ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ ХРЯЩА Российский патент 2024 года по МПК C07K14/47 A61K38/17 A61P19/00 A61P19/02 

Область техники

[0001]

Настоящая заявка относится к фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения заболевания хряща, содержащей фрагмент пептида белка 1 высокомобильной группы (HMGB1). По настоящей заявке испрашивается приоритет японской патентной заявки № 2018-200866, поданной 25 октября 2018 года, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Предшествующий уровень техники

[0002]

Хрящевая ткань, такая как суставной хрящ, меньше поддается восстановлению, и для нее почти невозможно естественным образом регенерировать после повреждения. Например, методы лечения травматического дефекта суставного хряща представляют собой, в основном, симптоматическую терапию, такую как пероральное введение анальгетиков и внутрисуставное введение гиалуроновой кислоты, а лечебная терапия травматического дефекта суставного хряща еще не разработана. Кроме того, существуют способы хирургического лечения, такие как аутологичная трансплантация костно-хрящевого столба при травматическом дефекте суставного хряща, но у них есть проблемы, такие как невозможность справиться с большими дефектами из-за необходимости сбора нормальной ткани пациента. Таким образом, желательно разработать более эффективное и менее инвазивное терапевтическое средство для лечения заболевания хряща.

Список цитирования

Патентная литература

[0003]

Патентная литература 1: WO2012/147470

Патентная литература 2: WO2014/065347

Патентная литература 3: WO2014/065348

Патентная литература 4: WO2018/139562

Патентная литература 5: WO2018/186480

Сущность изобретения

Техническая задача

[0004]

Целью настоящей заявки является создание нового лекарственного средства, эффективного при заболевании хряща.

Решение задачи

[0005]

Авторы настоящего изобретения провели поиск вещества, эффективного для лечения заболевания хряща, и таким образом обнаружили, что фрагмент пептида HMGB1, имеющий определенную аминокислотную последовательность, имеет эффект регенерации нормальной хрящевой ткани, включая гиалиновый хрящ, у модели на животных с дефектом суставного хряща. На основании этого открытия настоящая заявка относится к фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения заболевания хряща, содержащей конкретный фрагмент пептида HMGB1.

[0006]

То есть, настоящая заявка относится к следующему:

[1] Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения заболевания хряща, содержащая любое одно вещество из пунктов (a)-(c) (также в настоящем документе, обозначаемое как вещество A):

(а) фрагмент пептида HMGB1, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1;

(b) пептид, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1, с одной или несколькими замененными, удаленными, вставленными или добавленными аминокислотами; и

(c) пептид, содержащий аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности приблизительно 80% или больше с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1.

[2] Фармацевтическая композиция согласно [1], где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

[3] Фармацевтическая композиция для регенерации гиалинового хряща у пациента с заболеванием хряща, содержащая вещество А.

[4] Фармацевтическая композиция согласно [3], где заболеванием хряща является травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

[A1] Способ профилактики и/или лечения хряща, включающий введение индивидууму эффективного количества вещества A.

[A2] Способ согласно [A1], где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

[A3] Способ регенерации гиалинового хряща у пациента с заболеванием хряща, включающий введение индивидууму эффективного количества вещества A.

[A4] Способ согласно [A3], где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

[B1] Вещество A для профилактики и/или лечения заболевания хряща.

[B2] Вещество A согласно [B1], где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

[B3] Вещество А для применения в регенерирующем гиалиновом хряще у пациента с заболеванием хряща.

[B4] Вещество A согласно [B3], где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

[C1] Использование вещества А в производстве лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания хряща.

[C2] Применение согласно [C1], где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

[C3] Применение вещества А в производстве лекарственного средства для регенерации гиалинового хряща у пациента с заболеванием хряща.

[C4] Применение согласно [C3], где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

Краткое описание чертежей

[0007]

[Фигура 1] фигура 1 представляет собой фотографии, показывающие результаты микроскопических наблюдений в участках дефекта хряща коленных суставов и вокруг них через 2, 4, 8 и 12 недель после операции («Носитель» указывает на контрольную группу, а «1-44» указывает на группу с введением пептида HMGB1 (1-44), соответственно).

