Способ применения штамма Bacillus subtilis 2.2 совместно с минеральными удобрениями и мелиорантами для повышения урожайности и качества сельскохозяйственных культур Российский патент 2024 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Область техники

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии, в частности к биомодификации минеральных удобрений и мелиорантов и к получению биомодификаторов и биомодифицированных минеральных удобрений и мелиорантов для применения в растениеводстве с целью стимуляции роста растений, улучшения питания и повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Уровень техники

В настоящее время известно множество микробиологических препаратов для сельского хозяйства различного назначения: ростостимулирующих, а также подавляющих развитие фитопатогенных бактерий и грибов.

Известен способ получения биоудобрений (патент RU 2241692, 11.10.2002), заключающийся в совмещении гранулированных минеральных удобрений с микробной биомассой в виде бактериального препарата на основе штамма Bacillus subtilis Ч-13, обладающего антагонистическими свойствами к фитопатогенам и ростостимулирующим действием. Совмещение производят путем нанесения на поверхность гранул минеральных удобрений бактериального препарата в виде сухого порошка, либо в виде жидкой фракции. Указанные способы обеспечивают повышение эффективности защиты растений от инфекционных болезней, проникающих вместе с минеральными удобрениями.

Известен биопрепарат «Фитоспорин» для защиты растений от болезней (патент RU 2099947, 15.11.1996). Основу биопрепарата «Фитоспорин» составляет штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 с концентрацией клеток 10⁹-10¹⁰ на 1 мл физраствора в количестве 92-98 об.% и наполнитель в количестве 2-8 об.%. При этом штамм Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов, что позволяет использовать его для защиты различных видов сельскохозяйственных, декоративных, древесных растений.

Известен штамм бактерий Bacillus pumilus А1.5, используемый в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами (патент RU 2551968, 01.08.2013). Штамм обладает фунгицидной и бактерицидной активностями против фитопатогенных бактерий.

Несмотря на наличие большого количества разработок и использования различных штаммов, вопросы повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям являются по-прежнему очень актуальными.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности минеральных удобрений и мелиорантов в усилении роста и продуктивности растений, защите их от фитопатогенных грибов и повышения их устойчивости к заболеваниям. Также задачей настоящего изобретения является разработка и создание биомодифицированных минеральных (биоминеральных) удобрений и мелиорантов.

Поставленная задача решается путем применения штамма Bacillus subtilis 2.2 для биомодификации удобрений и мелиорантов.

Для этого штамм Bacillus subtilis 2.2 наносят на мелиоранты или на минеральные удобрения, используемые как в сухой, так и в жидкой форме. В некоторых вариантах изобретения минеральное удобрение в сухой форме представляет собой удобрение в гранулированной, приллированной, микрогранулированной, порошкообразной форме или в форме водорастворимого минерального удобрения.

В различных вариантах изобретения бактерии наносят непосредственно на минеральное удобрение или мелиорант или с использованием носителя. В некоторых вариантах изобретения носитель представляет собой минеральное или органическое природное или синтетическое вещество, приемлемое в сельском хозяйстве. В некоторых частных вариантах изобретения носитель представляет собой природное или неприродное вещество на основе кремнийсодержащих пород.

В некоторых вариантах изобретения при иммобилизации бактерий используют средство, увеличивающее (повышающее) адгезию бактерий на минеральном удобрении и/или носителе. В некоторых частных вариантах изобретения в качестве средства, увеличивающего адгезию бактерий, используют крахмал катионный, коллагеновый клей, костно-желатиновый клей, альбуминовый клей, рыбный клей, вишневый клей, декстрин, патоку, гуммиарабик или жидкое стекло.

В некоторых вариантах изобретения минеральное удобрение представляет собой азотное, фосфорное, калийное, борное, молибденовое, комплексное, сложно-смешанное, водорастворимое или микроудобрение, или смесь одного из удобрений с микроэлементами. В некоторых частных вариантах изобретения минеральное удобрение представляет собой карбамид, нитрат аммония, сернокислый аммоний, кальциевую селитру, аммофос, натриевую селитру, диаммонийфосфат, нитроаммофоску, фосфоритную муку, сульфат калия, калийную соль, сульфоаммофос, диаммофос, азофоску, нитрофос, нитрофоску, калиевую селитру, хлористый калий или калимагнезию.

В некоторых вариантах изобретения мелиорант представляет собой мелиорант-сорбент, мелиорант-структурообразователь, удобрение-мелиорант, в том числе, например, фосфогипс, фосфоритную муку.

В различных вариантах изобретения бактерии используют в споровой форме, поскольку она обеспечивает более длительное хранение и выживаемость бактерий.

Поставленная задача также решается путем разработки биомодификатора минеральных удобрений и мелиорантов (бактериального препарата для модификации минеральных удобрений и мелиорантов), включающего штамм бактерий Bacillus subtilis 2.2 и, опционально, по меньшей мере одно вспомогательное вещество.

В некоторых частных вариантах изобретения вспомогательное вещество представляет собой носитель и/или средство, увеличивающее адгезию бактерий на минеральном удобрении и/или мелиоранте и/или носителе. В частных вариантах изобретения концентрация бактерий на носителе составляет не менее 10⁴ КОЕ/г носителя.

В частных вариантах изобретения концентрация бактерий в жидком биомодификаторе составляет не менее 10⁵ КОЕ/мл бактериальной суспензии.

