СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛОРИЗИНА Российский патент 1998 года по МПК A01G7/00 A01H1/04 

Изобретение касается замещенных глюкозидов, в частности способа количественного определения флоризина в тканях растений.

Флоризин (флоридзин, флоретин-2-глюкозид) в различной мере содержится в листьях, цветочных пестиках, семенах, корнях, побегах и коре яблони.

Способ пригоден для массовых анализов в биохимических, физиологических исследованиях и селекции яблони, в плодоводстве при сопоставлении содержания флоризина с сортовыми особенностями яблони по морозоустойчивости.

Известен способ количественного определения флоризина (Hutchinson A. Taper C. D. and Towers G.H.N., Studies of phloridzin in Malus Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, V. 37. 1958), включающий экстракцию флоризина из нативных побегов и листьев яблони 80%-ным этанолом в аппарате Сокслета в течение 12 ч, высушивание экстракта в потоке воздуха при комнатной температуре, растворение остатка в горячей воде, фильтрование этого водного раствора, экстракцию из него флоризина этилацетатом и измерение оптической плотности этого экстракта при 283 нм, по величине которой находят концентрацию и содержание флоризина в исследуемых объектах.

Недостатком этого способа является сложность, трудоемкость и большая длительность исполнения процессов количественного выделения флоризина из объектов исследований.

Известен следующий способ количественного определения флоризина (Острейко С.А., Булатова Т.Г., Дрожжачих В.Г. Методика количественного определения флоризина, флоретина, хлорогеновой кислоты и герниарина. - Сб. Применение физиологически активных веществ в садоводстве. Материалы симпозиума. - М. , 1972), включающий экстракцию флоризина этанолом из навесок органов яблони (кора, листья, почки), хроматографирование экстракта на бумаге, элюирование флоризина из хроматограммы, фотометрирование элюатов и расчет содержания флоризина по данным фотометрирования.

Недостатком этого известного способа является применение бумажной хроматографии, требующей выполнения множества действий, длительного подбора условий (сорт бумаги, состав растворителя, состав проявителей, состав элюата, температура), при малейшем изменении которых неизбежны отклонения в результатах.

Наиболее близким по технической сущности изобретению является способ (Сарапуу Л. Определение флоризина в тканях яблони. Ж. "Физиология растений". Т. 17, вып. 3, 1970), включающий 7 - 8-кратную экстракцию флоризина из измельченных образцов свежих органов яблони (листья, почки, побеги) массой 5 г 80%-ным этанолом в течение суток, хроматографирование соединенных экстрактов на бумаге в течение 30 ч в смеси растворителей: изопропанол-аммиак-вода (85: 1: 15), определение пятна флоризина в ультрафиолете, вырезание этого пятна, элюирование из него флоризина 48%-ным этанолом, определение оптической плотности элюата при λ - 283 нм и вычисление содержания флоризина по формуле, основывающейся на законе Бера - Ламберта

где
C - содержание флоризина;
D₂₈₃ - оптическая плотность измеряемого раствора при λ = 283 нм;
d - разведение пробы,
1 - толщина кюветы.

Основным недостатком указанного способа является его длительность (около 3 сут), трудоемкость и сложность из-за применения бумажной хроматографии.

Изобретение относится к усовершенствованному способу количественного определения флоризина (флоретин-2-глюкозида) в тканях плодовых растений.

Целью изобретения является упрощение технологии количественного определения флоризина за счет исключения операций многократного, длительного экстрагирования, а также за счет исключения хроматографии экстрактов на бумаге.

Поставленная цель достигается тем, что в способе количественного определения флоризина экстракцию флоризина ведут 75 - 85%-ным, предпочтительно 80%-ным, по объему водным этанолом из растительной ткани, тонко измельченной, с основным ацетатом свинца (свинцовым сахаром (CH₃COO)₂ Pb • Pb (OH)₂).

