Способ диагностики повреждения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом Российский патент 2024 года по МПК G01N33/49 G01N33/493 G01N30/72 

Изобретение относится к медицине, а именно, к патологической физиологии, клинической лабораторной диагностике, детской хирургии, урологии, нефрологии, педиатрии. При осуществлении способа используется масс-спектрометрический анализ волатома мочи.

Первичный пузырно-мочеточниковый рефлюкс (ПМР) относится к группе диспластических заболеваний почек [Macioszek S, Wawrzyniak R, Kranz A, et al. Comprehensive Metabolic Signature of Renal Dysplasia in Children. A Multiplatform Metabolomics Concept. Front Mol Biosci. 2021; 8:665661] и является одной из наиболее распространенных врожденных уропатий у детей [Hajiyev Р, Burgu В. Contemporary Management of Vesicoureteral Reflux. Eur Urol Focus. 2017;3(2-3): 181-188], приводящих к развитию рефлюкс-нефропатии и хронической болезни почек [Fillion ML, Watt CL, Gupta IR. Vesicoureteric reflux and reflux nephropathy: from mouse models to childhood disease. Pediatr Nephrol. 2014;29(4):757-766], которая достигает конечной стадии у 25-60% пациентов [Chertin В, Abu Arafeh W, Kocherov S. Endoscopic correction of complex cases of vesicoureteral reflux utilizing Vantris as a new nonbiodegradable tissue-augmenting substance. Pediatr Surg Int. 2014; 30 (4):445-448].

Диагностика почечной недостаточности в настоящее время основывается на определении уровня сывороточного креатинина, альбуминурии и скорости клубочковой фильтрации (СКФ). Однако эти индикаторы не являются чувствительными и специфичными на ранних этапах повреждения почек и не отражают полную картину развития патологии [Sanchez-Niño, М. D., Sanz, А. В., Ramos, А. М., Fernandez-Fernandez, В. & Ortiz, A. Clinical proteomics in kidney disease as an exponential technology: Heading towards the disruptive phase. Clinical Kidney Journal (2017) doi: 10.1093 /ckj/sfx023].

Уровень креатинина в сыворотке может зависеть от расы, пола, мышечной массы, статуса гидратации и лекарств; следовательно, изменения креатинина могут не отражать истинных изменений функции почек [Zhang WR, Parikh CR. Biomarkers of Acute and Chronic Kidney Disease. Annu Rev Physiol. 2019; 81:309-33310]. В связи с высокими компенсаторно-приспособительными возможностями почки и непрямой зависимостью между уровнем креатинина сыворотки и рСКФ сывороточные концентрации креатинина повышаются в сыворотке только в случае повреждения 50-75% почечной паренхимы [Mussap, М., Noto, A., Fanos, V. & Van Den Anker, J. N. Emerging biomarkers and metabolomics for assessing toxic nephropathy and acute kidney injury (AKI) in neonatology. BioMed Research International (2014) doi: 10.1155/2014/602526]. Кроме того, сывороточный креатинин может увеличиваться без прямого повреждения почек при гиповолемии, применении нестероидных противовоспалительных препаратов или многих других причинах снижения почечной перфузии [Rysz, J., Gluba-Brzózka, A., Franczyk, В., Jablonowski, Z. & Cialkowska-Rysz, A. Novel biomarkers in the diagnosis of chronic kidney disease and the prediction of its outcome. International Journal of Molecular Sciences (2017) doi: 10.3390 /ijms18081702], или напротив, может оставаться неизменным в условиях значительного повреждения канальцев, особенно у пациентов с хорошей основной функцией почек и значительным почечным резервом [Zhang WR, Parikh CR. Biomarkers of Acute and Chronic Kidney Disease. Annu Rev Physiol. 2019; 81:309-33310]. Чтобы устранить эти ограничения, исследования с использованием новых технологий были сосредоточены на выявлении структурных маркеров повреждения почечных канальцев в моче или системном кровотоке, которые непосредственно производятся почками или накапливаются в результате дисфункции канальцевых клеток после повреждения почек [Molin, L. et al. A comparison between MALDI-MS and CE-MS data for biomarker assessment in chronic kidney diseases. J. Proteomics (2012) doi:10.1016/j.jprot.2012.07.024].