Поставленная задача также решается путем разработки биомодифицированного минерального (биоминерального) удобрения и мелиоранта для защиты растений от фитопатогенных (и токсигенных) грибов, улучшенного питания и стимуляции роста растений, включающего минеральное удобрение и бактерии штамма Bacillus subtilis 2.2.

В различных вариантах изобретения минеральное удобрение используют в твердой или жидкой форме. В некоторых вариантах изобретения минеральное удобрение в твердой форме представляет собой удобрение в гранулированной, приллированной, микрогранулированной или порошкообразной форме.

В частных вариантах воплощения бактерии нанесены на минеральное удобрение или мелиорант непосредственно, или с использованием носителя. В некоторых вариантах изобретения концентрация бактерий в биомодифицированном минеральном (биоминеральном) удобрении (или, соответственно, мелиоранте) составляет не менее 10³ КОЕ на 1 г твердого минерального удобрения (мелиоранта). В частных вариантах - не менее 10⁴ КОЕ на 1 г твердого минерального удобрения (мелиоранта).

В некоторых вариантах изобретения бактерии смешаны с жидким минеральным удобрением. В частных вариантах воплощения изобретения концентрация бактерий составляет не менее 10³ КОЕ на 1 мл жидкого минерального удобрения.

Настоящее изобретение также включает применение штамма Bacillus subtilis 2.2 для получения биомодификатора минеральных удобрений и мелиорантов.

Настоящее изобретение также включает применение биомодификатора на основе штамма Bacillus subtilis 2.2 для получения биомодифицированного минерального (биоминерального) удобрения или мелиоранта для защиты растений от фитопатогенных грибов, улучшения питания и стимуляции роста растений, повышения их устойчивости к заболеваниям, повышения эффективности усвояемости, соответственно, минеральных удобрений и/или мелиорантов.

Также поставленная задача решается путем разработки способа биомодификации минеральных удобрений и мелиорантов, включающего смешивание бактерий штамма Bacillus subtilis 2.2 (биомодификатора по изобретению) с минеральным удобрением или мелиорантом, соответственно. В некоторых вариантах воплощения изобретения указанный способ включает иммобилизацию бактерий штамма Bacillus subtilis 2.2 непосредственно на минеральном удобрении или мелиоранте, а также с использованием носителя.

В некоторых частных вариантах изобретения бактериальную суспензию (или суспензию бактерий, в которую предварительно добавлены вспомогательные вещества) смешивают с жидким минеральным удобрением или прямо наносят на поверхность твердого минерального удобрения или мелиоранта.

В других частных вариантах воплощения изобретения бактериальную суспензию сначала наносят на носитель, после чего полученный биомодификатор наносят на минеральное удобрение (или мелиорант) путем перемешивания. Поскольку содержание КОЕ (колониеобразующих единиц) микроорганизмов в бактериальной суспензии влияет на количество КОЕ микроорганизмов, осажденных в конечном итоге на носителе и минеральном удобрении и мелиоранте, их концентрацию выбирают исходя из количества, являющегося целевым для содержания в биомодифицированном минеральном (биоминеральном) удобрении/мелиоранте. Чем больше КОЕ в бактериальной суспензии, тем большее количество агрономически полезных микроорганизмов осаждается на носитель и минеральное удобрение/мелиорант. В частных вариантах воплощения изобретения бактерии наносят на носитель до достижения концентрации на носителе не менее 10⁴ КОЕ на 1г носителя. Полученный биомодификатор в частных вариантах изобретения наносят на минеральное удобрение/мелиорант в соотношении не менее 1 кг на тонну минерального удобрения/мелиоранта.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:

- разработан новый эффективный подход к биомодификации минеральных удобрений и мелиорантов, а также способ биомодификации;

- биомодифицированные минеральные удобрения и мелиоранты по изобретению обеспечивают защиту от фитопатогенных (и токсигенных) грибов, усиление роста и продуктивности растений, а также повышение их устойчивости к заболеваниям благодаря эффективному комбинированному воздействию, обусловленному способностью штамма Bacillus subtilis 2.2 продуцировать антифунгальные и ауксиноподобные вещества, ферменты и другие органические соединения, способные подавлять развитие фитопатогенов, стимулировать разрастание корневой и ростковой системы растений - с одной стороны, и обеспечивать растения дополнительными питательными веществами, содержащимися в минеральных удобрениях (мелиорантах) и почве - с другой;

- ключевой особенностью штамма Bacillus subtilis 2.2 является способность подавлять развитие фитопатогенных (и токсигенных) грибов и продуцировать ауксиноподобные вещества, стимулирующие разрастание корневой системы растений, поэтому применение штамма в составе биоминеральных удобрений/мелиорантов и биомодификаторов обеспечивает защиту растений от фитопатогенов, увеличение фитомассы и продуктивности растений;

- биомодифицированные минеральные (биоминеральные) удобрения и мелиоранты по изобретению эффективны для применения при выращивании различных растений - овощных, зерновых и технических культур в сельском хозяйстве, растений, используемых в цветоводстве, лесоводстве, и других, без ограничений;

- биомодификатор минеральных удобрений и мелиорантов (биомодифицированное минеральное удобрение и мелиорант) на основе штамма Bacillus subtilis 2.2 позволяет уменьшить потери минеральных удобрений (мелиорантов) путём их вымывания и улетучивания;

- применение штамма бактерий Bacillus subtilis 2.2 в составе биомодифицированного минеральнго удобрения и мелиоранта позволяет повысить эффективность их усвояемости растениями;

- биомодифицированное минеральное (биоминеральное) удобрение и мелиорант по изобретению характеризуется длительной жизнеспособностью бактерий в его составе, как минимум, в течение 3-х месяцев (а в большинстве случаев намного дольше), в концентрациях, обеспечивающих эффективность биоминеральных удобрений и мелиорантов;

- разработанные биоминеральные удобрения/мелиоранты и биомодификаторы на основе штамма Bacillus subtilis 2.2 расширяют ассортимент средств для повышения урожайности и улучшения роста сельскохозяйственных культур и других растений и их устойчивости к различным заболеваниям.

