Способ использования 4-((5,10-диметил-6-оксо-6,10-дигидро-5Н-пиримидо[5,4-b]тиено[3,2-e][1,4]диазепин-2-ил)амино)бензолсульфонамида (XMU-MP-1) для подавления роста клеток лимфомы Беркитта Российский патент 2024 года по МПК A61K31/5517 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины, в частности к онкологии, а именно к новому способу подавления роста опухоли лифомы Беркитта за счет ингибирования сигнального пути Hippo с помощью XMU-MP-1, у которого выявлена новая биологическая активность, заключающаяся в способности оказывать цитотоксическое действие на клетки лимфомы Беркитта и показано, что его цитотоксическое действие усиливается при совместном использовании с 5-азацитидином.

Уровень техники

Злокачественные опухоли кроветворной и лимфоидной ткани составляют примерно 8% всех злокачественных заболеваний. Они делятся на две большие группы - лимфомы и лейкозы; многие из них характеризуются неблагоприятным прогнозом и низким уровнем выживаемости. В настоящее время основным методом лечения этих заболеваний является химиотерапия.

Лимфома Беркитта (ЛБ) - высоко агрессивная лимфома из иммунологически зрелых В-клеток с преимущественно экстранодальной локализацией. У детей ЛБ составляет около 30-50% всех лимфом. Соотношение мальчики:девочки 3-4:1, средний возраст 8 лет. У взрослых ЛБ встречается значительно реже, в 2% случаев всех лимфом. Болеют преимущественно молодые мужчины, соотношение мужчины:женщины - 3:1, средний возраст 25-30 лет.

Для лимфомы Беркитта характерно весьма агрессивное течение, она склонна распространяться в центральную нервную систему. Основной метод лечения лимфомы Беркитта - интенсивная полихимиотерапия. Она продолжается в течение нескольких месяцев, и пациент очень много времени проводит в клинике. Применяются разные комбинации химиопрепаратов: R-CODOX-M (ритуксимаб+циклофосфамид+винкристин+доксорубицин+метотрексат); R-IVAC (ритуксимаб+ифосфамид+этопозид+цитарабин); R-CHOP (ритуксимаб+циклофосфамид+доксорубицин+винкристин+преднизолон); DA-EPOCH-R (ритуксимаб+этопозид+преднизолон+винкристин+циклофосфамид+доксорубицин) [Клинические рекомендации по диагностике и лечению лимфомы Беркитта. Коллектив авторов под руководством академика В.Г. Савченко, профессора И.В. Поддубной. Рекомендации утверждены на II Конгрессе гематологов. Национальное гематологическое общество. Российское профессиональное общество онкогематологов. 2014 г.].

Следует отметить, что ЛБ - это самая быстро растущая из всех злокачественных новообразований. ЛБ отличается высокой химиочувствительностью. У 80-90% больных удается получить длительные полные клинико-гематологические и цитогенетические ремиссии при проведении программ интенсивной высокодозной полихимиотерапии, однако терапия рецидивов остается нерешенной проблемой. Следовательно, на данный момент, задача разработки новых комбинаций препаратов для более эффективной борьбы с этим заболеванием стоит очень остро.

Одним из классов потенциальных препаратов для комбинированной терапии онкологических заболеваний рассматриваются препараты, модулирующие сигнальный путь Hippo [Bae JS, Kim SM, Lee Н. The Hippo signaling pathway provides novel anti-cancer drug targets. Oncotarget. 2017;8(9):16084-16098. doi:10.18632/oncotarget.14306].

Hippo сигнальный путь - это эволюционно консервативный сигнальный путь - каскад, регулирующий многочисленные биологические процессы, включая деление, рост клеток и направление дифференцировки, контроль размера органов и регенерацию. Ядро Hippo сигнального пути у млекопитающих состоит из киназного каскада киназы MST1 (серин-Треонинкиназа 4 (STK4)) и MST2 (серин-Треонинкиназа 3 (STK3)), и киназ LATS1 и LATS2, а также нижестоящих эффекторов - коактиваторов транскрипции YAP и TAZ. Эти основные компоненты пути Hippo контролируют транскрипционные программы, участвующие в пролиферации, выживании, подвижности, поддержании стволовых клеток и дифференцировке клеток [Wang J, Liu S, Heallen T, Martin JF. The Hippo pathway in the heart: pivotal roles in development, disease, and regeneration. Nat Rev Cardiol. 2018;15(ll):672-684. doi:10.1038/s41569-018-0063-3].