[Фигура 2] фигура 2 представляет собой график, показывающий оценки макроскопической картины по системе оценки Wayne для участков дефекта хряща коленных суставов через 2, 4, 8 и 12 недель после операции («Носитель» показывает контрольную группу и «1- 44» показывает группу с введением пептида HMGB1 (1-44), соответственно). Вертикальная ось показывает количество баллов, а горизонтальная ось показывает количество недель после образования дефекта хряща. *p<0,05 (двухсторонний непарный t-критерий), †p<0,05 (двухсторонний дисперсионный анализ с апостериорным критерием Тьюки).

[Фигура 3] фигура 3 представляет собой фотографии, показывающие результаты окрашивания сафранином O тканевых срезов хряща коленных суставов через 2, 4, 8 и 12 недель после операции («Носитель» указывает на контрольную группу, а «1-44» указывает на группу с введением пептида HMGB1 (1-44), соответственно).

[Фигура 4] фигура 4 представляет собой график, показывающий оценку по Wakitani для хрящевых тканей коленных суставов через 2, 4, 8 и 12 недель после операции («Носитель» указывает на контрольную группу, а «1-44» указывает на группу с введением пептида HMGB1 (1-44), соответственно). Вертикальная ось показывает количество баллов, а горизонтальная ось показывает количество недель после образования дефекта хряща. *p<0,05 (двухсторонний непарный t-критерий), †p<0,05 (двухсторонний дисперсионный анализ с апостериорным критерием Тьюки).

[Фигура 5] фигура 5 представляет собой фотографии, показывающие результаты индивидуального окрашивания сафранином O тканевых срезов хряща коленных суставов через 12 недель после операции («Носитель» указывает на контрольную группу, а «1-44» указывает на группу с введением пептида HMGB1 (1-44), соответственно).

[Фигура 6] фигура 6 представляет собой график, показывающий оценки по Wakitani хрящевых тканей коленных суставов через 12 недель после операции («Носитель» указывает на контрольную группу, а «1-44» указывает на группу с введением пептида HMGB1 (1-44), соответственно). Вертикальная ось показывает оценку, а горизонтальная ось показывает элементы, составляющие оценку по Wakitani. *p<0,05 (lвусторонний непарный t-критерий)

[Фигура 7] фигура 7 представляет собой фотографии, показывающие результаты окрашивания тканевых срезов хряща коленных суставов через 12 недель после операции у модели дефекта хряща мыши. Слева показан результат окрашивания сафранином О, справа показан результат иммуноокрашивания коллагена II типа.

[Фигура 8] фигура 8 представляет собой фотографии, показывающие результаты окрашивания тканевых срезов хряща коленных суставов здоровой мыши. Слева показан результат окрашивания сафранином О, а справа - результат иммуноокрашивания коллагена II типа.

Описание вариантов осуществления

[0008]

Настоящая заявка относится к фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения заболевания хряща, содержащей фрагмент пептида HMGB1, включающий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1.

[0009]

Заболевание хряща относится к нарушению, включающему патологию хрящевой ткани. Примеры патологий хрящевой ткани включают повреждения, износ, дефекты и дегенерацию хрящевой ткани.

[0010]

Примеры заболевания хряща в настоящей заявке в качестве неограничивающих примеров включают, травматический дефект хряща, остеоартрит, рассекающий остеохондрит, повреждение мениска, травматический артрит, воспалительный артрит (например, ревматоидный артрит) и инфекционный артрит (например, гнойный артрит). Остеоартрит включает первичный остеоартрит, причина которого неясна, и вторичный остеоартрит, причина которого ясна. Примеры вторичного остеоартрит в качестве неограничивающих примеров включают остеоартрит, вызванный повреждением связок, повреждением хряща, повреждением мениска и т.п.

[0011]

В одном из предпочтительных аспектов заболевание хряща, леченное фрагментом пептида HMGB1 по настоящей заявке, представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит. В другом предпочтительном аспекте, заболевание хряща, леченное фрагментом пептида HMGB1 по настоящей заявке, представляет собой травматический дефект хряща или остеоартрит. В дополнительном аспекте, заболевание хряща, леченное фрагментом пептида HMGB1 по настоящей заявке, представляет собой травматический дефект хряща. В другом аспекте заболевание хряща, обработанное фрагментом пептида HMGB1 по настоящей заявке, представляет собой остеоартрит.

