ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫЙ ПРЕПАРАТ БОТУЛОТОКСИНА Российский патент 2016 года по МПК A61K35/74 A61K39/08 

[Область техники]

Настоящее изобретение относится к лиофилизированному препарату ботулотоксина без белкового стабилизатора животного происхождения.

[Уровень техники]

Ботулотоксин, который является полипептидным продуктом анаэробной бактерии Clostridium botulinum, является токсичным веществом, который специфически воздействует на нервную клетку. Хотя токсин ботулизма обычно является токсичным веществом, вызывающим смерть, в последние годы он используется для лечения цервикальной дистонии, блефароспазма, гипергидроза, косоглазия, ахалазии, нейрогенного мочевого пузыря, урологической болезни, мигрени и тому подобных. В качестве примера использования ботулотоксина в качестве фармацевтического препарата является Meditoxin Inj., продающийся авторами настоящего изобретения в настоящее время.

Многие белки, обладающие лечебным эффектом, проявляют свойство адгезивности к твердой поверхности. Вследствие этого, когда белки вводят в контейнер, некоторые из белков прилипают к внутренней стенке контейнера, приводя, таким образом, к потере активного компонента. Кроме того, поскольку белок может быть легко окислен или деградирован до мелких фрагментов, необходимо добавлять стабилизатор как вещество, способное предотвращать окисление и деградацию белка.

Последнее время альбумин и желатин используются в качестве стабилизатора ботулотоксина. Потеря белковых активных компонентов может быть уменьшена путем уменьшения денатурации белка, вызванной адгезией белка или разведением, когда альбумин вводится в контейнер. Желатин получают гидролизом коллагена и иногда может быть использован вместо альбумина. Однако, так как альбумин и желатин являются белками животного происхождения, существует опасность патогенов, полученных из крови или латентной инфекции. Поэтому требуется стабилизатор, который не происходит от животного и при этом не вызывает потерю активности ботулотоксина.

В связи с этим, авторы настоящего изобретения раскрыли в Корейской публикации патента № 2009-0005963 жидкий лекарственный препарат ботулотоксина, включающий ботулотоксин, метионин и полисорбат 20, который проявляет продолжительную стабильность при нормальной температуре. Однако, в таком жидком препарате, трудно сохранять стабильность ботулотоксина при высокой температуре, выше, чем нормальная температура.

[Раскрытие]

[Техническая проблема]

Цель данного изобретения предоставить лиофилизированный препарат ботулотоксина, в котором стабильность при хранении может сохраняться длительный период времени при высокой температуре выше, чем нормальная температура.

[Техническое решение]

Для обычного препарата ботулотоксина стабильность ботулотоксина может сохраняться при температуре хладагента или нормальной температуре. Однако трудно сохранять активность ботулотоксина длительный период времени при высокой температуре. Поэтому авторы настоящего изобретения разработали лиофилизированный препарат ботулотоксина, обладающий великолепной стабильностью при хранении, при которой активность ботулотоксина может быть сохранена долгий период времени даже при широком диапазоне температуры, например, температуре замерзания, температуре хладагента, нормальной температуре и высокой температуре.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет лиофилизированный лекарственный препарат, включающий 1) ботулотоксин, 2) полисорбат и 3) метионин и один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из 4) сахара, сахароспирта и ионного соединения.

[Результат]

Лиофилизированный препарат ботулотоксина, согласно настоящему изобретению, может сохранять активность ботулотоксина и также проявляет великолепную стабильность долговременного хранения даже при условиях высокой температуры, которая может случиться, когда ботулотоксин храниться, доставляется или обрабатывается.

[Лучший вариант]

Лиофилизированный препарат ботулотоксина, согласно настоящему изобретению, включает 1) ботулотоксин, 2) полисорбат и 3) метионин, которые добавлены к стандартному жидкому препарату; и также включает один или более, выбранных из группы, состоящей из 4) сахара, сахароспирта и ионного соединения в качестве дополнительного компонента.

