Способ применения штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) совместно с минеральными удобрениями и мелиорантами для повышения урожайности и качества сельскохозяйственных культур Российский патент 2024 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Область техники

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии, в частности к биомодификации минеральных удобрений и/или мелиорантов и к получению биомодификаторов, биомодифицированных минеральных удобрений и мелиорантов, применяемых в растениеводстве для стимуляции роста растений, улучшения питания и повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Уровень техники

Известно, что бактериальные препараты на основе штаммов Bacillus megaterium, обладают способностью увеличивать урожайность ряда сельскохозяйственных культур.

Известен биопрепарат Фосфоробактерин для повышения плодородия почвы и способ его получения (SU97943). В указанном способе бактерии выращивают на картофельной среде, высушивают и смешивают с порошкообразным каолином, служащим субстратом для сохранения спор высушенных бактерий. При использовании Фосфоробактерина происходит минерализация сложных фосфороорганических соединений, что приводит к повышению плодородия почвы.

Известно использование бактерий вида Bacillus megaterium в качестве средства стимуляции роста растений и/или их корней (например, известен документ US20130014434, в котором питательная композиция для корней пересаживаемого растения содержит в числе других микроорганизмов бактерии Bacillus megaterium) или в качестве средства для борьбы с болезнями растений.

Известен также штамм бактерий Bacillus megaterium, мобилизующий фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчивый к полигексаметиленгуанидину (RU2327737). Штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum BKM В-2357Д способен выщелачивать фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчив к полигексаметиленгуанидину. Штамм может быть использован для получения бактериального препарата, повышающего приживаемость в почве и урожайность сельскохозяйственных культур, для рекультивации техногенно загрязненных земель, а также в биотехнологических работах в области геохимии.

Известен штамм бактерий Bacillus megaterium V3, депонированный в ФГБНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 04324, в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и древесных культур (RU2649359). Штамм Bacillus megaterium V3 обладает фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам, в частности, к овсу, кресс-салату, редису, томатам, винограду, а также древесным культурам, в частности к ели и сосне.

Известен штамм микроорганизмов Bacillus megaterium 2-06-TS1, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под номером ВКПМ В-12402 в качестве активатора фотосинтеза и энергии прорастания растений (RU2627608). Документ RU2627608 раскрывает использование штамма Bacillus megaterium 2-06-TS1 для разработки биопрепаратов с целью повышения продуктивности растений (повышения энергии прорастания семян, их всхожести, стимуляции развития корневой системы и работы фотосинтетического аппарата).

Известно полифункциональное средство для растениеводства на основе штамма бактерий Bacillus megaterium 501 GR (RU2558291). Указанный штамм споровых бактерий Bacillus megaterium 501 GR обладает ростостимулирующим эффектом, улучшает фосфорное питание растений, а также способствует биоремедиации загрязненных пестицидами почв. Использование штамма Bacillus megaterium 501 GR позволяет повысить продуктивность растений, а также защитить их от фитопатогенных грибов и микроорганизмов, вызывающих заболевания корней.

Проблема повышение урожайности сельскохозяйственных культур по-прежнему остается острой и актуальной, поэтому важно разрабатывать и находить новые подходы и средства для решения этого вопроса.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности и улучшения свойств минеральных удобрений для усиления роста и продуктивности растений путем применения бактериальной культуры. Также задачей настоящего изобретения является разработка и создание биомодифицированного минерального (биоминерального) удобрения и/или мелиоранта.

Поставленная задача решается путем применения штамма бактерий Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2), депонированного в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ ВНИИСХМ под № RCAM05946, для биомодификации минеральных удобрений и/или мелиорантов.

Для этого штамм Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) наносят на мелиоранты или на минеральные удобрения, используемые как в сухой, так и в жидкой форме. В некоторых вариантах изобретения минеральное удобрение в сухой форме представляет собой удобрение в гранулированной, приллированной, микрогранулированной, порошкообразной форме или в форме водорастворимого минерального удобрения.

В различных вариантах изобретения бактерии наносят непосредственно на минеральное удобрение или мелиорант или с использованием носителя. В некоторых вариантах изобретения носитель представляет собой минеральное или органическое природное или синтетическое вещество, приемлемое в сельском хозяйстве. В некоторых частных вариантах изобретения носитель представляет собой природное или неприродное вещество на основе кремнийсодержащих пород.

В некоторых вариантах изобретения при иммобилизации бактерий используют средство, увеличивающее адгезию бактерий на минеральном удобрении и/или носителе. В некоторых частных вариантах изобретения в качестве средства, увеличивающего адгезию бактерий, используют крахмал катионный, коллагеновый клей, костно-желатиновый клей, альбуминовый клей, рыбный клей, вишневый клей, декстрин, патоку, гуммиарабик или жидкое стекло.