Термины и определения

Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п. интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Это относится, в том числе, например, к применению штамма Bacillus subtilis 2.2 и к биомодификаторам минеральных удобрений или мелиорантов, а также к биомодифицированным минеральным удобрениям или биомодифицированным мелиорантам. Согласно изобретению, штамм Bacillus subtilis 2.2 может применяться не только изолированно, но и в составе консорциумов с другими штаммами.

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Термин «необязательный» или «необязательно» или «опциональный» или «опционально», используемый в данном документе, означает, что описываемое впоследствии событие или обстоятельство может, но не обязательно, произойти, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит, и случаи, в которых оно не происходит.

Под штаммом Bacillus subtilis 2.2 понимается не только штамм Bacillus subtilis 2.2, который был депонирован в коллекции ВКПМ под номером В-13292, но и мутантный штамм, полученный с использованием депонированного штамма в качестве исходного материала, и сохраняющий все свойства исходного штамма, т.е. обладающий всеми определяющими штамм Bacillus subtilis 2.2 (идентифицирующими) характеристиками. В том, числе, по меньшей мере, способный продуцировать ауксиноподобные вещества, пригодный для применения в усилении роста и продуктивности растений, защите их от фитопатогенных грибов, повышении устойчивости растений к заболеваниям. В частности, штамм Bacillus subtilis 2.2 имеет следующие идентифицирующие особенности, включающие (но не ограничиваясь) 1) способность к продукции 3-индолилуксусной кислоты и ее производных на среде с L-триптофаном; 2) способность подавлять фитопатогенные и токсигенные грибы, например, такие как Fusarium sporotrichioid, Alternaria solani, Fusarium culmorum; 3) наличие обязательных генов с идентичностью более 95%, более 96%, более 97%, более 98% или более 99% с обязательными генами Bacillus subtilis 2.2, которые могут использоваться для подтверждения того, что анализируемый вариант является Bacillus subtilis 2.2.

Используемый здесь термин «мутант» или «вариант» по отношению к штамму Bacillus subtilis 2.2 означает модификацию родительского штамма, в котором целевая биологическая активность является подобной активности, выражаемой родительским штаммом. Мутанты или варианты могут возникать в природе без вмешательства человека. Они могут быть получены также путем обработки одним или множеством способов и химических веществ (составов), известных специалистам в данной отрасли или же гамма-, рентгеновским либо ультрафиолетовым излучением, или любыми другими средствами, хорошо известными специалистам в данной отрасли.

«Носитель» согласно изобретению представляет собой любое вещество, не запрещенное к применению в сельском хозяйстве. Это может быть, не ограничиваясь, как минеральное, так и органическое вещество, как природное, так и синтетическое. Основными требованиями, предъявляемыми к носителям по изобретению, являются большая удельная поверхность, приемлемая для нанесения штамма бактерий согласно изобретению, и безопасность для применения в растениеводстве, в частности, в сельском хозяйстве. Прежде всего, такие носители не должны содержать катионов тяжелых металлов и радиоактивных веществ. В некоторых неограничивающих вариантах изобретения носитель представляет собой природное или неприродное вещество на основе кремнийсодержащих пород. Неограничивающими примерами носителей могут быть диатомит (кизельгур), цеолит, опока, трепел, каолин, глауконит, кремнезем, перлит, метакаолин, волластонит, бентонит, микрокремнезем неорганический, белит, сажа белая, вермикулит (вспученный), тальк, диабазит.

Под «бактериальной суспензией» согласно изобретению понимается сложная смесь, получаемая при культивировании агрономически полезных микроорганизмов in vitro и содержащая культивируемые микроорганизмы, остаточные питательные вещества и продукты метаболизма этих микроорганизмов. Бактериальная суспензия получается как результат ферментации - совокупности последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и нагретую до требуемой температуры питательную среду посевного материала агрономически полезных микроорганизмов и до завершения процесса роста клеток. Состав питательной среды для культивирования (содержание в легко усваиваемом виде веществ, необходимых для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей), ее температура, время культивирования и другие необходимые условия (в том числе, например, рН, наличие факторов роста, витаминов, буферность и др.) выбираются оптимальными в зависимости от конкретного штамма культивируемых агрономически полезных микроорганизмов.

«Культуральная жидкость» - термин, обозначающий питательную среду, в которой выращивали микроорганизмы, которая содержит их метаболиты и другие целевые вещества, продуцируемые микроорганизмами, а также остаточные питательные вещества, в отличие от «бактериальной суспензии», которая помимо культуральной жидкости содержит клетки агрономически полезных микроорганизмов.

Под «биомодификатором» («бактериальным препаратом для модификации минеральных удобрений») в настоящем изобретении понимают состав, включающий бактерии штамма Bacillus subtilis 2.2 и, опционально, вспомогательное вещество. В частных вариантах воплощения изобретения бимодификатор по изобретению представляет собой состав, включающий комплекс носителя с иммобилизованными на нем агрономически полезными микроорганизмами штамма Bacillus subtilis 2.2. Указанный биомодификатор предназначен для модификации минеральных удобрений и мелиорантов, в частности, путем смешения с минеральным удобрением (жидким или твердым) и мелиорантом. В частных вариантах воплощения изобретения биомодификатор включает, по меньшей мере, одно вспомогательное вещество.

