КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КЛЕТОК ПЕРВИЧНОГО РАКА ЯИЧНИКОВ, СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C12N5/09 C12Q1/02 

Область техники

Изобретение относится к области биомедицинской технологии, и, в частности, к культуральной среде и ее применению, и, более конкретно, к культуральной среде для клеток первичного рака яичников, а также к способу культивирования и его применению.

Уровень техники

Рак яичников относится к злокачественному опухолевому заболеванию, возникающему в яичнике, которое является одной из распространенных злокачественных опухолей женских репродуктивных органов и имеет частоту возникновения, уступающую только раку шейки матки и раку тела матки. Эпителиальный рак яичников является наиболее распространенным типом рака яичников, за которым следует злокачественная опухоль зародышевых клеток яичников. Эпителиальный рак яичников имеет самый высокий уровень смертности среди всех типов гинекологических опухолей и может представлять серьезную угрозу для жизни женщин. Рак яичников часто протекает бессимптомно на ранней стадии, но на поздней стадии могут возникать желудочно-кишечные симптомы, такие как дискомфорт в нижней части живота, вздутие живота и снижение аппетита. Основные варианты лечения рака яичников включают хирургическую резекцию, медикаментозную терапию и лучевую терапию, а общий прогноз неблагоприятный.

Химиотерапия является одним из основных методов лечения опухолей яичников. Несмотря на то, что в настоящее время доступно много химиотерапевтических препаратов для клинического применения, клиническая эффективность лечения опухолей яичников составляет лишь примерно 25%. Основная причина заключается в том, что большинство схем химиотерапии, используемых пациентами, основаны на опыте клиницистов, проводящих испытание/оценку/изменение лекарственного средства и испытание/повторную оценку без учета индивидуальных различий пациентов, что не только не улучшает терапевтический эффект препаратов, но и упускает наилучший период лечения, что приводит к переходу опухоли в запущенную стадию. Кроме того, пациенты обременены побочными эффектами препарата и чрезвычайно высокими медицинскими затратами на протяжении всего процесса лечения.

Таким образом, создание первичной модели опухоли in vitro и использование ее для проведения эффективных экспериментов по скринингу лекарственных средств является перспективным решением. В настоящее время основным способом создания in vitro моделей культуры первичных опухолей яичников является модель ксенотрансплантата опухоли (PDX), полученной от пациента, которая включает трансплантацию опухолевых клеток от пациентов голым мышам и изучение терапевтических эффектов различных противоопухолевых препаратов. Однако метод PDX также имеет некоторые недостатки, такие как видовые различия между людьми и мышами; длительный цикл испытаний (более 4 недель); высокая стоимость (более 200000); ложноположительные и ложноотрицательные результаты и т.д.

Краткое описание изобретения

Для решения вышеупомянутых технических проблем в настоящем изобретении предложена культуральная среда для клеток первичного рака яичников, а также способ культивирования in vitro и их применение.

Одним из аспектов изобретения является обеспечение культуральной среды для клеток первичного рака яичников, содержащей ингибитор киназы MST1/2, по меньшей мере один ингибитор киназы Rho, выбранный из группы, состоящей из Y27632, фасудила и Н-1152; добавки инсулин-трансферрин-селен; инсулин; простагландин Е2; эпидермальный фактор роста (EGF); гастрин; инсулиноподобный фактор роста 1; холерный токсин; амфирегулин; N2; и В27.

При этом ингибитор киназы MST1/2 содержит соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль, или сольват,

где

R₁ выбран из С1-С6 алкила, С3-С6 циклоалкила, С4-С8 циклоалкилалкила, С2-С6 спироциклоалкила и арила (например, фенила и нафтила и т.д.), необязательно замещенного 1-2 независимыми R₆, арил-С1-С6 алкила (например, фенилметила и т.д.), необязательно замещенного 1-2 независимыми R₆, и гетероарила (например, тиенила и т.д.), необязательно замещенного 1-2 независимыми R₆;

каждый из R₂ и R₃ независимо выбран из С1-С6 алкила, предпочтительно С1-С3 алкила, более предпочтительно метила;

каждый из R₄ и R₅ независимо, выбран из водорода, С1-С6 алкила, С3-С6 циклоалкила, С4-С8 циклоалкилалкила, гидроксил-С1-С6 алкила, С1-С6 галогеналкила, С1-С6 алкиламино-С1-С6 алкила, С1-С6 алкокси-С1-С6-алкила и С3-С6-гетероциклил-С1-С6 алкила (гетероциклил выбран, например, из пиперидила, тетрагидропиранила и т.д.);

R₆ выбран из галогена (предпочтительно фтора и хлора, более предпочтительно фтора), С1-С6 алкила (предпочтительно метила), С1-С6 алкокси (предпочтительно метокси) и С1-С6 галогеналкила (предпочтительно трифторметила).

В предпочтительном варианте осуществления ингибитор киназы MST1/2 содержит соединение формулы (Ia) или его фармацевтически приемлемую соль, или сольват,

где

R₁ выбран из С1-С6 алкила, фенила, необязательно замещенного 1-2 независимыми R₆, тиенила, необязательно замещенного 1-2 независимыми R₆, и фенилметила, необязательно замещенного 1-2 независимыми R₆; более предпочтительно, R₁ представляет собой фенил, необязательно замещенный 1-2 независимыми R₆;

R₅ выбран из водорода, С1-С6 алкила и С3-С6 циклоалкила; более предпочтительно, R₅ представляет собой водород;

R₆ независимо выбран из галогена, С1-С6 алкила и С1-С6 галогеналкила; более предпочтительно, R6 представляет собой фтор, метил или трифторметил.

Предпочтительно ингибитор киназы MST1/2 представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из следующих соединений, или его фармацевтически приемлемую соль или сольват.

Наиболее предпочтительно, ингибитор киназы MST1/2 согласно изобретению представляет собой соединение 1.

В одном варианте осуществления изобретения количество компонентов в культуральной среде согласно изобретению, удовлетворяет любому одному или более, или всем из следующих условий:

(1) количество ингибитора киназы MST1/2 в культуральной среде составляет 2,5-20 мкМ;

(2) количество ингибитора киназы Rho в культуральной среде составляет 2,5-20 мкМ;

(3) объемное отношение добавки инсулин-трансферрин-селен к культуральной среде составляет 1:800-1:50;

(4) количество инсулина в культуральной среде составляет 1-27 мкг/мл;

(5) количество простагландина Е2 в культуральной среде составляет 2,5-10 мкМ;

(6) количество эпидермального фактора роста в культуральной среде составляет 2,5-40 нг/мл;

(7) количество гастрина в культуральной среде составляет 1-9 нМ;

(8) количество инсулиноподобного фактора роста 1 в культуральной среде составляет 25-100 нг/мл;

(9) количество холерного токсина в культуральной среде составляет 0,05-0,8 мкг/мл;

(10) количество амфирегулина в культуральной среде составляет 1-81 нг/мл;

(11) объемное отношение добавки В27 к культуральной среде предпочтительно составляет 1:25-1:400;

(12) объемное отношение добавки N2 к культуральной среде предпочтительно составляет 1:50-1:400.

В одном варианте осуществления изобретения культуральная среда дополнительно содержит исходную среду, выбранную из группы, состоящей из DMEM/F12, DMEM, F12 или RPMI-1640; и один или более антибиотиков, выбранных из группы, состоящей из стрептомицина/пенициллина, амфотерицина В и примоцина.

В предпочтительном варианте осуществления, в случае использования стрептомицина/пенициллина в качестве антибиотиков, диапазон концентраций стрептомицина составляет 25-400 мкг/мл, диапазон концентраций пенициллина составляет 25-400 Ед/мл; в случае использования амфотерицина B в качестве антибиотиков, диапазон концентраций составляет 0,25-4 мкг/мл; и в случае использования примоцина в качестве антибиотиков, диапазон концентраций составляет 25-400 мкг/мл.