Дополнительный компонент функционирует как сохраняющий активность ботулотоксина и также стабилизирующий активность даже при высокой температуре выше, чем нормальная температура, когда ботулотоксин приготовлен в форме лиофилизированного состава. Для препарата, включающего 1) ботулотоксин; 2) полисорбат и 3) метионин, его стабильность уменьшается, когда он лиофилизируется и также уменьшается при высокой температуре, выше чем нормальная температура, даже когда приготовлен в виде жидкого препарата. Однако лиофилизированный препарат ботулотоксина согласно настоящему изобретению может сохранять активность ботулотоксина даже при высокой температуре, выше чем нормальная температура, и также может иметь великолепную стабильность долговременного хранения.

Ботулотоксин, который включен в лиофилизированный препарат согласно настоящему изобретению может происходить из Clostridium botulinum. Ботулотоксин, который включен в лиофилизированный препарат согласно настоящему изобретению может быть выделен и очищен из этих штаммов известными методами, или в качестве ботулотоксина могут быть использованы коммерчески доступные продукты.

Ботулотоксин, который включен в лиофилизированный препарат, согласно настоящему изобретению может быть любым, выбранным из группы, состоящей из серотипов ботулина A, B, C, D, E, F и G. Ботулотоксин поделен на серотипы A, B, C, D, E, F и G согласно методу иммунологического различия. Известно, что ботулотоксины всех серотипов ингибируют секрецию ацетилхолина, который является сигнальной молекулой нервно-мышечного синапса, генерируя, таким образом, эффект неврального паралича, и различные серотипы могут влиять на различные виды животных и иметь параличи разных степеней, продолжительностей и тому подобных.

В то же время, когда токсичный белок производится Clostridium botulinum, белок ботулотоксина производится путем образования разнообразных комплексов с различными гемагглютинирующими белками и не гемагглютинирующими белками, которые помогают и предохраняют функционирование белка ботулотоксина. Ботулотоксин, который включен в лиофилизированный препарат, согласно настоящему изобретению может включать комплексную форму с комплексообразующим белком и форму без комплексообразующего белка. На активность ботулотоксина не влияет, включен или нет комплексообразующий белок.

В лиофилизированном препарате ботулотоксина согласно настоящему изобретению полисорбат, который является одним из стабилизаторов ботулотоксина, является неионным поверхностно-активным веществом и, в основном, используется как эмульгирующее вещество в области фармацевтики или продовольствия. Тип полисорбата включает полисорбаты 20, 40, 60, 80 и 100, на основе общего числа оксиэтиленовой группы. Для лиофилизированного препарата ботулотоксина согласно настоящему изобретению все эти полисорбаты могут быть использованы. Полисорбат может быть включен в количестве от 0,01 до 2 мг относительно 100 единиц ботулотоксина. Внутри вышеуказанного предела активность ботулотоксина может сохраняться даже при высоких температурах выше, чем нормальная температура и при этом стабильность хранения может сохраняться в течение долгого периода времени.

Кроме того, метионин, стабилизатор, используется вместо белков животного происхождения, таких как альбумин и желатин, как стабилизатор ботулотоксина. Метионин может быть включен в количестве от 0,01 до 10 мг относительно 100 единиц ботулотоксина. Внутри вышеуказанного предела активность ботулотоксина может сохраняться даже при высокой температуре выше, чем нормальная температура, и при этом стабильность хранения может сохраняться в течение долгого периода времени.

Лиофилизированный препарат ботулотоксина согласно настоящему изобретению также включает, по крайней мере, один из 4) сахар, сахароспирт или ионное соединение как дополнительный компонент в дополнение к метионину и полисорбату, в отличие от обычного жидкого препарата.