Термин «вспомогательное вещество» при использовании в настоящем описании относится к веществам, которые не нарушают биологической активности и свойств бактерий и являются приемлемыми для использования в сельском хозяйстве (безопасность для применения в растениеводстве, в частности, в сельском хозяйстве). Частные варианты вспомогательных веществ включают сухие носители или жидкие разбавители, например, воду. В некоторых частных вариантах изобретения вспомогательное вещество представляет собой средство, увеличивающее адгезию бактерий на минеральном удобрении и/или мелиоранте и/или носителе.

Под «минеральным удобрением», согласно изобретению, понимают соединения неорганической природы, которые содержат необходимые элементы питания растений, т.е. удобрение промышленного или ископаемого происхождения, содержащее питательные элементы в минеральной форме. Согласно изобретению, могут быть использованы, без ограничения, любые минеральные удобрения в твердой (сухой) форме (например, в виде гранул, порошка, кристаллов, в таблетированной форме и др.), в том числе водорастворимые удобрения (удобрения в твердой форме, которые перед применением полностью растворяют в воде; они в основном предназначены для использования через систему полива растений) и удобрения в жидкой форме. В том числе могут быть использованы простые минеральные удобрения - с гарантированным содержанием только одного основного питательного элемента (например азотные, фосфорные, калийные, магниевые, борные, молибденовые), комплексные (в том числе сложно-смешанные) минеральные удобрения - содержащие не менее двух основных питательных элементов (например, азотно-калиевые, азотно-фосфорно-калиевые (NPK), азотно-фосфорно-калиевые удобрения с добавлением серы (NPKS)), микроудобрения - в которых питательными элементами являются микроэлементы в доступной для растений форме. При этом в любое минеральное удобрение могут быть дополнительно добавлены микроэлементы. В некоторых частных вариантах для получения биоминеральных удобрений по изобретению могут быть использованы карбамид, нитрат аммония (аммиачная селитра), сернокислый аммоний, кальциевая селитра, аммофос, натриевая селитра, диаммонийфосфат, нитроаммофоска, фосфоритовая (фосфоритная) мука, сульфат калия, калийная соль, сульфоаммофос, диаммофос азофоска, нитрофос, нитрофоска, калиевая селитра, хлористый калий, калимагнезия и др.

Под «мелиорантом» согласно изобретению понимают вещество промышленного или ископаемого происхождения, предназначенное для улучшения физико-химических свойств и повышения плодородия кислых, солонцеватых и других почв. Согласно изобретению, биомодификации могут быть подвергнуты любые мелиоранты, в том числе, например, мелиоранты-сорбенты, мелиоранты-структурообразователи, удобрения-мелиоранты (см., например, Петрова Т.А. и др. Виды мелиорантов для рекультивации техногенно нарушенных территорий горной промышленности // Горный информационно-аналитический бюллетень, 2021, № 4, с.100-112). В некоторых случаях мелиорантом по изобретению может быть, например, фосфогипс, фосфоритная мука и др.

Термин «питательный элемент» («действующее вещество») означает химический элемент удобрения, необходимый для роста и развития растений. Питательные элементы подразделяются на три группы: главные (основные) питательные элементы - N, Р, К, макроэлементы - N, Р, К, Са, Mg, S, микроэлементы - В, Mn, Cu, Zn, Co, Mo, Fe и др.

Термин «биомодифицированное минеральное удобрение» («биоминеральное удобрение») означает минеральное удобрение, гранулы или частицы которого покрыты бактериями, улучшающими его свойства. Также под этот термин подпадают жидкие минеральные удобрения (например, карбамидо-аммиачная смесь (КАС), но не только), в которые с целью улучшения их свойств вводятся бактерии.

Термин «биомодифицированный мелиорант» означает мелиорант, гранулы или частицы которого покрыты бактериями, улучшающими его свойства. Также под этот термин подпадают жидкие мелиоранты, в которые с целью улучшения их свойств вводятся бактерии.

Концентрации бактерий в биоминеральном удобрении, в биомодифицированном мелиоранте, а также в биомодификаторе относятся к таковым в начале хранения (т.е. сразу после нанесения или не более чем через месяц после нанесения), если не указано иное; или не менее указанных на определенный срок.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Подробное раскрытие изобретения

Штамм Bacillus subtilis 2.2 депонирован в Биоресурсом Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» 24 февраля 2022 года под номером В-13292.

Происхождение штамма

Выделен научными работниками компании Евробиохим из почв Краснодарского края в 2019 году.

Морфолого-культуральные и биохимические признаки

Крупные грамположительные спорообразующие палочки 1.0-2.0 мкм, прямые с закруглёнными концами. На картофельном агаре образуют колонии кремово-серого цвета с неровными фестончатыми краями, с поднятым центром, пастообразной консистенции с концентрическими кругами. Диаметр колоний 20-40 мм. Оптимальная температура для роста 37°С. При температуре более 45°С и менее 15°С рост замедленный. Оптимальное значение рН среды 6.8; рост происходит при рН от 4.5 до 8.0. На картофельном агаре образуют колонии кремово-желтого цвета с неровным фестончатым краем с приподнятым складчатым центром кожистой консистенции.

