FGF-18 В ПРОЦЕДУРАХ ПЕРЕСАДКИ ТРАНСПЛАНТАТА И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ Российский патент 2019 года по МПК A61L27/36 A61K38/18 A61F2/30 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к регенеративной медицине, в особенности для лечения поражений хряща, таких как остеоартрит, повреждение хряща и костно-хрящевые дефекты. Более конкретно, оно относится к соединению FGF-18 для применения в процедурах тканевой инженерии и трансплантации, таких как пересадка костно-хрящевых или хрящевых трансплантатов, или имплантация аутологичных хондроцитов (ACI).

Уровень техники

Поражения хряща в широком смысле относятся к заболеваниям, характеризующимся дегенерацией хряща и нарушениями в соединительных тканях, которые проявляются в боли, неподвижности и ограничении движения затронутых частей тела. Такие нарушения могут быть вызваны патологией, например остеоартритом (ОА), или могут являться результатом травмы или повреждения. Костно-хрящевые дефекты (OCD), то есть дефекты хряща, захватывающие конец кости в суставе, чаще всего обусловлены травмой или повреждением, но также могут быть вызваны патологией. OCD могут приводить к ОА. Зрелый хрящ имеет ограниченную способность к ауторепарации, в особенности потому, что зрелые хондроциты обладают малым потенциалом для пролиферации, и вследствие отсутствия кровеносных сосудов в хряще. Замена поврежденного хряща, в особенности суставного хряща, вследствие повреждения или болезни является основной проблемой для врачей, при этом доступные процедуры хирургического лечения считаются непредсказуемыми и эффективными лишь в течение ограниченного времени. Поэтому большинство больных либо не обращаются за помощью, либо получают рекомендацию отложить лечение на как можно более длительный срок. Когда требуется лечение, стандартная процедура зависит от возраста и варьирует от полной или частичной замены сустава до трансплантации частей хряща или методики стимуляции костного мозга (такой как микрофрактурирование). Микрофрактурирование является недорогостоящей и простой процедурой, которая включает перфорацию субхондральной кости с целью стимуляции отложения хряща из стволовых клеток костномозгового происхождения. Однако было показано, что такая методика не обеспечивает достаточного восстановления дефекта хряща, и новый сформировавшийся хрящ главным образом представляет собой волокнистый хрящ, что приводит к нарушению или изменению функции. Действительно, волокнистый хрящ не обладает такой стойкостью к износу и может не прикрепляться надлежащим образом к окружающему гиалиновому хрящу. По этой причине недавно образованный волокнистый хрящ может легче разрушаться (ожидаемый период времени: 5-10 лет).

Для больных остеоартритом консервативное лечение состоит исключительно из физиотерапии, изменения образа жизни (например, упражнения для снижения массы), поддерживающих устройств, лекарственных средств для приема внутрь и инъекций (например, нестероидных противовоспалительных средств), а также наблюдения у врача (хотя пока что не существует коммерчески доступного лечения, которое обеспечивает восстановление повреждений хряща (см. Lotz, 2010)). Если указанные способы лечения не эффективны, хирургическая операция, такая как замена сустава (частичная или полная), является основным выбором для пациентов. Такой вариант лечения может обеспечить уменьшение симптомов, однако часто приводит к нарушению функции сустава. Остеотомии большеберцовой или бедренной кости (с разрезом кости для ребалансировки изношенного сустава) могут уменьшать симптомы, способствуют поддержанию активного образа жизни и отсрочивают необходимость полной замены сустава. Полная замена сустава может обеспечить облегчение симптома запущенного остеоартрита, но обычно требует существенных изменений образа жизни и/или уровня активности больного.

Существующие процедуры восстановления хряща включают полную замену сустава, стимуляцию костного мозга (например, микрофрактурирование), костно-хрящевые аллотрансплантаты или аутотрансплантаты и имплантацию культивированного хряща (такую как имплантация аутологичных хондроцитов (ACI)). Эти процедуры предоставляют варианты лечения, в особенности для больных с симптоматическим повреждением хряща.

Пересадка костно-хрящевого аллотрансплантата или аутотрансплантата является стандартной процедурой для лечения очаговых дефектов суставов. На эффективность данной процедуры, вероятно, влияет множество факторов, включая источник донорского хряща, состояние хряща, окружающего дефектный участок, и качество интеграции. К сожалению, во многих случаях процедуры пересадки костно-хрящевой ткани приводят к плохой интеграции.

Как правило, в методе тканевой инженерии клетки выращивают в трехмерной (3D) матрице, где каждый элемент указанной матрицы играет ключевую роль в регенерации ткани. Основным типом стволовых клеток, используемых для формирования хряща, являются человеческие МСК (чМСК) (Zhang et al., 2013). Однако в тканевой инженерии важен тип МСК, каркаса и другие факторы. Кроме того, обеспечение регенерации однородной структуры, подобной гиалиновому хрящу, важно для высокого качества интеграции в дефект. Установление и поддержание указанного фенотипа в процессе тканевой инженерии суставного хряща является сложным и может быть оптимизировано при использовании факторов, ингибирующих гипертрофию (Tang et al., 2012). Например, хотя добавление TGF-бета1 улучшало экспрессию генов аггрекана, коллагена II типа и Sox-9 клетками чМСК, новый образующийся хрящ главным образом состоит из волокнистой, недолговечной ткани, а не гиалиновой ткани (Zhang et al., 2013).

Другим типом процедуры тканевой инженерии является процедура имплантации культивируемого хряща, такая как имплантация аутологичных хондроцитов (ACI), при которой хрящ берут из области с малой весовой нагрузкой на суставной поверхности больного, проходящего лечение; затем хондроциты выделяют и культивируют in vitro, либо в монослойных культурах, либо в трехмерных культурах; по прошествии некоторого времени в культуре полученные хондроциты или трехмерные конструкции имплантируют в дефект с целью заполнения дефекта. К сожалению, размножение хондроцитов, особенно в монослойных культурах, как известно, вызывает образование фибробласт-подобных хондроцитов (Magill et al., 2011).

Фактор роста фибробластов 18 (FGF-18) вызывает пролиферацию хондроцитов и остеобластов (Ellsworth et al., 2002; Shimoaka et al., 2002). Он был предложен для лечения поражений хряща, таких как остеоартрит и повреждение хряща, отдельно (WO2008023063) или в комбинации с гиалуроновой кислотой (WO2004032849). Лиофилизированные составы, содержащие FGF-18, показали многообещающие результаты при лечении ОА или повреждений хряща при внутрисуставном введении.

Хотя процедуры восстановления хряща, такие как пересадка костно-хрящевых трансплантатов и имплантация культивируемого хряща (например, ACI), являются многообещающими, степень интеграции или качество полученного хряща необходимо повысить. Таким образом, существует потребность в способе улучшения процедуры, который обеспечивает хорошую интеграцию и хорошее качество получаемого хряща (то есть главным образом гиалинового хряща). Действительно, формирование указанного гиалинового хряща ценно как в терапевтических целях, так и в качестве компонента биологических матриц (Getgood et al., 2010).

Сущность изобретения

Цель настоящего изобретения состоит в предоставлении способа получения трансплантируемого хрящевого материала для тканевой инженерии или костно-хрящевого/хрящевого трансплантата, где указанный способ включает или состоит из следующих этапов: культивирование хондрогенных клеток, в монослойной культуре или в трехмерной культуре, или культивирование костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов) в среде, содержащей соединение FGF-18, в течение некоторого времени, достаточного для формирования трансплантируемого костно-хрящевого/хрящевого материала. Необязательно, соединение FGF-18 может дополнительно быть введено на участке трансплантации полученного костно-хрящевого/хрящевого материала до, во время или после трансплантации.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу восстановления хряща у млекопитающего в области суставного дефекта (такого как дефект хряща), вызванного поражением хряща, где указанный способ включает или состоит из следующих этапов: (a) культивирование хондрогенных клеток, в монослойной культуре или в трехмерной культуре, или культивирование костно-хрящевого или хрящевого эксплантата(ов) в среде, содержащей соединение FGF-18, и (b) введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, культивируемых хондрогенных клеток или культивируемого костно-хрящевого/хрящевого эксплантата, полученного в этапе (a). Необязательно, соединение FGF-18 может быть дополнительно введено на участке, в который были введены культивируемые хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат, до, во время или после введения клеток/эксплантатов.

В альтернативном варианте осуществления, в настоящей заявке раскрыт способ восстановления хряща у млекопитающего в области суставного дефекта (такого как дефект хряща), вызванного поражением хряща, где указанный способ включает или состоит из следующих этапов: (a) культивирование хондрогенных клеток, в монослойной культуре или в трехмерной культуре, или культивирование костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов) в среде, (b) введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, культивированных хондрогенных клеток или культивированного костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), полученного в этапе (a), и (c) инъекция соединения FGF-18 на участке, в который вводили культивированные хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат. Этап (c) может быть выполнен до, во время или после введения клеток/эксплантатов.

В третьем варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению FGF-18 для применения в способе лечения дефекта в ткани хряща млекопитающего, где указанный дефект вызван поражением хряща, где способ включает или состоит из следующих этапов: (a) культивирование хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов) в культуре in vitro или ex vivo, где указанное культивирование проводят в среде для культур клеток, содержащей соединение FGF-18, (b) необязательно, повтор этапа (a) для получения материала трансплантата, включающего культивированные хондрогенные клетки или культивированный костно-хрящевой/хрящевой трансплантат, и (c) пересадка материала трансплантата из этапа (b) в дефект млекопитающего, нуждающегося в указанном лечении, где во время этапа (a) и (b) хондрогенные клетки могут культивировать в монослойной культуре или в трехмерной культуре. Необязательно, соединение FGF-18 может быть дополнительно введено на участке трансплантации до, во время или после трансплантации.

