Настоящее изобретение относится к композициям на основе липидов, которые можно использовать для эффективного введения РНК субъекту.
В данной области техники известны различные составы на основе липидов, которые могут действовать как векторы для нуклеиновых кислот, чтобы обеспечить их доставку в организм пациента, см., например, статью: А.С. Silva и др., Current Drug Metabolism, 16, 3-16, (2015) и цитированную в ней литературу. Составом, который был успешно протестирован в ходе клинических исследований доставки пДНК ингаляцией, является состав GL67A (Е. Alton и др., Efficacy and Mechanism Evaluation, 3, issue 5, (2016, июль)). Состав GL67A содержит вместе с пДНК, используемой в качестве терапевтически активной нуклеиновой кислоты, препарат GL67 (также известный как Genzyme Lipid 67, катионное производное холестерина), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG5000 (DMPE-PEG5000).
Однако этот состав характеризуется ограниченной стабильностью (t½: 6 ч), вследствие чего его следует готовить непосредственно перед применением. Более того, было установлено, что данный липидный состав не эффективен для трансфекции РНК in vivo (О. Andries и др., Molecular Pharmaceutics 9, 2136-2145, (2012)). Ввиду этих проблем все еще существует потребность в составах, которые могут действовать в качестве эффективных векторов для доставки РНК in vivo, обеспечивая благоприятный токсикологический профиль.
В контексте настоящего изобретения было установлено, что присутствие 1,2-пропандиола (также обозначаемого как пропиленгликоль) приводит к значительному повышению эффективности трансфекции составов на основе липидов типа, используемого в составе GL67A, которые содержат РНК в качестве нуклеиновой кислоты.
Таким образом, в первом объекте настоящего изобретения предлагается композиция, включающая
(i) частицы, содержащиеся в жидкой фазе, причем частицы включают РНК и липидную композицию, где липидная композиция включает:
(i-a) производное холестерина формулы (I) или его соль:
где
n равен 0 или 1, предпочтительно 0,
R1 означает группу -(CH2)q-NH2 или группу -(CH2)r-NH-(CH2)s-NH2, где q, r и s независимо равны целому числу от 2 до 6,
R2 означает группу -(CH2)t-NH2 или группу -(CH2)u-NH-(CH2)w-NH2, где t, u и w - независимо равны целому числу от 2 до 6,
R3 означает линейную алкандиильную группу, содержащую от 1 до 4 атомов углерода,
(i-b) фосфоглицерид формулы (II) или его соль:
где
R4 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 20 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 20 атомов углерода,
R5 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 20 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 20 атомов углерода,
и
(i-c) пегилированный фосфоглицерид формулы (III) или его соль:
где
р равен целому числу от 5 до 200, предпочтительно от 10 до 170 и наиболее предпочтительно от 10 до 140,
R6 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 20 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 20 атомов углерода,
R7 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 20 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 20 атомов углерода,
и
(ii) 1,2-пропандиол.
Второй объект настоящего изобретения относится к способу получения композиции по первому объекту изобретения, описанному выше, причем указанный способ включает следующие этапы
а) растворение и смешивание компонентов липидной композиции в органическом растворителе с последующей лиофилизацией липидной композиции,
б) регидратация лиофилизованной липидной композиции при добавлении воды,
в) объединение регидратированной липидной композиции с водным раствором РНК, что обеспечивает образование частиц, включающих РНК и липидную композицию, которые содержатся в жидкой фазе,
г) добавление 1,2-пропандиола.
Добавление 1,2-пропандиола можно осуществить простым способом, например, при его добавлении вместе с водой на этапе 6, его добавлении к регидратированной липидной композиции после этапа б), при его добавлении вместе с водным раствором РНК на этапе в), или его добавлении к жидкой фазе после этапа в), где содержатся частицы, включающие РНК и липидную композицию. Следует понимать, что добавление можно осуществлять в один или несколько этапов, например, на разных стадиях процесса.