В некоторых вариантах изобретения минеральное удобрение представляет собой азотное, фосфорное, калийное, борное, молибденовое, комплексное, сложно-смешанное, водорастворимое и микроудобрение или смесь одного из удобрений с микроэлементами. В некоторых частных вариантах изобретения минеральное удобрение представляет собой карбамид, нитрат аммония, сернокислый аммоний, кальциевую селитру, аммофос, натриевую селитру, диаммонийфосфат, нитроаммофоску, фосфоритную муку, сульфат калия, калийную соль, сульфоаммофос, диаммофос, азофоску, нитрофос, нитрофоску, калиевую селитру, хлористый калий или калимагнезию.

В некоторых вариантах изобретения мелиорант представляет собой мелиорант-сорбент, мелиорант-структурообразователь, удобрение-мелиорант, в том числе, например фосфогипс, фосфоритную муку.

В некоторых вариантах изобретения бактерии используют в споровой или вегетативной форме. В более предпочтительных вариантах изобретения бактерии используют в покоящейся (споровой) форме.

Настоящее изобретение также включает биомодификатор минеральных удобрений и/или мелиорантов (бактериальный препарат для модификации минеральных удобрений и/или мелиорантов), включающий штамм бактерий Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2), депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ ВНИИСХМ под № RCAM05946, и опционально, по меньшей мере, одно вспомогательное вещество.

В частных вариантах воплощение изобретения вспомогательное вещество представляет собой носитель и/или средство, увеличивающее адгезию бактерий на минеральном удобрении и/или мелиоранте и/или носителе. В частных вариантах изобретения концентрация бактерий на носителе составляет не менее 10⁴ КОЕ/г носителя.

В частных вариантах воплощения изобретения концентрация бактерий в жидком биомодификаторе составляет не менее 10⁵ КОЕ/мл бактериальной суспензии.

Настоящее изобретение также включает биомодифицированное минеральное (биоминеральное) удобрение и/или биомодифицированный мелиорант для улучшенного питания и/или стимуляции роста растений, включающее соответственно минеральное удобрение или мелиорант и бактерии штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2), депонированного в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ ВНИИСХМ под № RCAM05946.

В частных вариантах воплощения изобретения минеральное удобрение или мелиорант используют в твердой или жидкой форме.

В частных вариантах воплощения изобретения минеральное удобрение в твердой форме представляет собой удобрение в гранулированной, приллированной, микрогранулированной или порошкообразной форме.

В частных вариантах воплощения изобретения бактерии нанесены, соответственно, на минеральное удобрение или мелиорант непосредственно, или с использованием носителя. В некоторых вариантах изобретения концентрация бактерий в биомодифицированном минеральном (биоминеральном) удобрении (или, соответственно, мелиоранте) составляет не менее 10³ КОЕ на 1г твердого минерального удобрения (мелиоранта). В некоторых других вариантах - не менее 10⁴ КОЕ на 1г твердого минерального удобрения (мелиоранта).

В частных вариантах воплощения изобретения бактерии смешаны с жидким минеральным удобрением.

В частных вариантах воплощения изобретения концентрация бактерий составляет не менее 10³ КОЕ на 1 мл жидкого минерального удобрения.

Настоящее изобретение также включает применение штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) для получения биомодификатора минеральных удобрений или мелиорантов.

Настоящее изобретение также включает применение биомодификатора на основе штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) для получения биомодифицированного минерального (биоминерального) удобрения или мелиоранта для улучшения питания и/или стимуляции роста растений.

Настоящее изобретение также включает способ биомодификации минеральных удобрений или мелиорантов, включающего смешивание бактерий штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) (биомодификатора по изобретению) с минеральным удобрением или мелиорантом соответственно. В частных вариантах воплощения изобретения указанный способ включает иммобилизацию бактерий штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2), депонированного в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ ВНИИСХМ под № RCAM05946, непосредственно на минеральном удобрении или мелиоранте, а также с использованием носителя.

В некоторых частных вариантах воплощения изобретения бактериальную суспензию (или суспензию бактерий, в которую предварительно добавлены вспомогательные вещества) смешивают с жидким минеральным удобрением или прямо наносят на поверхность твердого минерального удобрения или мелиоранта.

В других частных вариантах воплощения изобретения бактериальную суспензию сначала наносят на носитель, после чего полученный биомодификатор наносят на минеральное удобрение (или мелиорант) путем перемешивания. Поскольку содержание КОЕ микроорганизмов в бактериальной суспензии влияет на количество КОЕ микроорганизмов, осажденных в конечном итоге на носителях и минеральном удобрении или мелиоранте, их концентрацию выбирают исходя из количества, являющегося целевым для содержания в биомодифицированном минеральном (биоминеральном) удобрении/мелиоранте. Чем больше КОЕ в бактериальной суспензии, тем большее количество агрономически полезных микроорганизмов осаждается на носитель и минеральное удобрение/мелиорант. В частных вариантах воплощения изобретения бактерии наносят на носитель до достижения концентрации на носителе не менее 10⁴ КОЕ на 1г носителя. Полученный биомодификатор в частных вариантах воплощения изобретения наносят на минеральное удобрение/мелиорант в соотношении не менее 1 кг на тонну минерального удобрения/мелиоранта.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:

- разработан новый и эффективный подход к биомодификации минеральных удобрений и/или мелиорантов, а также способ биомодификации;