В альтернативном варианте осуществления, в настоящей заявке раскрыто соединение FGF-18 для применения в способе лечения дефекта в ткани хряща млекопитающего, где указанный дефект вызван поражением хряща, где способ включает или состоит из следующих этапов: (a) культивирование хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов) в культуре in vitro или ex vivo, (b) необязательно, повтор этапа (a) для получения материала трансплантата, включающего культивированные хондрогенные клетки или культивированный костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы), (c) пересадка материала трансплантата из этапа (b) в дефект млекопитающего, нуждающегося в указанном лечении, где во время этапа (a) и (b) хондрогенные клетки могут культивировать в монослойной культуре или в трехмерной культуре, и (d) инъекция соединения FGF-18 на участке трансплантации. Этап (d) может быть выполнен до, во время или после трансплантации.

В пятом варианте осуществления, в настоящей заявке предложена композиция, включающая костно-хрящевой/хрящевой эксплантат млекопитающего или культивированные хондрогенные клетки млекопитающего в среде, включающей соединение FGF-18, для применения в тканевой инженерии или костно-хрящевом/хрящевом трансплантате у млекопитающего, нуждающегося в этом.

В рамках настоящего изобретения в целом, хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы) предпочтительно собирают или выделяют у млекопитающего перед этапом размножения или культивирования.

В рамках настоящего изобретения в целом, в отношении трехмерной культуры хондроцитов или хондрогенных клеток или в отношении костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), соединение FGF-18 предпочтительно периодически добавляют в среду в течение приблизительно одного, 2 или 3 дней в неделю, где указанное добавление в один, 2 или 3 дня повторяют каждую неделю в течение по меньшей мере 2 недель культивирования, по меньшей мере 3 недель культивирования или по меньшей мере 4 недель культивирования. Предпочтительно, указанное соединение FGF-18 периодически добавляют в среду в один, два или три дня в неделю, где указанное добавление в один, 2 или 3 дня повторяют каждую неделю в течение 2 недель культивирования, 3 недель культивирования или 4 недель культивирования. В альтернативе, соединение FGF-18 могут периодически добавлять в среду в течение приблизительно одного, 2 или 3 дней в месяц, где указанное добавление в один, 2 или 3 дня повторяют каждый месяц в течение по меньшей мере 2 месяцев культивирования, по меньшей мере 3 месяцев культивирования или по меньшей мере 4 месяцев культивирования. Предпочтительно, соединение FGF-18 периодически добавляют в среду в один, два или три дня в месяц, где указанное добавление в один, 2 или 3 дня повторяют каждый месяц в течение 2 месяцев культивирования, 3 месяцев культивирования или 4 месяцев культивирования. В альтернативе, соединение FGF-18 могут постоянно поддерживать в среде. В случае культивирования хондроцитов или хондрогенных клеток в монослое, хотя это и не является ограничивающим, соединение FGF-18 предпочтительно добавляют постоянно.

Согласно любому из вариантов осуществления настоящего изобретения, поражением хряща предпочтительно является остеоартрит, повреждение хряща или костно-хрящевой дефект.

В рамках настоящего изобретения в целом, соединение FGF-18 предпочтительно выбрано из группы, состоящей из: a) полипептида, включающего или состоящего из зрелой формы человеческого FGF-18, включающего остатки 28-207 из SEQ ID NO:1, b) полипептида, включающего или состоящего из остатков 28-196 из SEQ ID NO:1, или c) полипептида, включающего или состоящего из SEQ ID NO:2.

Кроме того, в рамках настоящего изобретения в целом, эксплантат предпочтительно является эксплантатами хряща, а хондрогенные клетки предпочтительно являются хондроцитами или мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из зрелых тканей. В зависимости от потребности, хондрогенные клетки или костно-хрящевые/хрящевые эксплантаты получены у млекопитающего, подвергаемого лечению, или у другого млекопитающего, предпочтительно из одного и того же вида, что и млекопитающее, подвергаемое лечению. Млекопитающее, подвергаемое лечению, предпочтительно является человеком, но в альтернативе, и без какого-либо ограничения, может быть также лошадью, верблюдом, овцой, собакой или более мелкими млекопитающими, такими как кошки, кролики, крысы или мыши.

Определения

- Термин "соединение FGF-18" или "FGF-18", при использовании в настоящем описании, относится к белку, сохраняющему по меньшей мере одну биологическую активность человеческого белка FGF-18. FGF-18 может быть нативным, находиться в своей зрелой форме, рекомбинантной форме или усеченной форме. Биологические активности человеческого белка FGF-18 включают, в частности, увеличение пролиферации хондроцитов или остеобластов (см. WO98/16644) или формирования хряща (см. WO2008/023063). Нативный, или дикого типа, человеческий FGF-18 представляет собой белок, экспрессируемый хондроцитами суставного хряща. Человеческий FGF-18 сначала был обозначен как zFGF-5 и полностью описан в WO98/16644. SEQ ID NO:1 соответствует аминокислотной последовательности нативного человеческого FGF-18 с сигнальным пептидом, который состоит из аминокислотных остатков 1 (Met) - 27 (Ala). Зрелая форма человеческого FGF-18 соответствует аминокислотной последовательности от остатка 28 (Glu) до остатка 207 (Ala) SEQ ID NO: 1 (180 аминокислот).

FGF-18, в настоящем изобретении, может быть получен рекомбинантным способом, таким как способ, описанный в заявке WO2006/063362. В зависимости от систем экспрессии и условий, FGF-18 в настоящем изобретении экспрессируется в рекомбинантной клетке-хозяине с первым остатком метионина (Met) или с сигнальной последовательностью для секреции. При экспрессии в прокариотическом хозяине, например в E. coli, FGF-18 содержит дополнительный остаток Met на N-конце своей последовательности. Например, аминокислотная последовательность человеческого FGF-18, при экспрессии в E.coli, начинается с остатка Met на N-конце (положение 1), после которого следуют остатки 28 (Glu) - 207 (Ala) в SEQ ID NO: 1.

- Термин "усеченная форма" FGF18, при использовании в настоящем описании, относится к белку, который включает или состоит из остатков 28 (Glu) - 196 (Lys) SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, усеченная форма белка FGF-18 является полипептидом, обозначенным как "trFGF-18" (170 аминокислот; также известный как rhFGF18 или сприфермин), который начинается с остатка Met (на N-конце), после которого следуют аминокислотные остатки 28 (Glu)-196 (Lys) человеческого FGF-18 дикого типа. Аминокислотная последовательность trFGF-18 показана в SEQ ID NO:2 (аминокислотные остатки 2-170 в SEQ ID NO:2 соответствуют аминокислотным остаткам 28-196 в SEQ ID NO:1). trFGF-18 является рекомбинантной усеченной формой человеческого FGF-18, продуцированной в E.coli (см. WO2006/063362). Было показано, что trFGF-18 демонстрирует активности, аналогичные зрелому человеческому FGF-18, например, он повышает пролиферацию хондроцитов и отложение хряща, что приводит к восстановлению и реконструкции множества хрящевых тканей (см. WO2008/023063).

- Термин "поражение хряща" при использовании в настоящем описании охватывает нарушения, возникающие в результате повреждений, таких как травматическое повреждение, хондропатия или артрит. Такие поражения приводят к дефекту, более предпочтительно дефекту хряща. Примеры поражений хряща, которые можно лечить путем применения соединения FGF-18, описанного в настоящей заявке, включают, без ограничения, артрит, такой как остеоартрит, повреждение хряща и костно-хрящевые дефекты. Дегенеративные заболевания/поражения хряща или сустава, такие как хондрокальциноз, полихондрит, рецидивирующий полихондрит, анкилозирующий спондилит или реберный хондрит также охвачены данным выражением. Международное общество по восстановлению хрящевой ткани (International Cartilage Repair Society) предложило артроскопическую шкалу для оценки тяжести дефекта хряща: оценка 0: (нормальный) здоровый хрящ, оценка 1: в хряще присутствует участок размягчения или пузыри, оценка 2: в хряще видны незначительные разрывы, оценка 3: поражения имеют глубокие трещины (затрагивают более 50% толщины слоя хряща) и оценка 4: разрыв хряща обнажает основную (субхондральную) кость (см. публикацию из ICRS: http://www.cartilage.org/_files/contentmanagement/ICRS_evaluation.pdf, страница 13).

- Термин "артрит", при использовании в настоящем описании, охватывает такие нарушения как остеоартрит, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, инфекционный артрит, псориатический артрит, болезнь Стилла (начало ювенильного ревматоидного артрита) или рассекающий остеохондрит. Это предпочтительно включает заболевания или нарушения, при которых хрящ поврежден или отделен от подлежащей кости.

- Термин "остеоартрит" используется для определения наиболее распространенной формы артрита. Термин "остеоартрит" рассматривают как поражение хряща, которое охватывает первичный остеоартрит и вторичный остеоартрит (см., например, The Merck Manual, 17th edition, page 449). Остеоартрит может быть вызван разрушением хряща. Фрагменты хряща могут отрываться и вызывать боль и опухание в суставе между костями. С течением времени хрящ может полностью изнашиваться, и кости будут тереться друг о друга. Остеоартрит может поражать любой сустав, но обычно затрагивает руки, плечи и опорные суставы, такие как бедра, колени, ступни и позвоночник. В предпочтительном примере остеоартрит может быть остеоартритом коленного сустава или остеоартритом тазобедренного сустава. Данная формулировка охватывает, в частности, формы остеоартрита, которые классифицируют по тяжести от стадии 1 до стадии 4 или от степени 1 до степени 6 согласно системе классификации OARSI. Специалист имеет полное представление о классификациях остеоартрита, которые используются в уровне техники, в особенности указанная система исследования OARSI (также называемая OOCHAS; см. например Custers et al., 2007). Остеоартрит является одним из предпочтительных поражений хряща, которые можно лечить путем применения FGF-18 согласно настоящему изобретению.