Нарушение регуляции Hippo сигнального пути часто встречается во многих опухолях человека. Недавно проведенное систематическое профилирование образцов опухолей выявило широко распространенное нарушение регуляции компонентов пути Hippo во многих типах рака человека, включая глиому, колоректальный рак и рак эндометрия, гепатоцеллюлярную карциному и постоянно сообщается о его роли как онкогена при эпителиальном раке [Zheng Y, Pan D. The Hippo Signaling Pathway in Development and Disease. Dev Cell. 2019;50(3):264-282. doi:10.1016/j.devcel.2019.06.003]; [Fu M, Hu Y, Lan T, Guan KL, Luo T, Luo M. The Hippo signalling pathway and its implications in human health and diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):376. Published 2022 Nov 8. doi:10.1038/s41392-022-01191-9]. Неконтролируемая пролиферация клеток является фундаментальным аспектом неоплазии, а роль Hippo сигнального пути и дисфункции YAP/TAZ в стимулировании пролиферации раковых клеток хорошо описана в литературе [LiuH, DuS, LeiT, et al. Multifaceted regulation and functions of YAP/TAZ in tumors (Review). Oncol Rep.2018;40(1): 16-28]. Помимо стимуляции пролиферации опухолевых клеток, путь Hippo обходит негативные регуляторы пролиферации клеток, что позволяет опухоли избежать подавления роста. Опухолевые клетки с нарушенной регуляцией передачи сигналов Hippo не только преодолевают внутренние механизмы гибели клеток, но также демонстрируют устойчивость к химиотерапевтическим препаратам или к молекулярной таргетной терапии, что еще больше способствует рецидиву рака [Zanconato F, Cordenonsi М, Piccolo S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 2016;29(6):783-803. doi:10.1016/j.ccell.2016.05.005]. Показано, что YAP1 фокально амплифицируется во многих солидных опухолях, включая головной мозг, толстую кишку. Однако полученные в последние годы данные подтверждают роль YAP1 как гена-супрессора опухолей при гематологических заболеваниях. В отличие от эпителиальных опухолей, инактивация MST1 или высокая экспрессия YAP в гематологических опухолях приводит к ингибированию роста гематологических опухолей и их апоптозу [Ma S, Meng Z, Chen R, Guan KL. The Hippo Pathway: Biology and Pathophysiology. Annu Rev Biochem. 2019;88:577-604. doi:10.1146/annurev-biochem-013118-111829].

Это связано с тем, что в гемопоэтических клетках сигнальный путь Hippo активируется, в основном, по альтернативному пути. Было показано, что при гематологических злокачественных новообразованиях, таких как лейкемии, лимфомы, множественные миеломы низкие уровни YAP1 предотвращают апоптоз, индуцированный ядерным ABL1 в этих клетках, а активация YAP1 вызывает гибель гематологических опухолевых клеток. Важно отметить, что генетическая инактивация киназы MST1 восстанавливает уровни YAP1, тем самым запуская апоптоз при гематологических злокачественных новообразованиях, вызывая гибель клеток гематологических опухолей in vitro и in vivo в естественных условиях. Эти данные показывают, что MST1 представляет собой многообещающую терапевтическую мишень и дают обоснование для разработки и клинической оценки новых ингибиторов MST [Cottini F, Hideshima Т, Xu С, et al. Rescue of Hippo coactivator YAP1 triggers DNA damage-induced apoptosis in hematological cancers. Nat Med. 2014;20(6):599-606. doi:10.1038/nm.3562]. Препараты, изменяющие активность STE20-подобных киназ MST1 и MST2 могут быть чрезвычайно перспективными терапевтическими мишенями при лечении гематологических опухолей.

STE20-подобная серин/треонинкиназа MST1 млекопитающих на высоком уровне экспрессируется в иммунных клетках. Интересно, что в иммунных клетках MST1 регулирует клеточные процессы, связанные с иммунным ответом, такие как хемотаксис, клеточная адгезия, иммунологические синапсы, транскрипция генов не с помощью «канонического» пути Hippo, а с помощью неканонического пути Hippo или альтернативных путей. Недавние успехи в понимании молекулярных механизмов этих процессов выявили важную роль MST1/2 в регуляции ремоделирования цитоскелета, активации интегрина и везикулярного транспорта в лимфоцитах [UedaY, KondoN, KinashiT. MST1/2 Balance ImmuneActivation and Tolerance by Orchestrating Adhesion, Transcription, and Organelle Dynamics in Lymphocytes. Front Immunol. 2020; 11:733].