- в результате применения штамма бактерий Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) по изобретению такой штамм способен солюбилизировать (растворять) малодоступные для растений формы микро- и макроэлементов и переводить их в формы, доступные для ассимиляции растением, в частности, повышает количество несвязанного фосфора в почве, способен повышать доступность калия посредством микробиологического расщепления его силикатных минералов и т.д., поэтому применение штамма в составе биоминеральных удобрений/мелиорантов и биомодификаторов обеспечивает увеличение фитомассы и продуктивности растений;

- штамм бактерий Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) является подходящим для применения в качестве биомодификатора минеральных удобрений и/или мелиорантов, как результат способствует повышению эффективности использования внесенных в почву минеральных удобрений и/или мелиорантов для улучшения питания, усиления роста и продуктивности растений (в частности, овощных, зерновых и технических культур в сельском хозяйстве);

- биомодификатор минеральных удобрений и/или мелиорантов на основе штамма по изобретению позволяет уменьшить потери минеральных удобрений и/или мелиорантов путем вымывания и улетучивания;

- разработано и создано новое эффективное биомодифицированное минеральное удобрение (на основе штамма по изобретению), характеризующееся тем, что обеспечивает наличие минералов в доступных для усваивания растениями форме, тем самым усиливая питание, рост и продуктивность растений;

- биомодифицированное минеральное (биоминеральное) удобрение и/или мелиорант по изобретению характеризуется длительной жизнеспособностью бактерий в его составе, по меньшей мере, в течение 12 месяцев, в концентрациях, обеспечивающих эффективность биоминеральных удобрений и/или мелиорантов;

- предлагаемые новые биоминеральные удобрения/мелиоранты и биомодификаторы на основе штамма бактерий Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) расширяют арсенал средств для повышения урожайности и улучшения роста и продуктивности сельскохозяйственных культур и других растений.

Механизмы солюбилизации малодоступных для растения форм микро- и макроэлементов (в частности, фосфатов, силикатных соединений калия и др.), в основе которых лежит принцип продукции бактериями вышеуказанного штамма различных органических и неорганических кислот, способных к растворению малорастворимых форм микро- и макроэлементов (в частности, фосфоросодержащих минералов). Бактерии, продуцируя органические кислоты и минеральные кислоты, переводят микро- и макроэлементы (в частности, фосфаты, силикатные соединения калиям и др.) в доступные для растения формы, в частности, повышая тем самым количество несвязанного фосфора в почве. Доступность калия повышается путем микробиологического расщепления его силикатных минералов с помощью К-солюбилизирующих бактерий Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2).

Термины и определения.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данном документе имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Термин «необязательный» или «необязательно» или «опциональный» или «опционально», используемый в данном документе, означает, что описываемое впоследствии событие или обстоятельство может, но не обязательно, произойти, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит, и случаи, в которых оно не происходит.

«Носитель» согласно изобретению представляет собой любое вещество, не запрещенное к применению в сельском хозяйстве. Это может быть, не ограничиваясь, как минеральное, так и органическое вещество, как природное, так и синтетическое. Основными требованиями, предъявляемыми к носителям по изобретению, являются большая удельная поверхность, приемлемая для нанесения штамма бактерий согласно изобретению, и безопасность для применения в растениеводстве, в частности, в сельском хозяйстве. Прежде всего, такие носители не должны содержать катионов тяжелых металлов и радиоактивных веществ. В некоторых неограничивающих вариантах изобретения носитель представляет собой природное или неприродное вещество на основе кремнийсодержащих пород. Неограничивающими примерами носителей могут быть диатомит (кизельгур), цеолит, опока, трепел, каолин, глауконит, кремнезем, перлит, метакаолин, волластонит, бентонит, микрокремнезем неорганический, белит, сажа белая, вермикулит (вспученный), тальк, диабазит.

Под «бактериальной суспензией» согласно изобретению понимается сложная смесь, получаемая при культивировании агрономически полезных микроорганизмов in vitro и содержащая культивируемые микроорганизмы, остаточные питательные вещества и продукты метаболизма этих микроорганизмов. Бактериальная суспензия является результатом ферментации - совокупности последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и нагретую до требуемой температуры питательную среду посевного материала агрономически полезных микроорганизмов и до завершения процесса роста клеток. Состав питательной среды для культивирования содержит в легкоусваиваемом виде вещества, необходимые для роста конкретного вида микроорганизмов. А также параметры культивирования, такие как температура, время культивирования и другие необходимые условия (в том числе, например, рН, наличие факторов роста, витаминов, буферность и др.). Все параметры выбираются оптимальными в зависимости от конкретного штамма культивируемых агрономически полезных микроорганизмов.

«Культуральная жидкость» - термин, обозначающий питательную среду в которой выращивали микроорганизмы, которая содержит их метаболиты, и другие целевые вещества, продуцируемые микроорганизмами, а также остаточные питательные вещества, в отличие от «бактериальной суспензии», где помимо культуральной жидкости с метаболитами содержатся клетки бактерий.