- Термин "повреждение хряща" при использовании в настоящем описании является поражением хряща или повреждением хряща, которые вызваны, в частности, травмой. Повреждения хряща могут происходить, в частности, после травматического механического разрушения, особенно после несчастного случая или хирургического вмешательства (например, микрофрактурирования). Данный термин "повреждение хряща" также включает хрящевую или костно-хрящевую трещину и повреждение мениска. Также в пределах данного определения рассматривают связанное со спортом повреждение или связанное со спортом изнашивание тканей сустава. Термин также включает микроповреждение или тупую травму, хрящевую трещину, костно-хрящевую трещину или повреждение мениска.

- Термин "костно-хрящевые дефекты" (OCD) относится к поражению хряща, при котором дефекты хряща охватывают конец кости в суставе. Такие дефекты чаще всего вызваны травмой или повреждением, но могут быть также обусловлены патологией. OCD может приводить к ОА. OCD, как правило, подразумевает, что также затронуты части кости, а не только хрящ. Если затронут только хрящ, то предпочтителен термин "повреждение хряща" (см. выше).

- Термин "тканевая инженерия" охватывает также имплантацию аутологичных хондроцитов (ACI). Она также известна как регенеративная медицина. Клетки или ткани могут быть выращены в монослойных культурах или в трехмерных культурах. Цель таких процедур заключается в восстановлении или замене части или всей ткани.

- Термин "трансплантат" относится к трансплантации или имплантации. Эта процедура также является частью регенеративной медицины. Она включает трансплантацию/имплантацию костно-хрящевой или хрящевой ткани (также указанной в настоящем описании как костно-хрящевой/хрящевой), такую как трансплантация/имплантация костно-хрящевого/хрящевого аутотрансплантата или костно-хрящевого/хрящевого аллотрансплантата. В рамках трансплантации эксплантаты получают от млекопитающего, либо от млекопитающего, подвергаемого лечению (то есть аутотрансплантат), либо от другого млекопитающего, предпочтительно того же вида (аллотрансплантат). Обычно трансплантат забирают из здоровой секции хряща или из здоровой костно-хрящевой ткани. Такой трансплантат предпочтительно применяют на уровне дефекта(ов) хряща.

- Термины "трансплантируемый хрящевой материал" или "трансплантируемый материал" используются попеременно. Они относятся к хондрогенным клеткам, таким как хондроциты, или к костно-хрящевым/хрящевым эксплантатам, которые получают для трансплантации (или имплантации) млекопитающему, нуждающемуся в этом. Такой трансплантируемый материал предпочтительно пересаживают/вживляют на уровне дефекта(ов) хряща.

- В рамках настоящего изобретения "эффективность" лечения может быть измерена по изменениям толщины хряща, например толщины суставного хряща в суставе. Эта толщина может быть оценена, например, с помощью компьютерной томографии, магнитно-резонансной томографии (МРТ) или ультразвукового исследования.

- Термин "приблизительно" в "приблизительно 24, 48 или 72 часа" или в "приблизительно один день, 2 дня или 3 дня" охватывает изменения в среде через 24, 48 или 72 часа после добавления соединения FGF-18, а также изменения в среде через 24, 48 или 72 часа +/- несколько часов после добавления соединения FGF-18 (например, +/- 1, 2, 3 или 4 часа). Аналогично, термин "приблизительно" в "приблизительно 7 дней", "приблизительно одна неделя", "приблизительно 4 недели" или "приблизительно один месяц" охватывает соответственно 7 дней, 1 неделю, 4 недели (то есть 28 дней) или один месяц, а также введение, разделенное соответственно 7 днями +/- 1 или 2 дня, одной неделей +/- 1 или 2 дня, 4 неделями +/- несколько дней (например, +/- 1, 2, 3, 4 дня) или одним месяцем +/- несколько дней (например, +/- 1, 2, 3, 4 дня). Фактически, следует понимать, что, в особенности с практической точки зрения, изменения среды или последующее добавление соединения FGF-18 не всегда могут быть выполнены с точными интервалами, например, обновление среды точно через 24, 48 или 72 после добавления соединения FGF-18, 4 недели (28 дней) день в день после предыдущего добавления. Таким образом, в рамках изобретения, например, через 4 недели означает через 28 дней, но может также быть через 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32 дня после предыдущего введения. В рамках настоящего изобретения термин "4 недели" аналогичен термину "1 месяц", и они могут использоваться попеременно. "4 недели", которые будут предпочтительно использоваться, должны соответствовать "дням" (например, 1-ое добавление в понедельник, следующее добавление в понедельник через 4 недели после), а "месяц", который будет предпочтительно использоваться, должен соответствовать "дате" (например, 1-ое добавление 1-ого августа, следующее добавление 1-ого сентября).

- Термин "цикл" означает цикл добавления. В рамках настоящего изобретения еженедельный цикл (или 7-дневный цикл) означает, что добавление соединения FGF-18 в среду будут производить в течение одного дня приблизительно каждую неделю (или приблизительно каждые 7 дней). Таким образом, указанный цикл будет включать один день культивирования в среде с добавкой и приблизительно 6 дней культивирования в среде без добавки (то есть без FGF-18). Аналогично, 4-недельный цикл означает, что соединение FGF-18 в среду будут добавлять в течение одного дня приблизительно каждые 4 недели. Таким образом, указанный цикл будет включать один день культивирования в среде с добавкой и приблизительно 4 недели культивирования в среде без добавки (то есть без FGF-18). То же применимо к ежемесячному циклу: ежемесячный цикл означает, что соединение FGF-18 в среду будут добавлять в течение одного дня приблизительно каждый месяц. Таким образом, указанный цикл будет включать один день культивирования в среде с добавкой и приблизительно один месяц культивирования в среде без добавки (то есть без FGF-18). Цикл может быть повторен.

Подробное описание изобретения

Хотя процедуры восстановления хряща, такие как костно-хрящевые/хрящевые трансплантаты и имплантация культивируемого хряща (например, ACI), являются многообещающими, степень интеграции или качество получаемого хряща необходимо повысить. Таким образом, существует потребность в способе с улучшенной процедурой, который обеспечивает хорошую интеграцию и хорошее качество получаемого хряща (то есть главным образом гиалинового хряща). Неожиданно было обнаружено, что в случае применения FGF-18 в регенеративной медицине (например, в процедурах тканевой инженерии или в процедурах трансплантации), качество получаемого хряща повышается, и при этом улучшается интеграция клеток/эксплантатов в дефекты.

Цель настоящего изобретения состоит в предоставлении способа получения трансплантируемого хрящевого материала для тканевой инженерии или костно-хрящевого/хрящевого трансплантата, где указанный способ включает или состоит из этапов культивирования хондрогенных клеток, в монослойной культуре или в трехмерной культуре, или культивирования костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), в среде, включающей соединение FGF-18, в течение времени, достаточного для формирования трансплантируемого хрящевого материала. Указанный трансплантируемый хрящевой материал может применяться для лечения поражения хряща, такого как остеоартрит, повреждение хряща (включая дефект хряща) или костно-хрящевой дефект. Предпочтительно хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы) собирают или выделяют у млекопитающего перед этапом размножения или культивирования. Таким образом, в альтернативе, цель настоящего изобретения состоит в предоставлении способа получения трансплантируемого хрящевого материала для тканевой инженерии или костно-хрящевого/хрящевого трансплантата, где указанный способ включает или состоит из следующих этапов: (a) сбор или выделение у млекопитающего хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), и (b) культивирование хондрогенных клеток, в монослойной культуре или в трехмерной культуре, или культивирование костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), в среде, включающей соединение FGF-18, в течение времени, достаточного для формирования трансплантируемого хрящевого материала. Указанный трансплантируемый хрящевой материал может применяться для лечения поражения хряща, такого как остеоартрит, повреждение хряща или костно-хрящевой дефект. Необязательно соединение FGF-18 может быть дополнительно введено на участке трансплантации полученного хрящевого материала или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата до, во время или после трансплантации.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу восстановления хряща у млекопитающего в области суставного дефекта хряща, вызванного поражением хряща, где указанный способ включает или состоит из следующих этапов: (a) культивирование хондрогенных клеток, в монослойной культуре или в трехмерной культуре, или культивирование костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), в среде, включающей соединение FGF-18, и (b) введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, культивированных хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ы), полученного в этапе (a). Указанный способ восстановления хряща может применяться для лечения поражения хряща, такого как остеоартрит, повреждение хряща или костно-хрящевой дефект. Предпочтительно хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы) собирают или выделяют у млекопитающего перед этапом культивирования. Таким образом, в альтернативе, настоящее изобретение относится к способу восстановления хряща у млекопитающего в области суставного дефекта хряща, вызванного поражением хряща, где указанный способ включает или состоит из следующих этапов: (a) сбор или выделение у млекопитающего хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), (b) культивирование хондрогенных клеток, в монослойной культуре или в трехмерной культуре, или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), в среде, включающей соединение FGF-18, и (c) введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, культивированных хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), полученных в этапе (b). Указанный способ восстановления хряща может применяться для лечения поражения хряща, такого как остеоартрит, повреждение хряща или костно-хрящевой дефект. Необязательно соединение FGF-18 может быть дополнительно введено на участке, в котором вводили культуры хондрогенных клеток или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы), до, во время или после введения клеток/эксплантатов.