Сахар известен как предотвращающий денатурацию макромолекул. Пример сахара, который может быть использован для лиофилизированного препарата согласно настоящему изобретению включает, но не ограничивается этим, трегалозу, сахарозу, мальтозу, фруктозу, раффинозу, лактозу, глюкозу или тому подобный. Такой сахар может быть включен в количестве от 0,1 до 50 мг относительно 100 единиц ботулотоксина. Внутри вышеуказанного предела активность ботулотоксина может сохраняться даже при высокой температуре, выше чем нормальная температура, и при этом стабильность хранения может сохраняться в течение долгого периода времени.

Известно, что сахароспирт стабилизирует макромолекулы при лиофилизации или в жидком состоянии и для предотвращения денатурации. Пример сахароспирта, который может быть использован для лиофилизированного препарата согласно настоящему изобретению, включает, но не ограничен этим, циклодекстрин, маннит, сорбит, глицерин, ксилит, инозит или подобные. Сахароспирт может быть включен в количестве от 0,1 до 50 мг относительно 100 единиц ботулотоксина. Внутри вышеуказанного предела активность ботулотоксина может сохраняться даже при высокой температуре, выше чем нормальная температура, и при этом стабильность хранения может сохраняться в течение долгого периода времени.

Кроме того, ионное соединение означает соль или буфер. Ионное соединение взаимодействует с макромолекулами путем специфического или неспецифического связывания. Соль может увеличивать термостабильность и растворимость и может уменьшать степень агрегации. Однако важно отметить, что белок может иметь склонность к денатурации при высокой концентрации соли. Пример ионного соединения включает, но не ограничивается этим, хлорид натрия, фосфат натрия, фосфат аммония, сульфат магния, ацетат натрия, лактат натрия, суксцинат натрия, пропионат натрия, фосфат калия или им подобный. Ионное соединение может быть включено в количестве от 0,1 до 10 мг относительно 100 единиц ботулотоксина. Внутри вышеуказанного предела активность ботулотоксина может сохраняться даже при высокой температуре выше, чем нормальная температура, и при этом стабильность хранения может сохраняться в течение долгого периода времени.

Лиофилизированный препарат ботулотоксина согласно настоящему изобретению готовится из культуры Clostridium botulinum, выращенной в специальной среде, но настоящее изобретение не ограничивается этим. Комплекс ботулотоксина выделяется из раствора культуры путем серий кислотных преципитаций для получения кристаллического комплекса ботулотоксина, состоящего из активного высокомолекулярного белка токсина и соответствующего белка гемагглютинина. Кристаллический комплекс растворяется в растворе, включающем соленую воду и стабилизатор, и затем лиофилизируется для получения лиофилизированного препарата ботулотоксина.

Преимущества и характеристики настоящего изобретения и способы получения преимуществ и характеристик настоящего изобретения будут очевидны из ссылок на примеры осуществлений изобретения, детально описанные ниже. В то же время, настоящее изобретение не ограничено любым аспектом примеров осуществлений изобретения, раскрытых ниже, и может быть осуществлено во всевозможных различных формах. Примеры осуществлений изобретения представлены только для того, чтобы позволить специалистам в данной технике реализовать и осуществить на практике настоящее изобретение. Техническая сущность и объем настоящего изобретения определены приложенной формулой изобретения.

<Пример 1> Производство лиофилизированного препарата ботулотоксина

Лиофилизированный препарат ботулотоксина согласно настоящему изобретению был приготовлен путем лиофилизации (или сублимации) стерильного раствора препарата, включающего ботулотоксин, метионин и полисорбат, и сахар или сахароспирт и/или ионное соединение.

(Тест на стабильность ботулотоксина)

Стабильность ботулотоксина была определена путем подтверждения постоянства активности после хранения в течение определенного периода времени, и постоянство активности ботулотоксина измерялось путем проверки летальности мышей или мыши LD₅₀. Лекарственная форма лиофилизированного препарата хранилась при 40°С и относительной влажности 70% в течение 30 дней и затем растворялась в физиологическом растворе. Затем ботулотоксин, соответствующий 2,5 LD₅₀ МЕ, был введен внутрибрюшинно трем мышам. Когда две или более мышей умерло, было определено, что стабильность сохранена, что выражено как смертность в нижеследующей таблице. Когда мышиная смертность равняется 50% или более, можно расценивать, что активность ботулотоксина сохраняется.