Более того, было установлено, что 1,2-пропандиол способен повышать стабильность содержащих частицы составов РНК при замораживании, например, когда такой содержащий частицы состав заморожен с целью хранения или обработки. Иными словами, 1,2-пропандиол может также действовать в качестве криопротектора для частиц, включающих РНК и липидную композицию.
Таким образом, в третьем объекте изобретения предлагается твердая композиция, включающая:
(i) частицы, включающие РНК и липидную композицию, и
(ii) 1,2-пропандиол,
причем указанную твердую композицию можно получить замораживанием композиции по первому объекту настоящего изобретения, как определено выше.
В дальнейшем будет представлено подробное описание изобретения и его объектов, рассмотренных выше. Следует понимать, что эти объекты тесно взаимосвязаны. Соответственно, представляется очевидным, что подробная информация, предоставленная с учетом признаков одного объекта изобретения, будет также применима к другим объектам, которые основаны на этом признаке, если не указано иное.
РНК
Композиция и твердая композиция по настоящему изобретению включают рибонуклеиновую кислоту (РНК), более предпочтительно однонитевую РНК, и наиболее предпочтительно иРНК.
Что касается РНК, в принципе в контексте настоящего изобретения можно использовать любой тип РНК. В предпочтительном варианте РНК является однонитевой. Термин "однонитевая РНК" обозначает единую последовательную цепь рибонуклеотидов в отличие от молекул РНК, в которых две или более отдельных цепей формируют двухнитевую молекулу за счет гибридизации отдельных цепей. Термин "однонитевая РНК" не исключает, что однонитевые молекулы сами по себе формируют двухнитевые структуры, такие как вторичные (например, петли и «петли-на-стебле») или третичные структуры.
Термин "РНК" охватывает как РНК, которые кодируют аминокислотную последовательность, так и РНК, которые не кодируют аминокислотную последовательность. Предполагается, что более 80% генома содержат функциональные элементы ДНК, которые не кодируют белки. Эти некодирующие последовательности включают регуляторные элементы ДНК (связывающие сайты для факторов транскрипции, регуляторов и корегуляторов и т.п.) и последовательности, которые кодируют транскрипты, которые никогда не транслируются в белки. Эти транскрипты, которые кодируются геномом и транскрибируются в РНК, но не транслируются в белки, называются некодирующими РНК (ncRNA). Таким образом, в одном варианте настоящего изобретения РНК представляет собой некодирующую РНК. Предпочтительно некодирующая РНК является однонитевой молекулой. Исследования свидетельствуют о том, что ncRNA играют решающую роль в регуляции генов, поддержании целостности генома, в дифференциации и в развитии клеток, а при различных заболеваниях человека наблюдается их разрегуляция. Существуют разные типы ncRNA: короткие (20-50 нуклеотидов), средние (50-200 нуклеотидов) и длинные (>200 нуклеотидов) ncRNA. Короткие ncРНК включают микроРНК (miPHK), малые интерферирующие РНК (siPHK), взаимодействующие с piwi-белками РНК (piPHK) и РНК, инициирующие транскрипцию (tiPHK). Примерами средних ncРНК являются малые ядерные РНК (snPHK)), малые ядрышковые РНК (snoPHK), транспортные РНК (тРНК), РНК, ассоциированные с сайтом начала транскрипции (TSSaPHK), малые РНК, ассоциированные с промотором (PASR) и транскрипты, активирующие последовательности промотора (PROMPT). Группа длинных некодирующих РНК (IncPHK) включает длинные межгенные некодирующие РНК (lincРНК), антисмысловые IncPHK, интронные IncPHK, транскрибированные ультраконсервативные РНК (T-UCR) и другие (статья: Bhan A, Mandal SS, ChemMedChem. (2014, 26 марта), doi: 10.1002/cmdc.201300534). Из упомянутых выше некодирующих РНК только siPHK является двухнитевой. Таким образом, с учетом того, что в предпочтительном варианте настоящего изобретения некодирующая РНК является однонитевой, предпочтительно некодирующая РНК не является siPHK. В другом варианте изобретения РНК является кодирующей РНК, т.е. РНК, которая кодирует аминокислотную последовательность. Такие молекулы РНК также называются иРНК (информационная РНК) и являются однонитевыми молекулами РНК. Нуклеиновые кислоты можно получать химическими и ферментативными методами, известными специалисту в данной области, или с использованием методов рекомбинантных ДНК, или их можно выделить из природных источников, или комбинацией вышеуказанных методов.
