] Таким образом, как показано в таблице 5, было подтверждено, что стабильность лиофилизированного состава ботулинического токсина сохранялась только для состава, содержащего протамина сульфат.

[99]

[100] Специалистам в данной области техники после изучения подробного описания конкретных деталей настоящего изобретения будет очевидно, что указанное конкретное описание отражает исключительно предпочтительные варианты реализации, и объем настоящего изобретения не ограничен ими. Соответственно, по существу объем настоящего изобретения будет определен прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

[101]

Промышленная применимость

[102] Согласно настоящему изобретению лиофилизированный состав ботулинического токсина может снижать скорость инактивации ботулинического токсина в процессе лиофилизации, в результате чего получается эффективный и стабильный лиофилизированный состав. Кроме того, лиофилизированный состав ботулинического токсина согласно настоящему изобретению может поддерживать стабильность ботулинического токсина в течение продолжительного периода времени по сравнению с традиционными лиофилизированными составами ботулинического токсина, а также обладает неизменным действием в месте введения благодаря образованию частиц однородного размера и может предотвращать побочные эффекты, которые вызывают появление эффектов избыточного введения токсина лишь в некоторых участках.

Группа изобретений относится к лекарственной форме ботулинического токсина. Композиция лиофилизированного состава ботулинического токсина содержит комплекс ботулинического токсина и протамина сульфата; от 5 до 20% (масс./об.) гидроксипропил-бета-циклодекстрина; от 0,35 до 0,5% (масс./об.) человеческого сывороточного альбумина; от 0,1 до 8% (масс./об.) маннита; от 0,7 до 0,95 (масс./об.) изотонического агента; буферный агент, где ботулинический токсин и протамина сульфат образуют комплекс при массовом отношении от 1:5 до 1:20, где буферный агент имеет pH от 6,0 до 7,0 и концентрацию от 10 до 35 мМ. Также раскрыт способ получения лиофилизированного состава ботулинического токсина. Группа изобретений обеспечивает повышение стабильности лиофилизированного состава ботулинического токсина и увеличение однородности частиц ботулинического токсина в составе. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.

1. Композиция лиофилизированного состава ботулинического токсина, содержащая

комплекс ботулинического токсина и протамина сульфата;

от 5 до 20% (масс./об.) гидроксипропил-бета-циклодекстрина;

от 0,35 до 0,5% (масс./об.) человеческого сывороточного альбумина;

от 0,1 до 8% (масс./об.) маннита;

от 0,7 до 0,95 (масс./об.) изотонического агента; и

буферный агент,

где ботулинический токсин и протамина сульфат образуют комплекс при массовом отношении от 1:5 до 1:20, и

где буферный агент имеет pH от 6,0 до 7,0 и концентрацию от 10 до 35 мМ.

2. Композиция лиофилизированного состава ботулинического токсина по п. 1, отличающаяся тем, что концентрация протамина сульфата составляет от 1,72 нМ до 0,22 мМ.

3. Композиция лиофилизированного состава ботулинического токсина по п. 1, отличающаяся тем, что буферный агент представляет собой фосфатный буферный раствор.

4. Композиция лиофилизированного состава ботулинического токсина по п. 1, отличающаяся тем, что указанный ботулинический токсин выбран из группы, состоящей из серотипов A, B, C, D, E, F и G.

5. Способ получения лиофилизированного состава ботулинического токсина, включающий:

(a) получение комплекса ботулинического токсина и протамина сульфата смешением ботулинического токсина и протамина сульфата в растворе, где ботулинический токсин и протамина сульфат образуют комплекс при массовом отношении от 1:5 до 1:20;

(b) получение маточного раствора ботулинического токсина путем добавления

от 5 до 20% (масс./об.) гидроксипропил-бета-циклодекстрина;

от 0,35 до 0,5% (масс./об.) человеческого сывороточного альбумина;

от 0,1 до 8% (масс./об.) маннита;

от 0,7 до 0,95 (масс./об.) изотонического агента; и

буферного агента, где буферный агент имеет pH от 6,0 до 7,0 и концентрацию от 10 до 35 мМ; и

(c) лиофилизацию маточного раствора ботулинического токсина.