(Титриметрия)

Титриметрия была выполнена следующим образом. 2,8 мл физиологического раствора было добавлено в две пробирки, содержащие образцы, соответственно. 4,4 мл образца было взято из пробирки и затем 1,45 мл физиологического раствора было добавлено к образцу для получения Тест-раствора 1. 1,45 мл физиологического раствора было добавлено к 4,4 мл тест раствора 1 для получения тест раствора 2. Таким же способом разведение раствора было повторно проведено восемь раз для получения каждого из тест-растворов. Для тест-растворов от 3 до 6, 0,1 мл каждого из тест-растворов было внутрибрюшинно введено 10 мышам (CD1, самка), обладающим весом от 17 до 22 г, и затем через 3 дня была замерена летальность. Результаты были статистически обработаны с использованием Пробит-метода для получения мышиного LD₅₀ и титра.

<Пример 2> Выбор стабилизатора ботулотоксина

(1) Выбор комбинации метионина и полисорбата

В комбинации человеческого сывороточного альбумина и полисорбата, которые являются компонентами обычного известного стабилизатора ботулотоксина, стабилизатор для замены человеческого сывороточного альбумина был выбран.

Таблица 1 Состав жидкого препарата Летальность после хранения в течение 30 дней (%) Полисорбат 20 (мг/мл) Ботулотоксин (единица /мл) Стабилизатор (Концентрация) 2 100 - 0 ЧСА (5 мг/мл) 100 L-метионин (20 мМ) 100 L-аргинин (50 мМ) 0 Гистидин (10 мМ) 0 Маннит (50 мг/мл) 0 Сорбит (50 мг/мл) 0 Сахароза (50 мг/мл) 0 Лактоза (50 мг/мл) 0

Из вышеприведенных результатов было определено, что комбинация ЧСА и полисорбата 20 может быть заменена комбинацией метионина и полисорбата 20 в качестве стабилизатора.

Затем для комбинации метионина и полисорбата 20, выбранных в качестве стабилизатора ботулотоксина, тесты на стабильность ботулотоксина были выполнены в зависимости от ряда концентрационных изменений метионина и полисорбата 20.

Таблица 2 демонстрирует результаты теста на стабильность (летальность (%)) ботулотоксина при условиях различных концентраций метионина и полисорбата 20 в случае хранения в течение 30 дней, и таблица 3 демонстрирует результаты теста на стабильность (летальность (%)) ботулотоксина при условиях различных концентраций метионина и полисорбата 20 в случае хранения в течение 60 дней. Концентрация ботулотоксина в жидком препарате ботулотоксина в вышеуказанном тесте была 100 единиц/мл.

Таблица 2 Концентрация Метионин (мМ)   1 5 10 25 50 75 100 Полисорбат 20 (мг/мл) 0,1 100 100 80 100 100 100 100 0,5 100 100 80 100 100 100 100 2,5 100 100 100 100 100 100 100 10 100 100 100 100 100 100 100 20 100 100 100 100 100 100 100 25 80 100 100 80 80 100 100

Таблица 3 Концентрация Метионин (мМ)   1 5 10 25 50 75 100 Полисорбат 20 (мг/мл) 0,1 100 100 80 100 100 80 100 0,5 100 100 80 100 100 100 100 2,5 100 100 100 80 100 100 100 10 0 40 0 100 100 100 40 20 0 80 80 100 - 100 60 25 0 0 0 0 80 - 0

В результате проведения статистического анализа с использованием результатов, перечисленных в таблицах 2 и 3, было принято, что комбинация от 25 до 75 мМ метионина и от 0,1 до 2,5 мг/мл полисорбата 20 максимально стабилизировали ботулотоксин.