Информационные РНК (иРНК) - это сополимеры, которые состоят из нуклеозидфосфатных структурных звеньев, в основном содержащих аденозин, цитидин, уридин и гуанозин в качестве нуклеозидов, которые в качестве промежуточных носителей переносят генетическую информацию от ДНК из клеточного ядра в цитоплазму, где эта информация транслируется в белки. Таким образом, они являются пригодными в качестве альтернативы для генной экспрессии.
В контексте настоящего изобретения термин иРНК означает любую полирибонуклеотидную молекулу, которая при попадании в клетку пригодна для экспрессии белка или его фрагмента, или транслируется в белок или его фрагмент. Термин «белок» в данном контексте охватывает любой тип аминокислотной последовательности, т.е. цепочки двух или более аминокислот, которые связаны друг с другом через пептидные связи и этот термин включает также пептиды и гибридные белки.
иРНК содержит рибонуклеотидную последовательность, кодирующую белок или его фрагмент, функция которого в клетке или в окружающей клетку среде необходима или оказывает положительный эффект, например, белок, недостаток или дефектная форма которого являются основной причиной расстройства или заболевания, и присутствие которого способно смягчить или предотвратить расстройство или заболевание, или белок, который может способствовать благоприятному процессу в организме, в клетке или в ее окружении. иРНК может содержать последовательность для полноразмерного белка или его функционального варианта. Кроме того, рибонуклеотидная последовательность может кодировать белок, который действует как фактор, индуктор, регулятор, стимулятор или фермент, или как их функциональный фрагмент, в случаях, когда функция этого белка необходима для лечения расстройства, прежде всего метаболического расстройства, или с целью инициирования процессов in vivo, таких как формирование новых кровеносных сосудов, тканей и т.д. В данном контексте функциональный вариант означает фрагмент, который внутри клетки способен проявлять функцию белка, действие которого необходимо в клетке, либо недостаток или поврежденная форма которого в клетке вызывают патогенный процесс. Помимо этого, иРНК может также включать дополнительные функциональные участки и/или 3' или 5' некодирующие участки. Некодирующими 3' и/или 5' участками могут являться участки, естественным образом фланкирующие кодирующую белок последовательность, или искусственные последовательности, которые способствуют стабилизации РНК. Специалисты в данной области техники могут определять пригодные для этих целей последовательности в каждом случае при проведении обычных экспериментов.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения иРНК содержит 5'-кэп структуру (пять-штрих кэп, кэп-0), состоящую из m7GpppG кэпа, соединенного с иРНК через 5'-5' фосфодиэфирную связь, дополнительной метальной группы в предконцевом нуклеотиде со стороны 5'-концевого участка иРНК (кэп-1, аналог структуры с прямым кэпированием (ARCA)) и/или участка внутренней посадки рибосомы (IRES) и/или поли(А)-хвоста в 3'-концевом участке, прежде всего в целях улучшения трансляции. иРНК может включать дополнительные участки, промотирующие трансляцию, такие как, например, кэп-2-структуры или гистонные структуры «петля-на-стебле».
Как отмечено выше, если не указано иное в особом контексте, термин «иРНК», используемый в настоящем документе, охватывает модифицированные иРНК, т.е. иРНК может быть модифицированной иРНК.