Предназначен для улучшения питания - ускорения роста и увеличения продуктивности овощных, зерновых и технических культур в сельском хозяйстве. При культивировании на среде с триптофаном вырабатывает ауксины: индолилуксусную кислоту, индолилкарбоновую кислоту и индолилмолочную кислоту.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма

Культивирование на жидких питательных средах (гороховая среда) с помощью лабораторных качалок и ферментеров. Оптимальные условия для ферментации: температура + 36°С, скорость мешалки 400-600 об/мин, подача воздуха 1 об./об., среда: гороховая мука, сахароза, MgSO₄. Периодический пересев 2 раза в год на свежую питательную среду ГМФ, МПА, TSA или картофельный агар.

Характеристика штамма

Штамм Bacillus subtilis 2.2 предназначен для защиты растений от фитопатогенов, улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности овощных, зерновых и технических культур в сельском хозяйстве, а также в цветоводстве, лесоводстве. Бактерии Bacillus subtilis 2.2 относятся к группе PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) - ризобактерии, способствующие росту растений. Бактерии штамма Bacillus subtilis 2.2 обладают широким кругом растений-хозяев, способны образовывать эндоспоры, позволяют повысить продуктивность растений. Штамм Bacillus subtilis 2.2 не патогенен, не вирулентен, не токсичен, не обладает диссеминацией в ткани.

Ключевыми особенностями штамма Bacillus subtilis 2.2, обеспечивающими его высокую эффективность при применении для модификации минеральных удобрений, являются механизмы его положительного воздействия на растения: штамм Bacillus subtilis 2.2 активно продуцирует фунгицидные вещества, подавляющие развитие фитопатогенных (и токсигенных) грибов, а также ауксин-подобные вещества, которые стимулируют разрастание корневой и ростковой системы растений, повышая всасываемую способность корней и количество поглощенных минеральных элементов. Таким образом, воздействие на усвояемость (доступность) минеральных удобрений растениями происходит путём продукции бактериями различных органических и неорганических кислот и увеличения объёма корневой системы.

Возможность объективного проявления технического результата при осуществлении изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными ниже в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Следует понимать, что приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Пример 1. Изучение способности штамма к продукции 3-индолилуксусной кислоты (ИУК) и ее производных на среде с L-триптофаном

Для выделения ауксинов культуральную жидкость (объемом 1 мл) подкисляли 0,4 н соляной кислотой до рН=3,0 и экстрагировали дважды эквивалентными объемами этилацетата. Полученные экстракты выпаривали досуха при 35°C на вакуумном роторном испарителе и растворяли в 0,5 мл 18% ацетонитрила. Полученные образцы фильтровали через нейлоновые мембранные фильтры (Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters) с диаметром пор 0,22 мкм (Sigma, США) и разводили в 10 раз 18% ацетонитрилом для последующего хроматографического анализа. Анализ ауксинов в полученных экстрактах проводили с помощью системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, HPLC) Waters ACQUITY UPLC H-class с флуоресцентным детектором. Ауксины разделяли на колонке с обращенной фазой Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 (Waters, США), используя изократическое разделение в элюенте ацетонитрил : вода : уксусная кислота (18:82:0.1 об./об./об.) в течение 4 мин, с дальнейшей промывкой колонки элюентом ацетонитрил : вода : уксусная кислота (80:20:0.1 об./об./об.) в течение 3 мин. Скорость подачи элюента составляла 0,3 мл/мин, температура колонки 300°С, длины волн флуоресцентного детектора: 280 нм возбуждающая (Ex) и 350 нм эмиссионная (Em). Идентификацию ауксинов проводили сравнением времен удержания соответствующих веществ (Sigma-Aldrich, США) в пробах и в стандартной смеси. Количества ауксинов определяли сравнением площадей пиков в пробах и стандартной смеси с концентрацией кислот 0,5 мкг/мл (индолил-3-молочная), 10 мкг/мл (индолил-3-карбоновая) и 4 мкг/мл (индолил-3-уксусная). Степень использования L-триптофана (%) определяли как долю его молекул, идущих на биосинтез эквивалентного количества молекул ауксинов, идентифицированных в пробах. Для определения содержания L-триптофана в питательных средах использовали стерильные среды без дополнительной пробоподготовки. Анализ L-триптофана проводили на колонке с обращенной фазой Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 (Waters, США) 5 минут в линейном градиенте элюента ацетонитрил : вода : уксусная кислота от 1% : 99% : 0,1% до 18% : 82% : 0,1%, с последующей 3-хминутной изократической элюцией и 3-минутной промывки колонки при концентрации компонентов буфера 80% : 20% : 0.1% . Скорость подачи элюента составляла 0.3 мл/мин, температура колонки 300°С, длины волн флуоресцентного детектора: 280 нм возбуждающая (Ex) и 350 нм эмиссионная (Em). Идентификацию L-триптофана проводили сравнением его времени удержания в пробах и в растворе химически чистого вещества (Sigma, США). Количество L-триптофана определяли сравнением площадей пиков в пробах и стандартной смеси с концентрацией 0,01 мкг/мл.

Установлено, что штамм Bacillus subtilis 2.2 характеризируется высокими показателями продукции ауксинов и ауксинподобных веществ: индолил-3-уксусной кислоты - 333,7 нг/мл, индолил-3-карбоновой кислоты - 19,6 нг/мл, индолил-3-молочной кислоты - 127 нг/мл. Таким образом, суммарно продукция штаммом ауксинов составила 480,3 нг/мл.

