Способ применения штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) совместно с минеральными удобрениями и мелиорантами для повышения урожайности и качества сельскохозяйственных культур Российский патент 2024 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Область техники

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии, в частности к биомодификации минеральных удобрений и мелиорантов и к получению биомодификаторов и биомодифицированных минеральных удобрений и мелиорантов для применения в растениеводстве с целью стимуляции роста растений, улучшения питания и повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Уровень техники

Бактерии Paenibacillus polymyxa хорошо известны как представители ризосферы растений, защищающих их от фитопатогенов, а также обладающие ростостимулирующими свойствами, что позволяет использовать их как в качестве биоудобрений, так и в качестве биопестицидов или фитостимуляторов роста. Обзорный ретроспективный анализ использования бактерий рода Paenibacillus в промышленной биотехнологии как продуцента биопрепаратов сельскохозяйственного назначения приведен в статье авторов Ха Т.З., Канарский А.В., Канарская З.А., Щербаков А.В., Щербакова Е.Н. «Перспектива применения бактерий рода Paenibacillus в промышленной биотехнологии для получения биопрепаратов сельскохозяйственного назначения» // Вестник Поволжского государственного технологического университета. Сер.: Лес. Экология. Природопользование. 2020. №3 (47). С. 74-84.

Из публикации CN 102851243 (A) известен штамм Paenibacillus polymyxa JZB120001, депонированный в центре сбора микробиологических культур Китая (CGMCC) под №5563. Штамм Paenibacillus polymyxa JZB120001 образует активные метаболиты с сильным ингибирующим действием на бактерии, которые могут быть использованы для приготовления препаратов биоконтроля с широким спектром ингибирующего действия на патогенные грибы и патогенные бактерии, а также для профилактики и лечения растений от грибковых заболеваний.

В статье Haeyoung Jeong et al. Chronicle of a Soil Bacterium: Paenibacillus polymyxa E681 as a Tiny Guardian of Plant and Human Health // Front Microbiol. 2019 Mar 15; 10:467 исследуется ризосферная бактерия Paenibacillus polymyxa E681, способствующая росту растений и способная производить противомикробные соединения, которые защищают растения от патогенных грибов, оомицетов и бактерий. Рассмотрены исследования этого вида за последние два с половиной десятилетия, а также механизмы действия штамма Paenibacillus polymyxa E681, выделенного из корней ячменя в Южной Корее в 1995 году, обладающего существенным стимулирующим действием на рост ячменя, огурца, перца, кунжута и арабидопсиса (Arabidopsis thaliana).

В патенте RU 2626543, 28.07.2017, «Штамм Paenibacillus mucilaginosus, используемый в качестве удобрения и для стимуляции роста и защиты растений от грибковых болезней» описан штамм бактерий Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906, депонированный в ВКПМ под № В-12259, выделенный из окультуренных почв методом многоступенчатой селекции, и удобрение на его основе. Удобрение для выращивания сельскохозяйственных культур получают путем ступенчатой ферментации указанного штамма на питательной среде Эшби. Применение удобрения позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных культур и снизить дозы внесения азотных, фосфорных и калийных минеральных удобрений при их выращивании. Штамм Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 также может быть использован в качестве противофитопатогенного средства в профилактике и/или лечении заболеваний растений.

Несмотря на многолетние исследования различных ризобактерий, способствующих росту растений, в том числе различных штаммов бактерий Paenibacillus polymyxa, вопросы повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям являются всегда остаются актуальными.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является получение высокого эффекта по повышению эффективности минеральных удобрений и мелиорантов, направленного на усиление роста и продуктивности растений и повышения их устойчивости к заболеваниям, обеспечиваемого за счет нанесения на поверхность минеральных удобрений и мелиорантов бактериальной культуры. Также задачей настоящего изобретения является разработка и создание биомодифицированных минеральных (биоминеральных) удобрений и мелиорантов.

Поставленная задача решается путем применения штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) для биомодификации минеральных удобрений и мелиорантов.

Для этого штамм Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) наносят на мелиоранты или на минеральные удобрения, используемые как в твердой, так и в жидкой форме. В некоторых вариантах изобретения минеральное удобрение в твердой форме представляет собой удобрение в гранулированной, приллированной, микрогранулированной, порошкообразной форме или в форме водорастворимого минерального удобрения.

В различных вариантах изобретения бактерии наносят непосредственно на минеральное удобрение или мелиорант, или с использованием носителя. В некоторых вариантах изобретения носитель представляет собой минеральное или органическое природное или синтетическое вещество, приемлемое в сельском хозяйстве. В некоторых частных вариантах изобретения носитель представляет собой природное или неприродное вещество на основе кремнийсодержащих пород.

