СИСТЕМА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ АМПЛИФИКАЦИИ Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12M1/34 

Описание патента на изобретение RU2813921C1

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к устройствам для проведения клинико-диагностических исследований и может быть использовано для работы со специальным картриджем для автоматического выделения из образца биоматериала нуклеиновых кислот и последующего проведения их амплификации внутри объема одноразового картриджа.

Из уровня техники известны системы и методы для выделения нуклеиновых кислот. Например, метод быстрого и точного обнаружения и характеристики вирусной нуклеиновой кислоты в образце (см. WO2021250617A1, опубл. 16.12.2021). Этот метод представляет собой мультиплексное секвенирование на основе изотермической амплификации и анализ в режиме близком к режиму в реальном времени нескольких вирусных геномов. Он может одновременно обнаруживать SARS-CoV-2 и коинфицирующие респираторные вирусы, а также отслеживать мутации. Метод позволяет работать одновременно с 96 образцами в режиме близком к режиму в реальном времени. Метод, названный NIRVANA (нанопоровое секвенирование изотермической быстрой вирусной амплификации для анализа в режиме близком к режиму в реальном времени), показал высокую чувствительность и специфичность в отношении SARS-CoV-2 в 70 клинических образцах. Он также одновременно обнаружил другие вирусные патогены (например, грипп А) в пробах клинических и муниципальных сточных вод. Он обеспечивает быстрое развертывание в полевых условиях решения для обнаружения COVID-19 и сопутствующих инфекций, а также наблюдения за эволюцией пандемических штаммов.

К недостаткам данной системы можно отнести необходимость проведения геномного секвенирования аналита, что существенно замедляет процесс детекции и увеличивает вероятность получения ложноотрицательных/ложноположительных результатов, потеря функциональных свойств микропор с течением времени, а также приводит к существенному удорожанию анализа, поскольку использует метод нанопорового секвенирования, для которого необходим микропоровый картридж, который крайне сложен в производстве. Заявленное устройство лишено данного недостатка, поскольку предполагает использование стандартных, доступных и дешевых компонентов для изотермальной или классической ПЦР-амплификации для проведения которой не требуется производство высокоточных комплектующих из пластика.

Известно также устройство (см. WO2019152336A1 опубл. 29.01.2019), которое использует одноразовый картридж с реагентами для проведения ПЦР внутри. Картридж имеет в составе первую реакционную камеру, снабженную множеством праймеров для мультиплексной амплификации нуклеиновых кислот. Во время проведения анализа внутри картриджа происходит амплификация множества последовательностей положительного контроля в первой реакционной камере с получением множества ампликонов положительного контроля, при этом материал положительного контроля не содержит тестируемый образец. Перемещение жидкости между ячейками картриджа осуществляется с помощью массива плунжеров и пневматических клапанов нажимного действия. ПЦР на второй стадии происходит в специальной реакционной камере, состоящей из массива одиночных реакционных ячеек, содержащих специфичные праймеры. Регистрация флуоресцентного сигнала амплификации на всех ячейках осуществляется с помощью фоточувствительной матрицы.

К недостаткам данной системы можно отнести очень высокую сложность исполнительного модуля, в состав которого входит множество прецизионных клапанов и прочих вспомогательных устройств, включая два отдельных элемента Пельтье. Все это приводит к высокой стоимости как исполнительного устройства, так и совместимого с ним картриджа.

Наиболее близким аналогом заявленного устройства по мнению заявителя является система (III) (см. US010562030B2, опубл. 26.01.2017), которую можно использовать с одноразовым картриджем. Система (III) и соответствующие картриджи отличаются высокой гибкостью и могут использоваться для обнаружения различных аналитов, включая нуклеиновые кислоты и белки. При загрузке картриджа, система будет выполнять функции обработки образца, которые в некоторых вариантах осуществления могут включать подготовку образца, амплификацию нуклеиновой кислоты и процесс обнаружения аналита. Система, помимо прочего, включает в себя модуль ультразвуковой обработки для проведения лизиса загружаемой пробы, систему перемещения жидкостей между ячейками картриджа с помощью шприца, являющегося составной частью картриджа, а также привода поворота золотника картриджа и модуль амплификации, состоящий из модуля термоциклирования и оптической системы для детекции флуоресцентного сигнала продуктов ПЦР на единственной ПЦР-ячейке.