В В-лимфоцитах дефицит MST1 вызывает дефект развития В-клеток маргинальной зоны (MZ), MST1 регулирует активацию В-клеточного рецептора (BCR). Нарушение CD19-опосредованной передачи сигналов Btk из-за дефицита MST1 приводит к серьезному дефекту дифференцировки MZ и В-клеток зародышевого центра. MST1 регулирует активацию и дифференцировку периферических В-клеток [BaiX, HuangL, NiuL, et al. MST1 positively regulates B-cell receptor signaling via CD19 transcriptional levels. Blood Adv. 2016;1(3): 219-230].

MST1 участвует в миграции T и В-лимфоцитов во вторичные лимфоидные органы. Нарушение экспрессии MST1, так и Mst2 в В-клетках приводит к тому, что В-клетки не могут рециркулировать в лимфатические узлы или в костный мозг. Неспособность поздних переходных и фолликулярных В-клеток, лишенных MST1 и 2, мигрировать в красную пульпу объясняет их неспособность дифференцироваться в предшественники В-клеток и в В-клетки в маргинальной зоне [AlsufyaniF, MattooH, ZhouD, et al. The MST1 Kinase Is Required for Follicular В Cell Homing and B-1 В Cell Development. Front Immunol. 2018;9:2393]. В обзорной статье суммированы данные о роль сигнального пути Hippo в регуляции гемопоэза и дифференцировки клеток иммунной системы [Kim I, Park Т, Noh JY, Kim W. Emerging role of Hippo pathway in the regulation of hematopoiesis. BMB Rep.2023;56(8):417-425.doi:10.5483/BMBRep.2023-0094].

Разработка препаратов, нацеленных на киназу MST1, все еще находится на этапе лабораторных испытаний, и до сих пор ни одно лекарство не было одобрено для продажи. Лишь немногие препараты находятся на стадии клинических испытаний. В патенте CN 103429582 A (заявка 2012-03-02; публикация 2013-12-04) "MST1 kinase inhibitors and method of use thereof" описан препарат XMU-MP-1 (4-((5,10-диметил-6-оксо-6,10-дигидро-5Н-пиримидо[5,4-b]тиено[3,2-е][1,4]диазепин-2-ил)амино)бензолсульфонамид), он же AKOS030621725; ZINC498035595; CS-5818; or HY-100526. Это вещество является обратимым, сильнодействующим и селективным ингибитором стерильных 20-подобных киназ млекопитающих 1 и 2 (MST1/2) - ключевых молекул Hippo сигнального пути. XMU-MP-1 блокируя активность киназ MST1 и MST2 активирует нижестоящий эффекторный Yes-ассоциированный белок (YAP) и способствует росту клеток [Fan F, Не Z, Kong LL, et al. Pharmacological targeting of kinases MST1 and MST2 augments tissue repair and regeneration. Sci Transl Med. 2016;8(352):352ral08. doi:10.1126/scitranslmed.aaf2304]. Ингибитор не смог достичь селективности между MST1 и MST2 и показал сравнимую ингибирующую активность (IC50 in vitro составила 71 нМ и 38 нМ соответственно). Он также оказывает некоторое ингибирующее действие на некоторые киназы того же семейства (MAP3K2, TAOK и др.). XMU-MP-1 имеет номер CAS 2061980-01-4 и идентификатор соединения PubChem Ser. №12/499,143.

XMU-MP-1 показывает очень хорошую фармакокинетику у крыс с периодом полувыведения 1,2 часа и биодоступностью 39,5%. Максимальное ингибирование YAP достигается между 1,5 и 6 часами после внутрибрюшинного введения препарата (1 мг/кг) [FanF, et al. Sci Transl Med. 2016, 8(352):352ral08], 2019 Oct;176(20):3956-3971.doi: 10.1111/bph.14795. Epub 2019 Oct 8].

Существует несколько патентов и статей, в которых описан терапевтический эффект подавления киназной активности MST1, в частности, роль XMU-MP-1 в лечении диабета, регенерации волосяных фолликулов, остеоартрита, ожирения, патологии печени и кишечника а также применение XMU-MP-1 для профилактики и/или лечения иммунной тромбоцитопении.

