ОПТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2023 года по МПК G01N21/64 C12Q1/6844 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к оптическим системам регистрации. В частности, изобретение относится к системе оптического мультиплексирования для регистрации компонентов образца в, по меньшей мере, двух разных камерах для образцов, к способу регистрации компонентов образца в, по меньшей мере, двух разных камерах для образцов

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Из уровня техники известна оптическая система для проведения амплификации нуклеиновых кислот (см. RU2757988, опубл. 25.10.2021) (1). Система состоит из узла возбуждения флуоресценции реакционных лунок чипа-картриджа и узла приема сигнала флуоресценции. Место для горизонтального положения чипа-картриджа размещено в нижней зоне оптической системы, а светодиоды выполнены узкополосными и установлены вдоль боковых торцов чипа-картриджа. Узел приема сигнала флуоресценции расположен над реакционными лунками чипа-картриджа, снабжен мультиспектральными сенсорами или отдельными фотодиодами.

Описанная схема (1) имеет ряд недостатков, такие как ограничение каналов детекции: в описанном варианте реализации оптической системы возможна реализация только двух каналов детекции, которые, к тому же, не могут находиться рядом. То есть возможны вариации каналов FAM- ROX, FAM-Cy5 и т.п., но не возможна реализация каналов FAM-HEX или HEX-ROX и т.п., что является существенным недостатком, поскольку, например, комбинация каналов FAM-HEX является одной из самых популярных среди ПЦР тест-систем. К другим недостаткам можно отнести необходимость использования сложного двухполосного фильтра на канале детекции, который, к тому же, имеет нестандартную форму, что приводит к увеличению себестоимости изготовления оптической системы.

Также известен патент-аналог, в котором раскрыта система и методы флуоресцентной детекции с подвижным модулем детекции (см. US8835118B2, опубл. 16.09.2014) (2). Предложенная система состоит из оптического модуля детекции состоящего из двух или более каналов детекции флуоресценции, которые изолированы друг от друга непрозрачными стенками. Каждый такой канал состоит из источника света возбуждения и приемника флуоресценции. Свет от источника света возбуждения проходит через светофильтр и линзу и попадает на светоделитель, который прозрачен для излучения возбуждения и пропускает его дальше в реакционный колодец, в котором проходит детекция продуктов амплификации нуклеиновых кислот. Сигнал флуоресценции из реакционного колодца отражается светоделителем, который непрозрачен для диапазона флуоресценции и отражает световой поток флуоресценции, который далее проходит через светофильтр и линзой фокусируется на детекторе. Расстояние между каналами детекции оптического модуля строго соответствует расстоянию между реакционными колодцами исследуемого образца, которым может служить, например, стандартный 96-луночный ПЦР-планшет. Оптический модуль перемещается по анализируемому планшету по двум координатам с помощью двух независимых подвижек таким образом, чтобы оптический модуль дискретно позиционировался над каждой реакционной лункой каждым каналом детекции оптического модуля.

Патент-аналог (2) имеет такие недостатки, как необходимость использования двух независимых подвижек для перемещения оптического модуля. Подвижка для линейного перемещения оптического модуля в принципе более сложное, более дорогое, менее надежное и менее компактное устройство, чем система вращательно-поступательного перемещения оптического модуля, которая применяется в заявленном изобретении.

Наиболее близким аналогом заявленного устройства, по мнению заявителя, является оптическая система регистрации для мониторинга реакции ПЦР-РВ (см. RU2548606, опубл. 20.04.2015) (3) система оптического мультиплексирования, допускающая цветовое мультиплексирование и пространственное мультиплексирование, обеспечивает полную систему «ввод образца/вывод ответа» для ПЦР-РВ. Другими словами, система может выполнять протокол ПЦР и создавать разные температурные прогрессии в разных камерах для образцов благодаря разным нагревателям, таким образом, вызывая амплификацию нужной ДНК. Одновременно, устройство способно, с помощью оптических блоков, оптически сканировать такие образцы на предмет наличия различных патогенов. Поэтому конкретные химические реакции в ходе ПЦР сначала оптически регистрируются с помощью разных оптических блоков, использующих разные оптические характеристики, наподобие описанных выше. Это устройство ПЦР-РВ может одновременно возбуждать и регистрировать несколько патогенов в разных пространственно-разнесенных камерах для образцов, и функциональные возможности для поворота оптических блоков к следующей камере для образцов и последующего сканирования камеры для образцов на другой оптической длине волны обеспечивает быструю и эффективную систему ПЦР-РВ благодаря цветовому и пространственному мультиплексированию.