В соответствии со вторым аспектом, в настоящем изобретении также предложен способ культивирования клеток первичного рака яичников in vitro. В способе культивирования клеток первичного рака яичников in vitro в соответствии с настоящим изобретением клетки первичного рака яичников культивируют in vitro с применением культуральной среды для клеток первичного рака яичников в соответствии с настоящим изобретением.

Способ культивирования клеток первичного рака яичников in vitro в соответствии с настоящим изобретением включает следующие стадии:

1. Выделение клеток первичного рака яичников

(1) образцы тканей рака яичников отделяют и добавляют в смесь базальной среды и раствора для расщепления тканей в соотношении 1:3 (примечание: количество добавленного раствора для расщепления тканей составляет примерно 5-10 мл раствора для расщепления тканей на 1 г опухолевой ткани), и помещают в шейкер с постоянной температурой для расщепления при температуре расщепления 4-37°С и скорости 200-350 об/мин;

(2) расщепление может быть прекращено после его полного завершения, т.е. когда не обнаруживаются видимые остатки ткани, и время расщепления составляет 3-6 часов;

(3) супернатант удаляют после центрифугирования со скоростью центрифугирования 1200-1600 об/мин в течение 2-6 минут и добавляют базальную среду для ресуспендирования клеток для последующего использования.

При этом состав базальной среды содержит исходную среду, выбранную из группы, состоящей из DMEM/F12, DMEM, F12 или RPMI-1640; и один или более антибиотиков, выбранных из группы, состоящей из стрептомицина/пенициллина, амфотерицина В и примоцина. Состав раствора для расщепления тканей содержит среду 1640, коллагеназу II (1-2 мг/мл), коллагеназу IV (1-2 мг/мл), ДНКазу (50-100 Ед/мл), гиалуронидазу (0,5-1 мг/мл), хлорид кальция (1-5 мМ), бычий сывороточный альбумин БСА (5-10 мг/мл).

2. Культивирование клеток с применением культуральной среды для клеток первичного рака яичников в соответствии с настоящим изобретением.

Базальную среду смешивают с матригелем (Corning®, 356231) в соотношении от 25:1 до 100:1 на льду. После высеивания клеток планшеты инкубируют в термостате с 5% СО₂ при 37°С в течение 25-35 минут и удаляют супернатант. Клетки первичного рака яичников, полученные на вышеуказанной стадии 1, ресуспендируют в культуральной среде для клеток первичного рака яичников в соответствии с настоящим изобретением и подсчитывают количество клеток. Плотность клеток доводят до 2-8×10⁴ клеток/см². Добавляют культуральную среду для клеток первичного рака яичников согласно настоящему изобретению и культивируют клетки в инкубаторе.

В другом аспекте настоящего изобретения также предложен способ скрининга лекарственного средства от рака яичников, который включает следующие стадии:

(1) культивирование клеток первичного рака яичников с применением способа культивирования клеток первичного рака яичников в соответствии с настоящим изобретением;

(2) выбор лекарственного средства для исследования и его разведение до требуемых градиентов концентрации;

(3) добавление лекарственного средства, разведенного до различных градиентов концентрации, в клетки, культивированные на стадии (1);

(4) детектирование жизнеспособности клеток.

Техническое решение в соответствии с настоящим изобретением позволяет достичь следующих технических эффектов:

(1) показатель успешности культивирования клеток первичного рака яичников улучшается, и изобретение обеспечивает возможность культивировать опухолевые ткани из различных источников образцов, таких как эпителиальный рак, злокачественная опухоль зародышевых клеток, стромальная опухоль и метастатическая опухоль, и показатель успешности составляет 80% или более;

(2) клетки первичного рака яичников, культивированные in vitro, обеспечивают сохранение патологических характеристик, присутствующих у пациентов;

(3) культивированию клеток первичного рака яичников не мешают стромальные клетки, такие как фибробласты и адипоциты;

(4) эффективность размножения высока, и клетки первичного рака яичников могут быть успешно культивированы примерно за неделю, а размноженные клетки первичного рака яичников обладают способностью к непрерывному пересеву;

(5) стоимость культивирования является контролируемой, поскольку культуральная среда не требует дорогостоящих факторов, таких как агонисты Wnt;

(6) культуральная среда не содержит сыворотки и позволяет избежать совместного культивирования первичных клеток со стромальными клетками, а также решить ряд проблем, существующих в традиционных протоколах культивирования, таких как протоколы, содержащие сыворотку, и совместное культивирование со стромальными клетками;

(7) клетки первичного рака яичников, культивируемые по вышеуказанной технологии, многочисленны и в высокой степени однородны, что делает их пригодными для высокопроизводительного скрининга новых соединений-кандидатов и обеспечивает высокопроизводительную чувствительность к лекарственным средствам in vitro для пациентов.

Описание чертежей

На Фиг. 1 представлен график, демонстрирующий влияние различных комбинаций факторов, добавленных в культуральную среду для клеток первичного рака яичников, на рост клеток первичного рака яичников.

На Фиг. 2A-2L представлены графики, демонстрирующие влияние различных концентраций каждого фактора, добавленного в культуральную среду для клеток первичного рака яичников, на рост клеток первичного рака яичников.

На Фиг. 3A-3F представлены сделанные под микроскопом фотографии клеток первичного рака яичников, культивированных с применением культуральной среды для клеток первичного рака яичников в соответствии с настоящим изобретением.

На Фиг. 4A-4G показаны результаты иммуногистохимического анализа клеток исходной ткани рака яичников.

На Фиг. 5A-5G показаны результаты иммуногистохимического анализа клеток первичного яичников, полученные путем культивирования исходных клеток ткани рака яичников в четвертом пересеве с применением культуральной для клеток первичного рака яичников в соответствии с настоящим изобретением.

На Фиг. 6А-6С показаны кривые роста клеток первичного рака яичников, культивированных с применением культуральной среды для клеток первичного рака яичников в соответствии с настоящим изобретением, культуральной среды в соответствии с известным уровнем техники и доступной для приобретения культуральной среды, соответственно.

На Фиг. 7A-7F показаны результаты скрининга лекарственных средств в отношении клеток первичного рака яичников, культивированных в различных пересевах с применением культуральной среды для клеток первичного рака яичников в соответствии с настоящим изобретением.

Подробное описание изобретения

Для того чтобы лучше понять настоящее изобретение, оно дополнительно описано ниже вместе с вариантами осуществления и чертежами. Следующие примеры приведены исключительно с целью иллюстрации, но не для ограничения настоящего изобретения.

[Примеры получения ингибиторов киназы MST1/2]

В описании характеристик ингибитор киназы MST1/2 относится к любому ингибитору, который прямо или косвенно отрицательно регулирует передачу сигналов MST1/2. Как правило, ингибиторы киназы MST1/2 снижают активность киназы MST1/2, например, связываясь с ней. Поскольку MST1 и MST2 имеют сходные структуры, то ингибиторами киназы MST1/2 могут быть, например, соединения, которые связываются с MST1 или MST2 и снижают их активность.

1. Получение ингибитора киназы MST1/2, соединения 1. 4-((7-(2,6-Дифторфенил)-5,8-диметил-6-оксо-5,6,7,8-тетрагидроптеридин-2-ил)амино)бензсульфамид 1

Метил-2-амино-2-(2,6-дифторфенил)ацетат (А2): 2-амино-2-(2,6-дифторфенил)уксусную кислоту (2,0 г) и затем метанол (30 мл) добавляли в круглодонную колбу, затем по каплям добавляли тионилхлорид (1,2 мл) на бане со льдом. Проводили реакцию в реакционной системе в течение ночи при 85°С. После завершения реакции систему выпаривали при пониженном давлении, чтобы высушить растворитель, и полученное белое твердое вещество непосредственно использовали на следующей стадии.