В другом варианте настоящего изобретения иРНК содержит меченые нуклеиновые кислоты (предпочтительно нуклеотиды и/или рибонуклеотиды), такие как, например, изотопно и/или флуоресцентно меченые нуклеотиды. Меченые молекулы иРНК играют важную роль, например, в изучении внутриклеточной конформации молекул РНК и ДНК.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения РНК, предпочтительно иРНК, является молекулой, которая содержит модифицированные нуклеотиды/рибонуклеотиды. Кроме четырех классических рибонуклеотидов, а именно аденозина, гуанозина, цитидина и уридина, существует множество аналогов каждого из этих азотистых оснований. Иногда в данном тексте и в цитируемой литературе эти аналоги или молекулы РНК/иРНК, которые включают один или более из этих аналогов, в контексте настоящего изобретения обозначаются как модифицированные (например, модифицированные нуклеотиды или модифицированные рибонуклеотиды). Некоторые аналоги отличаются от представленных выше канонических азотистых оснований, однако они все же могут существовать в природе. Другие аналоги имеют искусственное происхождение. Предусмотрено использование обоих типов аналогов.
Предпочтительные модификации представлены в следующей таблице (таблица 1).
В случае РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, либо каждый из всех уридиновых нуклеотидов или цитидиновых нуклеотидов можно модифицировать в одинаковой форме, либо в иных случаях можно использовать смесь каждого из модифицированных нуклеотидов. Модифицированные нуклеотиды могут содержать природные или не встречающиеся в природе модификации. Может применяться смесь различных модифицированных нуклеотидов. Таким образом, например, одна часть модифицированных нуклеотидов может содержать природные модификации, в то время как другая часть содержит не встречающиеся в природе модификации, или можно использовать смесь модифицированных нуклеотидов, содержащих природные и/или не встречающиеся в природе модификации. Кроме того, часть модифицированных нуклеотидов может содержать модификацию основания, а другая часть - модификацию сахара. Аналогичным образом, можно использовать модификации всех оснований, или модификации всех Сахаров, или любую пригодную комбинацию модификаций. Стабильность и/или продолжительность действия РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, можно избирательно регулировать, варьируя модификации.
В одном варианте настоящего изобретения для одного типа нуклеотидов применяются по меньшей мере две различных модификации, где один тип модифицированных нуклеотидов содержит функциональную группу, через которую можно присоединять дополнительные группы. Нуклеотиды с различными функциональными группами можно также использовать с целью обеспечения связывающими сайтами для присоединения различных групп. Таким образом, часть модифицированных нуклеотидов может нести, например, азидную группу, аминогруппу, гидроксильную группу, тиольную группу или несколько других реакционноспособных групп, пригодных для реакции в заданных условиях. Можно использовать также функциональную группу, которая в определенных условиях может активировать способную к связыванию природную группу, чтобы можно было присоединять молекулы с функциональными группами. Можно также вводить нуклеотиды, модифицированные таким образом, чтобы обеспечивать наличие сайтов связывания, в виде модифицированных аденозина или гуанозина. Выбор прежде всего предпочтительных модификаций и выбор доступных сайтов связывания зависит от типа групп, которые необходимо ввести, и от периодичности, с которой эти группы должны присутствовать. Таким образом, содержание нуклеотидов, обеспечиваемое функциональными и/или активирующими группами, зависит от того, насколько высоко содержание групп, которые должны участвовать в связывании, и которое специалисты в данной области техники могут определить простым методом. Как правило, содержание модифицированных нуклеотидов с функциональными и/или активирующими группами, при их наличии, составляет от 1 до 25% модифицированных нуклеотидов. Специалисты в данной области техники могут при необходимости определять наиболее пригодные для каждого случая группы и их оптимальное содержание в ходе обычных экспериментов.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, отличается тем, что модифицированные уридины выбраны из 2-тиоуридина, 5-метилуридина, псевдоуридина, 5-метилуридин-5'-трифосфата (m5U), 5-йодуридин-5'-трифосфата (I5U), 4-тиоуридин-5'-трифосфата (S4U), 5-бромуридин-5'-трифосфата (Br5U), 2'-метил-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (U2'm), 2'-амино-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (U2'NH2), 2'-азидо-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (U2'N3) и 2'-фтор-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (U2'F).