[0012]

Примеры типа (участка) хряща, леченного фрагментом пептида HMGB1 по настоящей заявке, в качестве неограничивающих примеров включают хрящ сустава. Примеры сустава в качестве неограничивающих примеров включают сустав конечности (плечевой сустав, локтевой сустав, сустав кисти, тазобедренный сустав, коленный сустав, голеностопный сустав), сустав челюсти и межпозвоночный сустав.

[0013]

В одном из аспектов заболевание хряща, леченное фрагментом пептида HMGB1 по настоящей заявке, представляет собой заболевание хряща сустава конечности. В другом аспекте заболевание хряща, леченное фрагментом пептида HMGB1 по настоящей заявке, представляет собой заболевание хряща локтевого или коленного сустава. В дополнительном аспекте, заболевание хряща, леченное фрагментом пептида HMGB1 по настоящей заявке, представляет собой заболевание хряща коленного сустава.

[0014]

Дополнительные примеры заболевания хряща, леченного фрагментом пептида HMGB1 по настоящей заявке, могут включать травматический дефект хряща сустава, травматический дефект хряща локтевого сустава, травматический дефект хряща коленного сустава, локтевой остеоартрит, коленный остеоартрит, рассекающий остеохондрит сустава, рассекающий остеохондрит локтевого сустава и рассекающий остеохондрит коленного сустава. В одном из аспектов, заболевание хряща, леченное фрагментом пептида HMGB1 по настоящей заявке, представляет собой травматический дефект хряща коленного сустава. В другом аспекте заболевание хряща, леченное фрагментом пептида HMGB1 по настоящей заявке, представляет собой коленный остеоартрит.

[0015]

В настоящей заявке, термин «фармацевтическая композиция» применяют взаимозаменяемо с термином «лекарственное средство», «средство» или «медицинская композиция».

[0016]

Настоящая заявка также предлагает фармацевтическую композицию для регенерации гиалинового хряща у пациента с заболеванием хряща, содержащую фрагмент пептида HMGB1, включающий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1. В одном из аспектов, фармацевтическая композиция по настоящей заявке предназначена для применения для регенерации гиалинового хряща у пациента с травматическим дефектом хряща, остеоартритом или рассекающим остеохондритом.

[0017]

В настоящей заявке фрагмент пептида HMGB1, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1, означает пептид, состоящий из части белка HMGB1, где пептид содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1. Такой пептид можно получать путем включения ДНК, кодирующей пептид, в соответствующую экспрессирующую систему для получения рекомбинанта, или можно синтезировать искусственным путем.

[0018]

Примеры белка HMGB1 в настоящей заявке в качестве неограничивающих примеров включают белок, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, и белок, кодируемый ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3.

[0019]

Примеры фрагмента пептида HMGB1, содержащего аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1, в настоящей заявке в качестве неограничивающих примеров, включают фрагмент пептида HMGB1, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1.

[0020]

В фармацевтической композиции по настоящей заявке, альтернативно или дополнительно к фрагменту пептида HMGB1, содержащему аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1, можно использовать пептид, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1, с одним или несколькими модифицированными аминокислотными остатками (замещенными, удаленными, вставленными или добавленными), где пептид функционально эквивалентен фрагменту пептида HMGB1, содержащему аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1. Примеры такого пептида в качестве неограничивающих примеров включают следующие:

i) пептид, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1, с одной или несколькими (например, от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, 1 до 3, или от 1 до 2) замененными, удаленными, вставленным или добавленными аминокислотами;

ii) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1, с одной или несколькими (например, от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, или от 1 до 2) замененными, удаленными, вставленным или добавленными аминокислотами;

iii) пептид, содержащий аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности приблизительно 80% или более, например, приблизительно 85% или более, приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, 97% или более, или приблизительно 98% или более с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1;

iv) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности с идентичностью последовательности приблизительно 80% или более, например, приблизительно 85% или более, приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, 97% или более, или приблизительно 98% или более с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1

[0021]

Эффективное количество пептида или фармацевтической композиции, содержащей его (далее в настоящем документе обозначаемого как пептид или т.п.) по настоящей заявке вводят индивидууму для лечения или предотвращение заболевания или симптома, описываемого в настоящем документе.