Метил-2-((2-хлор-5-нитропиримидин-4-ил)амино)-2-(2,6-дифторфенил)ацетат (A3): метил-2-амино-2-(2,6-дифторфенил)ацетат (2 г), а затем ацетон (30 мл) и карбонат калия (2,2 г) добавляли в крутодонную колбу и затем охлаждали систему до -10°С на бане с соленым льдом, а затем медленно добавляли раствор 2,4-дихлор-5-нитропиримидина (3,1 г) в ацетоне. Реакционную систему перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. После завершения реакции реакционную смесь фильтровали, растворитель удаляли из фильтрата при пониженном давлении и очищали остаток с помощью колоночной хроматографии на силикагеле под давлением с получением соединения A3. ЖХ/МС: М+Н 359,0.

В круглодонную колбу добавляли 2-хлор-7-(2,6-дифторфенил)-7,8-дигидроптеридин-6(5Н)-он (А4): метил-2-((2-хлор-5-нитропиримидин-4-ил)амино)-2-(2,6-дифторфенил)ацетат (2,5 г) и затем уксусную кислоту (50 мл) и порошок железа (3,9 г). Реакционную систему перемешивали при 60°С в течение двух часов. После завершения реакции реакционную систему выпаривали при пониженном давлении, чтобы высушить растворитель, и полученную смесь нейтрализовали до щелочной реакции насыщенным раствором бикарбоната натрия и экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу промывали водой и насыщенным солевым раствором и сушили безводным сульфатом натрия. Органическую фазу фильтровали и упаривали досуха при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт промывали диэтиловым эфиром с получением соединения А4. ЖХ/МС: М+Н 297,0.

2-Хлор-7-(2,6-дифторфенил)-5,8-диметил-7,8-дигидроптеридин-6(5Н)-он (А5): 2-хлор-7-(2,6-дифторфенил)-7,8-дигидроптеридин-6(5Н)-он (2 г) и N,N-диметилацетамид (10 мл) добавляли в круглодонную колбу и охлаждали до -35°С, затем добавляли йодметан (0,9 мл), а затем гидрид натрия (615 мг) и перемешивали реакционную систему в течение двух часов. После завершения реакции реакционную смесь гасили водой и экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу промывали водой и насыщенным солевым раствором, соответственно, и сушили безводным сульфатом натрия. Органическую фазу фильтровали и упаривали досуха при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт промывали диэтиловым эфиром с получением соединения А5. ЖХ/МС: М+Н 325,0.

В круглодонную колбу добавляли 4-((7-(2,6-дифторфенил)-5,8-диметил-6-оксо-5,6,7,8-тетрагидроптеридин-2-ил)амино)бензсульфамид (1):

2-хлор-7-(2,6-дифторфенил)-5,8-диметил-7,8-дигидроптеридин-6(5Н)-он (100 мг), сульфаниламид (53 мг), п-толуолсульфоновую кислоту (53 мг) и втор-бутанол (5 мл). Реакционную систему перемешивали при 120°С в течение ночи. После завершения реакции реакционную смесь фильтровали и промывали метанолом и диэтиловым эфиром с получением соединения 1. ЖХ/МС: М+Н 461,1.

2. Получение других соединений-ингибиторов MST1/2 согласно изобретению

Другие соединения-ингибиторы MST1/2 согласно изобретению были синтезированы способом, аналогичным способу синтеза соединения 1, и их структуры и данные масс-спектров показаны в следующей таблице.

Пример 1. Влияние различных факторов, добавленных культуральную среду для клеток первичного рака яичников, на пролиферацию клеток первичного рака яичников

(1) Получение культуральной среды для клеток первичного рака яичников.

Сначала получали базальную среду, содержащую исходную среду. Исходная среда может быть выбрана из группы, состоящей из DMEM/F12, DMEM, F12 или RPMI-1640, обычно используемых в данной области техники. В этом примере состав базальной среды следующий: среда DMEM/F12 (приобретали у компании Corning) + 100 мкг/мл примоцина (приобретали у компании InvivoGen, 0,2% (об./об.), коммерческий продукт имеет концентрацию 50 мг/мл). В базальную среду добавляли различные типы добавок (см. таблицу 1) для получения культуральных сред для клеток первичного рака яичников с различными компонентами.

(2) Выделение и обработка клеток первичного рака яичников

1. Выбор образца

Образцы тканей (интраоперационные) солидной опухоли рака яичников были получены от пациентов профессиональным врачом профессиональных медицинских учреждений, и все пациенты подписали информированное согласие. Интраоперационные образцы размером 0,25 см3, эндоскопические образцы размером 0,025 см³ хранили и транспортировали с использованием доступного для приобретения раствора для сохранения тканей (производитель: Miltenyi Biotec).

2. Подготовка материалов.

После стерилизации поверхностей стерильные пробирки для центрифугирования емкостью 15 мл, дозаторы, пипетки емкостью 10 мл, стерильные наконечники пипеток и т.д. помещали на ультрачистое рабочее место для облучения ультрафиолетом в течение 30 минут. Базальную среду заранее вынимали из холодильника с температурой 4°С за 30 минут, а раствор для расщепления тканей заранее вынимали из холодильника с температурой -20°С за 30 минут.

Раствор для расщепления тканей: среда 1640 (Corning, 10-040-CVR), коллагеназа II (2 мг/мл), коллагеназа IV (2 мг/мл), ДНКаза (50 Ед/мл), гиалуронидаза (0,75 мг/мл), хлорид кальция (3,3 мМ), БСА (10 мг/мл).

Коллагеназа II, коллагеназа IV, ДНКаза и гиалуронидаза, упомянутые выше, были приобретены у Sigma Corporation; хлорид кальция был приобретен у Sangon Biotech (Шанхай) Co., Ltd.; БСА был приобретен у Biofroxx Corporation.

3. Выделение клеток первичного рака яичников

3.1. Образцы ткани переносили из ультрачистого рабочего места в чашку для культивирования и удаляли ткань с кровью. Образцы ткани дважды промывали базальной средой, а затем переносили в другую чашку для культивирования и механически разрезали стерильным скальпелем на блоки ткани размером 1×1×1 мм³.

3.2. Вырезанные интраоперационные ткани аспирировали в пробирку для центрифугирования емкостью 15 мл, в которую добавляли 5 мл базальной среды, тщательно перемешивали, а затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 4 минут.

3.3. Супернатант удаляли, и к полученному осадку добавляли смесь 1:3 базальной среды и раствора для расщепления тканей (количество добавленного раствора для расщепления тканей составляло примерно 10 мл раствора для расщепления тканей на 1 г опухолевой ткани). Образцы маркировали названиями и номерами, герметично запечатывали герметизирующей пленкой, а затем расщепляли на шейкере (Zhichu Instrument ZQLY-180N) при 37°С, 300 об/мин. Завершение расщепления определяли путем наблюдения каждые 30 минут, исходя из наличия или отсутствия видимых частиц. Время расщепления составляло 4 часа.

3.4. После того как расщепление было завершено, нерасщепленную тканевую массу отфильтровывали через сетчатый фильтр с размером пор 100 мкм. Тканевую массу на фильтре промывали базальной средой в пробирку для центрифугирования для уменьшения потери клеток. Полученный раствор центрифугировали при 25°С, 1500 об/мин в течение 4 минут.

3.5. Супернатант удаляли и визуально исследовали осадок на наличие клеток крови. Если клетки крови присутствовали, в полученный осадок добавляли 8 мл реагента, лизирующего клетки крови (приобретенного у Sigma), и тщательно перемешивали, лизировали при 4°С в течение 20 минут, однократно переворачивая и перемешивая во время процесса. Полученный раствор центрифугировали при 25°С, 1500 об/мин в течение 4 минут.

3.6. Супернатант удаляли и добавляли 2 мл базальной среды для ресуспендирования клеток для сохранения.

4. Подсчет клеток и обработка

4.1 Микроскопическое исследование: небольшое количество ресуспендированных клеток высевали в чашку для культивирования и визуально исследовали плотность и морфологию раковых клеток под микроскопом (CNOPTEC, BDS400);

4.2 Подсчет жизнеспособных клеток: 12 мкл ресуспендированной суспензии клеток тщательно смешивали с 12 мкл окрашивающего раствора трипанового синего (Sangon Biotech (Шанхай) Co., Ltd.), а затем 20 мкл смеси добавляли в слайд-планшет для подсчета клеток (Countstar, комплектация: 50 шт. на коробку). Процент жизнеспособных крупных клеток (размер клеток > 10 мкм) = количество жизнеспособных клеток / общее количество клеток × 100%, рассчитывали с помощью счетчика клеток (Countstar, IC1000).