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, отличается тем, что модифицированные цитидины выбраны из 5-метилцитидина, 3-метилцитидина, 2-тиоцитидина, 2'-метил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата (С2'm), 2'-амино-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата (C2'NH2), 2'-фтор-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата (C2'F), 5-йодцитидин-5'-трифосфата (I5U), 5-бромцитидин-5'-трифосфата (Br5U) и 2'-азидо-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата (C2'N3).
В предпочтительном варианте настоящего изобретения иРНК означает иРНК, содержащую комбинацию модифицированных и не модифицированных нуклеотидов, предпочтительно иРНК, содержащую комбинацию модифицированных и не модифицированных нуклеотидов, как описано в международной заявке WO 2011/012316. Как сообщалось, описываемая в этом документе иРНК проявляет повышенную стабильность и пониженную иммуногенность. В предпочтительном варианте настоящего изобретения в такой модифицированной иРНК от 5 до 50% цитидиловых нуклеотидов и от 5 до 50% уридиловых нуклеотидов являются модифицированными. Аденозин- и гуанозинсодержащие нуклеотиды могут являться не модифицированными. Аденозиновые и гуанозиновые нуклеотиды могут быть не модифицированными или частично модифицированными, и в предпочтительном варианте они представлены в не модифицированной форме. Предпочтительно от 10 до 35% цитидиловых и уридиловых нуклеотидов являются модифицированными, и прежде всего предпочтительно содержание модифицированных цитидиловых нуклеотидов находится в диапазоне от 7,5 до 25%, а содержание модифицированных уридиловых нуклеотидов находится в диапазоне от 7,5 до 25%. Было установлено, что в действительности относительно низкое содержание, например, только 10% каждого из модифицированных цитидилового и уридилового нуклеотидов, может способствовать достижению требуемых свойств. Более предпочтительно модифицированными цитидиловыми нуклеотидами являются 5-метилцитидиловые остатки, а модифицированными уридиловыми нуклеотидами являются 2-тиоуридиловые остатки. Наиболее предпочтительно содержание модифицированных цитидиловых нуклеотидов и модифицированных уридиловых нуклеотидов составляет 25% соответственно.
В некоторых других вариантах настоящего изобретения в такой модифицированной РНК, предпочтительно иРНК от 5 до 50% цитидинов являются аналогами С и от 5 до 50% уридинов являются аналогами U. В некоторых вариантах настоящего изобретения в такой модифицированной РНК, предпочтительно иРНК от 5 до 40% цитидинов являются аналогами С и от 5 до 40% уридинов являются аналогами U. В некоторых вариантах настоящего изобретения в такой модифицированной РНК, предпочтительно иРНК от 5 до 30% цитидинов являются аналогами С и от 5 до 30% уридинов являются аналогами U. В некоторых вариантах настоящего изобретения в такой модифицированной РНК, предпочтительно иРНК от 10 до 30% цитидинов являются аналогами С и от 10 до 30% уридинов являются аналогами U. В некоторых вариантах настоящего изобретения в такой модифицированной РНК, предпочтительно иРНК от 5 до 20% цитидинов являются аналогами С и от 5 до 20% уридинов являются аналогами U. В некоторых вариантах настоящего изобретения в такой модифицированной РНК, предпочтительно иРНК от 5 до 10% цитидиновых нуклеотидов и от 5 до 10% уридиновых нуклеотидов модифицированы. В некоторых вариантах настоящего изобретения в такой модифицированной РНК, предпочтительно иРНК 25% цитидиновых нуклеотидов и 25% уридиновых нуклеотидов модифицированы. В некоторых вариантах настоящего изобретения аденозин- и гуанозинсодержащие нуклеотиды могут являться не модифицированными. В некоторых вариантах настоящего изобретения аденозин- и гуанозин-содержащие нуклеотиды могут являться не модифицированными или частично модифицированными, причем они предпочтительно присутствуют в не модифицированной форме.
Как отмечено выше, в некоторых вариантах настоящего изобретения термин «аналоги U» относится к единственному типу аналога U. В некоторых вариантах настоящего изобретения термин «аналоги U» относится к двум или более типам аналогов U. В некоторых вариантах настоящего изобретения термин «аналоги С» относится к единственному типу аналогов С. В некоторых вариантах настоящего изобретения термин «аналоги С» относится к двум или более типам аналогов С.