Пример 2. Изучение ростостимулирующей активности на проростках пшеницы

Семена озимой пшеницы (сорт «Светоч») замачивали в бактериальной суспензии, содержащей клетки бактерий штамма Bacillus subtilis 2.2 в концентрации 1*10⁵ КОЕ/мл, в течение 30 мин, затем в условиях опыта in vitro выкладывали во влажные камеры на поверхность фильтровальной бумаги. Для каждого варианта на одну влажную камеру выкладывали по 25 семян в трех повторностях. Семена в контрольном варианте замачивали в стерильном физиологическом растворе. Проростки выращивали в течение пяти суток при 28°С. Контрольным штаммом для сравнения ростостимулирующих свойств бактерий был выбран штамм B. subtilis Am 7 (ВКПМ В-12776) из коллекции лаборатории ООО «Микробокс», уже используемый при производстве биопрепарата Нодикс.

Ростостимуляция штамма Bacillus subtilis 2.2 на проростках пшеницы составила: корень - на 60% больше по отношению к контролю, стебель - на 39,6% больше к контрольному варианту.

Пример 3. Изучение фунгицидных свойств штамма на тест-культурах фитопатогенных грибов

Оценку фунгицидных свойств штамма Bacillus subtilis 2.2 исследовали в отношении штаммов фитопатогенных и токсигенных грибов: Fusarium sporotrichioid, Alternaria solani, Fusarium culmorum (из коллекции ООО «Микробокс»).

Культуру бактерий Bacillus subtilis 2.2 наращивали на жидкой среде R₂A стационарно, при 20°С в течение 3-х суток, фунгицидную активность определяли с помощью метода «колодцев» (Magnusson и Schnurer, 2001) на картофельно-декстрозном агаре (Difco, США). Для этого поверхностным смывом с колонии гриба готовили суспензию спор с титром 10⁵ КОЕ/мл. 20 мкл полученной суспензии вносили в расплавленный и охлажденный до 45°С картофельно-декстрозный агар объемом 200 мл. Питательную среду разливали по чашкам, после застывания среды стерильным пробочным сверлом в ней делали отверстия. В полученные «колодцы» вносили по 100 мкл культуры бактерий Bacillus subtilis 2.2. Посевы инкубировали 5 суток при 25°С, после инкубации фунгицидную активность оценивали по диаметру зон ингибирования фитопатогена вокруг «колодца».

Изучение фунгицидной активности позволило установить способность Bacillus subtilis 2.2 активно подавлять все тест-объекты фитопатогенных грибов. Установлены зоны подавления фитопатогенов: Fusarium sporotrichioides - > 60 мм, Alternaria solani - > 60 мм, Fusarium culmorum 50 мм. Края зон при этом были четко ограничены, хорошо выражены, а размеры зон характеризовались длительностью сохранения эффекта подавления.

Пример 4. Нанесение бактериальной культуры на гранулы минеральных удобрений и определение численности

Поскольку штамм микроорганизмов Bacillus subtilis 2.2 предназначен для повышения эффективности применения минеральных удобрений, была определена способность бактериальных клеток сохранять свою жизнеспособность на поверхности гранул и влиять на показатели роста и продуктивности растений.

Для обработки гранул минеральных удобрений (карбамид, аммофос и нитроаммофоска) использовали бактериальную суспензию штамма Bacillus subtilis 2.2, содержащую бактерии в титре не менее 0,5*10⁹ КОЕ/мл. Обработку гранул минеральных удобрений бактериальной суспензией проводили методом нанесения на поверхность гранул из расчета 1 литр на тонну (или 1 мл на кг). Через 24 часа определяли численность бактерий на гранулах методом серийных разведений с высевом на твердые питательные среды и культивированием при 36°С в течение 48 часов, после чего проводили подсчет выросших колоний. Установленный титр штамма Bacillus subtilis 2.2 на поверхности гранул при прямом нанесении в начале хранения (через 24 часа после нанесения) составил: на карбамиде - 29*10⁶ КОЕ/г, на аммофосе - 17*10⁶ КОЕ/г, на нитроаммофоске - 23*10⁶ КОЕ/г. Повторное определение численности колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий штамма Bacillus subtilis 2.2 на поверхности минеральных удобрений проводили через 12 месяцев после нанесения.

Определение титра бактерий Bacillus subtilis 2.2 на поверхности гранул минеральных удобрений позволило установить способность бактерий сохранять свою жизнедеятельность после их нанесения на минеральные удобрения. Установленный титр штамма Bacillus subtilis 2.2 на поверхности гранул после 12 месяцев хранения составил: на карбамиде - 6*10⁴КОЕ/г, на аммофосе - 4.1*10⁴ КОЕ/г, на нитроаммофоске - 3.2*10⁶ КОЕ/г. Таким образом, было показано, что штамм Bacillus subtilis 2.2 способен сохранять свою жизнедеятельность на поверхности гранул минеральных удобрений в концентрациях, обеспечивающих эффективность биоминеральных удобрений на протяжении не менее 12 месяцев.

Пример 5. Нанесение бактериальной культуры на гранулы минеральных удобрений с использованием носителя

Подготовка компонентов. Культуру бактерий штамма Bacillus subtilis 2.2 выращивают в жидкой питательной среде при 36°С в течение 3х суток на качалке при 400 об/мин. Носитель (цеолит) стерилизовали в сушильном шкафу при 200°С в течение 8 часов. В эксперименте использовали следующие виды минеральных удобрений: карбамид, аммофос, нитроаммофоска. Все виды гранул минерального удобрения стерилизовали в сушильном шкафу при 100°С в течение 10 ч.