[0022]

Эффективное количество по настоящей заявке относится к количеству, достаточному для лечения или профилактики заболевания или симптома, описываемого в настоящем документе. Примеры лечения в настоящем заявке в качестве неограничивающих примеров включают облегчение, отсрочку, остановку, улучшение, ремиссию, излечение и полную ремиссию. Примеры профилактики в настоящей заявке в качестве неограничивающих примеров включают облегчение, задержку и остановку.

[0023]

Индивидуум в настоящей заявке конкретно не ограничен, и его примеры включают млекопитающее, птицу и рыбу. Примеры млекопитающего в качестве неограничивающих примеров включают человека и не являющееся человеком животное, например, человек, мышь, крыса, обезьяна, свинья, собака, кролик, хомяк, морская свинка, лошадь, овца, или кит. В настоящей заявке термин «индивидуум» применяют взаимозаменяемо с термин «пациент», «субъект» или «животное».

[0024]

Участок введения пептида или т.п. по настоящей заявке не ограничен, и пептид или т.п. по настоящей заявке может оказывать влияние на любой участок, в который его вводят, такой как участок, где появляется симптом заболевания хряща, или его окрестности, участок, отличный от этого (участок, иной, чем этот), участок, удаленный от участка, где появляется симптом заболевания хряща, участок, дистальнее участка, где появляется симптом заболевания хряща, или участок, дистальный и эктопический по отношению к участку, где появляется симптом заболевания хряща.

[0025]

Пептид или т.п. по настоящей заявке может также оказывать свое действие в зависимости от того, в какую ткань его вводят, такую как ткань, отличную от ткани, в которой проявляется симптом заболевания хряща (например, сустав), ткань, удаленную от ткани, в которой проявляется симптом заболевания хряща, ткань, дистальнее ткани, в которой появляется симптом заболевания хряща, или ткань, дистальную и эктопическую по отношению к ткани, где появляется симптом заболевания хряща.

[0026]

Примеры способа введения пептида или т.п. по настоящей заявке включают в себя пероральное введение и парентеральное введение, и примеры способа парентерального введения в качестве неограничивающих примеров включают внутрисосудистое введение (внутриартериальное введение, внутривенное введение и т.п.), внутримышечное введение, подкожное введение, интрадермальное введение, интраперитонеальное введение, трансназальное введение, транспульмональное введение, и трансдермальное введение. Пептид или т.п. по настоящей заявке также можно вводить системно или местно (например, подкожно, интрадермально, на поверхность кожи, в глазное яблоко или конъюнктиву века, назальную слизистую оболочку, интраперорально и в слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, вагинальную/внутриматочную слизистую оболочку, или участок повреждения) путем инъекции, например, внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, интраперитонеальной инъекции или подкожной инъекции.

[0027]

Альтернативно по отношению к пептиду или т.п. по настоящей заявке можно использовать клетку, которая секретирует пептид по настоящей заявке, ДНК, кодирующую пептид, вектор, в который встроена ДНК, клетку, содержащую вектор, и фармацевтическую композицию, содержащую то же самое.

[0028]

Способ введения может быть соответствующим образом выбран в зависимости от возраста и симптомов пациента. Когда вводят пептид по настоящей заявке, введение количества можно выбирать количество для введения, например, в диапазоне приблизительно от 0,0000001 до приблизительно 1000 мг на кг массы тела на введение. Альтернативно, количество для введения можно выбирать, например, в диапазоне приблизительно от 0,00001 до приблизительно 100000 мг/тело на пациента. Когда вводят клетку, секретирующую пептид по настоящей заявке, или генотерапевтический вектор со вставленной ДНК, кодирующей пептид, клетку или вектор можно вводить таким образом, что количество пептида находится в указанном выше диапазоне. Однако фармацевтическая композиция по настоящей заявке не ограничена этими количествами для введения.

