Способ количественного определения флоридзина в плодах и листьях яблони методом капиллярного электрофореза Российский патент 2024 года по МПК A01G7/00 G01N27/26 

Изобретение относится к аналитической химии, служит для определения массовой концентрации флоридзина в плодах и листьях яблони, может быть применено в плодоводстве при сопоставлении содержания флоридзина с сортовыми особенностями яблони по морозоустойчивости.

Известен способ количественного определения флоридзина (флоризина) в тканях растений путем экстракции его водным этанолом с последующим спектрофотометрированием, предусматривающий смешивание навески растительной ткани с основным ацетатом свинца (II) и водного этанола, измельчение и экстракцию тем же раствором (80 об.%) этанола. В отделенный экстракт вводят серную кислоту, удаляют осадок, получают целевой раствор и по его оптической плотности определяют содержание флоридзина [Патент РФ №2115291 Палфитов В.Ф., Потапов В.А., Тарасов А.М. / Мичуринская государственная сельскохозяйственная академия. - Опубл.: 1998.07.20, Заявл.: 1996.08.05].

Недостатки способа: влияние на результат определения других фенольных веществ - хлорогеновой, кофейной, оксикоричных кислот, многостадийные операции подготовки проб, которым присущи ошибки и потери целевого вещества.

Наиболее близким (прототип) является следующий способ: качественный анализ извлечений из листьев и плодов яблони лесной проводили методом тонкослойной хроматографии в экспериментально отобранных системах растворителей. Для количественного анализа использовали метод ВЭЖХ, в ходе которого были определены арбутин, изорамнетин-3-галактозид, кверцитин-3-глюкозид, кверцитин-3-рутинозид, флоридзин. Анализ выполнен на колонке Kromasil С18 размером 4,6×250 мм, размер частиц 5 мкм, используемая подвижная фаза метанол-вода-кислота фосфорная концентрированная (400:600:5) в условиях изократического элюирования. Продолжительность анализа 70 мин [Nesterova, N.V. The Detection of Floretin and Floridzin in Eastern Apple Tree Fruits (Malus orientalis Uglitzk. ex Juz.) and Assessment of the Quantitative Content of Phenolic Compounds / N.V. Nesterova, at all. //

Moscow HYPERLINK "https://link. springer. com/iournal/11967" - HYPERLINK

"https://link. springer.com/journal/11967"University - HYPERLINK

"https.//link. springer.соm/journal/11967" - HYPERLINK

"https://link.springer.com/journal/11967 "Chemistry - HYPERLINK

"https://link. springer.com/journal/11967" - HYPERLINK

"https://link.springer.com/journal/11967"Bulletin. - 2021. - vol. 76. - P. 71-74].

Недостатки: использование в анализе токсичного метанола, сложная подготовка пробы и длительность анализа.

Задачей изобретения является количественное определение флоридзина методом капиллярного электрофореза, отсутствие токсичных реактивов, обеспечение экспрессных и достоверных результатов при низких затратах на выполнение анализа.

Техническим результатом при использовании предлагаемого изобретения является экспрессность и достоверность количественного определения флоридзина методом капиллярного электрофореза с применением нетоксичных и доступных реактивов для проведения анализа при отсутствии операций по дополнительной очистке экстрактов или яблочного сока перед выполнением анализа.

Способ количественного определения флоридзина в плодах и листьях яблони, предусматривающий кратное разбавление пробы яблочного сока до содержания флоридзина не более 200 мг/дм³, или пробы из листьев, которые предварительно растирают в ступке с 10%-ным водно-спиртовым раствором в соотношении 1:10, центрифугирование, проведение анализа, при этом используют систему капиллярного электрофореза с кварцевым капилляром, имеющий эффективную длину 0,5 м, внутренний диаметр 75 мкм и водный ведущий электролит, содержащий 3 г/дм³ имидазола, 3 г/дм³ тетрабората натрия десятиводного, 0,2 г/дм³ сульфата натрия при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм.

Новизна заявленного изобретения обусловлена тем, что свойства нового состава ведущего электролита обеспечивают эффективное разделение компонентов пробы за 5 мин, включая флоридзин, и позволяют исключить из процесса анализа многостадийную пробоподготовку, которой присущи ошибки и потери целевых веществ.

Преимущества заявляемого способа также заключаются в использовании нетоксичных и доступных реактивов, систем капиллярного электрофореза, обеспечение объективности и достоверности анализа реальных проб, стабильности во времени раствора ведущего электролита.

Использование предлагаемой совокупности существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, позволяет достичь желаемого технического результата - объективного и экспрессного определения массового содержания флоридзина как в градуировочных растворах, так и в пробах плодов и листьев яблони.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на рисунке 1 - представлена электрофореграмма определения флоридзина в яблочном соке из сорта Айдаред (анализ реального образца); на рисунке 2 - электрофореграмма градуировочного раствора флоридзина, концентрация 10 мг/дм³ (анализ калибровочного раствора флоридзина).

На электрофореграммах: ось ординат - интенсивность сигнала в условных единицах, коррелирующих с милливольтами; ось абсцисс - время с момента начала анализа в минутах. Оба рисунка - это результат компьютерной программы, которой оснащен прибор. Сами пики пронумерованы согласно порядку их появления с момента начала анализа.

Поскольку состав электролита является важным, т.к. он обеспечивает процесс разделения компонентов и собственно анализа, поэтому на электрофореграммах представлены цифровые значения от 1 до 10 без обозначения единиц измерения (мг/дм³) концентрации раствора флоридзина, расположенные над осью абсцисс (за определенный промежуток времени). Эти концентрации необходимы для калибровки прибора с целью учета его степени работоспособности.