В некоторых вариантах изобретения при иммобилизации бактерий используют средство, увеличивающее (повышающее) адгезию бактерий на минеральном удобрении и/или носителе. В некоторых частных вариантах изобретения в качестве средства, увеличивающего адгезию бактерий, используют крахмал катионный, коллагеновый клей, костно-желатиновый клей, альбуминовый клей, рыбный клей, вишневый клей, декстрин, патоку, гуммиарабик или жидкое стекло.

В некоторых вариантах изобретения минеральное удобрение представляет собой азотное, фосфорное, калийное, борное, молибденовое, комплексное, сложно-смешанное, водорастворимое или микроудобрение, или смесь одного из удобрений с микроэлементами. В некоторых частных вариантах изобретения минеральное удобрение представляет собой карбамид, нитрат аммония, сернокислый аммоний, кальциевую селитру, аммофос, натриевую селитру, диаммонийфосфат, нитроаммофоску, фосфоритную муку, сульфат калия, калийную соль, сульфоаммофос, диаммофос, азофоску, нитрофос, нитрофоску, калиевую селитру, хлористый калий или калимагнезию.

В некоторых вариантах изобретения мелиорант представляет собой мелиорант-сорбент, мелиорант-структурообразователь, удобрение-мелиорант, в том числе, например, фосфогипс, фосфоритную муку.

В различных вариантах изобретения бактерии используют в споровой или вегетативной форме. В более предпочтительных вариантах изобретения бактерии используют в покоящейся (споровой) форме, поскольку она обеспечивает более длительное хранение и выживаемость бактерий.

Поставленная задача также решается путем разработки биомодификатора минеральных удобрений и мелиорантов (бактериального препарата для модификации минеральных удобрений и мелиорантов), включающего штамм бактерий Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) и, опционально, по меньшей мере одно вспомогательное вещество.

В некоторых частных вариантах изобретения вспомогательное вещество представляет собой носитель и/или средство, увеличивающее адгезию бактерий на минеральном удобрении и/или мелиоранте и/или носителе. В частных вариантах изобретения концентрация бактерий на носителе составляет не менее 10⁴ КОЕ/г носителя.

В частных вариантах изобретения концентрация бактерий в жидком биомодификаторе составляет не менее 10⁵ КОЕ/мл бактериальной суспензии.

Поставленная задача также решается путем разработки биомодифицированного минерального (биоминерального) удобрения и мелиоранта для улучшенного питания и стимуляции роста растений, включающего минеральное удобрение и бактерии штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119).

В различных вариантах изобретения минеральное удобрение используют в твердой или жидкой форме. В некоторых вариантах изобретения минеральное удобрение в твердой форме представляет собой удобрение в гранулированной, приллированной, микрогранулированной или порошкообразной форме.

В частных вариантах воплощения бактерии нанесены на минеральное удобрение или мелиорант непосредственно, или с использованием носителя. В некоторых вариантах изобретения концентрация бактерий в биомодифицированном минеральном (биоминеральном) удобрении (или, соответственно, мелиоранте) составляет не менее 10³ КОЕ на 1 г твердого минерального удобрения. В частных вариантах - не менее 10⁴ КОЕ на 1 г твердого минерального удобрения (мелиоранта).

В некоторых вариантах изобретения бактерии смешаны с жидким минеральным удобрением. В частных вариантах воплощения изобретения концентрация бактерий составляет не менее 10³ КОЕ на 1 мл жидкого минерального удобрения.

Настоящее изобретение также включает применение штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) для получения биомодификатора минеральных удобрений и мелиорантов.

Настоящее изобретение также включает применение биомодификатора на основе штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) для получения биомодифицированного минерального (биоминерального) удобрения или мелиоранта для улучшения питания и стимуляции роста растений.

Также поставленная задача решается путем разработки способа биомодификации минеральных удобрений и мелиорантов, включающего смешивание бактерий штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) (биомодификатора по изобретению) с минеральным удобрением или мелиорантом, соответственно. В некоторых вариантах воплощения изобретения указанный способ включает иммобилизацию бактерий штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) непосредственно на минеральном удобрении или мелиоранте, а также с использованием носителя.

В некоторых частных вариантах изобретения бактериальную суспензию (или суспензию бактерий, в которую предварительно добавлены вспомогательные вещества) смешивают с жидким минеральным удобрением или прямо наносят на поверхность твердого минерального удобрения или мелиоранта.