В исследовании авторов [Bukharina A, Fedulkina A, Demidova K, et al. Omics technologies in screening for kidney disease in children with congenital uropathy. Annals of the Russian academy of medical sciences. 2022;77: 354-361] использование стандартных анализов креатинина и СКФ не позволило найти пороговое значение, которое позволяло бы разделить группы больные -здоровые. Повышение в моче детей с ПМР биомаркеров воспаления, ангиогенеза и фиброза подтверждало наличие персистирующего повреждения почек, гипоксии паренхимы, активации фиброза и воспаления в ней. Данные изменения не нашли отражения в результатах стандартных исследований.

Известен способ оценки состояния почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом (ПМР) для прогнозирования прогрессирования рефлюкс-нефропатии (РН) на основании исследования мочевой экскреции маркеров склерозирования (трансформирующего фактора роста-β1), ангиотензина II, прокальцитонина, β2-микроглобулина) и коллагенообразования (пептид-связанного и свободного гидроксипролина) [Зайкова Н.М., Длин В.В., Синицына Л.А., Еремеева Н.Е. и др. Маркеры коллагенообразования и склерозирования в диагностике прогрессирования рефлюкс-нефропатии у детей. Нефрология 2018; 22 (3): 33-42]. В ходе исследования установлена прямая корреляционная связь между уровнем экскреции AngII, TGF-β1, ПКТ и степенью тяжести РН у больных с ПМР. Недостатком данного способа является тот факт, что изменение данной панели биомаркеров происходит позже, чем изменение метаболома, поэтому метод не чувствителен на ранних этапах повреждения почек. Однако возможно его использование для прогнозирования нефросклероза у детей с ПМР. Также для проведения анализа каждого из 5 маркеров требуется не менее 3,5 часов и необходима предварительная пробподготовка и дорогостоящие наборы для иммуноферментного анализа. Это делает данный способ непригодным для скрининга начальных этапов повреждения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом и быстрого разделения пациентов на группы «с повреждением» и «без повреждения».

Известен способ оценки состояния почек у детей с ПМР: оценка уровня VEGF А в моче (Патент RU 2442982 С1, опубл. 20.02.2012.), согласно которому у детей с ПМР измерялся уровень VEGF А в моче до коррекции рефлюкса, и показано, что увеличение его концентрации свыше 140 пг/мл свидетельствует о повреждении почек. Однако данный способ имеет ограничения, так как использован только один биомаркер гипоксии VEGF для оценки состояния почек. Учитывая многогранный патогенез поражения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом определение только одного маркера недостаточно для диагностики различных процессов. Время проведения иммуноферментного анализа составляет 3.5 часа. При использовании данной методики необходимо заранее знать определяемый маркер и иметь набор для его определения с моноклональными антителами. При использовании этого метода необходима предварительная пробподготовка, в отличие от исследования метаболома, что делает его мало пригодным для скрининга.

Известен способ анализа протеома с использованием масс-спектрометрии Method for the early detection of renal disease using proteomics, Hegedus et al. Proteomics, (патент US 9234898 B1, опубл. 28.01.2016.) При анализе протеома определяются белки или их фрагменты с молекулярной массой от 5 до 70 кДа. Однако это достаточно крупные молекулы, определение которых требует дополнительной пробоподготовки (твердофазной экстракции, дериватизации анализируемого вещества), наличия сложного дорогостоящего оборудования и квалифицированный персонал. Кроме того, требуется применение сложных биомедстатистических программ для обработки полученных результатов, так как крупные белковые молекулы фрагментируются в ходе исследования, их молекулярная масса изменяется, могут детектироваться в прямой и обратной последовательности, их идентификация затруднительна. Изменения протеома появляются позже, чем изменения метаболома. Время проведения анализа протеома в данном исследовании - 2 часа, что связано с предварительной хроматографией и гораздо превосходит время исследования метаболома (не более 15 минут). Кроме того, для проведения протеомного анализа требуются дорогостоящие хроматографические колонки и другие реактивы.