[0029]

Фармацевтическую композицию по настоящей заявке можно формулировать в соответствии с общепринятыми способами (например, Remington's Pharmaceutical Science, последнее издание, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), и она может содержать фармацевтически приемлемый носитель или добавку в дополнение к пептиду. Примеры носителя и добавки включают поверхностно-активное вещество, эксципиент, краситель, ароматизатор, консервант, стабилизатор, буфер, суспендирующее средство, средство придания изотоничности, связывающее средство, дезинтегрант, смазочное средство, средство, способствующее текучести и модификатор вкуса, но не ограничиваются ими, и в качестве подходящих носителей и добавок можно использовать другие общепринятые носители и добавки. Их конкретные примеры включают легкую безводную кремниевую кислоту, лактозу, кристаллическую целлюлозу, маннит, крахмал, кармеллозу кальция, кармеллозу натрия, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, поливинилацетальдиэтиламиноацетат, поливинилпироксиролидон, желатин, триглицерид жирной кислоты со средней длиной цепи, обработанное полиоксиэтиленом касторовое масло 60, белый сахар, карбоксиметилцеллюлозу, кукурузный крахмал, неорганические соли, очищенную воду, физиологический раствор и глицерин.

[0030]

Следует отметить, что вся литература известного уровня техники, цитируемая в настоящем документе, включена в настоящий документ в виде ссылок.

[0031]

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими Примерами, но настоящее изобретение ими не ограничено.

Примеры

[0032]

Пример 1

Оценка эффективности фрагмента пептида HMGB1 на дефекте суставного хряща

[0033]

(1) Материалы и Способы

i) Получение средства

Пептид, состоящий из аминокислотных остатков 1-44 (SEQ ID NO: 1) человеческого белка HMGB1, был химически синтезирован твердофазным способом. Далее в настоящем документе фрагмент пептида HMGB1 обозначен как пептид HMGB1 (1-44), а на чертежах, соответствующих Примерам, пептид просто обозначен как «1-44».

[0034]

ii) Создание мышиной модели дефекта хряща

Мыши C57BL/6J (в возрасте 6-7 недель, самцы дикого типа) были приобретены у CLEA Japan, Inc., а затем акклиматизировались в помещениях для животных до достижения ими возраста 8 недель (с массой тела примерно 25 г в возрасте 8 недель). В то время как мыши находились под ингаляционной анестезией изофлураном 1,5-2,0% (об./об.), проводили сбривание сбоку на нижней конечности для создания дефекта хряща, и делали ножницами продольный разрез кожи приблизительно 1 см до середины коленного сустава. Проводили рассечение сустава приблизительно 1 см под микроскопом с острым лезвием (№ 11) в парапателлярном медиальном доступе для бокового вывиха надколенника. Фиксировали бедренный капсуло-связочный комплекс, и создавали дефект хряща 0,5×0,5×0,5 мм в центре комплекса с помощью ручного токарного сверла диаметром 0,5 мм (производства MEISINGER USA, L.L.C.). Внутри сустав отмывали физиологическим раствором, затем суставную капсулу без разрывов зашивали викрилом 8-0 для предотвращения вывиха надколенника, а кожу зашивали нейлоновой нитью 5-0.

[0035]

iii) Введение пептида

Мышей с моделью дефекта хряща, созданных, как описано выше, разделяли на группу с введением пептида HMGB1 (1-44) (n=16) и контрольную группу (n=16). Группе с введением пептида HMGB1 (1-44) вводили раствор пептида HMGB1 (1-44), скорректированный до концентрации 1 мкл/мкл при помощи физиологического раствора в качестве растворителя, в хвостовую вену в количестве 100 мкл/мышь (4 мг/кг как доза пептида) сразу после образования дефекта хряща, и после этого ту же дозу вводили дважды в неделю в течение 4 недель после образования дефекта хряща (далее в настоящем документе также упоминается просто как «после операции»). Контрольной группе вводили физиологический раствор в хвостовую вену в количестве 100 мкл на каждую мышь по тому же графику, что и группе с введением пептида HMGB1 (1-44).