Под «биомодификатором» («бактериальным препаратом для модификации минеральных удобрений») в настоящем изобретении понимают состав, включающий бактерии штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) по изобретению и опционально вспомогательное вещество, в частных вариантах воплощения изобретения биомодификатор по изобретению представляет собой состав, включающий комплекс носителя с иммобилизованными на нем агрономически полезными микроорганизмами штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) по изобретению. Указанный биомодификатор предназначен для модификации минеральных удобрений или мелиорантов, в частности, путем смешения с минеральным удобрением (жидким или твердым) и мелиорантом. В частных вариантах воплощения изобретения биомодидификатор включает, по меньшей мере, одно вспомогательное вещество.

Термин «вспомогательное вещество» при использовании в настоящем описании относится к веществам, которые не нарушают биологической активности и свойств бактерий и является приемлемым для использования в сельском хозяйстве (безопасность для применения в растениеводстве, в частности, в сельском хозяйстве). Частные варианты вспомогательных веществ включают сухие носители или жидкие разбавители, например, воду. В некоторых частных вариантах изобретения вспомогательное вещество представляет собой средство, увеличивающее адгезию бактерий на минеральном удобрении и/или мелиоранте и/или носителе.

Термин «минеральное удобрение» (или сокращенно МУ) согласно изобретению понимают соединения неорганической природы, которые содержат необходимые элементы питания растений, т.е. удобрение промышленного или ископаемого происхождения, содержащее питательные элементы в минеральной форме. Согласно изобретению, могут быть использованы, без ограничения, любые минеральные удобрения в твердой (сухой) форме (например, в виде гранул, порошка, кристаллов в таблетированной форме и др.), в том числе водорастворимые удобрения (удобрения в твердой форме, которые перед применением полностью растворяют в воде; они в основном предназначены для использования через систему полива растений) и удобрения в жидкой форме. Категория минерального удобрения, выделяется по действующему веществу (основной питательный элемент, содержащийся в удобрении). Минеральное удобрение также может представлять собой простое минеральное удобрение (минеральное удобрение с гарантированным содержанием только одного основного питательного элемента), а также комплексное минеральное удобрение (минеральное удобрение, содержащее не менее двух главных питательных элементов). Согласно изобретению, могут быть использованы, без ограничения, любые минеральные удобрения в твердой (сухой) форме (например, в виде гранул, порошка, в таблетированной форме и др.), в том числе азотные, фосфорные, калийные, магниевые, борные, молибденовые, комплексные (например, азотно-калиевые, азотно-фосфорно-калиевые (NPK), азотно-фосфорно-калиевые удобрения с добавлением серы (NPKS)), сложно-смешанные, микроудобрения (содержащие микроэлементы в доступной для растений форме). При этом в любое минеральное удобрение могут быть дополнительно добавлены микроэлементы. В некоторых частных вариантах для получения биомодифицированных минеральных удобрений по изобретению могут быть использованы, например, карбамид, нитрат аммония (аммиачная селитра), сернокислый аммоний, кальциевая селитра, аммофос, натриевая селитра, диаммонийфосфат, нитроаммофоска, фосфоритовая (фосфоритная) мука, сульфат калия, калийная соль, сульфоаммофос, диаммофос, азофоска, нитрофос, нитрофоска, калиевая селитра, хлористый калий, калимагнезия и др.

Под «мелиорантом» согласно изобретению понимают вещество промышленного или ископаемого происхождения, предназначенное для улучшения физико-химических свойств и повышения плодородия кислых, солонцеватых и других почв. Согласно изобретению, биомодификации могут быть подвергнуты любые мелиоранты, в том числе, например, мелиоранты-сорбенты, мелиоранты-структурообразователи, удобрения-мелиоранты (см., например, Петрова Т.А. и др. Виды мелиорантов для рекультивации техногенно нарушенных территорий горной промышленности // Горный информационно-аналитический бюллетень, 2021, № 4, с.100-112). В некоторых случаях мелиорантом по изобретению может быть, например, фосфогипс, фосфоритная мука и др.

Термин "питательный элемент (действующее вещество)" означает химический элемент удобрения, необходимый для роста и развития растений. Питательные элементы подразделяются на три группы: главные питательные элементы - N, Р, К, макроэлементы - N, Р, К, Са, Mg, S, микроэлементы - В, Мn, Сu, Zn, Co, Mo, Fe и др.

Термин «биомодифицированное минеральное удобрение» («биоминеральное удобрение») означает минеральное удобрение, гранулы или частицы которого покрыты бактериями, улучшающими его свойства, или жидкие минеральные удобрения (например, КАС (карбамидо аммиачная смесь), но не только), в которые с целью улучшения их свойств вводятся бактерии.

Термин «биомодифицированный мелиорант» означает мелиорант, гранулы или частицы которого покрыты бактериями, улучшающими его свойства. Также под этот термин подпадают жидкие мелиоранты, в которые с целью улучшения их свойств вводятся бактерии.

Концентрации бактерий в биоминеральном удобрении, в биомодифицированном мелиоранте, а также в биомодификаторе относятся к таковым в начале хранения (т.е. сразу после нанесения или не более чем через месяц после нанесения), если не указано иное; или не менее указанных на определенный срок.