В экстракт добавляют серную кислоту до полного осаждения свинца (II). После отделения осадка получают целевой раствор, по оптической плотности которого расчитывают содержание флоризина в навеске растительной ткани.

Способ исключает длительные и трудоемкие процессы, прост в осуществлении, обеспечивает воспроизводимость и соответствие результатов измерения содержанию пробы с ошибкой в 1 - 2%, при затратах времени на анализ в пределах 2 ч.

Известен способ выделения флоризина из коры и побегов яблони (Палфитов В. Ф., патент N 1309539), в котором выделение флоризина проводят экстракцией из сухой коры яблони 75 - 98%-ным по объему водным этанолом, затем в экстракт вносят ацетат свинца (II) с последующим добавлением аммония, для полного осаждения из раствора ионов свинца (II), отгоняют этанол, а образовавшийся концентрат флоризина переосаждают из водно-ацетонового раствора бензолом.

Указанным способом решается проблема препаративного выделения флоризина из коры яблони.

Задачей предлагаемого способа является количественное извлечение флоризина из растительных тканей с последующим получением целевого раствора, по концентрации которого устанавливают содержание флоризина в этих тканях. Положительный результат достигается другими воздействиями на исходную растительную ткань и применением реактивов, отличающихся от приведенных в описании патента N 1309539.

Пример 1. 2,52 мг коры корня яблони, высушенной в вакууме при остаточном давлении 0,5 - 1,0 мм рт. ст. и 18 - 20^oC до постоянной массы смешивают с 8 мг основного ацетата свинца (II), добавляют к ним 2,0 мл 80%-ного по объему водного этанола и в течение 6 мин в фарфоровой ступке смесь тонко растирают. Затем смесь переносят на стеклянный фильтр и отфильтровывают экстракт. Остаток смеси на фильтре 4 раза промывают по 2 мл 80%-ным по объему водным этанолом (4 х 2 мл), который также отфильтровывают.

Четырехкратным промыванием остатка на фильтре достигается количественное извлечение флоризина из навески коры.

Все фильтраты объединяют в мерную колбу на 25 мл. Далее непосредственно в колбу приливают 0,1 н. серную кислоту для осаждения ионов свинца (II). Этой же кислотой доводят общий объем раствора до 25 мл. Осажденные вещества отделяют от раствора на центрифуге. На спектрофотометре СФ-26 при λ = 287 нм и толщине слоя кюветы в 1 см измеряют оптическую плотность целевого раствора - центрифугата.

Результат измерения D = 0,75 используют для расчета. По формуле, основанной на законе Бугера-Ламберта-Бера, рассчитывают массу флоризина, содержащегося в исходной навеске коры

Отсюда, процент содержания флоризина в исходном образце коры равен

где
m - масса флоризина, мг;
D - оптическая плотность, 0,75;
M - молярная масса, 472,4 г/моль;
V - объем мерной колбы, 25 см³;
E - коэффициент молярного поглощения (максимальная экстинция) 18400 ± 200 см² моль^-1;
1 - толщина кюветы, 1 см;
X% - процентное содержание флоризина;
a - масса навески, 2,52 мг.

Примечание: численное значение E = 18400 ± 200 для чистого флоризина фирмы Carlo ERBA в водно-этанольном растворе установлено нами экспериментально, так как его значение в справочной литературе мы не нашли.

Аналогичный анализ проведен еще для 8 навесок одного и того же образца корня яблони.

Результаты проведенных измерений представлены в табл. 1.

Среднее арифметическое содержание флоризина в образце коры имеет значение

Среднее квадратичное (стандартное) отклонение от среднего арифметического содержания численно равно

Отклонение X_i - X (0,34; 0,31; 0,18; 0,16; 0,9; 0,08; 0,15; 0,31; 0,50) для любой из взятых навесок не входит за пределы значения 3; то есть X_i - X < 3S. Это означает, что воспроизводимость определения флоризина по предлагаемому способу достаточно высока.