В других частных вариантах воплощения изобретения бактериальную суспензию сначала наносят на носитель, после чего полученный биомодификатор наносят на минеральное удобрение (или мелиорант) путем перемешивания. Поскольку содержание КОЕ микроорганизмов в бактериальной суспензии влияет на количество КОЕ микроорганизмов, осажденных в конечном итоге на носителях и минеральном удобрении и мелиоранте, их концентрацию выбирают исходя из количества, являющегося целевым для содержания в биомодифицированном минеральном (биоминеральном) удобрении/мелиоранте. Чем больше КОЕ в бактериальной суспензии, тем большее количество агрономически полезных микроорганизмов осаждается на носитель и минеральное удобрение/мелиорант. В частных вариантах воплощения изобретения бактерии наносят на носитель до достижения концентрации на носителе не менее 10⁴ КОЕ на 1 г носителя. Полученный биомодификатор в частных вариантах изобретения наносят на минеральное удобрение/мелиорант в соотношении не менее 1 кг на тонну минерального удобрения/мелиоранта.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:

- разработан новый эффективный способ биомодификации минеральных удобрений и мелиорантов путем применения штамма бактерий Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119);

- бактерии Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) способны обеспечивать сохранение азота в почве путём уменьшения его улетучивания с помощью азотфиксации, а также прямым образом воздействуют на солюбилизацию (растворение) минеральных удобрений и повышение их усвояемости растениями путем продукции бактериями различных органических и неорганических кислот, в связи с чем применение штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) в составе биоминеральных удобрений и биомодификаторов обеспечивает повышение усвояемости минеральных удобрений растениями;

- способность штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) стимулировать рост растений обеспечивает повышение продуктивности, урожайности и качества сельскохозяйственной продукции при применении штамма в составе биоминеральных удобрений и биомодификаторов;

- применение бактерий Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) в составе биоминеральных удобрений и биомодификаторов сглаживает негативное воздействие от контакта с минеральными удобрениями растений путём подкисления ризосферы, индукции устойчивости растений к стрессу, что в целом также обеспечивает дополнительное положительно влияние на растения;

- биомодифицированные минеральные (биоминеральные) удобрения и мелиоранты по изобретению эффективны для применения при выращивании различных растений - овощных, зерновых и технических культур в сельском хозяйстве, растений, используемых в цветоводстве, лесоводстве, и других, без ограничений;

- биомодификатор минеральных удобрений на основе штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) позволяет уменьшить потери минеральных удобрений путём вымывания и улетучивания;

- биомодифицированное минеральное (биоминеральное) удобрение и мелиорант по изобретению характеризуется длительной жизнеспособностью бактерий в его составе, как минимум, в течение 3-х месяцев (а в большинстве случаев намного дольше), в концентрациях, обеспечивающих эффективность биоминеральных удобрений и мелиорантов;

- предлагаемые новые биоминеральные удобрения/мелиоранты и биомодификаторы на основе штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) расширяют ассортимент средств для повышения урожайности и улучшения роста сельскохозяйственных культур и других растений и их устойчивости к различным заболеваниям.

Термины и определения

Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п. интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Термин «необязательный» или «необязательно» или «опциональный» или «опционально», используемый в данном документе, означает, что описываемое впоследствии событие или обстоятельство может, но не обязательно, произойти, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит, и случаи, в которых оно не происходит.

«Носитель» согласно изобретению представляет собой любое вещество, не запрещенное к применению в сельском хозяйстве. Это может быть, не ограничиваясь, как минеральное, так и органическое вещество, как природное, так и синтетическое. Основными требованиями, предъявляемыми к носителям по изобретению, являются большая удельная поверхность, приемлемая для нанесения штамма бактерий согласно изобретению, и безопасность для применения в растениеводстве, в частности, в сельском хозяйстве. Прежде всего, такие носители не должны содержать катионов тяжелых металлов и радиоактивных веществ. В некоторых неограничивающих вариантах изобретения носитель представляет собой природное или неприродное вещество на основе кремнийсодержащих пород. Неограничивающими примерами носителей могут быть диатомит (кизельгур), цеолит, опока, трепел, каолин, глауконит, кремнезем, перлит, метакаолин, волластонит, бентонит, микрокремнезем неорганический, белит, сажа белая, вермикулит (вспученный), тальк, диабазит.

Под «бактериальной суспензией» согласно изобретению понимается сложная смесь, получаемая при культивировании in vitro агрономически полезных микроорганизмов и содержащая культивируемые микроорганизмы, остаточные питательные вещества и продукты метаболизма этих микроорганизмов. Бактериальная суспензия получается как результат ферментации - совокупности последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и нагретую до требуемой температуры питательную среду посевного материала бактерий штамма агрономически полезных микроорганизмов и до завершения процесса роста клеток. Состав питательной среды для культивирования (содержание в легко усваиваемом виде веществ, необходимых для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей), ее температура, время культивирования и другие необходимые условия (в том числе, например, рН, наличие факторов роста, витаминов, буферность и др.) выбираются оптимальными в зависимости от конкретного штамма культивируемых агрономически полезных микроорганизмов.

«Культуральная жидкость» - термин, обозначающий питательную среду, в которой выращивали микроорганизмы, которая содержит их метаболиты и другие целевые вещества, продуцируемые микроорганизмами, а также остаточные питательные вещества, в отличие от «бактериальной суспензии», которая помимо культуральной жидкости содержит клетки агрономически полезных микроорганизмов.