(3) Культивирование клеток первичного рака яичников. Клетки первичного рака яичников, выделенные из образцов ткани 2 клинических случаев рака яичников (пронумерованных L40 и LQQ) в соответствии с описанной выше стадией (2), ресуспендировали в культуральной среде, указанной в таблице 1, соответственно, и подсчитывали количество клеток. Базальную среду смешивали с матригелем (Corning®, 356231) в соотношении 50:1 на льду. Помещали на планшет 300 мкл смеси и инкубировали в термостате с 5% СО₂ при 37°С в течение 25-35 минут, предпочтительно 30 минут. Удаляли супернатант. Культуральную среду с различными компонентами из таблицы 1, содержащую клетки первичного рака яичников, добавляли в 48-луночный планшет в количестве 4×10⁴ клеток на лунку и 500 мкл на лунку. В качестве контроля использовали базальную среду без добавления каких-либо добавок. Через 7-10 дней культивирования клетки вырастали до 85%, культуральную среду удаляли и однократно промывали клетки, используя 100 мкл 0,05% трипсина (приобретенного у Gibco) на лунку. После аспирации трипсина в каждую лунку добавляли 200 мкл 0,05% трипсина. Затем планшет помещали в термостат при 37°С и 5% СО₂ для протекания реакции в течение 10 минут, и наблюдали под микроскопом (CNOPTEC, BDS400), что клетки полностью расщепились. Затем добавляли 300 мкл среды DMEM/F12, содержащей 10% сыворотки (Excell Bio, FND500), для прекращения расщепления и добавляли 20 мкл полученного раствора в слайд-планшет для подсчета клеток (Countstar, размер: 50 шт. на коробку). Общее количество клеток подсчитывали с помощью счетчика клеток (Countstar, IC1000). Экспериментальные результаты приведены в таблице 1.

где «+» показывает, что, по сравнению с базальной средой, культуральная среда с добавкой(-ами) оказывает эффект стимуляции пролиферации двух клинических случаев клеток первичного рака яичника, выделенных из ткани рака яичника; «-» показывает, что культуральная среда с добавкой(-ами) оказывает эффект стимуляции пролиферации одного клинического случая клеток первичного рака яичника, выделенных из ткани рака яичника; «о» показывает, что культуральная среда с добавкой(-ами) не оказывает значимого эффекта на пролиферацию по меньшей мере двух клинических случаев клеток первичного рака яичника, выделенных из ткани рака яичника.

В соответствии с приведенными выше результатами, для дальнейших экспериментов по культивированию были выбраны такие факторы как соединение 1, простагландин Е2, В27, N2, эпидермальный фактор роста, инсулин, добавка инсулин-трансферрин-селен, амфирегулин, Y-27632, инсулиноподобный фактор роста 1, гастрин, холерный токсин.

Пример 2. Влияние различных комбинаций факторов, добавленных в культуральную среду для клеток первичного рака яичников, на пролиферацию клеток первичного рака яичников

Культуральные среды для клеток первичного рака яичников, содержащие различные комбинации добавленных факторов, получали в соответствии с компонентами, указанными в таблице 2, для изучения эффекта стимуляции пролиферации клеток первичного рака яичников различными комбинациями добавленных факторов.

Клетки первичного рака яичников получали из ткани рака яичников (пронумерованной L46, L55, L56) в соответствии со способом, описанным на стадии (2)-3 в примере 1. Полученную суспензию клеток разделяли на 14 равных частей, которые затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 4 минут. После центрифугирования клетки ресуспендировали в 200 мкл БС и культуральных средах №1-13, соответственно. Базальную среду смешивали с матригелем (Corning®, 356231) в соотношении 50:1 на льду. В 48-луночный планшет помещали 300 мкл смеси и инкубировали в термостате с 5% СО₂ при 37°С в течение 25-35 минут, предпочтительно 30 минут. Удаляли супернатант. Клетки первичного рака яичников инокулировали в 48-луночный планшет при плотности жизнеспособных клеток 4×10⁴ клеток на лунку (40000 клеток на лунку). Каждую лунку 48-луночного планшета доводили до объема 1 мл соответствующими культуральными средами и тщательно перемешивали полученную смесь. После стерилизации поверхности планшет помещали в термостат с 5% СО₂ при 37°С (приобретенный у Thermo Fisher) для культивирования.

Когда клетки вырастали до более чем 85% в 48-луночном планшете, удаляли культуральную среду. Клетки однократно промывали 100 мкл 0,05% трипсина на лунку (приобретали у Gibco). После аспирации трипсина в каждую лунку добавляли 200 мкл 0,05% трипсина. Затем планшет помещали в термостат при 37°С и 5% СО₂ для протекания реакции в течение 10 минут, и наблюдали под микроскопом (CNOPTEC, BDS400), что клетки полностью расщепились. Затем добавляли 300 мкл среды DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, для прекращения расщепления и добавляли 20 мкл полученной смеси в слайд-планшет для подсчета клеток (Countstar, комплектация: 50 шт. на коробку). Общее количество клеток подсчитывали с помощью счетчика клеток (Countstar, IC1000). Результаты, полученные для клеток первичного рака яичников, выделенных из L46, L55 и L56 (интраоперационных), показаны на Фиг. 1.

Согласно результатам, показанным на Фиг. 1, по сравнению с базальной средой, вышеуказанные культуральные среды №1-13 могут в различной степени стимулировать пролиферацию клеток первичного рака яичников. Следовательно, когда клетки первичного рака яичников культивируют с культуральной средой, содержащей такие добавки как соединение 1, простагландины Е2, В27, N2, эпидермальный фактор роста, инсулин, добавка инсулин-трансферрин-селен, амфирегулин, Y-27632, инсулиноподобный фактор роста 1, гастрин, холерный токсин, пролиферация является более эффективной.

Пример 3. Влияние различных концентраций добавленных факторов, содержащихся в культуральной среде для клеток первичного рака яичников, на пролиферацию клеток первичного рака яичников

Клетки первичного рака яичников получали из образцов ткани (пронумерованных А26083, L56, L62) в соответствии со способом, описанным на стадии (2)-3 в примере 1. Для культивирования использовали культуральную среду с комбинацией эффективных факторов, описанных в примере 2. Базальную среду смешивали с матригелем (Corning®, 356231) в соотношении 50:1 на льду. В культуральную колбу Т12.5 помещали 4 мл смеси и инкубировали в термостате с 5% СО₂ при 37°С в течение 25-35 минут, предпочтительно 30 минут. Удаляли супернатант.

Полученные клетки первичного рака яичников высевали в планшет Т12.5 (300000 клеток на лунку) при плотности жизнеспособных клеток 2,4×10⁴ клеток/см². Затем планшет помещали в термостат при 37°С, 5% СО₂ (приобретенный у Thermo Fisher) после проведения стерилизации поверхности. Клетки культивировали и размножали с использованием культуральной среды с комбинацией эффективных факторов (содержащей базальную среду (БС), 20 мкМ соединения 1, 5 мкМ простагландина Е2, 1:100 (об./об.) В27, 1:100 (об./об.) N2, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, 3 мкг/мл инсулина, 1:50 (об./об.) добавки инсулин-трансферрин-селен, 27 нг/мл амфирегулина, 5 мкМ Y-27632, 50 нг/мл инсулиноподобного фактора роста 1, 27 нМ гастрина, 0,1 мкг/мл холерного токсина), определенных в примере 2, до тех пор, пока клетки не выросли до 85% или более, и добавляли 500 мкл 0,05% трипсина (приобретенного у Gibco) для промывки клеток в течение 1 минуты. После аспирации трипсина в каждую лунку добавляли 500 мкл 0,05% трипсина и помещали планшет в термостат при 37°С, 5% СО₂ для проведения реакции в течение 2-10 минут. Расщепление прекращали после полного расщепления клеток. После центрифугирования при 1500 об/мин в течение 4 минут удаляли супернатант. Клеточный осадок ресуспендировали в DMEM/F12, а затем добавляли 20 мкл суспензии в слайд-планшет для подсчета клеток (производитель: Countstar, комплектация: 50 шт. на коробку) и подсчитывали общее количество клеток с помощью счетчика клеток (Countstar, IC1000). Полученные клетки использовали в следующих экспериментах по культивированию.

