СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ, САХАРОЗЫ, ФРУКТОЗЫ Российский патент 2013 года по МПК G01N27/26 G01N33/02 

Изобретение относится к аналитической химии сахаров, в частности к способам определения глюкозы, сахарозы, фруктозы в сельскохозяйственном сырье и продукции переработки.

Современные способы количественного определения глюкозы, сахарозы, фруктозы основаны на ферментативных или хроматографических методах анализа.

Известен способ определения и эффективного разделения сахаров методом капиллярного электрофореза с использованием ведущего электролита с высоким значением рН, предусматривающий получение производных сахаров с помощью реагентов, молекулы которых содержат хромофорные ионогенные группы. [Y. Lee, T. - I. Lin. J. Chromatogr. В., 681, 87 (1996)]. Недостатки: высокое значение pH негативно сказывается на работоспособности кварцевого капилляра, и приводит к его быстрому выходу из строя; для определения сахаров необходимы дорогие специфические реагенты, содержащие хромофорные ионогенные группы, кроме того получение производных сахаров неизбежно приводит к ухудшению точности измерений.

Известен способ определения и эффективного разделения сахаров методом капиллярного электрофореза за счет изменения электрофоретической подвижности молекул сахаров путем получения комплексов с борат-ионом или ионами металлов [A. Bazanella, K. Bachmann. J. Chromatogr. A., 799, 283 (1998)]. Недостатки: необходимость получения производных сахаров в виде комплексов с борат-ионом или ионами металлов, что неизбежно приводит к ухудшению точности измерений.

Наиболее близким к заявляемому способу является определение глюкозы, фруктозы, сахарозы методом лигандообменного капиллярного электрофореза после перевода их в форму соответствующих комплексов с катионами двухвалентной меди. Использованы следующие условия разделения на системе капиллярного электрофореза: ведущий электролит - 175 мМ·(дм³)^-1 аммиака, 1 мМ·(дм³)^-1 двухвалентной меди; напряжение +25 кВ, длина волны детектирования - 245 нм, эффективная длина капилляра 0,5 м, внутренний диаметр 75 мкм [Алексеева, А.В. Определение сахаров методом лигандообменного капиллярного электрофореза / А.В. Алексеева, Л.А. Карцева, Н.В. Казачищева // Ж. Аналитической химии. - 2010. - Т.65. - №2. - С.205-211].

Недостатки: применение аммиака в составе ведущего электролита может служить причиной нестабильности условий анализа, так как содержание газообразного компонента (аммиака) в растворе слишком подвержено влиянию температуры окружающей среды, а высокое значение pH негативно сказывается на работоспособности кварцевого капилляра, и приводит к его быстрому выходу из строя. Использование солей меди нежелательно, так как в процессе электролиза для поверхности электродов будет выделяться медь. Специфичная длина волны детектора ограничивает применение более доступных систем капиллярного электрофореза, а необходимость получения производных сахаров с ионам меди неизбежно будет искажать результаты измерений в реальных пробах и не обеспечивать стабильность количественных результатов.

Задачей изобретения является эффективное разделение и определение глюкозы, сахарозы, фруктозы методом капиллярного электрофореза, обеспечение экспрессных и достоверных количественных результатов при минимальных затратах на выполнение анализа.

Техническим результатом при использовании предлагаемого изобретения является экспрессность и достоверность количественного определения глюкозы, сахарозы, фруктозы методом капиллярного электрофореза с применением нетоксичных и доступных реактивов для проведения анализа.

Технический результат достигают за счет того, что способ предусматривает кратное разбавление пробы до суммарного содержания сахаров не более 10 г/дм³, центрифугирование, и выполнение анализа на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, отличающийся тем, что в анализе используют ведущий электролит содержащий 4 г/дм³ сорбата калия, 8 г/дм³ 10%-ного водного раствора цетил-триметил-аммоний-основания (ЦТА-ОН), 36 г/дм³ глицерина, 0,16 г/дм³ гидроокиси калия при отрицательной полярности напряжения и длине волны детектирования 254 нм.

Способ отличается тем, что, с целью повышения достоверности анализа используют раствор ведущего электролита, состоящий из сорбата калия, цетил-триметиламмоний-основания, глицерина и гидроокиси калия при отрицательной полярности напряжения.

Поставленная задача решается за счет того, что свойства ведущего электролита позволяют исключить из процесса анализа многостадийную пробоподготовку и необходимость лигандообразования молекул сахаров с ионами двухвалентной меди и исключение из анализа ведущего электролита, содержащего аммиак и ионы меди.

Преимущества заявляемого способа заключаются в использовании нетоксичных и доступных реактивов и систем капиллярного электрофореза, обеспечении объективности и достоверности анализа реальных проб, стабильности во времени раствора ведущего электролита, отсутствии гальванических процессов на поверхности рабочих электродов системы капиллярного электрофореза.

Использование предлагаемой совокупности существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, позволяет достичь желаемого технического результата - объективного и экспрессного определения массового содержания глюкозы; сахарозы и фруктозы как в градуировочных растворах, так и в реальных пробах. Примеры конкретного выполнения.