В отдельный стерильный фалькон объемом 50 мл вносили 5 г цеолита. В него добавляли 5 мл бактериальной суспензии. Смесь тщательно перемешали стерильной стеклянной палочкой и перенесли на стеклянную чашку Петри слоем не более 5 мм. После этого провели сушку при 60°С в сушильном шкафу в течение 10 ч.

В стерильные фальконы объемом 50 мл внесли 15 г минерального удобрения. К удобрению добавили 0,06 г высушенного цеолита с нанесенной бактериальной культурой. Смесь тщательно перемешали на вортексе 30 с.

Титр бактерий на гранулах минеральных удобрений определяли через 24 часа после нанесения методом серийных разведений с высевом на твердые питательные среды и культивированием при 36°С в течение 48 часов, после чего провели подсчет выросших колоний. Как показал проведенный подсчет, количество бактериальных клеток на гранулах минеральных удобрений составило: на карбамиде - 4,5*10⁷ КОЕ/г, на аммофосе - 3,1*10⁷ КОЕ/г, на нитроаммофоске - 4,0*10⁷ КОЕ/г.

Пример 6. Определение активности бактериальных штаммов при их совместном внесении с гранулами минеральных удобрений

Для определения активности интродукции микроорганизмов в ризосферу сельскохозяйственных культур использовали модельные гнотобиотические системы. В качестве тест-объектов использовали тест растения озимой пшеницы.

Гранулы минеральных удобрений (карбамид, аммофос и нитроаммофоска) использовались сразу после обработки бактериальной суспензией штамма Bacillus subtilis 2.2 - см. пример 4.

Для выявления способности исследуемого штамма к активной колонизации высших растений использовали метод внесения обработанных гранул, их внесение в систему без непосредственного контакта между гранулой и высаженным проростком растения, последующее выращивание растений в стерильных условиях гнотобиотических систем. Контрольным штаммом для сравнения колонизационных свойств бактерий выбран штамм B. subtilis Am 7 (ВКПМ В-12776), уже используемый при производстве биопрепаратов.

Растительным объектом для изучения были проростки пшеницы Triticum aestivum (сорт «Светоч»). Семена пшеницы стерилизовали сначала 2 минуты в 70% этаноле, затем промывали в стерильной воде, после чего двукратно выдерживали в 30% растворе гипохлорита натрия в течение 30 минут. После стерилизации семена тщательно отмывали в стерильной воде. Далее семена высаживали в системы и выращивали в условиях гнотобиотических систем. Для определения количества интродуцируемых бактерий в ризоплане, отмытые корни суспендировали в физиологическом растворе и учитывали численность микроорганизмов высевом на твердую среду R2A.

Проведенный анализ показал, что тестируемый штамм Bacillus subtilis 2.2 хорошо прижился и в ризосфере, и на корнях пшеницы, не уступая, а иногда превосходя соответствующие показатели контрольного штамма B. subtilis Am 7. Так, количество бактерий (КОЕ /1 г корня пшеницы) для вариантов гранул аммофоса со штаммом Bacillus subtilis 2.2 составило для корня - 8,7*10⁷, для ризосферы - 12,4*10⁶, для контрольных вариантов - корень 6,0*10⁶ , ризосфера - 6,8*10⁶ КОЕ /1 г корня пшеницы. Для гранул карбамида, содержащих на поверхности штамм Bacillus subtilis 2.2, количество бактерий составило для корня - 5,2*10⁶, для ризосферы - 11,6*10⁶, тогда как значения для контрольных вариантов были - корень 1,4*10⁶, ризосфера - 5,2*10⁶ КОЕ /1 г корня пшеницы. Для гранул нитроаммофоски со штаммом Bacillus subtilis 2.2 количество бактерий составило для корня - 7,3*10⁶, для ризосферы - 4,4*10⁶, тогда как значения для контрольных вариантов были - корень 4,0*10⁶, ризосфера - 3,2*10⁶ КОЕ /1 г корня пшеницы.

Таким образом, штамм Bacillus subtilis 2.2 способен к активной колонизации высших растений при его внесении в составе биоминеральных удобрений.

С целью выявления фитостимулирующей активности бактерий в составе биоминеральных удобрений был проведен также вегетационный опыт с озимой пшеницей, сорт Светоч, элита, для изучения эффективности штамма бактерий Bacillus subtilis 2.2. Опыт проводили в поликарбонатной теплице. Для исследования в трехлитровые сосуды добавлялось по 2 кг почвы. Далее равномерным слоем раскладывалось по 0,7 г биомодифицированных (на основе штамма Bacillus subtilis 2.2) минеральных удобрений карбамида, аммофоса и нитроаммофоски (см. пример 4). В контрольные сосуды раскладывали такое же количество не биомодифицированного минерального удобрения. Сверху засыпали 1 кг почвы. Семена сажались в лунки глубиной 4-5 см. На каждый сосуд по 15 семян. Эксперимент проводили на протяжении 3 месяцев, учитывали влияние биомодифицированных удобрений на основе штамма Bacillus subtilis 2.2, на высоту растений, длину корневой части растений и на вес растений. В результате эксперимента установлено положительное влияние биомодифицированных удобрений на рост и развитие растений пшеницы. Так, штамм Bacillus subtilis 2.2 показал прибавку веса растений озимой пшеницы на аммофосе - на 18,9 %, на карбамиде - на 22,8% (по сравнению с не биомодифицированными минеральными удобрениями). Таким образом, экспериментально было установлено, что штамм Bacillus subtilis 2.2 обладает выраженным фитостимулирующим эффектом.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что штамм бактерий Bacillus subtilis 2.2 является эффективным биологическим агентом для использования в биомодификации минеральных удобрений в качестве эффективного средства защиты растений, повышения их продуктивности и эффективности усвояемости минеральных удобрений и расширяет арсенал подобных средств.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к биомодификации минеральных удобрений и мелиорантов путем применения штамма Bacillus subtilis 2.2, а также к получению биомодификаторов и биомодифицированных минеральных удобрений и мелиорантов для применения в растениеводстве с целью защиты растений от фитопатогенов, стимуляции роста растений, улучшения питания и повышения урожайности сельскохозяйственных культур. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 5 пр.