Для экспериментов были получены следующие 12 составов культуральных сред.

Состав 1: вышеупомянутая культуральная среда для клеток первичного рака яичников без соединения 1;

Состав 2: вышеупомянутая культуральная среда для клеток первичного рака яичников без простагландина Е2;

Состав 3: вышеупомянутая культуральная среда для клеток первичного рака яичников без В27;

Состав 4: вышеупомянутая культуральная среда для клеток первичного рака яичников без N2;

Состав 5: вышеупомянутая культуральная среда для клеток первичного рака яичников без эпидермального фактора роста;

Состав 6: вышеупомянутая культуральная среда для клеток первичного рака яичников без инсулина;

Состав 7: вышеупомянутая культуральная среда для клеток первичного рака яичников без добавки инсулин-трансферрин-селен;

Состав 8: вышеупомянутая культуральная среда для клеток первичного рака яичников без амфирегулина;

Состав 9: вышеупомянутая культуральная среда для клеток первичного рака яичников без Y-27632;

Состав 10: вышеупомянутая культуральная среда для клеток первичного рака яичников без инсулиноподобного фактора роста 1;

Состав 11: вышеупомянутая культуральная среда для клеток первичного рака яичников без гастрина;

Состав 12: вышеупомянутая культуральная среда для клеток первичного рака яичников без холерного токсина.

В каждую лунку добавляли 20 мкл ресуспендированных клеток, содержащих 4×10⁴ клеток, которые затем разбавляли 1 мл культуральной среды вышеуказанных составов 1-12, соответственно.

При использовании культуральной среды состава 1, полученное соединение 1 добавляли в каждую лунку 48-луночного планшета с высеянными первичными клетками, по 1 мл на лунку, и конечные концентрации соединения 1 составляли 2,5 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ и 40 мкМ, соответственно; и в качестве лунки холостого контроля (ВС) использовали лунку с культуральной средой состава 1.

При использовании культуральной среды состава 2, полученный простагландин Е2 добавляли в каждую лунку 48-луночного планшета с высеянными первичными клетками, по 1 мл на лунку, и конечные концентрации простагландина Е2 составляли 2,5 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ и 40 мкМ, соответственно; и в качестве лунки холостого контроля (ВС) использовали лунку с культуральной средой состава 2.

При использовании культуральной среды состава 3, полученный В27 добавляли в каждую лунку 48-луночного планшета с высеянными первичными клетками, по 1 мл на лунку, и конечные концентрации В27 составляли 1:400 (об./об.), 1:200 (об./об.), 1:100 (об./об.), 1:50 (об./об.) и 1:25 (об./об.), соответственно; и в качестве лунки холостого контроля (ВС) использовали лунку с культуральной средой состава 3.

При использовании культуральной среды состава 4, полученный N2 добавляли в каждую лунку 48-луночного планшета с высеянными первичными клетками, по 1 мл на лунку, и конечные концентрации N2 составляли 1:400 (об./об.), 1:200 (об./об.), 1:100 (об./об.), 1:50 (об./об.) и 1:25 (об./об.), соответственно; и в качестве лунки холостого контроля (ВС) использовали лунку с культуральной средой состава 4.

При использовании культуральной среды состава 5, полученный эпидермальный фактор роста добавляли в каждую лунку 48-луночного планшета с высеянными первичными клетками, по 1 мл на лунку, и конечные концентрации эпидермального фактора роста составляли 2,5 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл и 40 нг/мл, соответственно; и в качестве лунки холостого контроля (ВС) использовали лунку с культуральной средой состава 5.

При использовании культуральной среды состава 6, полученный инсулин добавляли в каждую лунку 48-луночного планшета с высеянными первичными клетками, по 1 мл на лунку, и конечные концентрации инсулина составляли 1 мкг/мл, 3 мкг/мл, 9 мкг/мл, 27 мкг/мл и 81 мкг/мл, соответственно; и в качестве лунки холостого контроля (ВС) использовали лунку с культуральной средой состава 6.

При использовании культуральной среды состава 7 полученную добавку инсулин-трансферрин-селен добавляли в каждую лунку 48-луночного планшета с высеянными первичными клетками, по 1 мл на лунку, и конечные концентрации добавки инсулин-трансферрин-селен составляли 1:800 (об./об.), 1:400 (об./об.), 1:200 (об./об.), 1:100 (об./об.) и 1:50 (об./об.), соответственно; и в качестве лунки холостого контроля (ВС) использовали лунку с культуральной средой состава 7.

При использовании культуральной среды состава 8 полученный амфирегулин добавляли в каждую лунку 48-луночного планшета с высеянными первичными клетками, по 1 мл на лунку, и конечные концентрации амфирегулина составляли 1 нг/мл, 3 нг/мл, 9 нг/мл, 27 нг/мл и 81 нг/мл, соответственно; и в качестве лунки холостого контроля (ВС) использовали лунку с культуральной средой состава 8.

При использовании культуральной среды состава 9 полученный Y-27632 добавляли в каждую лунку 48-луночного планшета с высеянными первичными клетками, по 1 мл на лунку, и конечные концентрации Y-27632 составляли 2,5 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ и 40 мкМ, соответственно; и в качестве лунки холостого контроля (ВС) использовали лунку с культуральной средой состава 9.

При использовании культуральной среды состава 10 полученный инсулиноподобный фактор роста 1 добавляли в каждую лунку 48-луночного планшета с высеянными первичными клетками, по 1 мл на лунку, и конечные концентрации инсулиноподобного фактора роста 1 составляли 12,5 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл и 200 нг/мл, соответственно; и в качестве лунки холостого контроля (ВС) использовали лунку с культуральной средой состава 10.

При использовании культуральной среды состава 11 полученный гастрин добавляли в каждую лунку 48-луночного планшета с высеянными первичными клетками, по 1 мл на лунку, и конечные концентрации гастрина составляли 1 нМ, 3 нМ, 9 нМ, 27 нМ и 81 нМ, соответственно; и в качестве лунки холостого контроля (ВС) использовали лунку с культуральной средой состава 11.

При использовании культуральной среды состава 12 полученный холерный токсин добавляли в каждую лунку 48-луночного планшета с высеянными первичными клетками, по 1 мл на лунку, и конечные концентрации холерного токсина составляли 0,05 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл и 0,8 мкг/мл, соответственно; и в качестве лунки холостого контроля (ВС) использовали лунку с культуральной средой состава 12.

После того как клетки разрастались примерно до 85% площади 48 лунок, клетки подвергали ферментативному расщеплению и подсчитывали их, и вычисляли кратность пролиферации с учетом количества клеток в лунке холостого контроля (ВС), а результаты представлены на Фиг. 2A-2L, соответственно. На Фиг. 2A-2L соотношение представляет собой отношение количества клеток первого пересева, культивированных с использованием каждой культуральной среды, к количеству клеток первого пересева, культивированных в соответствующей лунке холостого контроля. Если значение соотношения больше 1, это указывает на то, что стимулирующее пролиферацию действие полученной культуральной среды, содержащей различные концентрации факторов или низкомолекулярных соединений, предпочтительнее, чем действие культуральной среды в лунке холостого контроля; если значение соотношения меньше 1, это указывает на то, что стимулирующее пролиферацию действие полученной культуральной среды, содержащей различные концентрации факторов или низкомолекулярных соединений, слабее, чем действие культуральной среды в лунке холостого контроля.