[0036]

iv) Оценка эффектов при введении пептид

Как в группе с введением пептида HMGB1 (1-44), так и в контрольной группе, мышей умерщвляли в каждый момент времени на 2, 4, 8 и 12 недели после операции, и участки образования дефектов хряща в коленных суставах удаляли для микроскопического наблюдения и окрашивания тканей. Для микроскопического исследования состояние хрящевой ткани оценивали путем оценки общего внешнего вида в соответствии с критериями, приведенными в таблице 1 ниже, с использованием системы оценки Wayne. Кроме того, были созданы срезы ткани хряща для гистологической оценки и подвергнуты окрашиванию сафранином О, и состояние ткани хряща оценивали путем расчета оценки по Wakitani по изображениям ткани в соответствии с критериями, приведенными в таблице 2 ниже.

[0037]

[Таблица 1]

Оценка по Wayne Общий вид Степень Покрытие >75% заполнено 4 50-75% заполнено 3 25-50% заполнено 2 <25% заполнено 1 Без заполнения 0 Цвет нового хряща Нормальный 4 25% желто-коричневый 3 50% желто-коричневый 2 75% желто-коричневый 1 100% желто-коричневый 0 Края дефекта Не видны 4 25% видимой окружности 3 50% видимой окружности 2 75% видимой окружности 1 Полностью видимая окружность 0 Поверхность Гладкая, на уровне с нормальной 4 Гладкая, но приподнятая 3 Неоднородная 25-50% 2 Неоднородная 50-75% 1 Неоднородная 75% 0

[0038]

[Таблица 2]

Оценка по Wakitani Категория Оценка Клеточная морфология Гиалиновый хрящ 0 В основном гиалиновый хрящ 1 В основном фиброзный хрящ 2 В основном не хрящевая ткань 1 Только не хрящевая ткань 0 Окрашивание матрикса(метохромазия) Нормальное (по сравнению с прилежащим хрящом) 0 Слегка сниженное 1 Заметно сниженное 2 Нет метахроматического окрашивания 3 Однородность поверхности^† Гладкая (>3/4) 0 Умеренная (>1/2-3/4) 1 Неоднородная (1/4-1/2) 2 Сильно неоднородная (<1/4) 3 Толщина хряща >2/3 0 1/3-2/3 1 <1/3 2 Интеграция донора с прилежащим хрящом Обе грани интегрированы 0 Одна грань интегрирована 1 Ни одна грань не интегрирована 2 Общий максимум 14

^† Общая гладкая область регенерированного хряща по сравнению со всей областью дефекта хряща

[0039]

(2) Результаты

i) Микроскопическое наблюдение (общий вид)

На фигуре 1 представлены результаты микроскопических наблюдений участков дефекта хряща коленных суставов и вокруг них на 2, 4, 8 и 12 неделе после операции. Было отмечено, что участки дефекта хряща в группе с введением пептида HMGB1 (1-44) были восстановлены до состояния, более близкого к нормальному, чем в контрольной группе. Также по оценкам по Wayne группа с введением пептида HMGB1 (1-44) была выше, чем контрольная группа (фигура 2).

[0040]

ii) Гистологическая оценка

В результате окрашивания сафранином O тканевых срезов хряща, области, сильно окрашенные красным (считается гиалиновым хрящом), наблюдали на всем протяжении участков образования дефектов хряща в группе с введением пептида HMGB1 (1-44), что подтверждает, что дефектная хрящевая ткань полностью регенерирована (фигуры 3 и 5). Оценка по шкале Wakitani также показала, что оценка группы с введением пептида HMGB1 (1-44) была значительно ниже по сравнению с контрольной группой, что демонстрирует терапевтический эффект пептида HMGB1 на дефекты хряща суставов (фигуры 4 и 6).