В альтернативном варианте осуществления в настоящей заявке раскрыт способ восстановления хряща у млекопитающего в области суставного дефекта хряща, вызванного поражением хряща, где указанный способ включает или состоит из следующих этапов: (a) культивирование хондрогенных клеток, в монослойной культуре или в трехмерной культуре, или культивирование костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), в среде, (b) введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, культивированных хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), полученных в этапе (a), и (c) введение соединения FGF-18 на участке, в котором вводили культивированные хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат. Этап (c) может быть выполнен до, во время или после применения клеток/эксплантатов. В другом альтернативном варианте настоящее изобретение относится к способу восстановления хряща у млекопитающего в области суставного дефекта хряща, вызванного поражением хряща, где указанный способ включает или состоит из следующих этапов: (a) сбор или выделение у млекопитающего хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), (b) культивирование хондрогенных клеток, в монослойной культуре или в трехмерной культуре, или культивирование костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), в среде, (c) введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, культивированных хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), полученных в этапе (b), и (d) инъекция соединения FGF-18 на участке, в котором вводили культивированные хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы). Этап (d) может быть выполнен до, во время или после введения клеток/эксплантатов.

В четвертом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению FGF-18 для применения в способе лечения дефекта в ткани хряща млекопитающего, где указанный дефект хряща вызван поражением хряща, где способ включает или состоит из следующих этапов: (a) культивирование хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов) в культуре in vitro или ex vivo, где указанное культивирование проводят в среде для культур клеток, содержащей соединение FGF-18, (b) необязательно повтор этапа (a) для получения материала трансплантата, включающего культивируемые хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы), и (c) трансплантацию материала трансплантата из этапа (b) в дефект у млекопитающего, нуждающегося в указанном лечении, где во время этапа (a) и (b) хондрогенные клетки могут культивировать в монослойной культуре, или в трехмерной культуре. Предпочтительно хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы) собирают или выделяют у млекопитающего перед этапом размножения или культивирования. Таким образом, в альтернативе, настоящее изобретение относится к соединению FGF-18 для применения в способе лечения дефекта в ткани хряща у млекопитающего, где указанный дефект хряща вызван поражением хряща, где способ включает или состоит из следующих этапов: (a) выделение хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов) у млекопитающего, (b) культивирование указанных хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов) в культуре in vitro или ex vivo, где указанное культивирование проводят в среде для культур клеток, содержащей соединение FGF-18, (c) необязательно повтор этапов (a) и (b) для получения материала трансплантата, включающего культивированные хондрогенные клетки или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), и (d) пересадка материала трансплантата из этапа (c) в дефект у млекопитающего, нуждающегося в указанном лечении, где во время этапов (b) и (c) хондрогенные клетки могут культивировать в монослойной культуре, или в трехмерной культуре. Необязательно соединение FGF-18 может быть дополнительно введено на участке трансплантации до, во время или после трансплантации.

В альтернативном варианте осуществления в настоящей заявке раскрыто соединение FGF-18 для применения в способе лечения дефекта в ткани хряща млекопитающего, где указанный дефект хряща вызван поражением хряща, где способ включает или состоит из следующих этапов: (a) культивирование хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов) в культуре in vitro или ex vivo, (b) необязательно повтор этапа (a) для получения материала трансплантата, включающего культивированные хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы), (c) пересадка материала трансплантата из этапа (b) в дефект у млекопитающего, нуждающегося в указанном лечении, где во время этапа (a) и (b) хондрогенные клетки могут культивировать в монослойной культуре или в трехмерной культуре, и (d) инъекция соединения FGF-18 на участке трансплантации. Этап (d) может быть выполнен до, во время или после трансплантации. В другом альтернативном варианте настоящее изобретение относится к соединению FGF-18 для применения в способе лечения дефекта в ткани хряща млекопитающего, где указанный дефект хряща вызван поражением хряща, где способ включает или состоит из следующих этапов: (a) выделение хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов) у млекопитающего, (b) культивирование указанных хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов) в культуре in vitro или ex vivo, где указанное культивирование проводят в среде для культур клеток, содержащей соединение FGF-18, (c) необязательно повтор этапов (a) и (b) для получения материала трансплантата, включающего культивированные хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы), (d) пересадка материала трансплантата из этапа (c) в дефект у млекопитающего, нуждающегося в указанном лечении, где во время этапов (b) и (c) хондрогенные клетки могут культивировать в монослойной культуре, или в трехмерной культуре, и (e) инъекция соединения FGF-18 на участке трансплантации. Этап (e) может быть выполнен до, во время или после трансплантации.

В альтернативе настоящее изобретение относится к способу лечения дефекта в ткани хряща млекопитающего, где указанный дефект хряща вызван поражением хряща, где способ включает или состоит из следующих этапов: (a) выделение хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата у млекопитающего, (b) культивирование указанных хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов) в культуре in vitro или ex vivo, где указанное культивирование проводят в среде для культур клеток, содержащей соединение FGF-18, (c) необязательно повтор этапов (a) и (b) для получения материала трансплантата, включающего культивированные хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы), и (d) пересадка материала трансплантата этапа (c) в дефект у млекопитающего, нуждающегося в указанном лечении, где во время этапов (b) и (c) хондрогенные клетки могут культивировать в монослойной культуре или в трехмерной культуре. Необязательно соединение FGF-18 может быть дополнительно введено на участке трансплантации до, во время или после трансплантации.

В альтернативном варианте осуществления в настоящей заявке раскрыт способ лечения дефекта в ткани хряща млекопитающего, где указанный дефект хряща вызван поражением хряща, где способ включает или состоит из следующих этапов: (a) выделение хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата у млекопитающего, (b) культивирование указанных хондрогенных клеток или костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов) в культуре in vitro или ex vivo, где указанное культивирование проводят в среде для культур клеток, (c) необязательно повтор этапов (a) и (b) для получения материала трансплантата, включающего культивированные хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой трансплантат, (d) пересадка материала трансплантата из этапа (c) в дефект у млекопитающего, нуждающегося в указанном лечении, где во время этапов (b) и (c) хондрогенные клетки могут культивировать в монослойной культуре или в трехмерной культуре, и (e) инъекция соединения FGF-18 на участке трансплантации. Этап (e) может быть выполнен до, во время или после трансплантации.

В пятом варианте осуществления в настоящей заявке предложена композиция, включающая культивированный костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы) млекопитающего или культивированные хондрогенные клетки млекопитающего, в среде, содержащей соединение FGF-18, для применения в регенеративной медицине, например, в тканевой инженерии или костно-хрящевом/хрящевом трансплантате, у млекопитающего, нуждающегося в этом. Предпочтительно млекопитающее, нуждающееся в указанной композиции, имеет поражение хряща. Предпочтительно хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы) собраны или выделены у млекопитающего перед этапом размножения или культивирования.

В другом варианте осуществления в настоящей заявке описано соединение FGF-18 для применения в лечении поражения хряща, такого как остеоартрит, повреждение хряща (включая дефект хряща) или костно-хрящевой дефект, где соединение FGF-18 следует вводить в среду культивирования, в рамках процедур восстановления хряща. В альтернативе, в настоящей заявке раскрыт способ лечения поражения хряща, такого как остеоартрит, повреждение хряща (включая дефект хряща) или костно-хрящевой дефект, где соединение FGF-18 следует вводить в среду культивирования, в рамках процедур восстановления хряща. В частности указанные процедуры восстановления хряща выбраны из группы, состоящей из тканевой инженерии хряща, имплантации аутологичных хондроцитов или костно-хрящевых трансплантатов.

Следует понимать, что трансплантируемый хрящевой материал, полученный согласно первому варианту осуществления, или восстановленный хрящ, полученный согласно второму варианту осуществления, предназначены для применения в лечении поражения хряща.

В рамках настоящего изобретения в целом, соединение FGF-18 предпочтительно выбрано из группы, состоящей из: a) полипептида, включающего или состоящего из зрелой формы человеческого FGF-18, включающего остатки 28-207 из SEQ ID NO:1, b) полипептида, включающего или состоящего из остатков 28-196 в SEQ ID NO:1, или c) полипептида, включающего или состоящего из SEQ ID NO:2. В частности, это соединение выбрано из человеческого зрелого FGF-18 дикого типа или trFGF-18.

В настоящей заявке описано соединение FGF-18, которое добавляют в среду культивирования (то есть добавление в среду) в концентрации от 1 нанограмма (нг) до 50 микрограммов (μг или мкг), предпочтительно от 5 нг до 5 мкг, или предпочтительно от 5 нг до 1 мкг, или более предпочтительно от 10 нг до 500 мкг, или еще более предпочтительно от 10 нг до 100 нг на миллилитр (мл) среды культивирования. В предпочтительном варианте осуществления соединение FGF-18 добавляют в среду культивирования в концентрации приблизительно 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 или 1000 нг на мл среды культивирования. Предпочтительные концентрации включают 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 или 200 нг на мл среды культивирования.