Термин "микроудобрение" - минеральное удобрение, в котором питательными элементами являются микроэлементы.

Подробное раскрытие изобретения

Штамм Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2), депонирован 06.06.2022 в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ ВНИИСХМ с рег.№ RCAM05946.

Происхождение штамма .

Штамм является естественным природным, выделен из образцов почв Самарской области, путем селекции наиболее эффективных по способности растворять ортофосфат кальция на среде Александрова.

Морфолого - культуральные и биохимические признаки.

Колонии штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) светло-бежевые, гладкие, блестящие. Пигментация культуры (среда) - по мере старения культуры может выделять пигмент темно-серого цвета. Палочки, образуют споры. Форма вегетативных клеток - палочковидные клетки, размер клеток 2,4×0,8 мкм. Спорообразование - бациллярное спорообразование.

Окраска по Граму - грамположительные. Способен растворять силикаты калия и труднорастворимые фосфаты. Особенностью B. megaterium является то, что клетки 14-20 суточной культуры приобретают дрожжеподобную, выпуклую, фасолеобразную форму. Аэроб. Диаметр колоний 10-15 мм. Оптимальная температура роста 32°С; при температуре более 45°С и менее 15°С рост замедленный. Оптимальное значение рН среды 7.1; рост происходит также при рН от 4.5 до 8.0. Ассимилируют мальтозу, манозу, лактозу, глюкозу, сахарозу, галактозу, арабинозу, манит, раффинозу с образованием кислоты. Гидролизует крахмал. Использует минеральные формы азота: соли аммония и нитраты. Каталазо- и оксидазо-положительный желатин не гидролизует.

Утилизирует аминокислоты: L-аланин, L-аргинин, L-аспартам, L-глутамин, L-серин; органические кислоты: лимонную, яблочную, γ-аминомасляную, α-кетомасляную, ацетоуксусную, уксусную. Проявляет сахаролитическую, амилолитическую, липолитическую активность. Обладает способностью к денитрификации и азотфиксации. Растет при 10% NaCl.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма.

Культивирование на жидких питательных средах (гороховая среда) с помощью лабораторных качалок и ферментеров. Оптимальные условия и состав среды для ферментации - температура 34°С, скорость мешалки 400-600 об.мин., подача воздуха 1 об/об питательной среды в минуту, среда: гороховая мука, крахмал, сахароза, MgSO₄. B. megaterium хорошо развивается на среде Менкиной с мелом и лецитином, а при выделении фосфатазы, отщепляет фосфорную кислоту, вызывающую зону просветления мела. Приемлемыми средами для развития этих бактерий являются мясопептонный агар, гидролизат рыбной муки агар, L-агар. Длительное хранение (3 года и более) осуществляется в криоконсервированном состоянии при -80° С. Рабочие штаммы хранятся в холодильнике при +4°C на среде Эшби. Периодический пересев 2 раза в год на свежую питательную среду.

Характеристика штамма.

Штамм Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) предназначен для улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности сельскохозяйственных культур, в частности, овощных, зерновых и технических культур в сельском хозяйстве. Бактерии Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) относятся к группе PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) - ризобактерии, способствующие росту растений. Обладают широким кругом хозяев, способны образовывать эндоспоры и растворять труднорастворимые соединения фосфора и кальция, Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) является потенциально коммерчески перспективным для создания биопрепаратов.

Ключевым отличием штамма Bacillus megaterium SL04 для модификации минеральных удобрений является механизм положительного воздействия на растения, штамм Bacillus megaterium SL04 прямым образом воздействует на солюбилизацию (растворение) минеральных удобрений и повышение их усвояемости растениями путем продукции бактериями различных органических и неорганических кислот. Кроме того, способность штамма бактерий Bacillus megaterium SL04 к мобилизации соединений минеральных удобрений, в частности, фосфора и калия, повышение их усвояемости, позволяет повысить продуктивность и урожайность растений, а также уменьшить потери минеральных удобрений путем вымывания и улетучивания. Именно эти свойства являются принципиальным отличием от существующей технологии биологической модификации удобрений, в основе которой штамм Bacillus Subtilis Ч-13, являясь эффективным ростостимулирующим агентом, воздействует лишь косвенно на усвояемость элементов питания из гранул удобрений, а именно, стимулирует рост корневой системы растения, в том числе количества корневых волосков.

Возможность объективного проявления технического результата при осуществлении изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными ниже в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Следует понимать, что приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

В результате проведенных исследований была определена активность солюбилизации фосфора и калия.

Способность штамма бактерий по изобретению растворять малорастворимые неорганические соединения фосфора проверяли на модифицированной среде Муромцева, в которую вносили 2 г/л ортофосфата Ca, гидрофосфата Ca и фосфоритной муки, следующего состава (г/л):

Глюкоза - 10,0;

Аспарагин - 1,0;

K₂SO₄ - 0,2;

MgSO₄ - 0,2;

Дрожжевой экстракт - 0,02;

Агар - 15,0;

pH=7,0.