В некоторых вариантах настоящего изобретения процентное содержание цитидинов, которые являются аналогами цитидина, в РНК, предпочтительно в иРНК, не равно процентному содержанию в РНК, предпочтительно в иРНК, уридинов, являющихся аналогами уридина. В некоторых вариантах настоящего изобретения процентное содержание аналогов цитидина ниже, чем процентное содержание аналогов уридина. Как отмечено выше, это может быть справедливым при наличии или отсутствии аналогов аденозина и гуанозина, однако в некоторых вариантах настоящего изобретения это справедливо при отсутствии аналогов аденозина и аналогов гуанозина. В некоторых вариантах настоящего изобретения РНК, предпочтительно иРНК, как раскрыто в изобретении, включает менее 15%, менее 10%, менее 5% или менее 2% аналогов аденозина, аналогов гуанозина или аналогов обоих нуклеозидов.
В некоторых вариантах изобретения молекулы РНК, предпочтительно иРНК, по настоящему изобретению, включают аналоги цитидина и аналоги уридина, причем от 5 до 20% цитидинов являются аналогами цитидина, а от 25 до 45% уридинов являются аналогами уридина. Другими словами, РНК, предпочтительно иРНК, включает модифицированные и не модифицированные цитидины, а также модифицированные и не модифицированные уридины, причем от 5 до 20% цитидинов включают аналоги цитидина, в то время как от 25 до 45% уридинов включают аналоги уридина. В других вариантах настоящего изобретения РНК, предпочтительно иРНК, включает от 5 до 10% аналогов цитидина и от 30 до 40% аналогов уридина, например, от 7 до 9% аналогов цитидина, прежде всего приблизительно 7, 7,5 или 8% и от 32 до 38% аналогов уридина, прежде всего приблизительно 33, 34, 35 или 36%.
В некоторых вариантах изобретения могут использоваться любые из описанных в данном контексте аналогов уридина и аналогов цитидина, необязательно исключая псевдоуридин. В некоторых вариантах изобретения аналог цитидина включает или состоит из 5-йодцитидина (например, «состоит» в случае, если используется единственный тип аналога), и аналог уридина включает или состоит из 5-йодуридина (например, «состоит» в случае, если используется единственный тип аналога).
В некоторых из любых вышеприведенных вариантах изобретения термин «процентное содержание» аналогов данного нуклеотида относится к исходному процентному содержанию (например, процентное содержание аналогов в исходной реакционной смеси, такой как исходная реакционная смесь транскрипции in vitro). В некоторых из любых приведенных выше вариантах изобретения термин «процентное содержание» аналогов данного нуклеотида относится к процентному содержанию продукта (например, процентное содержание в синтезированном или транскрибированном соединении). Оба возможных варианта рассматриваются в равной степени.
Молекулы РНК, предпочтительно иРНК, по настоящему изобретению можно получить рекомбинантным методом в системах in vivo, известным специалистам в данной области техники.