Что касается энергетического обмена, нарушение регуляции Hippo киназы MST1/2 тесно связано с патологией метаболических органов, включая печень, поджелудочную железу и скелетные мышцы. Было показано, что фармакологическое ингибирование пути Hippo с помощью XMU-MP-1 in vivo в дозе 1-3 мг/кг посредством внутрибрюшинной инъекции способен усиливать восстановление кишечника у мышей и регенерацию печени на моделях мышей с острым и хроническим повреждением печени. Обработка XMU-MP-1 приводит к значительно более высокой скорости репопуляции гепатоцитов человека в модели мышей с дефицитом Fah, чем в контрольной группе, что указывает на то, что XMU-MP-1 может способствовать регенерации печени человека. Таким образом, фармакологическая модуляция активности киназ MST1/2 обеспечивает новый подход к потенцированию восстановления и регенерации тканей, при этом XMU-MP-1 является первым лидером в разработке направленных регенеративных терапевтических средств [Fan F, He Z, Kong LL, et al. Pharmacological targeting of kinases MST1 and MST2 augments tissue repair and regeneration. Sci Transl Med. 2016;8(352):352ra108. doi: 10.1126/scitranslmed.aaf2304].

Было показано, что XMU-MP-1 защищает сердце при перегрузке давлением, уменьшает клеточную гипертрофию и улучшает выживаемость культивируемых кардиомиоцитов, a in vivo сохраняет сердечную функцию после перегрузки давлением. Улучшение функции сердца у мышей, получавших XMU-MP-1, сопровождается более низким уровнем фиброза [Triastuti Е, Nugroho АВ, Zi М, Prehar S, Kohar YS, Bui ТА, Stafford N, Cartwright EJ, Abraham S, Oceandy D. Pharmacological inhibition of Hippo pathway, with the novel kinase inhibitor XMU-MP-1, protects the heart against adverse effects during pressure overload. Br J Pharmacol. 2019 Oct;176(20):3956-3971. doi: 10.1111/bph.14795. Epub 2019 Oct 8. PMID: 31328787; PMCID: PMC6811740].

XMU-MP-1 используют для регуляции пролиферации β-клеток поджелудочной железы и восстановления печени. Исследования показали, что MST1 играет важную регуляторную роль в процессе гибели или апоптоза β-клеток поджелудочной железы и может быть использован в качестве потенциальной новой мишени при разработке лекарств для лечения диабета [Ardestani A, Paroni F, Azizi Z, et al. MST1 is a key regulator of beta cell apoptosis and dysfunction in diabetes. Nat Med. 2014;20(4):385-397. doi:10.1038/nm.3482]. В поджелудочной железе MST1 активируется в условиях сахарного диабета и отвечает за апоптоз β-клеток. Основываясь на этих эффектах, ингибиторы MST1/2 вероятно можно использовать в качестве профилактического или терапевтического средства для лечения диабета. В нескольких патентах описаны применение и способы профилактики или лечения заболеваний, связанных с киназной активностью MST1, в частности, для профилактики или лечения повреждений печени и диабета. В этих патентах XMU-MP-1 был использован как стандарт (контроль) для регуляции пролиферации бэта-клеток поджелудочной железы и восстановления печени [Патент JP 2022504601 A (заявка 2019-10-09; публикация 2022-01-13), Патент ЕР 3868762 А1 (заявка 2019-10-09; публикация 2021-08-25),]; [Anand R, Maksimoska J, Pagano N, et al. Toward the development of a potent and selective organoruthenium mammalian sterile 20 kinase inhibitor. J Med Chem. 2009;52(6): 1602-1611. doi: 10.1021/jm8005806].

Было предложено использовать XMU-MP-1 для стимуляции регенерации волосяных фолликулов в качестве новой стратегии лечения патологического выпадения волос. В модельной системе мини-органа (волосяной фолликул человека) обработка XMU-MP-1 ингибировала фосфорилирование МОВ1, но не увеличивало активность YAP1 в волосяном фолликуле и вместо того, чтобы способствовать пролиферации, XMU-MP-1 уменьшал количество Ki-67+, EdU+ и фосфогистон Н3+ кератиноцитов матрикса волос и противодействовал цитотоксическим эффектам паклитаксела на клетки волосяного фолликула [Mitchell Е, Mellor CEL, Purba TS. XMU-MP-1 induces growth arrest in a model human mini-organ and antagonises cell cycle-dependent paclitaxel cytotoxicity. Cell Div. 2020 Sep 17;15:11. doi: 10.1186/s13008-020-00067-0. PMID: 32973917; PMCID: РМС7495873].