Недостатком ближайшего аналога (III) является возможность проведения ПЦР только в одной реакционной ячейке, что существенно снижает количество мишеней, которые можно диагностировать, поскольку оно ограничено числом каналов детекции устройства (III). Увеличение числа каналов детекции неизбежно приведет к усложнению как оптической системы Устройства, так и к существенному усложнению реагентов для проведения ПЦР в реакционной лунке, что отрицательно скажется и на стоимости, и на надежности работы Устройства (II). Предлагаемое нами решение имеет несколько реакционных лунок на ПЦР-чипе, поэтому задача увеличения числа ДНК/РНК - мишеней в нашем случае решается простым увеличением количества реакционных лунок с использованием стандартных ПЦР-флуорофоров.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение направлено на решение технической проблемы, связанной с созданием системы для выделения нуклеиновых кислот и их последующей амплификации.

Техническим результатом изобретения является создание системы для выделения нуклеиновых кислот и их последующей амплификации.

Технический результат достигается посредством системы для выделения нуклеиновых кислот и их последующей амплификации, которая состоит из по меньшей мере одного анализатора, управляющей консоли или компьютера, на которых установлено программное обеспечение, отличающаяся тем, что на корпусе анализатора выполнены выступы и впадины, которые позволяют соединять вместе несколько анализаторов с верхней и/или боковой части, на стороне анализатора находится крышка модуля загрузки, а также панель световой индикации и/или опционально жидкокристаллический дисплей.

В частном случае выполнения система содержит сканер штрих-кодов, который может быть выполнен в виде встроенного в управляющую консоль модуля или в виде стандартного отдельно стоящего устройства.

В частном случае выполнения анализатор содержит три модуля: модуль поворота золотника, модуль движения штока и модуль термоциклирования и оптической детекции.

В частном случае выполнения анализатор содержит ложемент для загрузки картриджа, перемещения его внутрь анализатора и фиксации в строгой ориентации относительно трех модулей анализатора.

В одном из вариантов выполнения модуль поворота золотника имеет приводной вал, который входит в контакт с поводком, выполненном в картридже, и выполнен с возможностью вращения посредством двигателя.

В одном из вариантов выполнения приводной вал имеет клинообразную форму, которая комплементарно соответствует форме поводка золотника картриджа.

В одном из вариантов выполнения модуль движения штока содержит подвижный шток, ось вертикального перемещения штока при фиксации картриджа концентрически совмещается с центром основания цилиндра картриджа.

В одном из вариантов выполнения подвижный шток в крайнем верхнем положении заходит внутрь цилиндра и входит в зацепление с поршнем картриджа.

В другом варианте выполнения верхняя часть штока имеет форму, которая комплементарна внутренней полости поршня, обеспечивающая зацепление поршня на штоке и совместные возвратно-поступательные движения.

В другом варианте выполнения модуль термоциклирования выполнен на базе элемента Пельтье, расположенного на теплопроводящем элементе, который имеет активное охлаждение.

В другом варианте выполнения модуль оптической детекции располагается над ПЦР лунками микрофлюидного чипа картриджа и осуществляет движение относительно чипа таким образом, чтобы каждый оптический канал модуля детекции был последовательно совмещен и производил считывание сигнала флуоресценции в лунке микрофлюидного чипа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых:

Фиг. 1 - вариант исполнения с управляющей консолью;

Фиг. 2 - вариант исполнения с компьютером;

Фиг. 3 - вариант общей компоновки прибора;

Фиг 4 - вид картриджа в Положении (А).