Пример 1

Пробу яблок измельчали в ступке или лабораторной мельнице до гомогенного состояния, с помощью лабораторного пресса получали 5-10 см³ яблочного сока, содержащий в основном фруктозу. Сок фильтровали и центрифугировали. Разбавляли пробу сока в 20 раз дистиллированной водой и подвергли анализу в следующих условиях. Система капиллярного электрофореза с источником питания отрицательной полярности, например, серии «Капель», оборудованная фотометрическим детектором с установленной длиной волны 254 нм, кварцевым капилляром внутренним диаметром 75 мкм, эффективной длиной 0,5 м; напряжение на капилляре «минус 16 кВ»; рекомендуемая температура термостатирования капилляра «+22°C»; ввод пробы - пневматический - 30 мбар в течение 5 секунд; время анализа - 20 мин. Используют раствор ведущего электролита следующего состава: 4 г/дм³ сорбата калия, 8 г/дм³ 10%-ного водного раствора цетил-триметил-аммоний-основания (ЦТА-ОН), 36 г/дм³ глицерина, 0,16 г/дм³ гидроокиси калия. Срок хранения ведущего электролита не более суток. Ведущий электролит готовят в количестве, обеспечивающем потребности рабочего дня. Ориентировочное время миграции (выхода) глюкозы - 15 мин, сахарозы - 17 мин, фруктозы - 14 мин.

Контролем служило определение глюкозы, сахарозы, фруктозы, согласно способу-прототипу.

Пример 2

Аналогично примеру 1, кроме того, что прессованием получали из арбузов сок, содержащий глюкозу, сахарозу и фруктозу. Применяли разбавление 20 раз.

Пример 3.

Аналогично примеру 1, кроме того, что анализу подвергали натуральный пчелиный мед, содержащий около 70% сахаров (фруктоза и глюкоза), и применяли разбавление 100 раз.

Пример 4

Аналогично примеру 1, кроме того, что анализу подвергали полусухое красное вино.

Пример 5

Навеску виноградных листьев в количестве 1,00 грамма растирали в ступке при добавлении 9 см³ дистиллированной воды до гомогенного состояния. Затем массу настаивали в течение 1 часа, фильтровали, центрифугировали и подвергали анализу в условиях, аналогичных примеру 1.

Пример 6

Аналогично примеру 1, кроме того, что анализ проводили согласно способу-прототипа.

Полученные результаты, характеризующие способ определения глюкозы, сахарозы, фруктозы отражены в таблице.

Таблица Определение глюкозы, сахарозы, фруктозы в исследуемых объектах, г/дм³ № примера Предлагаемый способ Согласно прототипу   Глюкоза Сахароза Фруктоза Глюкоза Сахароза Фруктоза 1 12,6 17,5 81 12 14,0 77 2 23,8 13,0 38,4 22 14 33,5 3 370 0 340 430 0 460 4 15,5 0 15,9 11 2 10,4 5 4,6 5,1 4,4 2 2,2 1,4 6 4,3 1,8 6,7 1,7 2,4 3,1

Анализ полученных результатов показал, что:

В случае анализа яблочного или арбузного сока занижение результатов определение сахаров согласно способу прототипа не превышает 10-15% в сравнении с результатами предлагаемого способа. В случае анализа объектов с более сложным составом - красное полусухое вино, вытяжка виноградного листа или лозы результаты согласно прототипу занижены на 50% и более. Ведущий электролит прототипа не способен устранить помехи в анализе сложных биологических объектов, так же как и в случае анализа продукции с высоким содержанием сахара - пчелиного меда. Искажение результатов определения глюкозы и фруктозы в меде согласно способу-прототипу связано с высокой кратностью разбавления пробы для проведения анализа составляющей тысячу раз, что негативно сказывается на качестве анализа.

Предлагаемый способ практически лишен данных недостатков - для корректного анализа требуется небольшая кратность разбавления сахаросодержащих проб, не сказывается влияние мешающих веществ биологической пробы - фенольных соединений, аминокислот, анионов, органических кислот, раствор ведущего электролита не содержит газообразной составляющей и катионов, способных участвовать в гальванических процессах.

При реализации способа получены количественные результаты анализа сахаров, превосходящие по своему качеству прототип.

Изобретение относится к аналитической химии сахаров, в частности к способам определения глюкозы, сахарозы, фруктозы в сельскохозяйственном сырье и продукции переработки, и направлено на ускорение, совершенствование и повышение объективности количественного анализа сахаров. Указанный результат достигают тем, что способ предусматривает кратное разбавление пробы до суммарного содержания сахаров не более 10 г/дм³, центрифугирование, и выполнение анализа на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, при этом согласно изобретению для проведения анализа используют ведущий электролит, содержащий 4 г/дм³ сорбата калия, 8 г/дм³ 10%-ного водного раствора цетил-триметил-аммоний-основания (ЦТА-ОН), 36 г/дм³ глицерина, 0,16 г/дм³ гидроокиси калия, при отрицательной полярности напряжения и длине волны детектирования 254 нм. 1 табл., 6 пр.

Способ определения глюкозы, сахарозы, фруктозы, характеризующийся тем, что предусматривает кратное разбавление пробы до суммарного содержания сахаров не более 10 г/дм³, центрифугирование и выполнение анализа на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, отличающийся тем, что для анализа используют ведущий электролит, содержащий 4 г/дм³ сорбата калия, 8 г/дм³ 10%-ного водного раствора цетил-триметил-аммоний-основания (ЦТА-ОН), 36 г/дм³ глицерина, 0,16 г/дм³ гидроокиси калия при отрицательной полярности напряжения и длине волны детектирования 254 нм.