Еще одно изобретение раскрывает применение XMU-MP-1 для получения лекарственного средства для лечения остеоартрита. Впервые было показано, что соединение XMU-MP-1 обладает эффектом лечения и замедления прогрессирования остеоартрита и может быть использовано для профилактики и лечения остеоартрита. А эксперименты на животных доказывают, что эффект соединения XMU-MP-1 на замедление развития остеоартрита проявляется в замедлении патологического процесса потери хрящевого матрикса за счет ингибирования экспрессии фермента, разрушающего матрикс [Патент CN 114366751 А (приоритет 2020-12-10; публикация 2022-04-19)].

Болезни обмена веществ - это общий термин для заболеваний, вызванных дисбалансом углеводов, липидов, белков, минералов, витаминов и воды, что может приводить к ожирению, гипертонии, гиперхолистеринемии и непереносимости глюкозы. Еще одно изобретение относится к способу лечения метаболических заболеваний, таких как ожирение, диабет или гиперлипидемия, путем изменения экспрессии MST1 или MST2 в жировых клетках и, в частности, относится к композиции, содержащей XMU-MP-1, в качестве эффективного компонента [Патент KR 20220059990 A (приоритет 2020-11-02; публикация 2022-05-11)]. Зарегистрирован патент на применение композиции препаратов, содержащих XMU-MP-1 для лечения пациентов с одним или несколькими состояниями, связанными с нарушением экспрессии PNPLA3, такими как неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и/или алкогольная болезнь печени (АЛД) и предложены способы и композиции для модулирования экспрессии гена PNPLA3 в клетке путем изменения сигнальных сетей генов [Патент US 20200208128 A1 (приоритет 2018-08-14; публикация 2020-07-02)]. В этом изобретении было подтверждено, что XMU-MP-1 повышает энергетический метаболизм в жировой ткани и облегчает непереносимость глюкозы, путем ингибирования экспрессии MST1/2 в адипоцитах и оказывает профилактическое и терапевтическое действие при ожирении и нарушении обмена веществ. Композиция, содержащая XMU-MP-1 по настоящему изобретению, увеличивает превращение белого жира в бурый жир, что повышает термогенез и митохондриальную активность, а также ингибирует активность митофагии. Кроме того, было подтверждено, что активация MST1/2 в жировой ткани наблюдалась у пациентов с ожирением или диабетом 2 типа. Эти результаты подтверждают клиническую значимость и патологическую роль регуляции MST1/2 при метаболических заболеваниях, таких как ожирение или диабет.

В настоящее время имеется не очень много данных о функции Hippo-сигнального пути в гемопоэзе и в опухолевых гемопоэтических клетках. Результаты этих работ суммированы в обзорах [Cheng J, Jing Y, Kang D, et al. The Role of Mst1 in Lymphocyte Homeostasis and Function. Front Immunol. 2018;9:149. Published 2018 Feb 5. doi:10.3389/fimmu.2018.00149; Kim I, Park T, Noh JY, Kim W. Emerging role of Hippo pathway in the regulation of hematopoiesis. BMB Rep.2023;56(8):417-425. doi:10.5483/BMBRep.2023-0094]. Существует несколько патентов, в которых описано применение XMU-MP-1 для профилактики и/или лечения болезней кроветворной системы. Так, например, сигнальный путь Hippo рассматривается как потенциальная терапевтическая мишень в самообновлении и дифференцировке стволовых клеток и клеток-предшественников. Ингибитор киназ MST1/2 - XMU-MP-1 может спасти нарушенную функцию гемопоэтических стволовых клеток (HSC) и клеток-предшественников (НРС) в условиях окислительного стресса, вызванном ионизирующим излучением. Кроме того, предварительная обработка XMU-MP-1 заметно облегчала повреждение тонкой кишки, вызванное общим облучением тела в дозе 9 Гр, и увеличивала средние сроки выживания мышей, подвергшихся воздействию смертельной дозы радиации [Zhou X, Wang Н, Li D, Song N, Yang F, Xu W. MST1/2 inhibitor XMU-MP-1 alleviates the injury induced by ionizing radiation in haematopoietic and intestinal system. J Cell Mol Med. 2022 Mar;26(5): 1621-1628. doi: 10.1111/jcmm.17203. Epub 2022 Jan 27. PMID: 35088536; PMCID: РМС8899195].