Под «биомодификатором» («бактериальным препаратом для модификации минеральных удобрений») в настоящем изобретении понимают состав, включающий бактерии штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) и, опционально, вспомогательное вещество. В частных вариантах воплощения изобретения бимодификатор по изобретению представляет собой состав, включающий комплекс носителя с иммобилизованными на нем агрономически полезными микроорганизмами штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119). Указанный биомодификатор предназначен для модификации минеральных удобрений и мелиорантов, в частности, путем смешения с минеральным удобрением (жидким или твердым) и мелиорантом. В частных вариантах воплощения изобретения биомодификатор включает, по меньшей мере, одно вспомогательное вещество.

Термин «вспомогательное вещество» при использовании в настоящем описании относится к веществам, которые не нарушают биологической активности и свойств бактерий и являются приемлемыми для использования в сельском хозяйстве (безопасность для применения в растениеводстве, в частности, в сельском хозяйстве). Частные варианты вспомогательных веществ включают сухие носители или жидкие разбавители, например, воду. В некоторых частных вариантах изобретения вспомогательное вещество представляет собой средство, увеличивающее адгезию бактерий на минеральном удобрении и/или мелиоранте и/или носителе.

Под «минеральным удобрением» согласно изобретению понимают соединения неорганической природы, которые содержат необходимые элементы питания растений, т.е. удобрение промышленного или ископаемого происхождения, содержащее питательные элементы в минеральной форме. Согласно изобретению, могут быть использованы, без ограничения, любые минеральные удобрения в твердой (сухой) форме (например, в виде гранул, порошка, кристаллов в таблетированной форме и др.), в том числе водорастворимые удобрения (удобрения в твердой форме, которые перед применением полностью растворяют в воде; они в основном предназначены для использования через систему полива растений) и удобрения в жидкой форме. В том числе могут быть использованы простые минеральные удобрения - с гарантированным содержанием только одного основного питательного элемента (например азотные, фосфорные, калийные, магниевые, борные, молибденовые), комплексные (в том числе сложно-смешанные) минеральные удобрения - содержащие не менее двух основных питательных элементов (например, азотно-калиевые, азотно-фосфорно-калиевые (NPK), азотно-фосфорно-калиевые удобрения с добавлением серы (NPKS)), микроудобрения - в которых питательными элементами являются микроэлементы в доступной для растений форме. При этом в любое минеральное удобрение могут быть дополнительно добавлены микроэлементы. В некоторых частных вариантах для получения биоминеральных удобрений по изобретению могут быть использованы, например, карбамид, нитрат аммония (аммиачная селитра), сернокислый аммоний, кальциевая селитра, аммофос, натриевая селитра, диаммонийфосфат, нитроаммофоска, фосфоритовая (фосфоритная) мука, сульфат калия, калийная соль, сульфоаммофос, диаммофос, азофоска, нитрофос, нитрофоска, калиевая селитра, хлористый калий, калимагнезия и др.

Под «мелиорантом» согласно изобретению понимают вещество промышленного или ископаемого происхождения, предназначенное для улучшения физико-химических свойств и повышения плодородия кислых, солонцеватых и других почв. Согласно изобретению, биомодификации могут быть подвергнуты любые мелиоранты, в том числе, например, мелиоранты-сорбенты, мелиоранты-структурообразователи, удобрения-мелиоранты (см., например, Петрова Т.А. и др. Виды мелиорантов для рекультивации техногенно нарушенных территорий горной промышленности // Горный информационно-аналитический бюллетень, 2021, №4, с. 100-112). В некоторых случаях мелиорантом по изобретению может быть, например фосфогипс, фосфоритная мука и др.

Термин «питательный элемент» («действующее вещество») означает химический элемент удобрения, необходимый для роста и развития растений. Питательные элементы подразделяются на три группы: главные (основные) питательные элементы - N, Р, К, макроэлементы - N, Р, К, Са, Mg, S, микроэлементы - В, Mn, Cu, Zn, Co, Mo, Fe и др.

Термин «биомодифицированное минеральное удобрение» («биоминеральное удобрение») означает минеральное удобрение, гранулы которого покрыты бактериями, улучшающими их свойства. Также под этот термин подпадают жидкие минеральные удобрения (например, карбамидно-аммиачная смесь (КАС), но не только), в которые с целью улучшения их свойств вводятся бактерии.

Термин «биомодифицированный мелиорант» означает мелиорант, гранулы или частицы которого покрыты бактериями, улучшающими его свойства. Также под этот термин подпадают жидкие мелиоранты, в которые с целью улучшения их свойств вводятся бактерии.

Концентрации бактерий в биоминеральном удобрении, в биомодифицированном мелиоранте, а также в биомодификаторе относятся к таковым в начале хранения (т.е. сразу после нанесения или не более чем через месяц после нанесения), если не указано иное, или не менее указанных на определенный срок.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Подробное раскрытие изобретения

Штамм Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) депонирован 07.06.2022 в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ) под номером RCAM04926.