В соответствии с результатами, показанными на Фиг. 2A-2L, соединение 1, простагландин Е2, В27, N2, эпидермальный фактор роста, инсулин, добавка инсулин-трансферрин-селен, амфирегулин, Y-27632, инсулиноподобный фактор роста 1, гастрин и холерный токсин оказывают значительное стимулирующее пролиферацию действие на клетки первичного рака яичников. Согласно результатам этого примера, количество соединения 1 предпочтительно составляет 2,5-20 мкМ, более предпочтительно 2,5-10 мкМ, и влияние на пролиферацию клеток является наиболее значительным, когда концентрация составляет 5 мкМ; количество простагландина Е2 предпочтительно составляет 2,5-10 мкМ, и влияние на пролиферацию клеток является наиболее значительным, когда концентрация составляет 2,5 мкМ; количество В27 предпочтительно составляет 1:25-1:400 (об./об.) и более предпочтительно 1:50-1:200 (об./об.), и влияние на пролиферацию клеток является наиболее значительным, когда концентрация составляет 1:100 (об./об.); количество N2 предпочтительно составляет 1:50-1:400 (об./об.), и влияние на пролиферацию клеток является наиболее значительным, когда концентрация составляет 1:400 (об./об.); количество эпидермального фактора роста предпочтительно составляет 2,5-40 нг/мл, более предпочтительно 5-20 нг/мл, и влияние на пролиферацию клеток является наиболее значительным, когда концентрация составляет 10 нг/мл; количество инсулина предпочтительно составляет 1-27 мкг/мл и более предпочтительно 3-9 мкг/мл, и влияние на пролиферацию клеток является наиболее значительным, когда концентрация составляет 9 мкг/мл; количество добавки инсулин-трансферрин-селен предпочтительно составляет 1:50-1:800 (об./об.), более предпочтительно 1:400-1:100 (об./об.), и влияние на пролиферацию клеток является наиболее значительным, когда концентрация составляет 1:200 (об./об.); количество амфирегулина предпочтительно составляет 1-81 нг/мл, более предпочтительно 1-27 нг/мл, и влияние на пролиферацию клеток является наиболее значительным, когда концентрация составляет 3 нг/мл; количество Y-27632 предпочтительно составляет 2,5-20 мкМ, и влияние на пролиферацию клеток является наиболее значительным, когда концентрация составляет 5 мкМ; количество инсулиноподобного фактора роста 1 предпочтительно составляет 25-100 нг/мл, и влияние на пролиферацию клеток является наиболее значительным, когда концентрация составляет 50 нг/мл; количество гастрина предпочтительно составляет 1-9 нМ, и влияние на пролиферацию клеток является наиболее значительным, когда концентрация составляет 3 нМ; количество холерного токсина предпочтительно составляет 0,05-0,8 мкг/мл, более предпочтительно 0,05-0,2 мкг/мл, и влияние на пролиферацию клеток является наиболее значительным, когда концентрация составляет 0,1 мкг/мл.

Используя наиболее предпочтительные концентрации каждого добавленного фактора в вышеуказанной культуральной среде, культуральная среда для клеток первичного рака яичников согласно настоящему изобретению, используемая в следующих примерах, содержит: базальную среду (БС), 5 мкМ соединения 1, 2,5 мкМ простагландина Е2, 1:100 (об./об.) В27, 1:400 (об./об.) N2, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, 9 мкг/мл инсулина, 1:200 (об./об.) добавки инсулин-трансферрин-селен, 3 нг/мл амфирегулина, 5 мкМ Y-27632, 50 нг/мл инсулиноподобного фактора роста 1, 3 нМ гастрина, 0,1 мкг/мл холерного токсина (в дальнейшем называемая средой для культивирования «ОС-2»).

Пример 4. Культивирование клеток первичного рака яичников

Клетки первичного рака яичников получали из интраоперационных образцов ткани 6 клинических случаев (пронумерованных А26083, L65, L66, L72, L74, L84) в соответствии со способом, описанным на стадии (2)-3 в примере 1, и культивировали с использованием культуральной среды ОС-2. Базальную среду смешивали с матригелем (Corning®, 356231) в соотношении 50:1 на льду. В 6-луночный планшет помещали 2 мл смеси и инкубировали при 37°С в термостате с 5% СО₂ в течение 25-35 минут, предпочтительно 30 минут, и удаляли супернатант. Полученные клетки первичного рака яичников высевали в 6-луночный планшет (250000 клеток на лунку) при плотности жизнеспособных клеток 2×10⁴ клеток/см² и добавляли 4 мл культуральной среды ОС-2. После стерилизации поверхности планшет помещали в термостат при 37°С, 5% СО₂ (приобретенный у Thermo Fisher) для культивирования.

Проводили визуальный анализ культивированных клеток первичного рака яичников под микроскопом (EVOS М500, Invitrogen). На Фиг. 3A-3F показаны фотографии клеток первичного рака яичников, полученных из образцов А26083, L65, L66, L72, L74 и L84, после культивирования в течение 4-6 дней, соответственно, сделанные с помощью объектива с 10-кратным увеличением. Под микроскопом клетки были близко расположены и имели немного неправильную форму.

Пример 5. Гистохимическая идентификация культуры клеток первичного рака яичников

Опухолевую ткань размером приблизительно 0,25 см³ удаляли из интраоперационной ткани (номер образца L74) пациентки с раком яичников и фиксировали путем погружения в 1 мл 4% параформальдегида. Использовали способ из примера 4 для продолжения культивирования образца L74 до четвертого пересева с применением культуральной среды ОС-2 для клеток первичного рака яичников в соответствии с настоящим изобретением. Клетки первичного рака яичников, фиксированные в 4% параформальдегиде, заливали в парафин и с помощью микротома получали срезы тканей толщиной 4 мкм. Затем проводили обычную иммуногистохимическую детекцию (конкретные процедуры см. в публикации Li et al., Nature Communication, (2018) 9: 2983). Использовали следующие первичные антитела: ER, PR, Р53, NapsinA, Рах-8, WT-1 и Ki-67 (все приобретены у CST).

Фиг. 4A-4G и 5A-5G представляют собой сравнительные изображения результатов иммуногистохимического анализа клеток исходной ткани и клеток первичного рака яичников, полученных путем культивирования клеток исходной ткани в культуральной среде ОС-2 для клеток первичного рака яичников согласно настоящему изобретению, соответственно. На Фиг. 4А и Фиг. 5А представлены изображения ткани рака яичника и культивированных клеток первичного рака яичников, которые были помечены антителом против ER, соответственно. На Фиг. 4В и Фиг. 5В представлены изображения ткани рака яичника и культивированных клеток первичного рака яичников, которые были помечены антителом против PR, соответственно. На Фиг. 4С и Фиг. 5С представлены изображения ткани рака яичника и культивированных клеток первичного рака яичников, которые были помечены антителом против Р53, соответственно. На Фиг. 4D и Фиг. 5D представлены изображения ткани рака яичника и культивированных клеток первичного рака яичников, которые были помечены антителом против NapsinA, соответственно. На Фиг. 4Е и Фиг. 5Е представлены изображения ткани рака яичника и культивированных клеток первичного рака яичников, которые были помечены антителом против Рах-8, соответственно. На Фиг. 4F и Фиг. 5F представлены изображения ткани рака яичника и культивированных клеток первичного рака яичников, которые были помечены антителом против WT-1, соответственно. На Фиг. 4G и Фиг. 5G представлены изображения ткани рака яичника и культивированных клеток первичного рака яичников, которые были помечены антителом против Ki-67, соответственно. Таким образом, можно подтвердить, что когда клетки первичного рака яичников, культивированные с применением технологии в соответствии с настоящим изобретением, культивируют до четвертого пересева, экспрессия биомаркеров, связанных с раком яичников, на клетках первичного рака яичников соответствует их экспрессии на исходном срезе ткани, из которой получены клетки первичного рака яичников. Это указывает на то, что клетки первичного рака яичников, культивированные с применением технологии согласно настоящему изобретению, сохраняют исходные патологические характеристики раковой ткани пациентов с раком яичников.