На фиг.1-4 позиции обозначают следующее:

1- анализатор;

2- управляющая консоль;

3- компьютер;

4- крышка модуля загрузки;

5- панель световой индикации;

6- жидкокристаллический дисплей;

7- сканер штрих-кодов;

8- одноразовый картридж;

9- ложемент;

10- приводной вал;

11- поводок золотника;

12- шток;

13- цилиндр картриджа;

14- поршень картриджа;

15- ячейка картриджа;

16- двигатель поворота золотника;

17- модуль термоциклирования;

18- ПЦР-чип картриджа;

19- модуль УЗ-обработки;

20- модуль оптической детекции.

Эти чертежи не охватывают и, кроме того, не ограничивают весь объем вариантов реализации данного технического решения, а представляют собой только иллюстративный материал частного случая его реализации.

ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Система состоит из Анализатора (1), управляющей консоли (2) или компьютера (3), на которых установлено специальное программное обеспечение, причем к одному компьютеру или управляющей консоли может быть подключено несколько анализаторов числом от одного до 96. Для этого на корпусе Анализатора находятся специальные выступы и впадины, которые позволяют соединять вместе несколько Анализаторов с верхней или с боковой части прибора. На лицевой стороне Анализатора находится крышка модуля загрузки (4), а также панель световой индикации (5) и опционально жидкокристаллический дисплей (6).

Программное обеспечение, установленное на управляющую консоль или на компьютер, контролирует работу анализаторов, позволяет загружать информацию об исследуемой пробе и идентифицировать используемые картриджи по выполняемому типу исследования перед загрузкой их в анализатор с помощью сканера штрих-кодов, который может быть выполнен в виде встроенного в управляющую консоль модуля (7), так и в виде стандартного отдельно стоящего устройства (не показано). Также программное обеспечение позволяет контролировать процесс выполнения протокола, просматривать результаты исследований, экспортировать данные в другие рабочие приложения (например, в лабораторную информационную систему).

Анализатор представляет собой устройство, способное взаимодействовать с одноразовым картриджем с анализируемой пробой. Загрузка одноразового картриджа (8) в Анализатор (1) производится оператором вручную. Для этого оператор помещает картридж (8) в ложемент (9), затем вручную закрывает крышку в направлении от себя (4) до упора. При этом картридж (8) в ложементе (9) перемещается внутрь анализатора и фиксируется в особом крайнем положении (А), в котором происходит его единообразно-строгая ориентация относительно трех модулей Анализатора одновременно: модуля поворота золотника, модуля движения штока и модуля термоциклирования и оптической детекции.

Модуль поворота золотника. В положении (А) приводной вал модуля поворота золотника (10) входит в контакт с поводком картриджа (11), которые оказываются комплементарно ориентированными друг относительно друга. При этом существует единственно верное взаимное положение вала (10) и поводка (11) при котором осуществляется установка картриджа в анализатор. При этом приводной вал (10) имеет клинообразную форму, которая комплементарно соответствует форме поводка золотника картриджа (11) таким образом, чтобы обеспечивать надежное сцепление вала (10) и поводка (11) с минимальным люфтом при повороте приводного вала, которое осуществляется посредством двигателя (16).

Модуль движения штока. Подвижный шток (12) в исходном положении задвинут в крайнее нижнее положение. После фиксации картриджа в положении (А) картридж (8) оказывается ориентирован над штоком (12) таким образом, чтобы ось вертикального перемещения штока (12) концентрически совместилась с центром основания цилиндра картриджа (13). Подвижный шток (12) перемещается в крайнее верхнее положение, заходит внутрь цилиндра (13) и входит в зацепление с поршнем картриджа (14). Верхняя часть штока (12) имеет форму, которая комплементарна внутренней полости поршня (14). После зацепления поршень (14) фиксируется на штоке (12) и совершает вместе с ним возвратно-поступательные движения. За счет движения штока происходит перемещение жидкости следующим образом: при движении поршня вниз жидкость из ячейки картриджа (15) заполняет цилиндр (13), при движении поршня вверх жидкость выходит из цилиндра (13) в полость ячейки картриджа (15).