Было показано, что XMU-MP-1 выполняет функцию стимулирования восстановления тромбоцитов после иммунной тромбоцитопении. Эффект XMU-MP-1 в основном реализуется за счет стимуляции созревания мегакариоцитов и экспрессии поверхностных молекул; и XMU-MP-1 может заметно способствовать миграционному движению зрелых мегакариоцитов из костной ниши костного мозга в нишу кровеносных сосудов и генерировать достаточное количество тромбоцитов. Этот эффект достигается за счет регуляции цитоскелета и подвижности мегакариоцитов [Патент CN 114366750 В (приоритет 2021-12-22; публикация 2022-11-25)].

Однако до сих пор не известно о противоопухолевой активности XMU-MP-1 в отношении В-клеточных опухолей. Ни одна из работ о свойствах XMU-MP-1 не касается противоопухолевой активности в отношении В-клеточных опухолей, в частности лимфомы Беркитта. До настоящего времени активность XMU-MP-1 и его комбинации с другими препаратами не исследованы в онкомедицине.

5-Азацитидин - это противоопухолевое средство, пиримидиновьгй нуклеозидный аналог цитидина. Считается, что противоопухолевое действие 5-азацитидина обусловлено гипометилированием ДНК и прямым цитотоксическим действием на патологические гемопоэтические клетки костного мозга. Концентрация 5-азацитидина, которая требуется для максимального ингибирования метилирования ДНК in vitro, не вызывает выраженного подавления синтеза ДНК. Гипометилирование может восстанавливать нормальную функцию генов, которые являются критическими для дифференцировки и пролиферации клеток. Цитотоксические эффекты 5-азацитидина вызывают гибель быстроделящихся клеток, включая раковые клетки, которые длительное время не поддаются влиянию контрольных механизмов нормального роста. 5-Азацитидин используется для лечения миелодиспластического синдрома и острого миелоидного лейкоза. Принимается внутрь (перорально). Начальная доза 300 мг в день. В низких концентрациях, которые применяются в настоящее время в онкогематологической практике, 5-азацитидин является гипометилирующим агентом, который ингибирует ДНК-метилтрансферазу путем включения в ДНК 5-азацитидинтрифосфата. Это приводит к потере метилирования ДНК и реактивации репрессированных генов. Считается, что гипометилирование может восстанавливать нормальную функцию генов, контролирующих дифференцировку и пролиферацию [Семочкин С.В., Толстых Т.Н., Румянцев А.Г. Миелодиспластические синдромы: терапевтические проблемы и решения. Онкогематология. 2012; Т. 2. С. 57-66; Овечкина В.Н., Бондаренко, С.Н., Морозова Е.В., Слесарчук О.А., Смирнова А.Г., Екушев К.А., Зубаровская Л.С., Афанасьев Б.В. Эффективность и безопасность применения 5-азацитидина после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток при остром миелобластном лейкозе и миелодиспластическом синдроме. Клеточная терапия и трансплантация 2015; Т. 5, С. 71; Kordella С, Lamprianidou Е, Kotsianidis I. Mechanisms of Action of Hypomethylating Agents: Endogenous Retroelements at the Epicenter. Front Oncol. 2021;11:650473]. 5-Азацитидин применяется для лечения взрослых больных с диагнозами миелодиспластический синдром (МДС) и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический миеломоноцитарнй лейкоз без признаков МДС. На основании результатов исследования 5-азацитидин был зарегистрирован, в том числе и в РФ (апрель 2010 г.), для лечения этих групп больных. Было показано, что 5-азацитидин в 2,5 раза увеличивает общую выживаемость пациентов с ОМЛ (20-30% бластов по критериям ВОЗ) [Fenaux Р., Mufti J., Hellstrom-Lindberg Е., et al, Azacitidine prolongs overall survival compared with conventional care regimens in elderly patients with low bone marrow blast count acute myeloid leukemia, JCO, 2010, 28(4),562-569]. После 16 лет клинического применения 5-азацитидина он остается основным препаратом для лечения МДС и ОМЛ. Однако точный механизм его действия все еще до конца не изучен [Christman J. 5-Azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene 2002; pg. 5483-5495]. Профиль безопасности 5-азацитидина позволяет его эффективно применять у пожилых больных с сопутствующей патологией.