Пример 6. Сравнение с эффектом культивирования в существующих культуральных средах, статистические данные о цикле культивирования и количестве клеток первичного рака яичников, а также расчет значения удвоения популяции (PD)

Культуральная среда, известная из уровня техники (Xuefeng Liu et al., Nat. Protoc, 12(2): 439-451, 2017)), имеет следующий состав: среда DMEM/F12+250 нг/мл амфотерицина В (приобретенного у Selleck)+10 мкг/мл гентамицина (приобретенного у МСЕ)+0,1 нМ холерного токсина+0,125 нг/мл EGF+25 нг/мл гидрокортизона+10 мкМ Y27632+10% FBS.

Коммерческая культуральная среда: Defined K-SFM, сывороточная среда для кератиноцитов (приобретенная у Gibco, 10744-019)

Клетки первичного рака яичников получали из образцов ткани рака яичников трех клинических случаев (пронумерованных L65, L66 и А22083) в соответствии со способом, описанным на стадии (2)-3 в примере 1. Полученные клетки первичного рака яичников культивировали с использованием культуральной среды, известной из уровня техники, коммерческой культуральной среды и культуральной среды ОС-2, описанной в примере 3, соответственно, и высевали клетки в 6-луночный планшет при плотности жизнеспособных клеток 3×10⁴ клеток/см². После разрастания клеток до 95% их расщепляли и подсчитывали, и регистрировали количество дней культивирования до расщепления как цикл культивирования. В этих условиях эксперимента разросшиеся клетки размножали в различных пересевах. Клетки каждого пересева расщепляли и подсчитывали, и регистрировали соответствующий цикл культивирования. Значение PD вычисляли в соответствии с формулой, удвоение популяции (PD)=3,32*log10 (общее количество клеток после расщепления/исходное количество инокулированных клеток). Указанная формула представлена в публикации Chapman et al., Stem Cell Research & Therapy 2014, 5: 60.

На Фиг. 6A-6C показаны кривые роста первичных клеток из трех клинических случаев, культивированных с использованием культуральной среды, известной из предшествующего уровня техники, коммерческой культуральной среды и культуральной среды ОС-2 для клеток первичного рака яичников в соответствии с настоящим изобретением, построенные с помощью программного обеспечения Graphpad Prism. По оси абсцисс представлены дни культивирования клеток, а по оси ординат - кратная кумулятивная пролиферация клеток, т.е. кратная экспансия клеток в цикле культивирования. Чем больше значение, тем больше кратность экспансии клеток за определенный цикл, то есть тем больше клеток размножается. Значение наклона представляет скорость размножения клеток. По Фиг. 6А-6С можно убедиться, что если клетки первичного рака яичников, культивируемые в культуральной среде ОС-2 в соответствии с настоящим изобретением, непрерывно культивировать и размножать в течение по меньшей мере 30 дней, то скорость размножения клеток остается в основном неизменной, и клетки все еще имеют способность продолжать размножаться. Результаты на Фиг. 6А-6С показывают, что скорость размножения клеток первичного рака яичников, культивированных с использованием культуральной среды, известной из уровня техники, и коммерческой среды, значительно ниже, чем в среде ОС-2. Таким образом, по сравнению со средой для культивирования, известной из предшествующего уровня техники, и коммерческой средой, эффективность пролиферации клеток рака яичников, культивируемых in vitro с использованием культуральной среды для клеток первичного рака яичников в соответствии с настоящим изобретением, значительно выше.

Пример 7. Применение клеток первичного рака яичников, размноженных в культуральной среде в соответствии с настоящим изобретением, для скрининга лекарственных средств и оценки эффективности.

1. Культивирование и посев клеток

Клетки первичного рака яичников (пронумерованные А22083) выделяли в соответствии со способом, описанным на стадии (2)-3 в примере 1, использованным в качестве способа генерации, и культивировали с культуральной средой ОС-2 для клеток первичного рака яичников согласно настоящему изобретению до тех пор, пока клетки не разрастались до 85%, и пересевали. Клетки пересевали и подсчитывали в соответствии со стадией (2)-4, описанной в примере 1. Клетки помещали в загрузочный слот (приобретенный у Corning) при плотности жизнеспособных клеток 1×10⁵ клеток/мл. После тщательного смешивания их высевали в 384-луночный непрозрачный белый планшет для культивирования клеток (приобретенный у Corning), в объеме 50 мкл на лунку и в количестве клеток 5000 клеток на лунку. Планшет заполняли добавлением культуральной среды для клеток первичного рака яичников согласно настоящему изобретению до края планшета, и отмечали на планшете названия образцов, время дозирования и время тестирования CellTiter-Glo (Promega). Поверхность планшета дезинфицировали 75% спиртом (LIRCON) и культивировали планшет в термостате при 37°С, 5% СО₂, и вводили дозы через 24 часа. Для скрининга лекарственных средств получали клетки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го и 5-го пересевов культуры, соответственно, и проверяли чувствительность к лекарственному средству клеток первичного рака яичников, культивированных с использованием культуральной среды согласно настоящему изобретению, для непрерывного пересева.

2. Подготовка лекарственных средств-кандидатов.

Шесть лекарственных средств (цитарабин, доксорубицин, бортезомиб, панобиностат, азацитидин и гомогаррингтонин; все приобретены у МСЕ) были подготовлены в градиентах 6 концентраций в соответствии со следующей таблицей, которые были добавлены в 384-луночный планшет (Thermo Fisher) в объеме 30 мкл на лунку и хранились до использования.

3. Высокопроизводительное введение доз

Планшет с подготовленными лекарственными средствами вынимали и выдерживали при комнатной температуре. Планшет центрифугировали при комнатной температуре в течение 1 минуты при 1000 об/мин в центрифуге (Beckman), а затем вынимали из центрифуги. Для высокопроизводительного введения доз использовали высокопроизводительную автоматизированную рабочую станцию (JANUS, Perkin Elmer). В каждую лунку 384-луночного планшета с культивированными клетками первичного рака яичников добавляли 0,1 мкл лекарственных средств-кандидатов в соответствующих концентрациях. После введения дозы дезинфицировали поверхность 384-луночного планшета и перемещали его в термостат. Жизнеспособность клеток измеряли через 72 часа.

4. Измерение жизнеспособности клеток

Люминесцентный реагент CellTiter-Glo (Promega) вынимали из холодильника с температурой 4°С и добавляли 10 мл реагента в загрузочный слот.384-Луночный планшет для тестирования вынимали из термостата и добавляли 10 мкл люминесцентного реагента CellTiter-Glo в каждую лунку. После выдерживания в течение 10 минут проводили анализ с применением многофункционального устройства для прочтения микропланшетов (Envision, Perkin Elmer).

5. Обработка данных

В соответствии с формулой, скорость ингибирования клеток (%) = 100% - значение хемилюминесценции лунки с загруженным лекарственным средством/значение хемилюминесценции контрольной лунки × 100%, рассчитывали скорость ингибирования клеток, обработанных различными лекарственными средствами, и концентрацию полумаксимального ингибирования (IC₅₀) клеток лекарственными средствами рассчитывали с применением программного обеспечения Graphpad Prism. Результаты показаны на Фигурах 7A-7F.

На основании Фигур 7A-7F можно подтвердить, что при использовании для скрининга лекарственных средств клеток первичного рака яичников, культивированных в культуральной среде ОС-2 для клеток первичного рака яичников в соответствии с настоящим изобретением, ингибирующее действие одного и того же лекарственного средства на культивируемые клетки различных пересевов остается по существу одинаковым (кривые ингибирования по существу сходны). Клетки от одного и того же пациента отличаются по чувствительности к разным лекарственным средствам при максимальной концентрации в крови в организме человека. По полученным результатам можно судить об эффективности препарата при клиническом применении у пациентов с раком яичников. В то же время полученные результаты указывают на то, что чувствительность опухолевых клеток различных пересевов, полученных в соответствии со способом культивирования согласно настоящему изобретению, к лекарственным средствам является стабильной.