Другими словами, эта оптическая система регистрации типа «ввод образца/вывод ответа» для мониторинга реакций ПЦР-РВ нагревает и охлаждает с помощью, по меньшей мере, одного нагревателя, камеры для образцов для достижения температуры, необходимой для каждого этапа реакции. Таким образом, можно использовать эффект Пельтье, который позволяет нагревать и охлаждать камеру для образцов путем обращения электрического тока. Таким образом, ПЦР может состоять из ряда, например, от двадцати до сорока повторяющихся изменений температуры, так называемых циклов. Таким образом, каждый цикл может состоять из двух или трех дискретных изменений температуры.

Предложенный патент-аналог (3) наиболее близко подходит к решению проблем, решаемых заявленным изобретением, однако, по мнению заявителя проблема решается не самым эффективным способом. Описанная в (3) система оптического мультиплексирования имеет такие недостатки, как невозможность проводить мониторинг ПЦР в одной лунке, поскольку рассчитана на работу с, по меньшей мере, двумя разными реакционными лунками - камерами для образцов, что сужает вариативность применения данного изобретения. Регистрация ПЦР в одной лунке с помощью заявленного изобретения возможна. Кроме этого, система оптического мультиплексирования в (3) состоит из отдельных оптических блоков, каждый из которых имеет отдельную плату для источника света и отдельную плату для фотоприемника. При монтаже оптической системы из нескольких оптических блоков они располагаются под определенным углом друг к другу на общем радиусе, при этом платы источников света и платы фотоприемников должны быть соединены посредством отдельных шлейфов или проводов что увеличивает сложность монтажа описанной оптической системы, а также существенно снижает ее надежность. В заявленном изобретении оптические блоки скомпонованы вместе в одну деталь таким образом, что оптические оси приемных или передающих (в зависимости от исполнения) каналов оказываются параллельны друг другу. При этом появляется возможность разместить все источники излучения и фотоприемники на общих платах, что упрощает монтаж оптического модуля, а также существенно повышает его надежность.

Кроме этого, при детектировании ПЦР в разных реакционных лунках оптическая система (3) должна совершать почти полный поворот. Оптический модуль в заявленном изобретении совершает движение лишь по сектору окружности, что также приводит к упрощению конструкции, поскольку такое движение не требует применения сложных контактных колец и элементов для накручивания сигнального шлейфа при вращении.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническим результатом является создание компактной оптической системы для детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот, позволяющей одновременно регистрировать сигнал более четырех различных флуоресцентных красителей с помощью поворотной системы перемещения оптического блока.

Данное изобретение направленно на решение технической проблемы, связанной со сложностью конструкций систем флуоресцентной детекции, содержащих большое количество оптических каналов детекции. Кроме того, существует проблема создания надежных миниатюрных оптических систем детекции сигналов флюоресценции в условиях ограниченных габаритных размеров ПЦР амплификатора, а также задача уменьшения общего времени анализа за счет увеличения скорости детекции флуоресцентного сигнала в анализируемых реакционных лунках.

Заявленный технический результат достигается за счет оптической системы для детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот, содержащей корпус оптического блока, в котором расположены отдельные оптические спектральные каналы. Каждый оптический канал состоит из двух оптических трактов: передающего и приемного. Передающий оптический тракт служит для возбуждения флуоресценции реакционной смеси и состоит из расположенного на общей электронной плате источника света, например, но не ограничиваясь, узкополосного светодиода, первой фокусирующей линзы, светофильтра, дихроичного зеркала, которое отражает световой поток от источника света и прозрачное для флуоресцентного излучения и/или второй фокусирующей линзы. Приемный оптический тракт служит для детектирования сигнала флуоресценции реакционной смеси и состоит из второй фокусирующей линзы, дихроичного зеркала, светофильтра, третьей фокусирующей линзы и детектора - любого устройства, способного регистрировать излучение света, попадающего на него.

При этом оптические блоки скомпонованы вместе в одну деталь таким образом, что оптические оси приемных каналов оказываются параллельны друг другу.

В частном варианте исполнения приемный и/или передающий тракт оптического канала может не содержать фокусирующих линз или их количество может быть сокращено до двух или до одной.

В частном варианте исполнения, приемные и передающие каналы оптических блоков меняются местами. При этом оптические оси передающих каналов оказываются параллельны друг другу.