Модуль термоциклирования (17) выполнен на базе элемента Пельтье, расположенного на теплопроводящем элементе, который имеет активное охлаждение. Данный вариант исполнения модуля упрощает компоновку прибора, а также позволяет вывести поток горячего воздуха наружу. При фиксации картриджа (8) в положении (А) ПЦР-чип (18) оказывается ориентированным строго над модулем (17) и имеет при этом максимально полный физический контакт с элементом Пельтье модуля (17).

Модуль оптической детекции (20) располагается строго над ПЦР лунками микрофлюидного чипа картриджа (18) и осуществляет движение относительно чипа таким образом, чтобы каждый оптический канал модуля детекции был последовательно совмещен и производил считывание сигнала флуоресценции в лунке микрофлюидного чипа.

Принцип работы системы

Оператор вводит информацию об исследуемой пробе и об используемом картридже с помощью сканера штрих-кодов (7) на управляющей консоли, ручным сканером штрих-кодов или вручную с помощью сенсорного экрана и/или клавиатуры. Управляющее программное обеспечение автоматически определяет конкретный анализатор, который будет работать с картриджем и информирует об этом оператора панелью световой индикации (5) и/или посредством дисплея (6) на выбранном анализаторе.

Оператор вручную загружает картридж (8) с исследуемой пробой внутри в ложемент (9) и, прилагая усилие на крышку модуля загрузки (4) в направлении от себя, загружает картридж (8) в Анализатор (1) за счет автоматической фиксации крышки (4) в анализаторе (1) при этом фиксация крышки осуществляется только в случае наличия картриджа (8) в ложементе (9). При этом приводной вал (10) Анализатора входит в поводок золотника (11) и происходит их надежное сцепление, ПЦР-чип картриджа (18) ориентируется над модулем термоциклирования (17) и плотно к нему прижимается. Шток (12) поднимается в цилиндр золотника картриджа (13) и входит в зацепление с поршнем (14). Таким образом картридж занимает положение (А) внутри анализатора.

Затем запускается протокол исследования, соответствующий загруженному картриджу. В соответствии с протоколом выполнения анализа, приводной вал (10) посредством поворота поводка (11) перемещает золотник к ячейке, заправленной реактивами. Поршень со штоком совершает возвратно-поступательные движения внутри цилиндра (13). При этом при движении штока вниз в золотнике создается разрежение, а при обратном движении - избыточное давление, а расстояние, на которое переместится поршень, будет определять объем забираемой жидкости.

В соответствии с протоколом выполнения анализа, на определенном этапе происходит термостатирование, работа магнита и модуля УЗ обработки (19). В соответствии с протоколом выполнения анализа, на определенном этапе происходит включение модуля термоциклирования и модуля оптической детекции (20).

По завершении протокола, подвижный шток (12) уходит в крайнее нижнее положение, теряя контакт с поршнем (14). Приводной вал (10) возвращает золотник в стартовую позицию и происходит автоматическое открытие крышки (4). После этого картридж готов к извлечению. Световая панель (5) и/или дисплей (6) индикацией информирует оператора о завершении протокола. Извлечение картриджа происходит вручную, для чего необходимо потянуть крышку (4) на себя до упора, а затем извлечь картридж (8) из ложемента (9).

ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Предложенная система предназначена для ряда применений, включающие применение одноразового картриджа для выделения нуклеиновых кислот и их последующей амплификации в медицине и биотехнологической промышленности.