Качественно флоризин в растворе идентифицируют по спектру поглощения ультрафиолетового излучения. Из данных табл. 2 следует, что спектр поглощения ультрафиолета водно-этанольным раствором-центрифугатом, полученным от 2,52 мг коры корня яблони и показавшим концентрацию флоризина 0,019 мг/мл, и спектр поглощения ультрафиолета водно-этанольным раствором чистого флоризина фирмы Garlo ERBA с концентрацией 0,019 мг/мл практически идентичны.

Аналогично УФ спектры экстрактов из остальных 8 навесок коры корня яблони совпадают со спектрами растворов чистого флоризина.

Из этого следует, что в примере 1 количественно идентифицирован флоризин.

Пример 2. Готовят эталонный (стандартный) образец путем добавки чистого флоризина к навеске коры корня яблони с известным содержанием флоризина.

К 2,10 мг сухой коры корня яблони, содержащей 19,28% флоризина (пример 1), добавляют в виде этанольного раствора 0,18 мг чистого флоризина фирмы Garlo ERBA. Суммарная расчетная масса флоризина в эталонном образце равна

Процентное содержание флоризина в эталонном образце составляет

Эталонный образец смешивают с 9 мг основного ацетата свинца и тонко растирают в течение 6 мин в фарфоровой ступке. Далее, как в примере 1, получают осветленный экстрат-центрифугат, оптическая плотность которого при λ = 287 нм и толщине кюветы в 1 см равна D = 0,86.

По оптической плотности определяют массу флоризина в эталонном образце

Процентное содержание флоризина в эталонном образце по результатам анализа равно

Случайная ошибка измерения, то есть различие между суммарным процентом содержания флоризина в эталонном образце и найденным в нем предлагаемым способом процентом содержания флоризина, составляет
X_Σ% - X_ан% = 25,43 - 24,70 = 0,73%.

Аналогично были изготовлены еще пять эталонных образцов и проведен их анализ предлагаемым способом. Результаты измерений представлены в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что процентное содержание флоризина в эталонных образцах предлагаемым способом определяется достаточно точно. Случайная ошибка не превышает 2%.

Пример 3. Влияние концентрации этанола на величину извлечения флоризина из растительной ткани. Навески коры корня яблони однородного происхождения повторно обрабатывают: а) 96%, б) 85%, в) 80%, г) 75% и д) 70%-ным по объему водным этанолом аналогично примеру 1. Полученные результаты приведены в табл. 4.

Из данных табл. 4 следует, что при обработке растительного материала 80%-ным по объему водным этанолом достигают максимального извлечения флоризина.

Предлагаемым способом флоризин количественно извлекают из листьев, коры побегов, древесины, семян и пестиков цветков яблони. В описании способа приведены результаты количественного определения флоризина лишь в коре корней яблони.

Мы сочли это достаточно показательным, так как содержание флоризина в этом органе яблони наибольшее.

Способ предназначен для количественного определения замещенных глюкозидов и может быть использован для количественного определения флоризина. Флоризин экстрагируют из навески растительной ткани, предварительно смешанной с основным ацетатом свинца (II). Экстракцию проводят 80%-ным по объему водным этанолом. Экстрат отделяют, добавляют в него 0,1 н. серную кислоту до полного осаждения ионов свинца и по оптической плотности целевого раствора определяют содержание флоризина более простым и менее длительным и трудоемким способом. 5 табл.

Способ количественного определения флоризина в тканях растений путем экстракции его водным этанолом с последующим спектрофотометрированием, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии анализа, сокращения затрат времени и уменьшения расхода реагентов, навески растительной ткани смешивают с основным ацетатом свинца (II), добавляют 75 - 85%-ный, предпочтительно 80%-ный, по объему водный этанол, тонко измельчают и проводят экстракцию тем же раствором этанола, в отделенный экстракт вводят серную кислоту, удаляют осадок, получают целевой раствор и по его оптической плотности определяют содержание флоризина.