Промышленная применимость

В соответствии с настоящим изобретением предложены культуральная среда и способ культивирования первичных клеток для культивирования клеток первичного рака яичников in vitro, и культивированные клетки могут быть использованы для оценки эффективности и скрининга лекарственных средств. Таким образом, настоящее изобретение подходит для промышленного применения.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано в настоящем документе, настоящее изобретение не ограничивается этим описанием, и специалисты в данной области техники могут вносить модификации в соответствии с принципом настоящего изобретения. Таким образом, любую модификацию, осуществленную в соответствии с принципом настоящего изобретения, следует понимать как подпадающую под объем охраны настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение раскрывает культуральную среду для клеток первичного рака яичников, содержащую ингибитор киназы MST1/2; ингибитор киназы Rho, который выбран из по меньшей мере одного из Y27632, фасудила и Н-1152; добавку инсулин-трансферрин-селен; инсулин; простагландин Е2; эпидермальный фактор роста; гастрин; инсулиноподобный фактор роста 1; холерный токсин; амфирегулин; N2; и В27. По сравнению с существующими способами культивирования, культивирование in vitro с использованием указанной культуральной среды имеет более высокую эффективность амплификации. Использование предложенной культуральной среды для культивирования клеток первичного рака яичников может сохранять морфологическую структуру и патологические особенности первичных тканей, а также улучшать показатель успешности и показатель выживаемости культивированных клеток первичного рака яичников. Клеточная модель, полученная с применением культуральной среды для первичных клеток согласно настоящему изобретению, может быть использована для оценки эффективности и скрининга лекарственных средства, подходящих для лечения рака яичников. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 пр., 4 табл., 7 ил.

1. Культуральная среда для клеток первичного рака яичников, причем указанная среда содержит:

ингибитор киназы MST1/2, по меньшей мере один ингибитор киназы Rho, выбранный из группы, состоящей из Y27632, фасудила и Н-1152; добавку инсулин-трансферрин-селен; инсулин; простагландин Е2; эпидермальный фактор роста; гастрин; инсулиноподобный фактор роста 1; холерный токсин; амфирегулин; N2; и B27,

при этом ингибитор киназы MST1/2 содержит соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль, или сольват,

Формула (I)

где

R₁ выбран из C1–C6 алкила, C3–C6 циклоалкила, C4–C8 циклоалкилалкила, C2–C6 спироциклоалкила и арила, необязательно замещенного 1–2 независимыми R₆, арил-C1–C6 алкила, необязательно замещенного 1–2 независимыми R₆, и гетероарила, необязательно замещенного 1–2 независимыми R₆;

R₂ и R₃, каждый независимо, выбран из C1–C6 алкила;

R₄ и R₅, каждый независимо, выбран из водорода, C1–C6 алкила, C3–C6 циклоалкила, C4–C8 циклоалкилалкила, гидроксил-C1–C6 алкила, C1–C6 галогеналкила, C1–C6 алкиламино-C1–C6 алкила, C1–C6 алкокси-C1–C6 алкила и C3–C6 гетероциклил-C1–C6 алкила;

R₆ выбран из галогена, C1–C6 алкила, C1–C6 алкокси и C1–C6 галогеналкила.

2. Культуральная среда по п. 1, отличающаяся тем, что

R₁ выбран из C1–C6 алкила, C3–C6 циклоалкила, C4–C8 циклоалкилалкила, C2–C6 спироциклоалкила и фенила, необязательно замещенного 1–2 независимыми R₆, нафтила, необязательно замещенного 1–2 независимыми R₆, фенилметила, необязательно замещенного 1–2 независимыми R₆, и тиенила, необязательно замещенного 1–2 независимыми R₆;

R₂ и R₃, каждый независимо, выбраны из C1–C3 алкила;

R₄ и R₅, каждый независимо, выбраны из водорода, C1–C6 алкила, C3–C6 циклоалкила, C4–C8 циклоалкилалкила, гидроксил-C1–C6 алкила, C1–C6 галогеналкила, C1–C6 алкиламино-C1–C6 алкила, C1–C6 алкокси-C1–C6 алкила, пиперидил-C1–C6 алкила и тетрагидропиранил-C1–C6 алкила;

R₆ выбран из галогена, C1–C6 алкила, C1–C6 алкокси и C1–C6 галогеналкила.

3. Культуральная среда по п. 1, отличающаяся тем, что ингибитор киназы MST1/2 содержит соединение формулы (Ia) или его фармацевтически приемлемую соль, или сольват,

Формула (Ia)

где

R₁ выбран из C1–C6 алкила, фенила, необязательно замещенного 1–2 независимыми R₆, тиенила, необязательно замещенного 1–2 независимыми R₆, и фенилметила, необязательно замещенного 1–2 независимыми R₆;

R₅ выбран из водорода, C1–C6 алкила и C3–C6 циклоалкила;

R₆ независимо выбран из галогена, C1–C6 алкила и C1–C6 галогеналкила.

4. Культуральная среда по п. 3, отличающаяся тем, что

R₁ представляет собой фенил, необязательно замещенный 1–2 независимыми R₆;

R₅ представляет собой водород;

R₆ представляет собой фтор, метил или трифторметил.

5. Культуральная среда по п. 1, отличающаяся тем, что ингибитор киназы MST1/2 представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из следующих соединений, или его фармацевтически приемлемую соль:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 .

6. Культуральная среда по любому из пп. 1–5, отличающаяся тем, что количество компонентов в культуральной среде удовлетворяет любому одному или более, или всем из следующих условий:

(1) количество ингибитора киназы MST1/2 в культуральной среде составляет 2,5–20 мкМ;

(2) количество ингибитора киназы Rho в культуральной среде составляет 2,5–20 мкМ;

(3) объемное отношение добавки инсулин-трансферрин-селен к культуральной среде составляет 1:800–1:50;

(4) количество инсулина в культуральной среде составляет 1–27 мкг/мл;

(5) количество простагландина E2 в культуральной среде составляет 2,5–10 мкМ;

(6) количество эпидермального фактора роста в культуральной среде составляет 2,5–40 нг/мл;

(7) количество гастрина в культуральной среде составляет 1–9 нМ;

(8) количество инсулиноподобного фактора роста 1 в культуральной среде составляет 25–100 нг/мл;

(9) количество холерного токсина в культуральной среде составляет 0,05–0,8 мкг/мл;

(10) количество амфирегулина в культуральной среде составляет 1–81 нг/мл;

(11) объемное отношение добавки B27 к культуральной среде предпочтительно составляет 1:25–1:400;

(12) объемное отношение добавки N2 к культуральной среде предпочтительно составляет 1:50–1:400.

7. Культуральная среда по любому из пп. 1–6, дополнительно содержащая:

исходную среду, выбранную из группы, состоящей из DMEM/F12, DMEM, F12 или RPMI-1640; и один или более антибиотиков, выбранных из группы, состоящей из стрептомицина/пенициллина, амфотерицина B и примоцина.

8. Способ культивирования клеток первичного рака яичников, включающий следующие стадии:

(1) получение культуральной среды для клеток первичного рака яичников по любому из пп. 1–7;

(2) получение клеток первичного рака яичников из образцов ткани рака яичников;

(3) добавление культуральной среды для клеток первичного рака яичников, полученной на стадии (1), к клеткам первичного рака яичников, полученным на стадии (2), для культивирования.

9. Способ оценки эффективности лекарственного средства для лечения рака яичников, включающий следующие стадии:

(1) культивирование клеток первичного рака яичников с применением способа культивирования клеток первичного рака яичников по п. 8;

(2) выбор лекарственного средства для исследования и разведение лекарственного средства до требуемых градиентов концентрации;

(3) добавление лекарственного средства, разведенного до различных градиентов концентрации, в клетки первичного рака яичников, культивированные на стадии (1);

(4) детектирование жизнеспособности клеток, расчет скорости ингибирования клеток, обработанных лекарственным средством, и определение эффективности лекарственного средства для лечения рака яичников.