Происхождение штамма

Штамм выделен из почв Ленинградской области и идентифицирован в ВНИИСХМ.

Морфолого-культуральные и биохимические признаки

Колонии штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) на среде Эшби - слегка выпуклые, гладкие, слизистые. Ассимилируют мальтозу, маннозу, лактозу, глюкозу, сахарозу, галактозу, арабинозу, маннит, раффинозу с образованием кислоты. Гидролизуют крахмал. Форма и размеры вегетативных клеток: крупные подвижные прямые палочки, 3-5 мкм × 1,1-1,3 мкм, одиночные, в парах и коротких цепочках. Споры крупные, овальные. Аэроб.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма

Длительное хранение (3 года и более) осуществляется в криоконсервированном состоянии при -80°С. Рабочие штаммы хранятся в холодильнике при +4°C на среде Эшби. Периодический пересев 2 раза в год на свежую питательную среду.

Характеристика штамма

Позитивный эффект штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) на рост растений связан с улучшением азотного питания и продукцией физиологически активных веществ. Штамм перспективен для создания бактериального препарата ростостимулирующего действия.

Штамм Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) не токсичен, не токсигенен, не обладает диссеминацией во внутренних органах человека, не является патогенным.

Бактерии штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) относятся к группе PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) - ризобактерии, способствующие росту растений. Обладают широким кругом хозяев, способны образовывать эндоспоры, растворять фосфат кальция и фитат кальция, а также обладают способностью к азотфиксации.

Ключевыми особенностями штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119), обеспечивающими его высокую эффективность при модификации минеральных удобрений, являются механизмы положительного воздействия на растения: штамм Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) прямым образом воздействует на солюбилизацию (растворение) минеральных удобрений и повышение их усвояемости растениями путем продукции бактериями различных органических и неорганических кислот. Кроме того, способность штамма бактерий Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) к фиксации, связыванию и повышению усвояемости азота, позволяет повысить продуктивность и урожайность растений, а также уменьшить потери азота путём вымывания и улетучивания. Именно эти свойства штамма обеспечивают принципиальные отличия применения штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) от существующей технологии биологической модификации удобрений на основе штамма Bacillus Subtilis Ч-13, который, являясь эффективным ростостимулирующим агентом, воздействует лишь косвенно на усвояемость элементов питания из гранул удобрений, а именно, стимулирует рост корневой системы растения, в том числе количества корневых волосков.

Возможность объективного проявления технического результата при осуществлении изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными ниже в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Следует понимать, что приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Пример 1. Определение азотфиксирующей активности штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119)

В лабораторных условиях установлена способность штамма обеспечивать растения азотом в отсутствии минеральных форм азота и оказывать влияние на рост и развитие растений. Эксперименты проводили на озимой пшенице сорта Светоч. Для получения культуры исследуемых микроорганизмов, 1-2 колонии вносили в колбы с 50 мл жидкой среды Эшби и культивировали 72 ч при комнатной температуре. Затем плотность культуры оценивали микроскопически, культуры выращивали до получения плотности не менее 10⁹ КОЕ/мл.

Семена озимой пшеницы сорта Светоч поверхностно стерилизовали согласно следующему протоколу: 70% этанол - 2 мин, стерильная вода - 1 мин, «Белизна» - 20 мин, стерильная вода - 1 мин, «Белизна» - 20 мин, стерильная вода - 1 мин, все операции повторяли пятикратно. Для контроля качества стерилизации семена раскладывали на поверхность питательно агара и инкубировали 24 ч при 28°С. Семена, вокруг которых отсутствовал бактериальный рост, брали в дальнейшую работу.

Для подготовки условно-стерильных гнотобиотических систем, отмытый и высушенный кварцевый песок прокаливали в течение 2 ч при 18°С. Затем песок охлаждали и помещали в стеклянные стаканы объемом 250 мл. В стаканы с песком, предназначенные для выращивания опытных образцов и отрицательного контроля, добавляли по 10 мл стерильной водопроводной воды, в стаканы, предназначенные для выращивания положительного контроля , где изучалось действие минеральных форм азота, добавляли по 10 мл 1% раствора калийной селитры (KNO₃) или карбамида (NH₂)₂CO). Для получения опытных образцов культуру бактерий Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) разбавляли в физрастворе в соотношении 1:200, затем семена пшеницы замачивали в культуре бактерий в течение 20 мин, инокулированные семена высаживали в стерильные гнотобиотические системы по 15 растений на систему. Для получения отрицательного и положительного контрольных образцов семена замачивали в стерильном физрастворе.