К «идеальному» биомаркеру предъявляются многочисленные требования. Помимо хороших преаналитических свойств, такой маркер должен быть чувствительным, специфичным, точным и надежным, быстро реагировать на любое повреждение почек, а его измерение должно быть стандартизированным, простым, быстрым и недорогим. «Идеальный» биомаркер должен быть связан с определенным звеном патогенеза хронической болезни почек (ХБП), что позволило бы отслеживать интенсивность тех или иных патологических процессов при ХБП. Кроме этого, такой биомаркер должен позволить диагностировать повреждение почек до истощения почечного резерва и лабораторно диагностируемого снижения их функции [Rysz, J., Gluba-Brzózka, A., Franczyk, В., Jablonowski, Z. & Cialkowska-Rysz, A. Novel biomarkers in the diagnosis of chronic kidney disease and the prediction of its outcome. International Journal of Molecular Sciences (2017) doi:10. 3390 /ijms18081702]. В настоящее время, биомаркеры, доступные в клинической практике, не сочетают в себе всех этих качеств.

В последнее время развивается способ анализа проб, не требующего идентификации веществ, - нетаргетное профилирование. Нетаргетный анализ основан на определении и сравнении концентраций множества химических соединений, так называемых «профилей» или «образов» проб [Coene, K. L. М. et al. Next-generation metabolic screening: targeted and untargeted metabolomics for the diagnosis of inborn errors of metabolism in individual patients. J. Inherit. Metab. Dis. (2018) doi: 10.1007 /s10545-017-0131-6]. Потенциально возможно определить метаболомный профиль любой патологии, при условии стремления к минимально возможной фрагментации соединений на этапе ионизации и регистрации максимального числа пиков метаболитов. Как и следовало ожидать, у такого метода есть особенности, обусловленные тем, что интерпретация результатов происходит за счет математической и статистической обработки данных большой выборки проб. Результаты такого нетаргетного анализ возможно получить с помощью дополнительных биоинформатических инструментов [Khoomrung, S. et al. Metabolomics and integrative omics for the development of Thai traditional medicine. Frontiers in Pharmacology (2017) doi:10.3389/fphar.2017.00474].

На настоящий момент из уровня техники не известны сведения об обнаружении повреждения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом с помощью масс-спектрометрического анализа летучих органических соединений (волатома) мочи.

Все известные способы не решали проблему неинвазивной диагностики повреждения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом в короткий временной промежуток без предварительной пробоподготовки.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является повышение эффективности диагностики повреждения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом

Технический результат достигается за счет того, что способ диагностики повреждения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом характеризуется сбором мочи у пациентов с последующим анализом масс-спектров летучих органических соединений, выделяемых пробами мочи без предварительной пробподготовки, на лазерном масс-спектрометре, и при регистрации в масс-спектрах набора пиков, 20 пиков в диапазоне от 42 до 287,1 m/z, диагностируют повреждение паренхимы почек.

Способ диагностики был подтвержден в исследовании, где был применен нетаргетный анализ масс-спектров летучих органических соединений мочи и сопоставлен с результатами содержания креатинина сыворотки крови и СКФ у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом и без таковых. Для верификации повреждения почек были определены мочевые уровни биомаркеров воспаления, фиброза и ангиогенных факторов.

Осуществление изобретения

Изобретение поясняется чертежом, где на фиг. 1 представлена зависимость полного ионного тока от времени при исследовании проб, на фиг. 2 - результат применения метода главных компонент к анализу масс-спектров ЛОС мочи больных (синие точки) и здоровых (красные точки), на фиг. 3 - сравнение результатов масс-спектрометрического анализа ЛОС и теста на креатинин и СКФ. Кроме того, в таблице 1 приведен перечень пиков с соответствующими р-значениями, в таблице 2 - характеристики групп исследования, в таблице 3 - мочевые уровни маркеров воспаления, факторов фибро- и ангиогенеза.

На Фиг. 1 использованы следующие обозначения 1 - участок вытеснения воздуха в пробирке аргоном, длительность ~ 30 с (закрашен синим); 2 - участок записи стабильного масс-спектра, длительность ~ 120 с (закрашен красным) и при установке пустой пробирки (незакрашенная область). На врезке показан единичный масс-спектр пробы мочи.

На фиг. 3 - А - сравнение с тестом на креатинин; Б - сравнение с тестом на СКФ.

В таблице 3 - М - медиана; LQ - нижний квартиль; UQ - верхний квартиль; р - критерий достоверности различий по отношению к показателям группы контроля.

Способ диагностики повреждения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом осуществляют следующим образом.