Оптическая система характеризуется тем, что оптический блок выполнен с возможностью возвратно-вращательного движения по сектору окружности посредством двигателя так, чтобы радиус траектории этого движения оптического блока совпадал с радиусом, на котором расположены центры реакционных лунок микрофлюидного чипа. При этом обеспечивается позиционирование каждого оптического канала над каждой из реакционных лунок, размещенных на микрофлюидном чипе путем совмещения оптической оси канала с реакционной лункой чипа так, чтобы реакционная лунка была расположена концентрично второй фокусирующей линзе оптического тракта.

В частном варианте выполнения количество отдельных спектральных каналов может варьироваться от одного до десяти.

В одном из частных вариантов выполнения содержит шесть отдельных оптических каналов с возможностью детектировать сигнал флуоресцентных красителей, например, EVA488, FAM, HEX, ROX, CY5, CY5.5.

В одном из вариантов выполнения источники света располагаются на фиксированном расстоянии от дихроичного зеркала в зависимости от длины волны излучения.

Приемные и передающие светофильтры и дихроичное зеркало могут быть установлены в специальную крепежную оправу.

Детектор может состоять, например, но не ограничиваясь, как из одного, так и из нескольких единичных фотодиодов, расположенных на общей электронной плате.

В частном варианте выполнения на корпусе оптического блока расположены дополнительные нагревательные элементы.

В частном варианте передающий оптический тракт оптического канала может содержать 2 или 3 расположенных рядом источников света, а также многополосный светофильтр и комплементарное ему многополосное дихроичное зеркало. В этом случае появляется возможность возбуждения сигнала от нескольких флуоресцентных красителей с помощью одного оптического канала.

В частном варианте приемный оптический тракт оптического канала может содержать многополосный светофильтр и комплементарное ему многополосное дихроичное зеркало. В этом случае появляется возможность детектирования сигнал от нескольких флуоресцентных красителей с помощью одного оптического канала.

В одном из частных вариантов в оптическом канале вместо соответствующего дихроичного зеркала используется светоделитель. Коэффициент разделения света в данном светоделителе может изменяться в диапазоне от 1:9 до 9:1.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых:

Фиг. 1 - вид сверху на оптическую систему для детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот;

Фиг. 2 - вид в разрезе оптической системы для детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот;

Фиг. 3 - общий вид оптической системы для детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот.

На фиг.1-3 позиции обозначают следующее:

1 - чип;

2 - реакционная лунка;

3 - оптический блок;

4 - оптическая ось;

5 - центральная ось;

6 - траектория движения;

7 - радиус вращения;

8 - двигатель;

9 - электронная палата детекторов;

10 - источник света;

11 - корпус;

12 - электронная плата источников излучения;

13 - фокусирующая линза;

14 - светофильтр;

15 - вторая фокусирующая линза;

16 - дихроичное зеркало;

17 - крепежная оправа;

18 - второй светофильтр;

19 - третья фокусирующая линза;

20 - детектор;

21 - расстояние между лунками микрофлюидного чипа.

Эти чертежи не охватывают и, кроме того, не ограничивают весь объем вариантов реализации данного технического решения, а представляют собой только иллюстративный материал частного случая его реализации.

ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявленная оптическая система для проведения амплификации нуклеиновых кислот предназначена для использования в компактном приборе для проведения ПЦР в режиме реального времени и представляет собой набор отдельных оптических спектральных каналов, расположенных в едином корпусе (11). Количество отдельных спектральных каналов может варьироваться от одного до десяти и более и ограничиваться только габаритными размерами оптической системы. Например, один из вариантов данного изобретения подразумевает, но не ограничивается, использованием шести отдельных оптических каналов с возможностью детектировать сигнал флуоресцентных красителей, например, EVA488, FAM, HEX, ROX, CY5, CY5.5.

Каждый оптический канал состоит из двух оптических трактов передающего и приемного. Передающий оптический тракт служит для возбуждения флуоресценции реакционной смеси и состоит из расположенного на общей электронной плате (12) источника света (10), отвечающего за возбуждение флуоресценции и имеющего минимальный угол расходимости излучения, первой фокусирующей линзы (13), светофильтра (14), дихроичного зеркала (16) и второй фокусирующей линзы (15). Причем, оптические оси(4) передающих трактов всех оптических каналов оказываются параллельны друг другу.

В некоторых вариантах данного изобретения передающий и приемный тракты меняются местами. В этом случае оптические оси (4) приемных трактов всех оптических каналов оказываются параллельны друг другу.