В рамках настоящего изобретения в целом, FGF-18 добавляют в среду культивирования, в которой культивируют хондрогенные клетки или костно-хрящевой/хрящевой эксплантат(ы). Предпочтительно указанное соединение FGF-18 периодически добавляют в среду культивирования в течение приблизительно одного дня, 2 дней или 3 дней в неделю (приблизительно одна неделя), где указанное добавление в один, 2 или 3 дня повторяют каждую неделю в течение по меньшей мере 2 недель культивирования, по меньшей мере 3 недель культивирования или по меньшей мере 4 недель культивирования. Предпочтительно, указанное соединение FGF-18 периодически добавляют в среду культивирования в течение одного, 2 или 3 дней в неделю, где указанное добавление в один, 2 или 3 дня повторяют каждую неделю в течение 2 недель культивирования, 3 недель культивирования или 4 недель культивирования. Один день предпочтительно следует понимать как приблизительно 24 часа (то есть 24 часа +/- 4 часа), два дня предпочтительно следует понимать как приблизительно 48 часов (то есть 48 часов +/- 4 часа) и три дня предпочтительно следует понимать как приблизительно 72 часа (то есть 72 часа +/- 4 часа). После однодневного культивирования в среде с добавкой, культивирование затем продолжают еще в течение 6 дней без соединения FGF-18, после 2-дневного культивирования в среде с добавкой, культивирование затем продолжают еще в течение 5 дней без соединения FGF-18, и после 3-дневного культивирования в среде с добавкой, культивирование затем продолжают еще в течение 4 дней без соединения FGF-18. Указанная схема соответствует еженедельному циклу. Например, в случае 1-дневного культивирования соединение FGF-18 следует добавлять в среду культивирования во вторник, его удаляют из указанной среды культивирования через один день после указанного добавления, то есть в среду. Затем следующее добавление производят во вторник после 1-ого добавления FGF-18. Добавление в культуру могут повторять каждую неделю (например, каждый вторник) согласно такой же схеме (то есть через одну неделю после предыдущего добавления). Если это более удобно, добавление соединения FGF-18 может быть выполнено через приблизительно одну неделю после предыдущего добавления, то есть через одну неделю (или 7 дней) +/- 1 или 2 дня. Например, добавление может быть сделано в понедельник или среду, если предыдущее добавление было выполнено в предыдущий вторник.

В альтернативе соединение FGF-18 могут периодически добавлять в среду культивирования в течение одного, 2 или 3 дней в месяц, где указанное добавление в один, 2 или 3 дня повторяют каждый месяц в течение по меньшей мере 2 месяцев культивирования, по меньшей мере 3 месяцев культивирования или по меньшей мере 4 месяцев культивирования. В случае трехмерной культуры хондрогенных клеток соединение FGF-18 предпочтительно периодически добавляют в среду культивирования в течение одного, двух или трех дней в месяц, где указанное добавление в один, 2 или 3 дня повторяют каждый месяц в течение 2 месяцев культивирования, 3 месяцев культивирования или 4 месяцев культивирования. Один день предпочтительно следует понимать как приблизительно 24 часа (то есть 24 часа +/- 4 часа). После однодневного, 2- или 3-дневного культивирования в среде с добавкой, культивирование затем продолжают в течение 1 месяца без соединения FGF-18. Указанная схема соответствует ежемесячному циклу. Например, если соединение FGF-18 добавляют в течение однодневного добавления в среду культивирования 1-ого августа, его удаляют из указанной среды культивирования через один день после указанного добавления, то есть 2-ого августа. Следующее добавление будет сделано 1-ого сентября. Добавление в культуру можно повторять каждый месяц, согласно такой же схеме (то есть через один месяц после предыдущего добавления). Если это более удобно, добавление соединения FGF-18 может быть выполнено через приблизительно один месяц после предыдущего добавления, то есть через один месяц +/- 1, 2, 3 или 4 дня. Например, добавление может быть сделано 31 августа или 3-его сентября, если предыдущее добавление было выполнено 1-ого августа.

Как определено выше, "4 недели" и "ежемесячно" или "один месяц" являются взаимозаменяемыми. Таким образом, согласно рассматриваемому изобретению соединение FGF-18 могут периодически добавлять в культуру или среду в течение одного, 2 или 3 дней приблизительно каждые 4 недели, где указанное добавление в один, 2 или 3 дня повторяют каждые 4 недели по меньшей мере в течение 2 циклов добавления, по меньшей мере 3 циклов добавления или по меньшей мере 4 циклов добавления. Предпочтительно соединение FGF-18 периодически добавляют в культуру или среду в течение одного, 2 или 3 дней в месяц, где указанное добавление в один, 2 или 3 дня повторяют каждый месяц в течение 2 месяцев культивирования, 3 месяцев культивирования или 4 месяцев культивирования. Один день предпочтительно следует понимать как приблизительно 24 часа (то есть 24 часа +/- 4 часа). После однодневного, 2- или 3-дневного культивирования в среде с добавкой, культивирование затем продолжают в течение 4 недель без соединения FGF-18. Указанная схема соответствует 4-недельному циклу. Например, если соединение FGF-18 добавляют в течение однодневного добавления в среду культивирования во вторник, его удаляют из указанной среды культивирования через один день после указанного добавления, то есть в среду. Следующее добавление будет сделано во вторник, через 4 недели после 1-ого добавления. Добавление в культуру может быть повторено каждые 4 недели, согласно такой же схеме (то есть через один месяц после предыдущего добавления). Если это более удобно, добавление соединения FGF-18 может быть выполнено приблизительно через 4 недели после предыдущего добавления, то есть через 4 недели +/- 1, 2, 3 или 4 дня. Например, добавление может быть сделано в понедельник 28 октября или в четверг 31 октября, если предыдущее добавление было выполнено во вторник 1-ого октября.

В отношении хондроцитов или хондрогенных клеток, культивируемых в монослое, хотя это и не является ограничивающим, соединение FGF-18 предпочтительно добавляют постоянно. Наоборот, в случае, когда хондрогенные клетки или хондроциты культивируют в трехмерной культуре, или в случае костно-хрящевого/хрящевого эксплантата(ов), хотя это и не является ограничивающим, соединение FGF-18 предпочтительно добавляют периодически.

Соединения FGF-18, такие как trFGF-18, и композиции, содержащие соединения FGF-18 ("композиции FGF-18"), способы и применения, описанные в настоящей заявке, могут применяться для лечения поражений хряща. В особенности они могут применяться для лечения дефектов суставных хрящей в синовиальных сочленениях, которые, например, вызваны возрастной поверхностной фибрилляцией, дегенерации хряща, вызванной остеоартритом, и хрящевых или костно-хрящевых дефектов, вызванных повреждением или болезнью. Они могут также применяться для лечения заболевания суставов, вызванных рассекающим остеохондритом и дегенеративными заболеваниями суставов. В области реконструктивной и пластической хирургии соединения FGF-18, композиции и способы согласно настоящему изобретению могут применяться для выращивания и пересадки аутогенной или аллогенной хрящевой ткани для реконструкции обширных дефектов ткани. Композиции FGF-18 могут применяться для восстановления повреждений хряща в сочетании с лаважем сустава, стимуляцией костного мозга, абразивной артропластикой, субхондральным сверлением или микрофрактурированием субхондральной кости.

В предпочтительном варианте осуществления поражение хряща, которое подлежит лечению согласно изобретению, является остеоартритом, таким как остеоартрит коленного сустава или остеоартрит тазобедренного сустава. Остеоартрит, который подлежит лечению, может быть, например, и без ограничения, первичным остеоартритом или вторичным остеоартритом, а также остеоартритом, который классифицирован от стадии 1 до стадии 4 или от степени 1 до степени 6 согласно системе классификации OARSI.

В рамках изобретения в целом, при добавлении соединения FGF-18 на участке трансплантации. Указанное добавление может быть выполнено до, во время или после трансплантации. При его выполнении до или после трансплантации, его предпочтительно выполняют за несколько часов до или через несколько часов после трансплантации (например, но без ограничения, за 1, 2, 3 или 4 часа до или после). Указанная инъекция или инъекции могут быть выполнены в течение нескольких дней до или после трансплантации (например, но без ограничения, за 1, 2, 3 или 4 дня до или после). Пациенту не приносит вреда, если такое добавление не выполняют во время трансплантации. Фактически, инъекция соединения FGF-18 не требует хирургического вмешательства или любой другой инвазивной процедуры.

В другом предпочтительном варианте осуществления поражение хряща, которое подлежит лечению согласно изобретению, является повреждением хряща, включая микрофрактурирование или дефект хряща, или костно-хрящевой дефект.

В рамках настоящего изобретения в целом, эксплантат предпочтительно является эксплантатом хряща, а хондрогенные клетки предпочтительно являются хондроцитами, хондроцитами или мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из зрелых тканей. В зависимости от потребностей хондрогенные клетки или костно-хрящевые/хрящевые эксплантаты собирают у млекопитающего, подвергаемого лечению (то есть нуждающегося в лечении), или у другого млекопитающего (предпочтительно того же вида). Указанным млекопитающим предпочтительно является человек, но в альтернативе им могут быть также, без какого-либо ограничения, лошади, верблюды или собаки, или более мелкие млекопитающие, такие как кошки, кролики, крысы или мыши.

Описание фигур:

Фигура 1: Подготовка модели репарации дефекта хряща: (A) 8-мм хрящевой диск, (b) создание центрального 4-мм дефекта, (C) вставка хряща в дефект, и (D) длительное культивирование восстановленной конструкции. НД означает наружный диаметр, а ВД означает внутренний диаметр.

Фигура 2: (A-C) Поперечные разрезы трехмерной микро-КТ реконструкции с различными обработками. (D) Прочность интеграции восстановленного дефекта демонстрирует увеличение прочности в порядке от контроля до обработки 1+30 и до обработки 1+6. (E) Экспериментальная установка с выдавливающим стендом. Планки погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего значения.

Фигура 3: микро-КТ сканы восстанавливаемых конструкций хрящ-хрящ. Слева: одиночный микро-КТ скан среза, представляющий образец. В центре: трехмерная реконструкция. Справа: поперечный разрез реконструкции. Микро-КТ сканы демонстрируют увеличение интеграции в порядке от контроля до обработки 1+30 и до обработки 1+6.