Похожие патенты RU2813921C1

название год авторы номер документа
ОДНОРАЗОВЫЙ КАРТРИДЖ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ АМПЛИФИКАЦИИ 2023
  • Пономарев Владимир Александрович
  • Каникевич Дмитрий Владимирович
  • Алябин Владимир Олегович
RU2813912C1
ОДНОРАЗОВЫЙ КАРТРИДЖ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ АМПЛИФИКАЦИИ 2022
  • Пономарев Владимир Александрович
  • Алябин Владимир Олегович
  • Каникевич Дмитрий Владимирович
  • Горский Евгений Вячеславович
RU2790849C1
ПРИБОР ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 2020
  • Каникевич Дмитрий Владимирович
  • Пауль Станислав Юрьевич
  • Захарченко Павел Александрович
  • Горский Евгений Вячеславович
  • Колесниченко Кирилл Владимирович
RU2757987C1
ОПТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 2023
  • Каникевич Дмитрий Владимирович
  • Пономарев Владимир Александрович
  • Воробьёв Антон Александрович
RU2809485C1
ОДНОРАЗОВЫЙ КАРТРИДЖ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ АМПЛИФИКАЦИИ (ВАРИАНТЫ) 2021
  • Алябин Владимир Олегович
  • Горский Евгений Вячеславович
  • Каникевич Дмитрий Владимирович
  • Киселев Алексей Сергеевич
  • Пономарев Владимир Александрович
RU2768005C1
ОПТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 2020
  • Каникевич Дмитрий Владимирович
RU2757988C1
АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ ПРИБОР ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ, ОЧИСТКИ И АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ МЕТОДОМ ПЦР-РВ 2020
  • Евстрапов Анатолий Александрович
  • Петров Дмитрий Григорьевич
  • Белов Юрий Васильевич
  • Воробьев Алексей Анатольевич
  • Казанцев Алексей Васильевич
  • Антифеев Иван Евгеньевич
  • Есикова Надежда Александровна
  • Зубик Александра Николаевна
  • Гермаш Наталия Николаевна
  • Белов Дмитрий Анатольевич
RU2784821C2
ОДНОРАЗОВЫЙ КАРТРИДЖ ДЛЯ ИЗОТЕРМАЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ 2022
  • Пауль Станислав Юрьевич
  • Лысенко Кирилл Вячеславович
  • Захарченко Павел Александрович
  • Горский Евгений Вячеславович
  • Абрамов Юрий Юрьевич
RU2797710C1
Автономная диагностическая микрофлюидная платформа с интегрированными магнитными микрочастицами для активного перемешивания реагентов, оснащенная системой односторонних клапанов, управляемая оператором посредством нажатия на гибкие мембраны 2021
  • Сергеева Екатерина Юрьевна
  • Бугакова Дарья Сергеевна
  • Анастасова Елизавета Ярославна
  • Виноградов Александр Валентинович
RU2778345C2
УНИВЕРСАЛЬНАЯ СИСТЕМА ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦОВ И ПРИМЕНЕНИЕ В ИНТЕГРИРОВАННОЙ СИСТЕМЕ АНАЛИЗА 2010
  • Джованович Стивен Б.
  • Нильсен Уильям Д.
  • Коэн Дэвид С.
  • Рекнор Майкл
  • Вангбо Маттиас
  • Ван Гельдер Эзра
  • Майлоф Ларс
  • Эль-Сисси Омар
RU2559541C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 813 921 C1

Реферат патента 2024 года СИСТЕМА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ АМПЛИФИКАЦИИ

Изобретение относится к устройствам для проведения клинико-диагностических исследований и может быть использовано для работы со специальным картриджем для автоматического выделения из образца биоматериала нуклеиновых кислот и последующего проведения их амплификации внутри объема одноразового картриджа. Система для выделения нуклеиновых кислот и их последующей амплификации состоит из по меньшей мере одного анализатора, управляющей консоли или компьютера, на которых установлено программное обеспечение. На корпусе анализатора выполнены выступы и впадины, которые позволяют соединять вместе несколько анализаторов с верхней и/или боковой части. На лицевой стороне анализатора находится крышка модуля загрузки, а также панель световой индикации и/или опционально жидкокристаллический дисплей. Система обеспечивает выделение нуклеиновых кислот и их последующую амплификацию. 10 з.п. ф-лы, 4 ил.