В некоторых вариантах данного изобретения источники света располагаются на строго фиксированном расстоянии от дихроичного зеркала (16) в зависимости от длины волны излучения. Это необходимо для получения требуемых геометрических и энергетических характеристик возбуждающего излучения. При этом приемные и передающие светофильтры и дихроичное зеркало установлены в специальную крепежную оправу (17), позволяющую упростить процесс сборки и фиксации элементов внутри общего оптического блока (3). Дихроичное зеркало (16) служит для совмещения оптических осей приемного и передающего оптических каналов, а также для дополнительной блокировки попадания возбуждающего излучения в приемный тракт. Допускается изменение взаимного расположения первой фокусирующей линзы (13) и светофильтра (14), а также наличие и отсутствие второй фокусирующей линзы (15) в зависимости от близости расположения оптического блока относительно реакционных лунок.

Приемный оптический тракт служит для детектирования сигнала флуоресценции реакционной смеси и состоит из второй фокусирующей линзы (15), дихроичного зеркала (16), светофильтра (18), третьей фокусирующей линзы (19) и детектора (20). Детектор - любое устройство, способное регистрировать электромагнитное излучение, может состоять, например, но ограничиваясь, как из одного, так и из нескольких единичных, расположенных на общей электронной плате (9). Детектор выбирается исходя из фотометрических характеристик оптической системы, а также исходя из геометрической формы реакционных лунок. Допускается изменение взаимного расположения третьей фокусирующей линзы (19) и светофильтра (18), в зависимости от используемого детектора (20), а также, в случае необходимости уменьшения общих габаритов оптического блока.

При этом в частном варианте исполнения приемный и/или передающий тракт оптического канала может не содержать фокусирующих линз или их количество может быть сокращено до двух или до одной.

На корпусе оптического блока (11) в некоторых вариантах данного изобретения могут располагаться дополнительные нагревательные элементы (не показаны), необходимые для поддержания постоянной температуры оптических элементов, источников света (10) и детектора (20). Это позволяет исключить изменение временных фотометрических характеристик оптических элементов, что приводит к увеличению стабильности системы и исключает возможный дрейф сигнала связанный с прогревом оптических элементов и изменениями температуры окружающей среды.

Оптическую систему для проведения амплификации нуклеиновых кислот используют следующим образом. В процессе работы прибора, после каждого цикла термоциклирования проводят измерение сигнала флуоресценции специальных флуоресцентных красителей в исследуемом образце, при этом интенсивность регистрируемого излучения находится в прямой зависимости от количества искомых молекул ДНК в исследуемом образце.

Для измерения сигнала флуоресценции происходит позиционирование канала над лункой (2) путем вращения оптического блока (3) вокруг оси (5) и движением по сектору окружности вдоль траектории (6) посредством двигателя (8) до совмещения оптической оси канала с реакционной лункой (2) чипа (1) так, чтобы реакционная лунка была расположена концентрично второй фокусирующей линзе (15) оптического тракта. При этом точность позиционирования оптического блока (3) и повторяемость перемещения между циклами крайне важна и может обеспечиваться применением шагового двигателя и/или установкой дополнительного энкодера (не показан). После детекции сигнала флуоресценции двигатель (8) поворачивает оптический блок (3) до следующей реакционной лунки (2) и так далее. Количество циклов перемещения выбирается таким образом, чтобы каждый оптический канал блока (3) последовательно и точно позиционировался у каждой реакционной лунки чипа и детектировал сигнал флуоресценции в каждой из них. При этом расстояние между оптическими осями каналов блока (3) может быть равным целому или половине расстояния между реакционными лунками (21). В этом случае происходит последовательное детектирование сигнала флуоресценции сразу несколькими оптическими каналами без необходимости дополнительного позиционирования оптического блока над лунками. После завершения процедуры детектирования сигнала во всех реакционных ячеек оптический блок возвращается в исходное положение. Далее процесс детектирования сигнала последовательно повторяется при каждом цикле термоциклирования при проведении ПЦР или через заданное время при проведении изотермической реакции амплификации.

Решение поставленной задачи достигается за счет того, что оптический блок (3), состоящий из приемного и передающего оптического тракта и дихроичного зеркала (16) двигается посредством двигателя по сектору окружности с центром (5) так, чтобы траектория движения (6) оптического блока (3) совпадала с центральным положением реакционных лунок (2) микрофлюидного чипа, что позволяет избежать применения сложных систем линейного позиционирования, уменьшить габариты системы, а так же существенно повысить скорость детекции сигнала флуоресценции, обеспечивая при этом высокую повторяемость позиционирования оптического модуля. При этом радиус вращения (7) выбирается исходя из габаритных размеров оптического блока, количества оптических каналов, размеров и количества реакционных лунок (2).

ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Предложенное устройство предназначено для ряда применений, включающих применение оптической системы для детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот, в медицине, ветеринарии и биотехнологической промышленности.

Изобретение относится к области оптического приборостроения и касается оптической системы для детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот. Оптическая система содержит корпус оптического блока, в котором расположены оптические спектральные каналы, состоящие из передающего и приемного оптических трактов. Передающий оптический тракт состоит из по крайней мере одного источника света, светофильтра, а также дихроичного зеркала или светоделителя, обеспечивающего совмещение оптических осей приемного и передающего оптических трактов. Приёмный оптический тракт состоит из общего с предающим трактом дихроичного зеркала или светоделителя, светофильтра и детектора. Оптический блок выполнен с возможностью возвратно-вращательного движения по сектору окружности так, чтобы радиус траектории этого движения совпадал с радиусом, на котором расположены центры реакционных лунок микрофлюидного чипа. При этом обеспечивается позиционирование каждого оптического спектрального канала над каждой из реакционных лунок. Технический результат заключается в упрощении конструкции и повышении ее надежности, а также в обеспечении возможности одновременной регистрации сигнала от различных флуоресцентных красителей. 12 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Оптическая система для детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот, содержащая корпус оптического блока, в котором расположены отдельные оптические спектральные каналы, состоящие из двух оптических трактов, передающего и приемного,

передающий оптический тракт служит для возбуждения флуоресценции реакционной смеси и состоит из по крайней мере одного источника света, расположенного на электронной плате, светофильтра, а также дихроичного зеркала или светоделителя, обеспечивающего совмещение оптических осей приемного и передающего оптических трактов,

приёмный оптический тракт служит для детектирования сигнала флуоресценции реакционной смеси и состоит из общего с предающим трактом дихроичного зеркала или светоделителя, светофильтра и детектора,

отличающаяся тем, что оптический блок выполнен с возможностью возвратно-вращательного движения по сектору окружности посредством двигателя так, чтобы радиус траектории этого движения оптического блока совпадал с радиусом, на котором расположены центры реакционных лунок микрофлюидного чипа, при этом обеспечивается позиционирование каждого оптического спектрального канала над каждой из реакционных лунок, размещенных на микрофлюидном чипе, путем совмещения оптической оси канала с реакционной лункой чипа.

2. Оптическая система по п.1, отличающаяся тем, что передающий оптический тракт содержит по крайней мере одну фокусирующую линзу.

3. Оптическая система по п.1, отличающаяся тем, что приемный оптический тракт содержит по крайней мере одну фокусирующую линзу.

4. Оптическая система по п.1, отличающаяся тем, что количество отдельных оптических спектральных каналов составляет от одного до десяти.

5. Оптическая система по п.4, отличающаяся тем, что содержит шесть отдельных оптических каналов с возможностью детектировать сигнал флуоресцентных красителей EVA488, FAM, HEX, ROX, CY5, CY5.5.

6. Оптическая система по п.1, отличающаяся тем, что источники света располагаются на фиксированном расстоянии от дихроичного зеркала или светоделителя в зависимости от длины волны излучения.

7. Оптическая система по п.1, отличающаяся тем, что приемные и передающие светофильтры, а также дихроичное зеркало или светоделитель установлены в крепежную оправу.

8. Оптическая система по п.1, отличающаяся тем, что оптические оси передающих трактов всех оптических спектральных каналов параллельны друг другу.

9. Оптическая система по п.1, отличающаяся тем, что детектор состоит из по крайней мере одного приемника излучения, расположенного на общей электронной плате.

10. Оптическая система по п.1, отличающаяся тем, что на корпусе оптического блока расположены дополнительные нагревательные элементы.

11. Оптическая система по п.1, отличающаяся тем, что передающий оптический тракт оптического спектрального канала содержит два или три расположенных рядом источника света, а светофильтр передающего тракта и дихроичное зеркало выполнены многополосными для обеспечения возможности возбуждения сигнала от нескольких флуоресцентных красителей с помощью одного оптического канала.

12. Оптическая система по п.1, отличающаяся тем, что светофильтр приемного тракта оптического спектрального канала и дихроичное зеркало выполнены многополосными для обеспечения возможности детектирования сигнал от нескольких флуоресцентных красителей с помощью одного оптического спектрального канала.

13. Оптическая система по п.1, отличающаяся тем, что в случае использования в оптическом спектральном канале светоделителя его коэффициент разделения света находится в диапазоне от 1:9 до 9:1.