Фигура 4: Обработка CTA соединением rhFGF18

Фигура 5: Содержание клеток/CTA, оцениваемое по содержанию ДНК/CTA через 4 недели обработки без rhFGF18 (CTR), при постоянном присутствии rhFGF18 (perm), с rhFGF18 только в первую неделю (1w) или 1 день в неделю (1d/w). rhFGF18 использовали в концентрации 10 или 100 нг/мл. N=4. */*** среднее значимо отличалось от контроля при p<0,05 и 0,001, соответственно

Фигура 6: Содержание GAG и HPro/CTA через 4 недели обработки без rhFGF18 (CTR), при постоянном присутствии rhFGF18 (perm), с rhFGF18 только в первую неделю (1w) или 1 день в неделю (1d/w). rhFGF18 использовали в концентрации 10 или 100 нг/мл. N=4. */**/*** среднее значимо отличалось от контроля при p<0,05, 0,01 и 0,001 соответственно

Фигура 7: Экспрессию коллагена I типа и Sox9, а также отношение коллагена II/I оценивали в CTA через 4 недели культивирования без rhFGF18 (CTR), при постоянном присутствии rhFGF18 (perm), с rhFGF18 только в первую неделю (1w) или 1 день в неделю (1d/w). rhFGF18 использовали в концентрации 10 или 100 нг/мл. N=4. */**/*** средние значимо отличались от контроля при p<0,05, 0,01 и 0,001 соответственно

Фигура 8: Бычьи первичные хондроциты выращивали одну или две недели в монослое в отсутствии (CTR) или при постоянном присутствии rhFGF18 100 нг/мл. Определяли концентрацию клеток N=6. Экспрессию коллагена I типа и Sox9 N=4 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени.

Фигура 9: Содержание клеток/CTA оценивали по содержанию ДНК/CTA через 4 недели обработки без rhFGF18 (CTR), при постоянном присутствии rhFGF18 (perm), с rhFGF18 1 день в неделю (1d/w). * средние значимо отличались от контроля при p<0,05.

Фигура 10: Содержание GAG через 4 недели обработки без rhFGF18 (CTR), при постоянном присутствии rhFGF18 (perm), с rhFGF18 1 день в неделю (1d/w). * средние значимо отличались от контроля при p<0,05.

Фигура 11: Экспрессию коллагена I типа и Sox9, а также отношение коллагена II/I оценивали в CTA через 4 недели культивирования без rhFGF18 (CTR), при постоянном присутствии rhFGF18 (perm), с rhFGF18 1 день в неделю (1d/w). * средние значимо отличались от контроля при p<0,05.

Описание последовательностей:

SEQ ID NO.1: Аминокислотная последовательность нативного человеческого FGF-18.

SEQ ID NO.2: Аминокислотная последовательность рекомбинантного усеченного FGF-18 (trFGF-18).

Примеры

Материал

Рекомбинантный усеченный FGF-18 (rhrFGF18) в настоящих примерах был получен при экспрессии в E.coli согласно методике, описанной в заявке WO2006/063362. В следующих примерах rhFGF18, FGF-18 и сприфермин используются попеременно.

Пример 1

Методы:

Свежий гиалиновый хрящ забирали из трохлеарной выемки из коленей телят (3-6 месяцев). Цилиндрические эксплантаты диаметром 8 мм (Фигура 1A) извлекали с помощью трубчатого ножа и культивировали в течение ночи в полной среде (DMEM 4,5 г/л D-глюкозы и L-глутамина, 10% FBS, 1% PSF, 1% фунгизона, 1% витаминов MEM, 25 мМ HEPES и 50 мкг/мл витамина С). Образцы срезали с кости и формировали дефекты (диаметром 4 мм), получив конструкцию репарации в форме цилиндра и кольца (Фигура 1B). Внутренний цилиндр и внешнее кольцо культивировали отдельно в течение 24 часов перед тем, как заполнить дефект исходным цилиндром. Затем образцы культивировали в полной среде или обрабатывали сприфермином (rhFGF18, 100 нг/мл). Обработки состояли из одной дозы rhFGF18 в течение 24 часов, которую применяли один раз в неделю (и повторяли еженедельно) (1+6), или одной 24-часовой обработки с последующим культивированием в течение 1 месяца в полной среде (1+30 дней). Образцы собирали через 4 недели культивирования. Механическое испытание с выдавливанием (n=4-6) проводили (Instron 5848, Instron, Norwood, MA) с использованием оригинальной испытательной установки (Фигура 2E, [3]). Прочность интеграции вычисляли путем деления пикового усилия на площадь интеграции. Для трехмерной визуализации образцы (n=6) пропитывали в модифицированном растворе Люголя (2,5% I₂ и 5% KI в dH₂O) в течение 24 часов [4] и сканировали с помощью микро-КТ на энергетическом уровне 55 кВ и интенсивности 145 мкА с размером вокселя 6 мкм и 10,5 мкм (микро-КТ 35 и vivaCT 40, SCANCO Medical, Wayne, PA). Сканы анализировали и реконструировали при использовании программ производителей, и поперечные разрезы использовали для оценки интеграции дефекта. Дополнительные образцы (n=3) фиксировали в течение ночи в 4% ПФА и подвергали гистологическому исследованию на предмет отложения клеток и матрикса на контактной поверхности.

Результаты:

Прочность интеграции (Фигура 2D) контрольных образцов была самой низкой (2,5±1,4 кПа), с постоянно растущими показателями при обработке 1+30 (ежемесячный цикл) (5,0±2,4 кПа) и обработке 1+6 (еженедельный цикл) (10,2±3,7 кПа). Хотя результаты очевидны при сравнении контрольных групп и обработанных групп, при количестве повторов, возможном в данном исследовании, статистическая значимость не была достигнута. Микро-КТ анализ контрольных конструкций (Фигура 3, сверху слева) показал различимый темный круг, указывающий на разделение между внешним кольцом и внутренним цилиндром, и, таким образом, на низкую интеграцию. Обработка 1+30 (Фигура 3, посередине слева) показала менее различимый круг, что предполагает меньший зазор и большую интеграцию, а обработка 1+6 (Фигура 3, снизу слева) показала очень однородный сигнал микро-КТ по контактной поверхности, что указывает на наибольшую степень интеграции. Подтверждение этой увеличенной интеграции было очевидным как на вертикальных, так и на поперечных разрезах всех образцов.

Для успешной репарации хряща требуется, чтобы восстанавливаемый материал (сконструированный или нативный) хорошо интегрировался в окружающий хрящ, чтобы гарантировать перенос постоянной нагрузки (и отсутствие концентрации напряжений) через контактную поверхность. В данном исследовании исследовали потенциальную способность Сприфермина усиливать интеграцию хряща в хорошо исследованной ex vivo (эксплантатной) модели репарации хряща. Сприфермин обладает установленным пропролиферативным действием в отношении хондроцитов (Elthworth et al., 2002), причем временное (24-часовое) воздействие этого биологического агента вызывает наиболее заметный результат. Настоящие результаты четко демонстрируют, что Сприфермин улучшает прочность интеграции и отложение матрикса на контактной поверхности (что подтверждено с помощью контрастной микро-КТ, показавшей более однородное затухание при увеличении GAG-содержащих протеогликанов). В данном исследовании одно 24-часовое введение еженедельно в течение 4 недель приводило в целом к лучшему результату, чем одна 24-часовая обработка в течение одного месяца. Эта последняя схема также может быть полезной, хотя и не настолько хорошей, как схема с еженедельным циклом, так как она обеспечивает неожиданное улучшение по сравнению с контрольной конструкцией (то есть в отсутствии обработки сприфермином). Впервые в этом исследовании продемонстрировали, что биопрепарат (и в особенности сприфермин) улучшал интеграцию поверхностей хряща в клинически значимой модели репарации.

Выводы:

В этом исследовании продемонстрировано, что Сприфермин способен улучшать интеграцию поверхностей хряща в модели репарации хряща. Такие результаты предполагают его потенциальную применимость в хирургических процедурах, таких как OATS, и в методах тканевой инженерии, где хрящеподобные биоматериалы потребуются для успешной интеграции в нативный хрящ, чтобы добиться клинического успеха.

Пример 2

Метод:

Первичные остеоартритные хондроциты выделяли из хряща пациентов, перенесших полную замену коленного сустава. Клетки выращивали сначала в течение нескольких дней в монослойной культуре, а затем в течение одной недели в трехмерной бескаркасной культуре, перед тем как начать обработку. Последняя заключалась в инкубировании с rhFGF18 [100 нг/мл] постоянно или один раз в течение периода общей продолжительностью четыре недели. Результаты сравнивали с контрольной культурой без сприфермина. Биохимические анализы, количественную ПЦР (кПЦР) и гистологию использовали для исследования трехмерных конструкций.

Результаты (данные не показаны):

Чтобы гарантировать сохранение фенотипа, трехмерную бескаркасную культуру использовали для исследования действия сприфермина на чОА хондроциты. В этом исследовании было обнаружено, что rhFGF18 [1 день/неделя] оказывал благоприятное воздействие на содержание клеток и значительно увеличивал размер и содержание матрикса (содержание GAG и HPro) трехмерных конструкций. Также установили, что rhFGF18 уменьшал экспрессию коллагена I по сравнению с необработанными клетками.

Выводы:

Как наблюдали в предыдущих исследованиях на бычьих и свиных хондроцитах, сприфермин обладал анаболической активностью в чОА хондроцитах. Такие результаты подразумевают его потенциальную применимость в методах тканевой инженерии, где хрящеподобные биоматериалы потребуются для успешной интеграции в нативный хрящ, чтобы добиться клинического успеха.