(2) Выбор дополнительного компонента

Когда метионин и полисорбат 20, выбранные из таблиц 2 и 3, были использованы в качестве лиофилизированного препарата, содержания метионина и полисорбата 20 были рассчитаны так, чтобы быть в рядах от 0,01 до 10 мг и от 0,01 до 1 мг, соответственно. Однако, когда стабилизатор, имеющий такой состав, был использован как лиофилизированный препарат, стабильность не сохранялась после хранения в течение 30 дней. Вследствие этого, дополнительный стабилизатор, способный поддерживать стабильность, был выбран, как перечислено в таблице 4. В это время было использовано 100 единиц ботулотоксина, 3 мг метионина и 2 мг полисорбата 20.

Таблица 4 Состав лиофилизированного препарата Летальность после хранения в течение 30 дней (%) Ботулотоксин + Метионин + Полисорбат 20 Дополнительный стабилизатор Хлорид натрия Фосфат натрия Сахароза Маннит Сорбит - - - - - 0 0,9 мг - - - - 100 - 10 мМ - - - 100 - - 0,3 мг - - 100 - - - 40 мг - 100 0,9 мг - - 40 мг - 100 - 10 мМ - 40 мг - 100 - 10 мМ 50 мг - - 100 0,9 мг - 50 мг - - 100 - 10 мМ 50 мг - 40 мг 100

Как показано в таблице 4, можно подтвердить, что когда был использован лиофилизированный препарат, содержащий только метионин и полисорбат в качестве стабилизатора, стабилизационный эффект ботулотоксина не сохранялся, но когда, по крайней мере, один из сахара, сахароспирта и ионного компонента также был добавлен в дополнение к метионину и полисорбату, стабилизационный эффект сохранялся.

Затем подходящее количество и тип сахара, сахароспирта и ионного вещества, которое также добавляется в комбинацию метионина и полисорбата, было тестировано. В это время 100 единиц ботулотоксина, 2 мг метионина и 0,2 мг полисорбата 20 были использованы.

Таблица 5 Состав лиофилизированного препарата Летальность после хранения в течение 30 дней (%) Ботулотоксин + Метионин + Полисорбат 20 Дополнительный стабилизатор Количество Сахароза 0,3 мг 100 2,0 мг 100 4,0 мг 100 50 мг 100 Трегалоза 0,3 мг 100 2,0 мг 100 Сорбит 40 мг 100 Маннит 40 мг 100 Хлорид натрия 0,06 мг 0 0,1 мг 100     0,3 мг 100     0,6 мг 100     0,9 мг 100     1,2 мг 100     10 мг 100   Фосфат натрия Гидрофосфат натрия безводный 0,05 мг 100   Дигидрофосфат натрия дигидрат 0,101 мг  

Как показано в таблице 5, можно подтвердить, что когда от 0,1 до 50 мг сахарозы и от 0,1 до 10 мг хлорида натрия было добавлено к комбинации метионина и полисорбата, стабилизационный эффект был сохранен. Когда содержание дополнительного стабилизатора было в вышеприведенных пределах или ниже, стабилизационного эффекта не было, в то же время, когда содержание дополнительного стабилизатора было в вышеприведенных пределах или больше, стабильного типа лиофилизированного препарата не было получено.

Далее тест на долговременную стабильность лиофилизированного препарата при высокой температуре был проведен с использованием титриметрии. В это время, когда комбинация ботулотоксин + метионин + полисорбат 20 + фосфат натрия + сахароза была использована в виде лиофилизированного препарата, были использованы 100 единиц ботулотоксина, 0,8 мг метионина, 0,02 мг полисорбата 20, фосфата натрия (0,05 мг безводного гидрофосфата натрия + 0,101 мг дигидрофосфата натрия дигидрата) и 4 мг сахарозы. Когда комбинация ботулотоксин + метионин + полисорбат 20 + натрий хлорид + сахароза была использована в виде лиофилизированного препарата, были использованы 100 единиц ботулотоксина, 0,2 мг метионина, 0,02 мг полисорбата 20, 2 мг хлорида натрия и 4 мг сахарозы. Когда лиофилизированный препарат, содержащий человеческий сывороточный альбумин, был использован в качестве контрольной группы, были использованы 0,5 мг человеческого сывороточного альбумина и 0,9 мг хлорида натрия.