Штаммы изучаемых бактерий засевали уколом на поверхность твердой среды Муромцева, посевы инкубировали 5 суток при температуре 28°С. По диаметру зон просветления ортофосфата Ca, гидрофосфата Ca и фосфоритной муки судили о способности изучаемых штаммов мобилизовать неорганические соединения фосфора.

Фосфатмобилизующая активность определяется биохимической способностью микроорганизмов продуцировать метаболиты (например, органические кислоты), которые за счет своих гидроксильных и карбоксильных групп, а также хелатных катионов, связывают фосфат, переводя его в растворимые формы. Исследование способности микроорганизмов Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) использовать в качестве единственного источника фосфора труднорастворимые формы фосфатов показало, что зона растворения (просветления) Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) ортофосфата Ca - 10 мм, Гидрофосфат Ca - 8мм.

Способность исследуемых микроорганизмов растворять малорастворимые неорганические соединения калия , определяли по активности роста на субстратах силикатов К: флогопите, бентоните, вермикулите и цеолите. В качестве базовой среды использовали среду Александрова следующего состава (г/л):

Глюкоза - 5,0;

MgSO₄ - 0,5;

CaCO₃ - 0,1;

FeCl₃ - 0,006;

Ca₃(PO₄)₂ - 2,0;

Калийный минерал - 3,0;

Агар - 20,0.

В экспериментах единственным источником калия выступали именно эти минералы, что позволило судить о способности микроорганизмов потреблять соединения калия из исследуемых источников. Штаммы изучаемых бактерий засевали уколом на поверхность твердой среды Александрова, посевы инкубировали 5 суток при температуре 28°С. По активности роста и диаметру зон просветления минералов, судили о способности изучаемых штаммов мобилизовать труднорастворимые соединения калия. Для количественного определения способности штаммов высвобождать соединения калия из неорганических минералов проводили исследование содержания химических элементов в культуральной жидкости исследуемых образцов с добавлением флогопита, определение методом атомно-эмиссионной спектроскопии на АЭС ИСП iCAP 6300 DUO.

В экспериментах определяли активность использования калия почвенных минералов. В первом эксперименте, в качестве единственного источника калия для бактерий использовали три калийсодержащих минерала - бентонит, вермикулит, цеолит. В результате эксперимента установлено, что штамм Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) обладает способностью использовать в качестве единственного источника калия все три субстрата силикатов. Активность мобилизации штаммом оценена как высокая (5 баллов). Содержание химических элементов, определенное методом атомно-эмиссионной спектроскопии показало повышенное содержание в культуральной среде: К (766.490 нм) - 1,56 мг/л, Ca (422.673 нм) -51,1 мг/л, Na (588.995 нм) - 62,5 мг/л, Mg (279.553 нм) - 91,8 мг/л. Контрольные значения (питательная среда) - К (766.490 нм) - 0,76 мг/л, Ca (422.673 нм) -46,4 мг/л, Na (588.995 нм) - 55,9 мг/л, Mg (279.553 нм) - 81,5мг/л.

Нанесение бактериальной культуры на гранулы минеральных удобрений

Подготовка компонентов

1) Культура микроорганизмов штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2 выращивается в жидкой питательной среде при 28°С 3-х суток на качалке при 180 об/мин до получения бактериального титра 10⁸-10⁹ КОЕ/мл суспензии.

2) Кукурузный декстрин смешивается с физиологическим раствором в соотношении 1:5. Смесь клейстеризуется на водяной бане 10 минут и далее стерилизуется при 120°С в течение 60 минут.

3) Цеолит стерилизуется в сушильном шкафу при 200°С в течение 8 часов.

4) Гранулы минеральных удобрений стерилизуются в сушильном шкафу при 100°С в течение 10 часов.

Нанесение бактерий и определение титра

5) К 2 мл бактериальной суспензии вносится кукурузный декстрин в соотношении 1:3, смесь тщательно перемешивается на вортексе в течение 10 секунд.

6) В отдельный стерильный фалькон объемом 50 мл вносится 5 г цеолита. В него добавляется 5 мл полученной смеси. Полученная композиция тщательно перемешивается стерильной стеклянной палочкой.

7) В стерильные фальконы на 50 мл вносится 15 г минерального удобрения. К удобрению добавляется 0,06 г высушенного цеолита с нанесенной бактериальной культурой. Смесь тщательно перемешивается на вортексе в течение 30 секунд.

8) Титр бактерий на гранулах минеральных удобрений определяется через 24 часа после нанесения методом серийных разведений с высевом на твердые питательные среды и культивированием при 28°С в течение 48 часов, после чего проводится подсчет выросших колоний.

Оценка жизнеспособности бактерий на поверхности гранул минеральных удобрений и определение численности

Поскольку штамм микроорганизмов Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2), предназначен для повышения эффективности применения минеральных удобрений, была определена способность бактериальных клеток сохранять свою жизнеспособность на поверхности гранул и влиять на показатели роста и продуктивности растений.