Пример 3

Методы:

Свиные хондроциты выделяли из хряща головки бедренной кости из бедра свиньи. После диссекции суставов хрящ собирали и обрабатывали 45 минут 0,25% коллагеназой. Отделившиеся клетки удаляли и оставляли хрящ на ночь для дополнительного расщепления 0,1% коллагеназой с целью выделения хондроцитов. Свиные хондроциты культивировали в суспензии как CTA (аналоги хрящевой ткани) в течение первой недели без какой-либо обработки, с последующим применением одной из следующих обработок: 1) четыре недели культивирования при постоянном присутствии rhFGF18 в концентрации 10 или 100 нг/мл, 2) одна неделя культивирования в присутствии rhFGF18 в концентрации 10 или 100 нг/мл и затем три недели без rhFGF18, 3) три недели культивирования с rhFGF18 в концентрации 10 или 100 нг/мл, добавляемым 1 день в неделю (то есть 24 ч обработки, затем 6 дней без rhFGF18), а затем одну неделю без rhFGF18, или 4) четыре недели в отсутствии rhFGF18, в качестве контроля (Фигура 4). В конце периода культивирования CTA собирали и подвергали анализу на содержание GAG, гидроксипролина и клеток. Исследовали экспрессию генов коллагена I, II и Sox9, а также выполняли гистологию с сафранином O на коллаген I и II типа.

Результаты - Влияние постоянного или периодического воздействия rhFGF18 на рост клеток в CTA

Для каждого условия культивирования CTA подвергали лизису и оценивали содержание ДНК для вычисления количества клеток/CTA (Фигура 5). В контрольной культуре (без rhFGF18) не наблюдали пролиферации, поскольку количество клеток (1,2 миллиона) совпадало с плотностью при инокуляции (1 миллион клеток/CTA). Однако, как ожидали, постоянное присутствие rhFGF18 увеличивало пролиферацию хондроцитов (до 2,2 и 2,49 миллиона клеток/CTA с rhFGF18 при 10 и 100 нг/мл, соответственно). В случае, когда rhFGF18 добавляли только в одну неделю, а хондроциты затем культивировали 3 недели без rhFGF18 (1w), увеличения пролиферации по сравнению с контролем не наблюдали. Напротив, когда rhFGF18 добавляли один раз в неделю (1d/w), rhFGF18 стимулировал пролиферацию по сравнению с контролем, но также и по сравнению с постоянным воздействием. Содержание клеток/CTA достигло 4 миллионов клеток/CTA при обработке rhFGF18 100 нг/мл, один раз/неделя, по сравнению с 1,2 миллиона в отсутствии rhFGF18 или 2,49 миллиона при постоянном присутствии rhFGF18 100 нг/мл.

Результаты - Влияние постоянного или периодического воздействия rhFGF18 на продукцию матрикса в CTA

Для каждого условия культивирования CTA подвергали лизису протеиназой K и оценивали содержание GAG и гидроксипролина (Фигура 6). GAG отражает содержание протеогликанов, тогда как гидроксипролин отражает содержание коллагена в CTA. Как наблюдали ранее, постоянное присутствие rhFGF18 уменьшало содержание GAG/CTA (в 2,6 раза меньше GAG по сравнению с контролем), но также и содержание гидроксипролина/CTA (в 2,1 раза меньше гидроксипролина по сравнению с контролем). Напротив, когда rhFGF18 добавляли периодически (1/неделя или 1 день/неделя), содержание GAG и гидроксипролина увеличивалось. Например, когда rhFGF18 100 нг/мл добавляли один раз в неделю, содержание GAG увеличивалось в 2,67 раза, а содержание гидроксипролина - в 2,13 раза по сравнению с контролем.

Результаты - Влияние постоянного или периодического воздействия rhFGF18 на фенотип хондроцитов в CTA

Для каждого условия культивирования РНК выделяли из CTA и анализировали экспрессию коллагена I типа, II типа, типа X и Sox9 с помощью количественной ПЦР (Фигура 7). Высокая экспрессия Sox9 и коллагена II типа является маркером фенотипа хондроцитов, тогда как коллаген I типа является маркером дедифференцировки, а коллаген типа X - гипертрофии хондроцитов. Также вычисляли отношение коллагена II/I. Это отношение обычно используется для иллюстрации сохранения фенотипа (более высокое отношение) или потери фенотипа (более низкое отношение) хондроцитов в культуре. Во всех условиях с rhFGF18, при постоянном или периодическом воздействии, в концентрации 10 или 100 нг/мл, экспрессия коллагена I типа была уменьшена. Это уменьшение было наиболее сильным, когда rhFGF18 добавляли один раз в неделю в концентрации 100 нг/мл. Например, экспрессия коллагена I типа снизилась на 4 по сравнению с контролем с rhFGF18, 100 нг/мл, постоянно, и на 123 с rhFGF18, 100 нг/мл, добавляемым один раз в неделю. Было обнаружено, что коллаген II типа снижался при постоянном присутствии rhFGF18, но в основном оставался без изменений в присутствии rhFGF18, добавляемого в одну неделю (1w) или один раз в неделю (1d/w). Никаких важных изменений в экспрессии Sox9 не наблюдали. Последний был значительно повышен (×2,2) только с rhFGF18 10 нг/мл, добавляемым в одну неделю (1w). Наконец, постоянное присутствие rhFGF18, как обнаружили, не оказывало никакого влияния на отношение коллагена II/I, однако при добавлении rhFGF18 один раз в неделю это отношение увеличивалось в 19 и 138 раз по сравнению с контролем с rhFGF18 10 и 100 нг/мл, соответственно. Коллаген типа X также оценивали как маркер гипертрофии хондроцитов и установили, что в таких условиях культивирования rhFGF18 на него не влиял.

Результаты - Влияние постоянного или периодического воздействия rhFGF18 на морфологию и содержание коллагена II и I в CTA (данные не показаны)

Гистологический анализ CTA после 4 недель обработки при различном воздействии rhFGF18 показал, что при постоянном присутствии rhFGF18, CTA были более тонкими, а окрашивание сафранином O - менее интенсивным по сравнению с другими условиями. Кроме того, при постоянном присутствии rhFGF18 можно наблюдать зону пролиферации с более высокой плотностью клеток и отсутствием внеклеточного матрикса по периферии конструкций. С другой стороны, также можно наблюдать, что периодическое воздействие rhFGF18 приводило к конструкциям с большей толщиной по сравнению с контролем. При всех условиях коллаген I типа не обнаруживали (не показано), тогда как все CTA были интенсивно окрашены на коллаген II типа.

Выводы:

Постоянное воздействие rhFGF18 стимулировало пролиферацию хондроцитов, но уменьшало содержание матрикса в CTA (меньше GAG и гидроксипролина). Аналогично была снижена экспрессия коллаген I и II типа по сравнению с контролем. Никакого значимого влияния постоянного воздействия rhFGF18 при 10 или 100 нг/мл на Sox9 после 4 недель обработки не наблюдали. Гистологические исследования показали, что CTA были меньше и демонстрировали зону пролиферации с отсутствием ECM по периферии CTA. Все эти результаты в совокупности указывают, что при постоянном присутствии rhFGF18 пролиферация преобладает над продукцией матрикса.

В случае, когда CTA культивировали одну неделю с rhFGF18, 10 или 100 нг/мл, а затем 3 недели без rhFGF18, в отличие от постоянного воздействия, стимуляцию пролиферации не наблюдали. Однако содержание GAG и гидроксипролина, как было обнаружено, было более высоким, чем в контроле. Экспрессия коллагена I была снижена, тогда как экспрессия коллагена II типа не изменилась или даже немного увеличилась (для rhFGF18 10 нг/мл) по сравнению с контролем. Как следствие, отношение коллагена II/I увеличилось, что указывает на улучшение сохранения фенотипа. Аналогичным образом, Sox9 также несколько увеличился по сравнению с контролем (значимость только для rhFGF18 10 нг/мл). Гистология показала, что CTA состояли из сафранина O и коллагена II типа положительного матрикса, аналогично контрольным CTA. По сравнению с контролем эти CTA также обладали большей толщиной, в соответствии с более высоким содержанием GAG и гидроксипролина.

Наилучшие результаты относительно пролиферации и содержания матрикса были получены при добавлении 100 нг/мл rhFGF18 1 день в неделю. В случае данного условия уровень коллагена I типа был также самым низким, а отношение коллагена I/II - самым высоким. Впрочем, экспрессия коллагена II типа и Sox 9 оставалась неизменной по сравнению с контролем. CTA были положительными по сафранину O и коллагену II типа. Как и в случае обработки в течение одной недели, по сравнению с контролем, эти CTA также обладали большей толщиной, что также соответствовало их более высокому содержанию GAG и гидроксипролина.

Таким образом, периодическое воздействие потенцирует эффекты rhFGF18 и обеспечивает увеличенную пролиферацию, продукцию ECM и сохранение фенотипа хондроцитов в культуре в порядке 1 день/неделя>1 неделя>контроль>постоянное воздействие. Эти результаты говорят в пользу циклического введения rhFGF18 для лечения ОА.

Пример 4

Методы:

Бычьи хондроциты получали, как описано в примерах 2 и 3. Их выращивали 1 или 2 недели с rhFGF18, постоянно присутствующим в концентрации 100 нг/мл (FGF18), или, в качестве контроля, в отсутствии FGF18 (CTR). В конце культивирования клетки собирали и подсчитывали или лизировали для выделения РНК и анализа экспрессии генов. Экспрессию Sox9, коллагена I и II оценивали с помощью количественной ПЦР.