Формула изобретения RU 2 813 921 C1

1. Система для выделения нуклеиновых кислот и их последующей амплификации, которая состоит из по меньшей мере одного анализатора для загрузки картриджа, управляющей консоли или компьютера, на которых установлено программное обеспечение, отличающаяся тем, что на корпусе анализатора выполнены выступы и впадины, которые позволяют соединять вместе несколько анализаторов с верхней и/или боковой части, на лицевой стороне анализатора находится крышка модуля загрузки, а также панель световой индикации и/или опционально жидкокристаллический дисплей.

2. Система по п.1, отличающаяся тем, что содержит сканер штрихкодов, который может быть выполнен в виде встроенного в управляющую консоль модуля или в виде стандартного отдельно стоящего устройства.

3. Система по п.1, отличающаяся тем, что анализатор содержит три модуля: модуль поворота золотника, модуль движения штока и модуль термоциклирования и оптической детекции.

4. Система по п.3, отличающаяся тем, что анализатор содержит ложемент для загрузки картриджа, перемещения его внутрь анализатора и фиксации в строгой ориентации относительно трех модулей анализатора.

5. Система по п.3, отличающаяся тем, что модуль поворота золотника имеет приводной вал, который входит в контакт с поводком, выполненным в картридже, и выполнен с возможностью вращения посредством двигателя.

6. Система по п.3, отличающаяся тем, что приводной вал имеет клинообразную форму, которая комплементарно соответствует форме поводка золотника картриджа.

7. Система по п.3, отличающаяся тем, что модуль движения штока содержит подвижный шток, ось вертикального перемещения штока при фиксации картриджа концентрически совмещается с центром основания цилиндра картриджа.

8. Система по п.7, отличающаяся тем, что подвижный шток в крайнем верхнем положении заходит внутрь цилиндра и входит в зацепление с поршнем картриджа.

9. Система по п.8, отличающаяся тем, что верхняя часть штока имеет форму, которая комплементарна внутренней полости поршня, обеспечивающую зацепление поршня на штоке и совместное возвратно-поступательное движение.

10. Система по п.3, отличающаяся тем, что модуль термоциклирования выполнен на базе элемента Пельтье, расположенного на теплопроводящем элементе, который имеет активное охлаждение.

11. Система по п.3, отличающаяся тем, что модуль оптической детекции располагается над ПЦР лунками микрофлюидного чипа картриджа и осуществляет движение относительно чипа таким образом, чтобы каждый оптический канал модуля детекции был последовательно совмещен и производил считывание сигнала флуоресценции в лунке микрофлюидного чипа.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2813921C1

US 0010093965 B2, 09.10.2018
АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ ПРИБОР ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ, ОЧИСТКИ И АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ МЕТОДОМ ПЦР-РВ 2020
  • Евстрапов Анатолий Александрович
  • Петров Дмитрий Григорьевич
  • Белов Юрий Васильевич
  • Воробьев Алексей Анатольевич
  • Казанцев Алексей Васильевич
  • Антифеев Иван Евгеньевич
  • Есикова Надежда Александровна
  • Зубик Александра Николаевна
  • Гермаш Наталия Николаевна
  • Белов Дмитрий Анатольевич
RU2784821C2
EP 4144439 A1, 08.03.2023
Самоочищающаяся решетка к пульпопроводам 1957
  • Богданов В.Я.
  • Морозов А.М.
SU110746A1

RU 2 813 921 C1

Авторы

Каникевич Дмитрий Владимирович

Пономарев Владимир Александрович

Алябин Владимир Олегович

Даты

2024-02-19Публикация

2023-04-14Подача