Для обработки гранул минеральных удобрений (нитроаммофоска) использовали рабочую суспензию бактерий (культуральная жидкость, содержащая бактериальные клетки, остатки питательной среды и бактериальные метаболиты) с титром не менее 0,5 *10⁹ КОЕ/мл. Обработку гранул минеральных удобрений бактериальной суспензией проводили методом нанесения на поверхность гранул из расчета 1 литр на тонну (или 1 мл на кг). Через 24 часа определяли численность бактерий на гранулах методом серийных разведений и высевом на твердые питательные среды и культивированием при 28°С в течение 48 часов, после чего проводили подсчет выросших колоний. Установлено, что титр бактерий после высушивания на гранулах составил - 3,7 млн. КОЕ/гр.

Установлено, что штамм Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) способен сохранять свою жизнедеятельность на поверхности гранул минеральных удобрений в концентрациях, обеспечивающих эффективность биоминеральных удобрений, на протяжении, по меньшей мере, 12 месяцев. Исследование сроков хранения биоминерального удобрения по изобретению (на основе карбамида, аммофоса, нитроаммофоски, двойного суперфосфата, аммиачной селитры) на основе штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) на протяжении 12 месяцев хранения установило, что количество бактериальных клеток на поверхности гранул минеральных удобрений к концу срока хранения становило 10⁵-10⁴КОЕ/гр удобрений.

Определение активности бактериальных штаммов при их совместном внесении с гранулами минеральных удобрений (далее МУ).

Для определения активности интродукции микроорганизмов в ризосферу сельскохозяйственных культур использовали модельные гнотобиотические системы. В качестве тест объектов использовали тест растения озимой пшеницы.

Гранулы МУ (аммофос) использовались сразу после обработки суспензией штамма бактерий Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) (см. выше).

Для выявления способности исследуемого штамма к активной колонизации высших растений использовали метод внесения обработанных гранул, их внесение в систему без непосредственного контакта между гранулой и высаженным проростком растения, последующее выращивание растений в стерильных условиях гнотобиотических систем. Контрольным штаммом для сравнения колонизационных свойств бактерий выбран коммерческий штамм, предоставленный компанией ООО Микробокс и используемый для наработки биопрепаратов, B. subtilis Am 7 (ВКПМ В-12776) уже используемый при производстве биопрепаратов.

Растительным объектом для изучения были проростки пшеницы Triticum aestivum L. (сорт «Светоч»). Семена пшеницы стерилизовали сначала 2 минуты в 70% этаноле, затем промывали в стерильной воде, после чего двукратно выдерживали в 30% растворе гипохлорита натрия в течение 30 минут. После стерилизации семена тщательно отмывали в стерильной воде. Далее семена высаживали в системы и выращивали в условиях гнотобиотических систем. Для определения количества интродуцируемых бактерий в ризоплане, отмытые корни суспендировали в физиологическом растворе и учитывали численность микроорганизмов высевом на твердую среду R2A.

Проведенный анализ показал, что тестируемый штамм бактерий Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) хорошо приживался и в ризосфере и на корнях пшеницы, незначительно уступая, соответствующим показателям контрольного штамма B. subtilis Am 7. Так количество бактерий (КОЕ/1 г корня пшеницы) у вариантов со штаммом Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) составило для корня - 5,1*10⁶, для ризосферы - 5,1*10⁶, тогда как значения контрольных вариантов (B. Subtilis Am7) были - корень 6,0*10⁶, ризосфера 6,8*10⁶ КОЕ /1 г корня пшеницы.

Таким образом, экспериментально установлено, что штамм Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) обладает фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам, в частности, к растениям кукурузы и подсолнечника. Был проведен также вегетационный опыт с кукурузой гибрид П8521 и подсолнечником гибрид ЕС АГОРА для изучения эффективности штамма бактерий Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2). Опыт проводили в пленочной теплице. Для исследования в горшки (трехлитровые сосуды) добавлялось по 2 кг почвы. Далее равномерным слоем раскладывалось по 0,7г в каждый горшок биомодифицированных (на основе штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2)) гранулированных минеральных удобрений (по изобретению (см. пример 2). В контрольные сосуды раскладывали такое же количество не биомодифицированного минерального удобрения. Сверху засыпали 1 кг почвы. Семена высаживались в лунки глубиной 4-5 см. На каждый сосуд 15 семян.

В результате эксперимента установлено влияние биомодифицированных минеральных удобрений (минеральный компонент - нитроаммофоска) по изобретению на рост и развитие растений кукурузы и подсолнечника. Так штамм Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) показал прибавку веса растений подсолнечника на 12,2% (по сравнению с не биомодифицированными минеральными удобрениями), также отмечено влияние на количество и площадь листов на 21,2% и на толщину стебля на 6,8%, что для подсолнечника является очень важным показателем. Для растений кукурузы отмечено увеличение веса растений на 9,8%, также на количество и площадь листов на 18,4% и толщины стебля на 8,7% по сравнению с вариантом использования контрольных не биомодифицированных минеральных удобрений.