1. Штамм бактерий Bacillus subtilis 2.2, депонированный в коллекции ВКПМ под номером В-13292, для биомодификации минеральных удобрений и/или мелиорантов.

2. Применение штамма бактерий Bacillus subtilis 2.2 для биомодификации минеральных удобрений и/или мелиорантов.

3. Применение по п.2, в котором биомодификация обеспечивает улучшение питания и/или стимуляцию роста растений, повышение их устойчивости к заболеваниям, повышение эффективности усвояемости, соответственно, минеральных удобрений и/или мелиорантов.

4. Применение по любому из пп.2 или 3, в котором минеральное удобрение или мелиорант используют в твердой или жидкой форме.

5. Применение по п.4, в котором минеральное удобрение в твердой форме представляет собой удобрение в гранулированной, приллированной, микрогранулированной, порошкообразной форме или в форме водорастворимого минерального удобрения.

6. Применение по любому из пп.2-5, в котором бактерии наносят непосредственно на минеральное удобрение или мелиорант путем прямого нанесения бактериальной суспензии или с использованием носителя и/или средства, увеличивающего адгезию бактерий на минеральном удобрении и/или мелиоранте и/или носителе.

7. Применение по п.6, в котором носитель представляет собой минеральное или органическое природное или синтетическое вещество, приемлемое в сельском хозяйстве.

8. Применение по п.7, в котором носитель представляет собой диатомит, цеолит, опоку, трепел, каолин, глауконит, кремнезем, перлит, метакаолин, волластонит, бентонит, микрокремнезем неорганический, белит, сажу белую, вермикулит (вспученный), тальк или диабазит.

9. Применение по п.6, в котором в качестве средства, увеличивающего адгезию бактерий, используют крахмал катионный, декстрин, коллагеновый клей, костно-желатиновый клей, альбуминовый клей, рыбный клей, вишневый клей, патоку, гуммиарабик или жидкое стекло.

10. Применение по любому из пп.2-9, в котором минеральное удобрение представляет собой азотное, фосфорное, калийное, борное, молибденовое, комплексное, сложно-смешанное или микроудобрение или смесь одного из удобрений с микроэлементами.

11. Применение по п.10, в котором минеральное удобрение представляет собой карбамид, нитрат аммония, сернокислый аммоний, кальциевую селитру, аммофос, натриевую селитру, диаммонийфосфат, нитроаммофоску, фосфоритную муку, сульфат калия, калийную соль, сульфоаммофос, диаммофос, азофоску, нитрофос, нитрофоску, калиевую селитру, хлористый калий или калимагнезию.

12. Применение по любому из пп.2-4, 6-9, в котором мелиорант представляет собой мелиорант-сорбент, мелиорант-структурообразователь, удобрение-мелиорант, в том числе фосфогипс или фосфоритную муку.

13. Применение по любому из пп.2-12, в котором бактерии используют в споровой форме.

14. Биомодификатор для получения биомодифицированного минерального удобрения или мелиоранта, включающий штамм бактерий Bacillus subtilis 2.2 и, опционально, по меньшей мере одно вспомогательное вещество.

15. Биомодификатор по п.14, в котором вспомогательное вещество представляет собой носитель и/или средство, увеличивающее адгезию бактерий на минеральном удобрении и/или мелиоранте и/или носителе.

16. Биомодификатор по п.15, в котором носитель представляет собой диатомит, цеолит, опоку, трепел, каолин, глауконит, кремнезем, перлит, метакаолин, волластонит, бентонит, микрокремнезем неорганический, белит, сажу белую, вермикулит (вспученный), тальк или диабазит.

17. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант, включающее(-ий), соответственно, минеральное удобрение или мелиорант и бактерии штамма Bacillus subtilis 2.2.

18. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по п.17, полученное(-ый) путем биомодификации, соответственно, минерального удобрения или мелиоранта с использованием для этого биомодификатора по любому из пп.14-16.

19. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по любому из пп.17-18, в котором, соответственно, минеральное удобрение или мелиорант используют в твердой или жидкой форме.

20. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по п.19, в котором минеральное удобрение в твердой форме представляет собой удобрение в гранулированной, приллированной, микрогранулированной, порошкообразной форме или водорастворимое минеральное удобрение.

21. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по любому из пп.17-20, в котором минеральное удобрение представляет собой азотное, фосфорное, калийное, борное, молибденовое, комплексное, сложно-смешанное или микроудобрение или смесь одного из удобрений с микроэлементами, а мелиорант представляет собой мелиорант-сорбент, мелиорант-структурообразователь, удобрение-мелиорант.

22. Биомодифицированное минеральное удобрение или биомодифицированный мелиорант по п.21, в котором мелиорант представляет собой фосфогипс или фосфоритную муку.