[0041]

Пример 2

Окраска ткани суставного хряща

[0042]

Способы

Модель дефекта хряща мыши создавали таким же образом, как в примере 1, и подращивали. Ткани, содержащие участки образования дефектов хряща в коленных суставах, удаляли у мышей через 12 недель после операции для создания парафиновых срезов, и срезы подвергали иммуноокрашиванию с окрашиванием антителами против коллагена типа II и окрашиванию сафранином О. Кроме того, хрящевые ткани коленных суставов удаляли у нормальных мышей того же штамма для создания парафиновых срезов, и срезы подвергали иммуноокрашиванию по коллагену типа II и окрашиванию сафранином О таким же образом.

[0043]

Результаты

Ткани участков образования дефектов хряща коленных суставов через 12 недель после операции в модели дефектов хряща мыши (т.е. ткани, оставшиеся для естественного восстановления после образования дефектов хряща) показали слабый положительный ответ как при окрашивании сафранином О, так и при иммуноокрашивании по коллагену типа II, таким образом подтверждая, что они не были гиалиновым хрящом (фигура 7).

Напротив, хрящевые ткани коленных суставов нормальной мыши (известные как гиалиновый хрящ) показали значительно более сильный положительный ответ как при окрашивании сафранином О, так и при иммуноокрашивании по коллагену типа II по сравнению с участками образования дефекта хряща через 12 недель после операции у мышиной модели, описанной выше (фигура 8). Также было подтверждено, что положительные области при окрашивании сафранином О и положительные области при иммуноокрашивании по коллагену типа II хорошо соответствовали.

[0044]

Обсуждение

Хрящевые ткани коленных суставов (фигуры 3 и 5) через 12 недель после операции в группе с введением пептида HMGB1 (1-44), описанной в примере 1, демонстрируют сильную положительную реакцию, аналогичную хрящевой ткани коленных суставов нормальной мыши (фигура 8, слева) при окрашивании сафранином О. Таким образом, ткань хряща, регенерированная введением пептида HMGB1 (1-44), считается тканевым эквивалентом нормальной ткани суставного хряща, состоящей из гиалинового хряща.

Промышленная применимость

[0045]

Поскольку фармацевтическая композиция, содержащая пептид по настоящей заявке, может регенерировать полную форму суставного хряща, который не может быть регенерирован естественным путем, ожидается, что фармацевтическая композиция обеспечит значительные преимущества для пациентов с заболеваниями хряща, на которые существующие терапевтические средства не оказывают достаточных воздействий.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Osaka University

<120> Средство для лечения заболевания хряща

<130> 675238

<150> JP 2018-200866

<151> 2018-10-25

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 44

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственно синтезированная пептидная последовательность

<400> 1

Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr

1 5 10 15

Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro

20 25 30

Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys

35 40

<210> 2

<211> 215

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr

1 5 10 15

Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro

20 25 30

Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg

35 40 45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala

50 55 60

Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro

65 70 75 80

Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys

85 90 95

Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys

100 105 110

Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys

115 120 125

Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr

130 135 140

Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala

145 150 155 160

Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val

165 170 175

Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu

180 185 190

Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu

195 200 205

Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu

210 215

<210> 3

<211> 648

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

atgggcaaag gagatcctaa gaagccgaga ggcaaaatgt catcatatgc attttttgtg

60

caaacttgtc gggaggagca taagaagaag cacccagatg cttcagtcaa cttctcagag

120

ttttctaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagagaa aggaaaattt

180

gaagatatgg caaaagcgga caaggcccgt tatgaaagag aaatgaaaac ctatatccct

240

cccaaagggg agacaaaaaa gaagttcaag gatcccaatg cacccaagag gcctccttcg

300

gccttcttcc tcttctgctc tgagtatcgc ccaaaaatca aaggagaaca tcctggcctg

360

tccattggtg atgttgcgaa gaaactggga gagatgtgga ataacactgc tgcagatgac

420

aagcagcctt atgaaaagaa ggctgcgaag ctgaaggaaa aatacgaaaa ggatattgct

480

gcatatcgag ctaaaggaaa gcctgatgca gcaaaaaagg gagttgtcaa ggctgaaaaa

540

agcaagaaaa agaaggaaga ggaggaagat gaggaagatg aagaggatga ggaggaggag

600

gaagatgaag aagatgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa

648

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и раскрывает полипептид, содержащей фрагмент белка 1 высокомобильной группы (HMGB1). Изобретение демонстрирует эффект восстановления/регенерации хрящевой ткани, что может быть применимо в медицине при лечении заболеваний гиалинового хряща или их профилактике. 8 н. и 10 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания хряща, содержащая эффективное количество любого из веществ от (a) до (c) и фармацевтически приемлемый носитель или добавку:

(a) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1;

(b) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1, с одной или двумя замещенными, удаленными, вставленными или добавленными аминокислотами и оказывающий эффект регенерации хрящевой ткани, и

(c) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, с идентичностью последовательности приблизительно 95% или более с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1 и оказывающий эффект регенерации хрящевой ткани.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, где вещество представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1.