У пациентов с первично установленным диагнозом пузырно-мочеточниковый рефлюкс осуществлялся сбор средней порции утренней мочи до начала лечения. После центрифугирования 10 мин при 14 000 g производилось аликвотирование образцов в пластиковые пробирки типа эппендорф.

Данные образцы мочи хранились после сбора хранились при температуре -80°С. К образцам мочи, полученным от пациентов, не применялись никакие процедуры дополнительной обработки и пробоподготовки. Перед измерениями образцы размораживали при комнатной температуре в течение 10 минут.

Авторы при осуществлении способа использовали времяпролетный масс-спектрометр ЭМГ-30-3 рефлектрон с разрешающей способностью 5000.

Пробы разливались по микроцентрифужным пробиркам порциями по 20 мкл. Микроцентрифужные пробирки с пробами последовательно устанавливалась на герметичный пневматический разъем и продувалась потоком чистого аргона (99,995). Испаряющиеся с поверхности пробы ЛОС мочи поступали в потоке аргона в герметичную камеру, где происходила их ионизация. Масс-спектр ЛОС каждого образца записывался в течение 150 секунд, из которых в первые 30 секунд происходило вытеснение воздуха в пробирках аргоном и стабилизация масс-спектров (фиг. 1). Обработка полученных масс-спектров проводилась в самостоятельно разработанной программе в среде Python 3.7.

Исследование было проведено на образцах мочи 42 пациентов (средний возраст 5,4+2,3 года), разделенных на 2 группы: 1 группа - 24 ребенка с ПМР II-V степени, 2 группа сравнения - 18 пациентов с малой хирургической патологией без патологии мочевыделительной системы.

В таблице 1 приведен перечень пиков с соответствующими р-значениями. Анализ массива данных, проводившийся с использованием критерия Краскела-Уоллиса, показал, что в массиве, состоящем из 342 пиков, существует всего 20 пиков с р<0,05, по которым можно отличить группу пациентов с заболеваниями от контрольной группы.

Из этих пиков выбраны четыре пика, имеющие в своем наборе наибольшее количество ненулевых значений. К этим четырем был применен метод главных компонент (МГК). Результат анализа МГК представлен на фиг. 2. Разделение областей проводилось методом линейного дискриминантного анализа.

Как видно из фиг. 1, в координатах двух первых главных компонент наблюдается разделение двух групп пациентов. Это говорит о том, что в ЛОС, собираемых над поверхностью пробы мочи при комнатной температуре, содержится информация о состоянии пациента и эта информация может быть использована для целей диагностики заболеваний. На основе данных фиг. 2 можно оценить общепринятые статистические показатели - чувствительность и селективность. Для приведенных результатов они составят соответственно 22/23=0,96 и 10/18=0,56. Очевидно, что для получения более точных результатов необходимо увеличить объем выборки и стратифицировать пациентов как в контрольной группе, так и в группе больных не только по полу, но и возрасту. Это связано с тем, что в составе ЛОС, кроме изменений, связанных с заболеванием, возможно, наблюдаются возрастные изменения.

Сравнение результатов масс-спектрометрического исследования и результатов анализа на креатинин и СКФ представлено на фиг. 3, где приведено распределение результатов анализа для больных (красные точки), и здоровых (синие точки) пациентов в координатах значение анализа - амплитуда первой главной компоненты масс-спектров. Как видно из рисунка, по полученным данным анализов креатинина и СКФ невозможно найти пороговое значение, которое позволяет разделить пациентов на группы больных и здоровых. Это видно и из сравнения средних величин результатов анализа для двух групп, приведенных в таблице 2. Поэтому в анализируемом случае ни креатинин, ни СКФ не могут быть использованы в качестве индикатора наличия заболевания. В то же время масс-спектрометрические данные позволяют достаточно эффективно разделить группы, как это показано на фиг. 3. Разделение областей так же, как и в первом случае, проводилось методом линейного дискриминантного анализа.

Результаты исследования СКФ и уровня креатинина сыворотки крови представлены в таблице 2. Статистически значимых отличий данных показателей между группами не выявлено.