Анализ колонизационной, ростостимулирующей и азотообеспечительной активности штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) на растениях пшеницы в условиях условно-стерильных гнотобиотических систем показал, что прибавка длины корня, относительно отрицательного контроля, составила +29,08%, прибавка стебля - +96,27%. Значения положительного контроля (добавление KNO₃ в концентрации 1г/л питательного раствора) - корень - +17,79%, стебель - +83,85%, относительно отрицательного контроля. Добавление карбамида в концентрации 1 г/л питательного раствора - значения для корня - +25,64%, для стебля - +35,16% относительно отрицательного контроля. Визуальных признаков недостатка азота не обнаружено.

Как показал проведенный эксперимент, исследуемые бактерии способны обеспечивать растение молекулярным азотом при его недостатке в почве.

Пример 2. Нанесение бактериальной культуры на гранулы минеральных удобрений с использованием носителя и средства, увеличивающего адгезию бактерий на минеральном удобрении

Подготовка компонентов:

- культуру бактерий штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) выращивают в жидкой питательной среде при 28°С в течение 3х суток на качалке при 180 об/мин до получения бактериального титра 10⁸-10⁹ КОЕ/мл суспензии;

- средство, увеличивающее адгезию бактерий (кукурузный декстрин), смешивают с физиологическим раствором в соотношении 1:5. Смесь клейстеризуют на водяной бане 10 минут и далее стерилизуют при 120°С в течение 60 минут;

- носитель (цеолит) стерилизуют в сушильном шкафу при 200°С в течение 8 часов;

- гранулы минерального удобрения стерилизуют в сушильном шкафу при 100°С в течение 10 часов.

Подготовка смеси для биомодификации (биомодификатора):

- к 2 мл бактериальной суспензии добавляют кукурузный декстрин в соотношении 1:3 (1 часть декстрина на 3 части суспензии). Смесь тщательно перемешивают на вортексе в течение 10 с;

- в отдельный стерильный фалькон объемом 50 мл вносят 5 г цеолита. В него добавляют 5 мл полученной смеси. Полученную композицию тщательно перемешивают стерильной стеклянной палочкой.

Нанесение бактерий и определение титра:

- в стерильные фальконы объемом 50 мл вносят 15 г минерального удобрения. К удобрению добавляют 0,06 г полученного биомодификатора. Смесь тщательно перемешивают на вортексе в течение 30 с;

- титр бактерий на гранулах минеральных удобрений определяют через 24 часа после нанесения методом серийных разведений с высевом на твердые питательные среды и культивированием при 28°С в течение 48 часов, после чего проводят подсчет выросших колоний.

Пример 3. Нанесение бактериальной культуры на гранулы минеральных удобрений и определение численности

Поскольку штамм микроорганизмов Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) предназначен для повышения эффективности применения минеральных удобрений, была определена способность бактериальных клеток сохранять свою жизнеспособность на поверхности гранул и влиять на показатели роста и продуктивности растений.

Для обработки гранул минеральных удобрений (карбамид, аммофос и нитроаммофоска) использовали бактериальную суспензию штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119), содержащую бактерии в титре не менее 0,5*10⁹ КОЕ/мл. Обработку гранул минеральных удобрений бактериальной суспензией проводили методом нанесения на поверхность гранул из расчета 1 литр на тонну (или 1 мл на кг). Через 24 часа определяли численность бактерий на гранулах методом серийных разведений с высевом на твердые питательные среды и культивированием при 28°С в течение 72 часов, после чего проводили подсчет выросших колоний. Повторное определение численности колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) на поверхности минеральных удобрений проводили через 6 месяцев после нанесения.

Определение титра бактерий Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) на поверхности гранул минеральных удобрений позволило установить способность бактерий сохранять свою жизнедеятельность после их нанесения на минеральные удобрения. Установленный титр штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) на поверхности гранул при прямом нанесении в начале хранения (через 24 часа после нанесения) составил: на карбамиде - 12,3*10⁵ КОЕ/г, на аммофосе - 16,5*10⁵ КОЕ/г, на нитроаммофоске - 10,1*10⁵ КОЕ/г, после 6 месяцев хранения бактериальный титр составил: на карбамиде - 1,2*10⁴ КОЕ/г, на аммофосе - 2,6*10³ КОЕ/г, на нитроаммофоске - 1,8*10⁴ КОЕ/г. Таким образом, было показано, что штамм Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) способен сохранять свою жизнедеятельность на поверхности гранул минеральных удобрений в концентрациях, обеспечивающих эффективность биоминеральных удобрений на протяжении более 6 месяцев.

Пример 4. Определение фитостимулирующей активности штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) при совместном внесении с гранулами минеральных удобрений

Экспериментально установлено, что штамм Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) обладает фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам. Для этого был проведен вегетационный опыт. В качестве растительных объектов использовали сельскохозяйственно значимые культуры: картофель (оздоровленные клубни картофеля сорта Дезире фракции 28-35), горох посевной (сорт Амброзия) и яровую пшеницу (сорт Дарья, предоставлена ФГНУ ФНЦ ЗБК (Орловская обл., п. Стрелецкий)).