Раскрытие сущности изобретения

Сущность изобретения заключается в открытии способности ингибитора сигнального пути Hippo XMU-MP-1 оказывать цитотоксическое действие на клетки лимфомы Беркитта и усиливать цитотоксическое и противоопухолевое действие 5-азацитидина в новой комбинации препаратов для подавления роста лимфомы Беркитта. Техническим результатом изобретения является создание новых, высокоэффективных, селективных и малотоксичных комбинаций противоопухолевых препаратов для лечения лимфомы Беркитта, а именно комбинация препарата ингибирующего сигнальный путь Hippo - XMU-MP-1 и 5-азацитидина. Для осуществления изобретения необходимо подобрать диапазон концентраций тестируемых соединений, в котором наблюдается цитотоксический эффект для клеток лимфомы Беркитта.

В своем следующем исполнении необходимо оценить влияние композиции тестируемых веществ в подобранных концентрациях на цитотоксический эффект для клеток лимфомы Беркитта в in vitro системе.

Краткое описание фигур и таблиц. Фигура 1 - Цитотоксичность XMU-MP-1 в клетках лимфомы Беркитта Namalwa. Фигура 2 - Активность композиции двух препаратов - XMU-MP-1 и 5-азацитидина в отношении цитостатического действия в клетках лимфоы Беркитта Namalwa.

Осуществление изобретения

Для поиска противоопухолевых агентов против лимфомы Беркитта нами была выбрана линия лимфомы Беркитта Namalwa, которая получена из клеток больного лимфомой Беркитта и эта клеточная линия является модельной системой В-клеточной лимфомы Беркитта [Банк клеток института Цитологии РАН].

Анализ цитотоксичности соединения XMU-MP-1 проводили в диапазоне его концентраций от 0.3 до 2.5 мкМ, инкубируя клетки Namalwa в течение 2-х и 3-х суток. Анализ жизнеспособности проводили при помощи красителя MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt] и PES (phenazine ethosulfate;). MTS превращается в окрашенный формазан под действием оксидоредуктаз живых клеток, a PES обладает повышенной химической стабильностью, что позволяет сочетать его с MTS с образованием стабильного раствора. Эксперимент показал, что XMU-MP-1 обладает способностью подавлять рост опухолевых В-клеток лимфомы Беркитта: гибель 50% клеток наблюдалась в концентрациях 1.1-1.2 мкМ XMU-MP-1 через 72 часа инкубации (Фигура 1).

Цитотоксическую активность XMU-MP-1 анализировали, обрабатывая клетки Namalwa реагентом XMU-MP-1 в концентрациях 0.3; 0,6; 1,25; 2,5 мкМ. Соединение добавляли к клеткам за 48 или 72 часа до детекции цитотоксичности. Цитотоксический эффект определяли через 48 и 72 часа двумя методами: микроскопически (оценивая нарушение морфологии клеток и появление других признаков цитопатогенного эффекта) и измеряя активность превращения MTS в окрашенный формазан под действием оксидоредуктаз живых клеток в кондиционной среде методом определения оптической плотности. Было показано, что цитотоксический эффект XMU-MP-1 проявлялся уже в концентрации 0.3 мкМ, что сопоставимо с его терапевтическими концентрациями на других клеточных и животных моделях, а также с концентрациями, в которых вещество ингибирует активности киназ сигнального пути Hippo - MST1 и MST2. Кроме того, вещество показывало дозозависимое цитотоксическое действие на клетки Namalwa (Фигура 1). Таким образом, нами было показано, что XMU-MP-1 подавляет рост лимфомы Беркитта.

Далее мы исследовали влияние комбинированной терапии XMU-MP-1 и 5-азацитидина рост В-клеточной лимфомы Беркитта.

Было отмечено, что вещество XMU-MP-1 проявляет дозозависимое усиление цитотоксического эффекта в присутствии 5-азацитидина (Фигура 2), при этом использование XMU-MP-1 в комбинации с 5-азацитидином требует более низких концентраций XMU-MP-1, необходимых для достижения 50% цитотоксического эффекта. Это говорит об усилении цитотоксической активности ингибитора киназ MST1 и MST2 - вещества XMU-MP-1 в отношении клеток лимфомы Беркитта при его применении совместно с 5-азацитидином.

Таким образом, мы показали противоопухолевую активность XMU-MP-1 в отношении клеток лимфомы Беркитта, а также усиление противоопухолевой активности при комбинировании его с 5-азацитидином.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, предназначенными для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но которые при этом не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

Пример 1. Оценка цитотоксичности XMU-MP-1

Клеточную линию лимфомы Беркитта Namalwa культивируют при+37°С во влажной атмосфере на культуральном пластике фирмы ТРР (Швецария) в среде DMEM (Life Technologies, США) с добавлением 10% фетальной сыворотки телят (BioSera, Франция), 5% CO2, если нет иного уточнения.