Опытным путем было установлено, что штамм Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) обладает фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам, например, таким как подсолнечник, кукуруза и пшеница яровая. Таким образом, штамм бактерий Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2) является эффективным биологическим агентом для использования в биомодификации минеральных удобрений в качестве эффективного средства повышения продуктивности растений и эффективности усвояемости минеральных удобрений, и расширяет арсенал подобных средств.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к биомодификации минеральных удобрений и мелиорантов путем применения штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2), а также к получению биомодификаторов и биомодифицированных минеральных удобрений и мелиорантов для применения в растениеводстве с целью стимуляции роста растений, улучшения питания и повышения урожайности сельскохозяйственных культур. 3 н. и 18 з.п. ф-лы.

1. Применение штамма бактерий Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2), депонированного в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ ВНИИСХМ под № RCAM05946, для биомодификации минеральных удобрений и/или мелиорантов.

2. Применение по п.1, в котором биомодификация обеспечивает улучшение питания и/или стимуляцию роста растений, повышение их устойчивости к заболеваниям, калий-солюбилизацию, фосфатмобилизацию, повышение эффективности усвояемости соответственно,минеральных удобрений и/или мелиорантов.

3. Применение по любому из пп.1 или 2, в котором минеральное удобрение или мелиорант используют в твердой или жидкой форме.

4. Применение по п.3, в котором минеральное удобрение в твердой форме представляет собой удобрение в гранулированной, приллированной, микрогранулированной, порошкообразной форме или в форме водорастворимого минерального удобрения.

5. Применение по любому из пп.1-4, в котором бактерии наносят непосредственно на минеральное удобрение или мелиорант путем прямого нанесения бактериальной суспензии или с использованием носителя и/или средства, увеличивающего адгезию бактерий на минеральном удобрении, и/или мелиоранте, и/или носителе.

6. Применение по п.5, в котором в качестве средства, увеличивающего адгезию бактерий, используют крахмал катионный, декстрин, коллагеновый клей, костно-желатиновый клей, альбуминовый клей, рыбный клей, вишневый клей, патоку, гуммиарабик или жидкое стекло.

7. Применение по п.4, в котором носитель представляет собой минеральное или органическое природное или синтетическое вещество, приемлемое в сельском хозяйстве.

8. Применение по п.7, в котором носитель представляет собой диатомит, цеолит, опоку, трепел, каолин, глауконит, кремнезем, перлит, метакаолин, волластонит, бентонит, микрокремнезем неорганический, белит, сажу белую, вермикулит (вспученный), тальк или диабазит.

9. Применение по любому из пп.1-8, в котором минеральное удобрение представляет собой азотное, фосфорное, калийное, борное, молибденовое, комплексное, сложно-смешанное, или микроудобрение, или смесь одного из удобрений с микроэлементами.

10. Применение по п.9, в котором минеральное удобрение представляет собой карбамид, сернокислый аммоний, кальциевую селитру, аммофос, натриевую селитру, диаммонийфосфат, нитроаммофоску, фосфоритную муку, сульфат калия, калийную соль,сульфоаммофос, диаммофос, азофоску, нитрофос, нитрофоску, калиевую селитру, хлористый калий или калимагнезию.

11. Применение по любому из пп.1-3, 5-8, в котором мелиорант представляет собой мелиорант-сорбент, мелиорант-структурообразователь, удобрение-мелиорант, в том числе фосфогипс или фосфоритную муку.

12. Применение по любому из пп.1-11, в котором бактерии используют в споровой и/или вегетативной форме.

13. Биомодификатор для получения биомодифицированного минерального удобрения или биомодифицированного мелиоранта, включающий штамм бактерий Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2), депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ ВНИИСХМ под № RCAM05946, и опционально по меньшей мере одно вспомогательное вещество.

14. Биомодификатор по п.13, в котором вспомогательное вещество представляет собой носитель и/или средство, увеличивающее адгезию бактерий на минеральном удобрении, и/или мелиоранте, и/или носителе.

15. Биомодификатор по п.14, в котором носитель представляет собой диатомит, цеолит, опоку, трепел, каолин, глауколит, кремнезем, перлит, метакаолин, волластонит, бентонит, микрокремнезем неорганический, белит, сажу белую, вермикулит (вспученный), тальк или диабазит.

16. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант, включающее(ий) соответственно минеральное удобрение или мелиорант и бактерии штамма Bacillus megaterium SL04 (EBC/22-MP2), депонированного в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ ВНИИСХМ под № RCAM05946.

17. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по п.16, полученное(ый) путем биомодификации соответственно минерального удобрения или мелиоранта с использованием для этого биомодификатора по любому из пп.13-15.

18. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по любому из пп.16-17, в котором соответственно минеральное удобрение или мелиорант используют в твердой или жидкой форме.

19. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по п.18, в котором минеральное удобрение в твердой форме представляет собой удобрение в гранулированной, приллированной, микрогранулированной, порошкообразной форме или водорастворимое минеральное удобрение.

20. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по любому из пп.16-19, в котором минеральное удобрение представляет собой азотное, фосфорное, калийное, борное, молибденовое, комплексное, сложно-смешанное, или микроудобрение, или смесь одного из удобрений с микроэлементами, а мелиорант представляет собой мелиорант-сорбент, мелиорант-структурообразователь, удобрение-мелиорант.

21. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по п.20, в котором мелиорант представляет собой фосфогипс или фосфоритную муку.