В качестве минеральных удобрений использовали карбамид или нитроаммофоску (NPK15). Биомодификацию указанных минеральных удобрений осуществляли с помощью штамма бактерий Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119), которые наносили в титре 10³ КОЕ/г.

Влияние биоудобрений на горох и картофель оценивали в условиях теплиц. Для определения морфометрических показателей использовали не менее 12 растений для каждого варианта обработки. Удобрения вносили при посадке в верхний слой земли. Посадку семян гороха и картофеля осуществляли в горшки объемом 10 л, которые на две трети наполняли почвой, после чего добавляли биоудобрения (в опытные образцы) или минеральные удобрения (в контрольные образцы), засыпали их оставшимся объемом почвы и перемешивали, распределяя внесенные удобрения равномерно в верхнем слое почве. Горшки размещали на паллетах в двух теплицах тентового типа CoverIT Eco 6х3 м.

Растения пшеницы выращивали в открытом грунте на поле. Перед посевом почва была предварительно обработана мотоблоком. После вспашки опытный участок был выровнен и на нем были сформированы делянки из насыпного грунта. Для закладки агротехнического эксперимента использовали делянки площадью 1 м². Каждая комбинация удобрения была представлена в 3-х повторах. Между делянками были заложены технологические проходы шириной 1 метр, которые играли роль пространственной изоляции опытных образцов удобрений. Для распределения индивидуальных делянок в границах опытного поля использовали генератор случайных чисел. Посев зёрен пшеницы проводили на подготовленные делянки с нормой высева 3,3 млн. зерен на гектар (т.е. в рамках эксперимента на одну делянку высевали 330 зерен). На делянке было расположено 10 рядков с шириной междурядья 9 см и расстоянием между растениями в рядке 3 см. Внесение удобрений проводили ручным способом в рядки непосредственно перед посевом, после этого маркером наносили разметку, позволяющую равномерно распределять зерновки в пределах рядка.

Влияние биомодифицированных минеральных удобрений на продуктивные показатели пшеницы: установлено статистически достоверное влияние штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) на растения пшеницы яровой в совмещении с минеральным удобрением карбамид (по сравнению с внесением карбамида без бактерий) на такие показатели, как:

Число всех зёрен +18,5%

Вес всех зёрен +20,1%

Высота растения +4,8%

Число зёрен главного колоса +4,25%

Вес зёрен главного колоса +5,3%

Число зёрен боковых колосьев +46,60%

Вес зёрен боковых колосьев +53,19 %

Количество боковых побегов +19%

Количество побегов с колосом +14,37%.

Статистически выраженное влияние штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) на растения пшеницы яровой в совмещении с нитроаммофоской (по сравнению с внесением нитроаммофоски без бактерий) установлено на такие показатели, как, например:

Число всех зёрен +17,4%

Высота растения +5,7%

Число зёрен боковых колосьев +32,1%

Вес зёрен боковых колосьев +27%

Количество боковых побегов с колосом +21,6%.

Влияние биомодифицированных минеральных удобрений на продуктивные показатели картофеля: был выявлен статистически значимый эффект биоудобрения на основе нитроаммофоски, подвергнутой биомодификации с помощью штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119), на количество клубней с растения и их вес. Так, добавление штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) к минеральному удобрению NPK15 привело к статистически значимому уменьшению количества клубней, и при этом способствовало увеличению среднего веса клубней на растении. Более конкретно, совместно с нитроаммофоской использование штамма способствовало увеличению веса клубней (+25%) и среднего размера клубней (+8%). При совместном применении на карбамиде данный эффект также был статистически значимым, но был выражен не так сильно.

Влияние биомодифицированных минеральных удобрений на продуктивные показатели гороха: при использовании минерального удобрения NPK15, добавление штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) при выращивании гороха способствовало увеличению числа клубеньков на растении (+8%), числа семян (+24,7%) и веса семян (+21,3%) в сравнении с контролем (применение нитроаммофоски без биомодификации). Использование карбамида, биомодифицированного штаммом Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119), позволило повысить: число стручков (+5,7%), вес растения (+20,7%), число семян (+25,3%) и вес семян на одно растение (+40,9%).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что штамм микроорганизмов Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) в комплексе с минеральными удобрениями оказывает положительное влияние на показатели продуктивности различных растений, повышая эффективность их роста и урожайность, наиболее вероятным механизмом положительного влияния штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) на растения является способность повышать усвояемость минеральных удобрений за счет продукции штаммом органических кислот. Такие данные свидетельствуют о том, что штамм микроорганизмов Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) может успешно использоваться для биомодификации минеральных удобрений с целью ускорения роста и созревания растений, повышения урожайности, а также повышения эффективности усвояемости минеральных удобрений.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биомодификации минеральных удобрений и мелиорантов путем применения штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119), а также к получению биомодификаторов и биомодифицированных минеральных удобрений и мелиорантов для применения в растениеводстве с целью стимуляции роста растений, улучшения питания и повышения урожайности сельскохозяйственных культур. 3 н. и 18 з.п. ф-лы.