Таблица 6 Состав лиофилизированного препарата Титр (единицы) 0 недель 2 недели 4 недели 8 недель 12 недель 24 недели Ботулотоксин + Человеческий сывороточный альбумин + Хлорид натрия - 0 0 - - - Ботулотоксин + Метионин + Полисорбат 20, + Фосфат натрия (Хлорид натрия) + сахароза 109
(120) 100
(95) 80
(95) 100
(120) 95 103

Как показано в таблице 6, можно подтвердить что, когда комбинация ботулотоксина, метионина, полисорбата, фосфата натрия или хлорида натрия, и сахарозы была использована в качестве лиофилизированного препарата, стабилизационный эффект сохранялся в течение около 6 месяцев.

[Промышленная применимость]

Настоящее изобретение может быть использовано в качестве лекарства для лечения цервикальной дистонии, блефароспазма, гипергидрозиса, косоглазия, ахалазии, нейрогенного мочевого пузыря, урологической болезни, мигрени и тому подобного.

Изобретение относится к фармацевтическому лиофилизированному препарату ботулотоксина. Фармацевтический лиофилизированный препарат, включает: ботулотоксин, полисорбат и метионин, причем полисорбат включен в количестве от 0,01 до 2 мг относительно 100 единиц ботулотоксина, и метионин включен в количестве от 0,01 до 10 мг относительно 100 единиц ботулотоксина; и один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из сахара в количестве от 0,1 до 50 мг относительно 100 единиц ботулотоксина, сахароспирта в количестве от 0,1 до 50 мг относительно 100 единиц ботулотоксина и ионного соединения в количестве от 0,1 до 10 мг относительно 100 единиц ботулотоксина. Вышеописанный фармацевтический лиофилизированный препарат ботулотоксина является стабильным при хранении и может храниться длительный период времени при температуре выше, чем нормальная температура. 6 з.п. ф-лы, 6 табл., 2 пр.

1. Фармацевтический лиофилизированный препарат, включающий:
ботулотоксин, полисорбат и метионин, причем полисорбат включен в количестве от 0,01 до 2 мг относительно 100 единиц ботулотоксина, и метионин включен в количестве от 0,01 до 10 мг относительно 100 единиц ботулотоксина; и
один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из сахара в количестве от 0,1 до 50 мг относительно 100 единиц ботулотоксина, сахароспирта в количестве от 0,1 до 50 мг относительно 100 единиц ботулотоксина и ионного соединения в количестве от 0,1 до 10 мг относительно 100 единиц ботулотоксина.

2. Фармацевтический лиофилизированный препарат по п. 1, в котором ботулотоксин выбирается из группы, состоящей из Ботулина Серотипов А, В, С, D, Е, F и G.

3. Фармацевтический лиофилизированный препарат по п. 1, в котором ботулотоксин является формой без комплексообразующего белка или комплексной формой с комплексообразующим белком.

4. Фармацевтический лиофилизированный препарат по п. 1, в котором полисорбат является любым одним из полисорбатов 20, 40, 60, 80 и 100.

5. Фармацевтический лиофилизированный препарат по п. 1, в котором сахар является одним или более, выбранными из группы, состоящей из трегалозы, сахарозы, мальтозы, фруктозы, раффинозы, лактозы и глюкозы.

6. Фармацевтический лиофилизированный препарат по п. 1, в котором сахароспирт является одним или более, выбранными из группы, состоящей из циклодекстрина, маннита, сорбита, глицерина, ксилита и инозита.

7. Фармацевтический лиофилизированный препарат по п. 1, в котором ионное соединение является одним или более, выбранными из группы, состоящей из хлорида натрия, фосфата натрия, фосфата аммония, сульфата магния, ацетата натрия, лактата натрия, сукцината натрия, пропионата натрия и фосфата калия.