Результаты исследования мочевых уровней IL-8, IL-18, МСР-1, VEGF и TGF-β1 представлены в таблице 3. В моче детей с ПМР наблюдалось повышение концентрации маркеров воспаления МСР-1 (р<0,001), IL-18 (р<0,001), IL-8 (р<0,003), ангиогенеза VEGF (р<0,001) и фиброза TGF-β1 (р<0,004) при сравнении с группой контроля. Следует отметить, что в группе пациентов с ПМР концентрация маркеров не зависела от степени ПМР (р>0,05).

Изобретение поясняется примерами.

ПРИМЕР 1 (контрольная группа).

Пациент К., в возрасте 5 лет и 2-х месяцев, поступил в хирургическое отделение на плановое оперативное лечение по поводу пупочной грыжи. По данным стандартного клинико-лабораторного обследования - практически здоров, патологии со стороны мочевыделительной системы по данным ультразвукового исследования с допплерометрией не обнаружено. Общий анализ крови и мочи без патологии, креатинин сыворотки крови (58,3 мкмоль/л) и СКФ (96 мл/мин/1,73 м²) в норме. Концентрация мочевых уровней IL-8 - 2,7 пг/мл; IL-18 - 3,5 пг/мл; МСР-1 - 14,4 пг/мл; VEGF - 47 пг/мл; TGF-β1 - 7,5 нг/мл. Масс-спектрометрический анализ летучих органических соединений этой же пробы при комнатной температуре и атмосферном давлении не обнаружил пиков в диапазоне от 42 до 287,1 m/z, характерных для повреждения почек.

ПРИМЕР 2 (группа с ПМР).

Пациент П., в возрасте 5 лет поступил в урологическое отделение на обследование. По данным ультразвукового исследования с допплерометрией и микционной цистоуретерографии обнаружен двухсторонний пузырно-мочеточниковый рефлюкс II-III степени. Общий анализ крови и мочи без патологии, креатинин сыворотки крови (45,7 мкмоль/л) и СКФ (105,4 мл/мин/1,73 м²) в норме. Концентрация мочевых уровней IL-8 - 55,9 пг/мл; IL-18 - 42,6 пг/мл; МСР-1 - 253,1 пг/мл; VEGF - 198,2 пг/мл; TGF-β1 - 33,4 нг/мл. Масс-спектрометрический анализ летучих органических соединений этой же пробы при комнатной температуре и атмосферном давлении обнаружил 20 пиков в диапазоне от 42 до 287,1 m/z, характерных для повреждения почек.

Таким образом, проведенное исследование показало, что в регистрируемых масс-спектрах существует набор пиков, по которым возможно разделение групп здоровые - больные, и продемонстрировало потенциал масс-спектрометрического анализа волатолома для обнаружения повреждения почек у детей с ПМР. Повышение в моче детей с ПМР биомаркеров воспаления, ангиогенеза и фиброза подтверждало наличие персистирующего повреждения почек, гипоксии паренхимы, активации фиброза и воспаления в ней.

Преимуществами предложенного способа для выявления повреждения почек у детей с ПМР являются: возможность единовременного определения большого числа различных веществ, удобство и экспрессность, отсутствие предварительной подготовки.

Способ диагностики повреждения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом

Способ диагностики повреждения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической физиологии, клинической лабораторной диагностике, детской хирургии, урологии, нефрологии, педиатрии, и может быть использовано для диагностики повреждения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом (ПМР). Проводят сбор мочи у пациентов с последующим анализом масс-спектров летучих органических соединений, выделяемых пробами мочи без предварительной пробоподготовки, на лазерном масс-спектрометре. При регистрации в масс-спектрах набора 20 пиков в диапазоне от 42 до 287,1 m/z, приведенного в таблице 1 описания, диагностируют повреждение паренхимы почек. Способ обеспечивает возможность повышения эффективности диагностики повреждения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом за счет масс-спектрометрического анализа летучих органических соединений (волатома) мочи. 3 ил., 3 табл., 2 пр.

Способ диагностики повреждения почек у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом (ПМР), характеризующийся сбором мочи у пациентов с последующим анализом масс-спектров летучих органических соединений, выделяемых пробами мочи без предварительной пробоподготовки, на лазерном масс-спектрометре, и при регистрации в масс-спектрах набора 20 пиков в диапазоне от 42 до 287,1 m/z, приведенного в таблице 1 описания, диагностируют повреждение паренхимы почек.