1. Применение штамма бактерий Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119), депонированного в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) ФГБНУ ВНИИСХМ под номером RCAM04926, для биомодификации минеральных удобрений и/или мелиорантов.

2. Применение по п.1, в котором биомодификация обеспечивает улучшение питания и/или стимуляцию роста растений, повышение их устойчивости к заболеваниям, азотфиксацию, повышение эффективности усвояемости, соответственно, минеральных удобрений и/или мелиорантов.

3. Применение по любому из пп.1 или 2, в котором минеральное удобрение или мелиорант используют в твердой или жидкой форме.

4. Применение по п.3, в котором минеральное удобрение в твердой форме представляет собой удобрение в гранулированной, приллированной, микрогранулированной, порошкообразной форме или в форме водорастворимого минерального удобрения.

5. Применение по любому из пп.1-4, в котором бактерии наносят непосредственно на минеральное удобрение или мелиорант путем прямого нанесения бактериальной суспензии или с использованием носителя и/или средства, увеличивающего адгезию бактерий на минеральном удобрении, и/или мелиоранте, и/или носителе.

6. Применение по п.5, в котором носитель представляет собой минеральное или органическое природное или синтетическое вещество, приемлемое в сельском хозяйстве.

7. Применение по п.6, в котором носитель представляет собой диатомит, цеолит, опоку, трепел, каолин, глауконит, кремнезем, перлит, метакаолин, волластонит, бентонит, микрокремнезем неорганический, белит, сажу белую, вермикулит (вспученный), тальк или диабазит.

8. Применение по п.5, в котором в качестве средства, увеличивающего адгезию бактерий, используют крахмал катионный, декстрин, коллагеновый клей, костно-желатиновый клей, альбуминовый клей, рыбный клей, вишневый клей, патоку, гуммиарабик или жидкое стекло.

9. Применение по любому из пп.1-8, в котором минеральное удобрение представляет собой азотное, фосфорное, калийное, борное, молибденовое, комплексное, сложно-смешанное или микроудобрение, или смесь одного из удобрений с микроэлементами.

10. Применение по п.9, в котором минеральное удобрение представляет собой карбамид, нитрат аммония, сернокислый аммоний, кальциевую селитру, аммофос, натриевую селитру, диаммонийфосфат, нитроаммофоску, фосфоритную муку, сульфат калия, калийную соль, сульфоаммофос, диаммофос, азофоску, нитрофос, нитрофоску, калиевую селитру, хлористый калий или калимагнезию.

11. Применение по любому из пп.1-3, 5-8, в котором мелиорант представляет собой мелиорант-сорбент, мелиорант-структурообразователь, удобрение-мелиорант, в том числе фосфогипс или фосфоритную муку.

12. Применение по любому из пп.1-11, в котором бактерии используют в споровой и/или вегетативной форме.

13. Биомодификатор для получения биомодифицированного минерального удобрения или биомодифицированного мелиоранта, включающий штамм бактерий Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119) и, опционально, по меньшей мере одно вспомогательное вещество.

14. Биомодификатор по п.13, в котором вспомогательное вещество представляет собой носитель и/или средство, увеличивающее адгезию бактерий на минеральном удобрении, и/или мелиоранте, и/или носителе.

15. Биомодификатор по п.14, в котором носитель представляет собой диатомит, цеолит, опоку, трепел, каолин, глауконит, кремнезем, перлит, метакаолин, волластонит, бентонит, микрокремнезем неорганический, белит, сажу белую, вермикулит (вспученный), тальк или диабазит.

16. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант, включающее(-ий), соответственно, минеральное удобрение или мелиорант, и бактерии штамма Paenibacillus polymyxa RCAM04926 (1119).

17. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по п.16, полученное(-ый) путем биомодификации, соответственно, минерального удобрения или мелиоранта с использованием для этого биомодификатора по любому из пп.13-15.

18. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по любому из пп.16, 17, в котором, соответственно, минеральное удобрение или мелиорант используют в твердой или жидкой форме.

19. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по п.17, в котором минеральное удобрение в твердой форме представляет собой удобрение в гранулированной, приллированной, микрогранулированной, порошкообразной форме или водорастворимое минеральное удобрение.

20. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по любому из пп.16-19, в котором минеральное удобрение представляет собой азотное, фосфорное, калийное, борное, молибденовое, комплексное, сложно-смешанное или микроудобрение или смесь одного из удобрений с микроэлементами, а мелиорант представляет собой мелиорант-сорбент, мелиорант-структурообразователь, удобрение-мелиорант.

21. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по п.20, в котором мелиорант представляет собой фосфогипс или фосфоритную муку.