Цитотоксичность XMU-MP-1 в линии Namalwa оценивают с помощью набора CellTiter 96® AQueous One Solution (Promega, USA). 3a 24 ч до добавления вещества клетки Namalwa рассаживают на 96-луночный планшет в плотности 3×10⁴ клеток на лунку в среде DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки телят.Вещество добавляют в конечных концентрациях от 0.3 до 2.5 мкМ. Контролем служат клетки без добавления препарата. Через 48 и 72 ч цитотоксический эффект XMU-MP-1 анализируют микроскопией и MTS-теста, для чего добавляют раствор CellTiter 96® AQueous One Solution (Promega, USA), содержащий краситель MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt] и PES (phenazine ethosulfate;) и выдерживают клетки 3 ч при +37°С в СО₂ инкубаторе. Затем измеряют оптическую плотность растворов при 490 нм с помощью планшет-ридера Chameleon V (Hydex Оу, Финляндия). Количество формазанового продукта, измеренное по величине поглощения при длине волны 490 нм, прямо пропорционально количеству живых клеток в культуре. Токсичность различных концентраций препарата определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным данным строят график зависимости жизнеспособности клеток от концентрации препарата и определяют концентрацию, снижающую жизнеспособность клеток на 50% (ЦТД₅₀).

Из Фигуры 1 видно, что цитотоксичность XMU-MP-1 зависит от концентрации и при культивировании клеток Namalwa в течение 72 часов ЦТД₅₀ составляет 1.1 мкМ XMU-MP-1.

Пример 2. Оценка способности XMU-MP-1 усиливать цитотоксическое и противоопухолевое действие 5-азацитидина in vitro.

Цитотоксичность XMU-MP-1 в присутствии 5-азацитидина в линии Namalwa оценивают с помощью CellTiter 96® AQueous One Solution (Promega, USA). 3a 24 ч до добавления вещества клетки рассаживают на 96-луночный планшет в плотности 3×10⁴ клеток на лунку в среде DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки телят.К клеткам добавляют два вещества - XMU-MP-1 в концентрациях от 0,6 до 2,5 мкМ и 5-азацитидин в концентрации 1 мкМ. Контролем служат клетки без добавления препаратов. Через 48 и 72 часов цитотоксический эффект двух препаратов анализируют микроскопией и MTS-тестом, для этого добавляют раствор CellTiter 96® AQueous One Solution (Promega, USA), содержащий краситель MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt] и PES (phenazine ethosulfate;) и выдерживают клетки 3 ч при +37°С в СО₂ инкубаторе. Затем определяют оптическую плотность растворов на планшетном анализаторе Chameleon V (Hydex Оу, Финляндия) при 490 нм. Токсичность различных концентраций препарата определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным данным строят график зависимости жизнеспособности клеток от концентрации XMU-MP-1 в присутствии 5-азацитидина и определяют концентрацию, снижающую жизнеспособность клеток на 50% (ЦТД₅₀).

Из Фигуры 2 видно, что цитотоксическое действие XMU-MP-1 на клетки лимфомы Беркитта Namalwa усиливается в присутствии 5-азацитидина в микромолярных концентрациях. Присутствие 5-азацитина уменьшает концентрацию XMU-MP-1, при которой снижается жизнеспособность клеток на 50% (ЦТД₅₀) и ЦТД₅₀ достигается при концентрации XMU-MP-1 0.6 мкМ.

Изобретение относится к области медицины, а именно к применению 4-((5,10-диметил-6-оксо-6,10-дигидро-5Н-пиримидо[5,4-b]тиено[3,2-е][1,4]диазепин-2-ил)амино)бензолсульфонамида (XMU-MP-1) для подавления роста клеток лимфомы Беркитта. Вышеописанное изобретение позволяет создать высокоэффективные селективные и малотоксичные комбинации противоопухолевых препаратов для лечения лимфомы Беркитта. 2 ил., 2 пр.

Применение вещества - 4-((5,10-диметил-6-оксо-6,10-дигидро-5Н-пиримидо[5,4-b]тиено[3,2-е][1,4]диазепин-2-ил)амино)бензолсульфонамида (XMU-MP-1) для подавления роста клеток лимфомы Беркитта.