4. Фармацевтическая композиция для регенерации гиалинового хряща у пациента с заболеванием хряща, содержащая эффективное количество любого из веществ от (a) до (c) и фармацевтически приемлемый носитель или добавку:

(a) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1;

(b) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1, с одной или двумя замещенными, удаленными, вставленными или добавленными аминокислотами и оказывающий эффект регенерации гиалинового хряща, и

c) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, с идентичностью последовательности приблизительно 95% или более с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1 и оказывающий эффект регенерации гиалинового хряща.

5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

6. Фармацевтическая композиция по п. 4, где вещество представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1.

7. Способ лечения заболевания хряща, включающий введение субъекту эффективного количества любого вещества от (a) до (c):

(a) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1;

(b) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1, с одной или двумя замещенными, удаленными, вставленными или добавленными аминокислотами и оказывающий эффект регенерации хрящевой ткани; и

(c) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, с идентичностью последовательности приблизительно 95% или более с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1, и оказывающий эффект регенерации хрящевой ткани.

8. Способ по п. 7, где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

9. Способ регенерации гиалинового хряща у пациента с заболеванием хряща, включающий введение субъекту эффективного количества любого вещества от (a) до (c):

(a) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1;

(b) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1, с одной или двумя замещенными, удаленными, вставленными или добавленными аминокислотами и обладающий эффектом регенерации гиалинового хряща; и

(c) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, с идентичностью последовательности приблизительно 95% или более с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1, и обладающий эффектом регенерации гиалинового хряща.

10. Способ по п. 9, где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

11. Применение вещества для лечения заболевания хряща, при этом вещество представляет собой любое вещество от (a) до (c):

(a) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1;

(b) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1, с одной или двумя замещенными, удаленными, вставленными или добавленными аминокислотами и оказывающий эффект регенерации хрящевой ткани; и

(c) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, с идентичностью последовательности приблизительно 95% или более с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1, и оказывающий эффект регенерации хрящевой ткани.

12. Применение по п. 11, где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

13. Применение вещества для регенерации гиалинового хряща у пациента с заболеванием хряща, при этом вещество представляет собой любое вещество от (a) до (c):

(a) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1;

(b) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1, с одной или двумя замещенными, удаленными, вставленными или добавленными аминокислотами и обладающий эффектом регенерации гиалинового хряща; и

(c) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, с идентичностью последовательности приблизительно 95% или более с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1, и обладающий эффектом регенерации гиалинового хряща.

14. Применение по п. 13, где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

15. Применение любого вещества от (а) до (с) при получении лекарственного средства для лечения заболевания хряща:

(a) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1;

(b) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1, с одной или двумя замещенными, удаленными, вставленными или добавленными аминокислотами и оказывающий эффект регенерации хрящевой ткани; и

(c) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, с идентичностью последовательности приблизительно 95% или более с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1, и оказывающий эффект регенерации хрящевой ткани.

16. Применение по п. 15, где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.

17. Применение любого вещества от (а) до (с) при получении лекарственного средства для регенерации гиалинового хряща у пациента с заболеванием хряща:

(a) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1;

(b) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1, с одной или двумя замещенными, удаленными, вставленными или добавленными аминокислотами и обладающий эффектом регенерации гиалинового хряща; и

(c) пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, с идентичностью последовательности приблизительно 95% или более с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 1, и обладающий эффектом регенерации гиалинового хряща.

18. Применение по п. 17, где заболевание хряща представляет собой травматический дефект хряща, остеоартрит или рассекающий остеохондрит.