Результаты:

После двух недель культивирования с постоянным присутствием FGF18, концентрация клеток была более высокой, чем в контрольной группе. Экспрессия коллагена I типа была сильно репрессирована в присутствие rhFGF18, тогда как экспрессия коллагена II типа и Sox9 была повышена (Фигура 8).

Выводы:

При культивировании хондроцитов в монослое постоянное воздействие 100 нг/мл rhFGF18 обеспечивало увеличение пролиферации клеток с обеспечением сохранения фенотипа (экспрессия коллагена II типа и Sox9 повышена, а экспрессия коллагена I типа понижена),

Пример 5

Методы:

Использовали хрящ двух больных ОА, которые перенесли полную замену коленного сустава. Хондроциты выделяли, как описано в Примере 3, и сначала культивировали 3-4 дня при высокой плотности в монослое. Затем хондроциты собирали и инокулировали при плотности 1×10⁶ клеток/200 мкл в 96-луночный планшет и оставляли для агрегации на одну неделю без обработки для формирования CTA. Затем их культивировали еще 4 недели в отсутствии или присутствии 100 нг/мл rhFGF18 согласно следующей схеме обработки: 1) четыре недели культивирования в отсутствии rhFGF18 (контроль) 2) четыре недели культивирования при постоянном присутствии rhFGF18 (perm) и 3) четыре недели культивирования с rhFGF18, добавляемым 1 день в неделю (то есть 24 ч воздействие, затем 6 дней без rhFGF18) (1d/w) (см. Фигуру 4). В конце периода культивирования CTA собирали и анализировали на содержание GAG и клеток. В CTA, полученных от пациента 2, оценивали экспрессию генов коллагена I типа, II типа и Sox9, а также выполняли гистологию с сафранином O на коллаген I и II типа.

Результаты - Пролиферация клеток:

В концентрации 100 нг/мл rhFGF18 увеличивал пролиферацию человеческих остеоартритных хондроцитов в трехмерной культуре (см. Фигуру 9). В случае хондроцитов, полученных у пациента 1, в контроле количество клеток/CTA было ниже, чем исходное количество клеток (плотность инокуляции составляла 1 миллион клеток/CTA), что указывало на гибель многих клеток. Однако при постоянном присутствии rhFGF18 или 1 день/неделя можно было обнаружить 1,5 миллиона клеток/CTA, что дает основание предположить, что эти клетки не погибли, а пролиферировали. В случае хондроцитов, полученных у пациента 2, можно было наблюдать немного увеличенное число клеток (с 1 до 1,3 миллиона/CTA) в необработанном CTA. Оно еще увеличилось при постоянном присутствии rhFGF18 (с 1 до 1,9 миллионов клеток/CTA)

Результаты - Продукция матрикса:

В концентрации 100 нг/мл rhFGF18 увеличивал продукцию GAG в человеческих остеоартритных хондроцитах в трехмерной культуре (см. Фигура 10). У пациента 1 при постоянном присутствии rhFGF18 и 1 день/неделя и у пациента 2 при постоянном присутствии FGF18 значительно больше GAG присутствовало в CTA.

Результаты - Экспрессия генов:

Фенотип хондроцитов характеризуется низкой экспрессией или отсутствием экспрессии коллагена I типа и увеличенной экспрессией Sox9 и коллагена II. Такой профиль экспрессии изменен в остеоартритных хондроцитах (см. Фигуру 11). Действительно, в необработанных CTA экспрессия коллагена I типа была более высокой, чем экспрессия коллагена II типа (относительная интенсивность 0,67 и 0,04, соответственно). rhFGF18 был способен снижать экспрессию коллагена I с повышением экспрессии коллагена II. В результате отношение коллагена II/I увеличивалось в 11-13 раз в присутствии rhFGF18. Кроме того, rhFGF18 повышал экспрессию Sox9, маркера фенотипа хондроцитов.

Результаты - Гистология (данные не показаны):

В сравнении с контролем CTA, которые культивировали с rhFGF18 1 день/неделя или постоянно, показали более интенсивное окрашивание сафранином O, что указывало на то, что они содержали больше GAG. Это согласуется с результатами, представленными на Фигуре 10. Окрашивание коллагена I было уменьшено в rhFGF18-обработанных клетках, что также хорошо согласуется с результатами экспрессии генов на Фигуре 11. В контрольной культуре не наблюдали окрашивания коллагена II, что указывает на то, что эти человеческие остеоартритные (чОА) хондроциты не были способны к продукции хрящеподобного матрикса. Однако обработка rhFGF18 1 день/неделя и постоянно обеспечивала восстановление способности чОА хондроцитов продуцировать коллаген II.

Выводы:

Результаты, полученные с хондроцитами, выделенными из человеческого остеоартритного хряща, показали, что rhFGF18 был способен вызывать рост клеток, увеличивать продукцию гиалиноподобного хрящевого матрикса и способствовать сохранению фенотипа хондроцитов. В данном эксперименте обработка rhFGF18 постоянно и один день/неделя показала аналогичную эффективность в отношении нескольких параметров. Однако в отношении продукции матрикса обработка rhFGF18 один день/неделя оказалась немного лучшей (увеличение накопления GAG у Пациента 1 и увеличение экспрессии коллагена II у Пациента 2).

Список использованных источников

1. Magill et al., 2011, J. orthopaedic Surg. 19(1):93-98.

2. Zhang et al., 2013, Expert Opin. Biol. Ther. 13(4):527-540.

3. Tang et al., 2012, Expert Opin. Biol. Ther., 12(10):1361-1382.

4. Ellsworth et al., 2002, Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320.

5. Shimoaka et al., 2002, JBC 277(9):7493-7500.

6. WO2008023063

7. WO2004032849

8. WO9816644

9. WO2006063362

10. Custers et al., 2007, Osteoarthritis and Cartilage, 15:1241-1248.

11. Lotz, 2010, Arthritis research therapy, 12:211.

12. The Merck manual, 17th edition, 1999.

13. Getgood et al., 2010, P116, ICRS Meeting 2010, Barcelona.

14. ICRS publication: http://www.cartilage.org/ _files/contentmanagement/ICRS_evaluation.pdf, page 13

15. Bian et al., 2010, Am. J. Sports. Med, 38(1):78-85.

16. Gennero et al., 2013, Cell Biochem Funct 31(3) 214-227.

17. Mauck et al., 2006, Osteoarthritis and Cartilage, 14(2):179-189.

18. Bian et al., 2008 J.Biomech., 41(6):1153-1159.

Группа изобретений относится к медицине. Описаны способы, связанные с регенеративной медициной, для лечения поражений хряща, остеоартрита и повреждения хряща, в частности. Описано соединение FGF-18 для применения в процедурах тканевой инженерии и трансплантации, таких как трансплантация костно-хрящевой или хрящевой ткани, или имплантация аутологичных хондроцитов (ACI). Соединение FGF-18 оказывает благотворное влияние на трехмерные культуры. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 11 ил., 5 пр.

1. Способ получения трансплантируемого хрящевого материала для тканевой инженерии, где указанный способ включает этапы культивирования хондрогенных клеток в трехмерной культуре в среде культивирования, содержащей соединение FGF-18, в течение времени, достаточного для формирования трансплантируемого хрящевого материала, где соединение FGF-18 периодически добавляют в среду культивирования в течение приблизительно одного, двух или трех дней в неделю, где указанное приблизительно однодневное, двухдневное или трехдневное добавление повторяют каждую неделю в течение по меньшей мере 2 недель культивирования, по меньшей мере 3 недель культивирования или по меньшей мере 4 недель культивирования.

2. Способ получения трансплантируемого хрящевого материала для тканевой инженерии, где указанный способ включает этапы культивирования хондрогенных клеток в трехмерной культуре в среде культивирования, содержащей соединение FGF-18, в течение времени, достаточного для формирования трансплантируемого хрящевого материала, где соединение FGF-18 периодически добавляют в среду культивирования в течение приблизительно одного, двух или трех дней в месяц, где указанное приблизительно однодневное, двухдневное или трехдневное добавление повторяют каждый месяц в течение по меньшей мере 2 месяцев культивирования, по меньшей мере 3 месяцев культивирования или по меньшей мере 4 месяцев культивирования.

3. Способ по п.1, где соединение FGF-18 периодически добавляют в среду культивирования в течение одного, двух или трех дней в неделю, где указанное однодневное, двухдневное или трехдневное добавление повторяют каждую неделю в течение 2 недель культивирования, 3 недель культивирования или 4 недель культивирования.

4. Способ по п.2, где соединение FGF-18 периодически добавляют в среду культивирования в течение одного, двух или трех дней в месяц, где указанное однодневное, двухдневное или трехдневное добавление повторяют каждый месяц в течение 2 месяцев культивирования, 3 месяцев культивирования или 4 месяцев

культивирования.

5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где хондрогенные клетки являются хондроцитами или мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из зрелых тканей.

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где соединение FGF-18 выбрано из группы, состоящей из:

a) полипептида, включающего или состоящего из зрелой формы человеческого FGF-18, включающей остатки 28-207 из SEQ ID NO:1,

b) полипептида, включающего или состоящего из остатков 28-196 в SEQ ID NO:1, или

c) полипептида, включающего или состоящего из SEQ ID NO:2.

7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где хондрогенные клетки собраны или выделены у млекопитающего перед размножением или культивированием.

8. Способ по п.7, где хондрогенные клетки собраны или выделены у млекопитающего, подвергаемого лечению, или у другого млекопитающего.

9. Способ по любому из пп.7 или 8, где млекопитающим является человек.

10. Трансплантируемый хрящевой материал, полученный согласно способу по п.1 или 2, для применения в лечении поражения хряща.

11. Трансплантируемый хрящевой материал по п.10, где поражение хряща является остеоартритом, повреждением хряща или костно-хрящевым дефектом.