Способ количественного определения флоридзина в плодах и листьях яблони осуществляют следующим образом.

Предварительно готовят пробу, в качестве которой используют сок яблони или пробу из листьев. Пробу в виде сока кратно разбавляют до содержания флоридзина не более 200 мг/дм³, центрифугируют, проводят анализ на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, для анализа используют водный ведущий электролит, который содержит 3 г/дм³ имидазола, 3 г/дм³ тетрабората натрия десятиводного, 0,2 г/дм³ сульфата натрия при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм.

Оптимальное количество имидозола 3 г/дм³ обусловлено тем, что если взять большее количество, то нарушается разделение компонентов пробы и количественный анализ становится невозможным, а если использовать меньшее количество, то падает чувствительность детектирования, и при этом становится невозможным определение концентраций флоридзина менее 5 мг/дм³.

Что касается тетрабората натрия десятиводного (3 г/дм³), то при большем количестве существенно удлиняется продолжительность анализа, а при меньшем количестве не обеспечивается разделение компонентов пробы и достоверное определение массовой концентрации флоридзина.

Сульфат натрия в концентрации 0,2 г/дм³ использован для коррекции проводимости электролита, чтобы обеспечить экспрессность анализа - сократить его время: повышение концентрации нарушает разделение компонентов пробы, а уменьшение снижает чувствительность определения.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Пробу яблочного сока из сорта Айдаред в количестве 5 мл разбавляли дистиллированной водой в 5 раз, фильтровали, центрифугировали и переносили для анализа в систему капиллярного электрофореза. Анализ осуществляли в следующих условиях. Система капиллярного электрофореза с источником питания положительной полярности, например, серии «Капель», оборудованная фотометрическим детектором с установленной длиной волны 254 нм, кварцевым капилляром внутренним диаметром 75 мкм, эффективной длиной 0,5 м; положительное напряжение на капилляре 16 кВ; рекомендуется термостатирование капилляра при +24°С; ввод пробы - пневматический - 30 мБар в течение 5 секунд; время анализа - 5 мин. Для проведения анализа используют водный раствор ведущего электролита следующего состава: 3 г/дм³ имидазола, 3 г/дм³ тетрабората натрия десяти водного, 0,2 г/дм³ сульфата натрия. Срок хранения ведущего электролита не более десяти суток. Дозируют в прибор анализируемую пробу не менее двух раз и регистрируют электрофореграммы. Условия регистрации электрофореграмм проб должны соответствовать условиям регистрации электрофореграмм градуировочных растворов флоридзина.

Пример 2. Аналогично примеру 1, кроме того, что для анализа применяют пробу яблочного сока из сорта Фуджи.

Пример 3. Аналогично примеру 1, кроме того, что для анализа применяют пробу яблочного сока из сорта Корей.

Пример 4. Аналогично примеру 1, кроме того, что для анализа применяют пробу листьев яблони сорта Айдаред, предварительно листья растирают в ступке с 10%-ным водно-спиртовым раствором в соотношении 1:10. Пример электрофореграммы образца сока и градуировочного раствора флоридзина показан на рисунке 1 и 2. Результаты анализа приведены в таблице.

Выполненный анализ показал надежность получаемых результатов. Проверка полученных данных методом добавлено-найдено показала их воспроизводимость.

Время анализа составило 5 минут, стабильность показаний прибора на одной порции электролита сохранялась в течение 12 измерений, далее требовалась замена электролита новой порцией.

Предлагаемый способ практически лишен недостатков прототипа - для проведения экспрессного и корректного анализа требуется разбавление пробы в несколько раз дистиллированной водой, не сказывается влияние наличия других фенольных соединений, сахаров, пептидов, пектина и органических кислот, водный раствор ведущего электролита стабилен во времени и не загрязняет внутреннюю поверхность капилляра.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к плодоводству. Способ предусматривает кратное разбавление пробы яблочного сока до содержания флоридзина не более 200 мг/дм³, или пробу из листьев, которую предварительно растирают в ступке с 10%-ным водно-спиртовым раствором в соотношении 1:10, центрифугирование и проведение анализа. При этом используют систему капиллярного электрофореза с кварцевым капилляром, имеющим эффективную длину 0,5 м, внутренний диаметр 75 мкм и водный ведущий электролит, содержащий 3 г/дм³ имидазола, 3 г/дм³ тетрабората натрия десятиводного, 0,2 г/дм³ сульфата натрия, при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования – 254 нм. Способ обеспечивает экспрессность и достоверность количественного определения флоридзина методом капиллярного электрофореза с применением нетоксичных и доступных реактивов для проведения анализа при отсутствии операций по дополнительной очистке экстрактов или яблочного сока перед выполнением анализа. 2 ил., 1 табл., 4 пр.

Способ количественного определения флоридзина в плодах и листьях яблони методом капиллярного электрофореза, предусматривающий кратное разбавление пробы яблочного сока до содержания флоридзина не более 200 мг/дм³, или пробу из листьев, которую предварительно растирают в ступке с 10%-ным водно-спиртовым раствором в соотношении 1:10, центрифугирование, проведение анализа, отличающийся тем, что используют систему капиллярного электрофореза с кварцевым капилляром, имеющим эффективную длину 0,5 м, внутренний диаметр 75 мкм и водный ведущий электролит, содержащий 3 г/дм³ имидазола, 3 г/дм³ тетрабората натрия десятиводного, 0,2 г/дм³ сульфата натрия, при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования – 254 нм.