В другом варианте молекулы модифицированной РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, можно получить в системе in vitro, например, с использованием системы транскрипции in vitro, известной специалисту в данной области техники. Для осуществления реакции транскрипции in vitro, способной получать РНК, предпочтительно иРНК, требуется исходная смесь модифицированных и не модифицированных нуклеозидтрифосфатов для получения модифицированных молекул РНК, предпочтительно иРНК с требуемыми свойствами по настоящему изобретению. В некоторых вариантах изобретения от 5 до 50% цитидинов являются аналогами цитидина в такой исходной смеси, и от 5 до 50% уридинов являются аналогами уридина в такой исходной смеси. В других вариантах осуществления изобретения от 5 до 40% цитидинов являются аналогами цитидина в такой исходной смеси, и от 5 до 40% уридинов являются аналогами уридина в такой исходной смеси. В других вариантах осуществления изобретения от 5 до 30% цитидинов являются аналогами цитидина в такой смеси, и от 5 до 30% уридинов являются аналогами уридина в такой исходной смеси. В еще одних вариантах осуществления изобретения от 5 до 30% цитидинов являются аналогами цитидина в такой смеси, и от 10 до 30% уридинов являются аналогами уридина в такой смеси. В еще одних вариантах осуществления изобретения от 5 до 20% цитидинов являются аналогами цитидина в такой исходной смеси, и от 5 до 20% уридинов являются аналогами уридина в такой исходной смеси. В других вариантах осуществления изобретения от 5 до 10% цитидинов являются аналогами цитидина в такой исходной смеси, и от 5 до 10% уридинов являются аналогами уридина в такой исходной смеси. В других вариантах осуществления изобретения 25% цитидинов являются аналогами цитидина в такой исходной смеси, и 25% уридинов являются аналогами уридина в такой исходной смеси. В еще одних вариантах осуществления изобретения исходная смесь не включает аналоги аденозина и/или гуанозина. В других вариантах осуществления изобретения исходная смесь не обязательно включает один или более аналогов аденозина и/или гуанозина (или ни одного из них).
В некоторых вариантах осуществления изобретения процентное содержание цитидинов, являющихся аналогами цитидина, в исходной смеси не равно процентному содержанию уридинов, являющихся аналогами уридина, в исходной смеси. В других вариантах осуществления изобретения процентное содержание аналогов цитидина в исходной смеси ниже, чем процентное содержание аналогов уридина в исходной смеси. Как отмечено выше, это может иметь место при наличии или в отсутствие аналогов аденозина и гуанозина в исходной смеси, однако в других вариантах осуществления изобретения это имеет место при отсутствии аналогов аденозина и аналогов гуанозина в исходной смеси.
В некоторых вариантах осуществления изобретения исходная смесь нуклеотидов для системы транскрипции in vitro, при помощи которой получают РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, включает аналоги циидина и аналоги уридина, причем от 5 до 20% цитидинов в исходной смеси являются аналогами цитидина и от 25 до 45% уридинов в исходной смеси являются аналогами уридина. Иными словами, исходная смесь включает модифицированные и не модифицированные цитидины, а также модифицированные и не модифицированные уридины, причем от 5 до 20% цитидинов в исходной смеси включают аналоги цитидина, в то время как от 25 до 45% уридинов в исходной смеси включают аналоги уридина. В иных вариантах осуществления изобретения исходная смесь включает от 5 до 10% аналогов цитидина и от 30 до 40% аналогов уридина, например, от 7 до 9% аналогов цитидина, прежде всего 7, 7,5 или 8% и, например, от 32 до 38% аналогов уридина, прежде всего 33, 34, 35 или 36%.
В других вариантах осуществления изобретения могут использоваться любые из описанных в данном контексте аналогов уридина и аналогов цитидина, необязательно исключая псевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления изобретения аналог цитидина включает или состоит (например, «состоит» в случае использования единственного типа аналога С) из 5-йодцитидина, а аналог уридина включает или состоит (например, «состоит» в случае использования единственного типа аналога U) из 5-йодуридина.
Типичные аналоги описаны в выше приведенных таблицах. Представляется очевидным, что для модифицированных полирибонуклеотидов, кодирующих требуемый полипептид (модуль (а)), термины «аналоги» и «степень модификации», если не указано иное, рассматриваются в отношении всей длины полирибонуклеотида, кодирующего требуемый полипептид (модуль (а)), включая 5' и 3' нетранслируемые участки (например, степень модификации основана на исходных соотношениях содержания аналогов в реакционной смеси транскрипции in vitro, например, для встраивания аналогов в положения, предназначенные для транскрипции).
Более того, модифицированные молекулы РНК, предпочтительно иРНК, можно синтезировать химическим способом известными методами химического синтеза на автоматизированном синтезаторе нуклеотидных последовательностей с использованием твердофазного носителя и стандартных методик или химическим синтезом соответствующих последовательностей ДНК и их последующей транскрипции in vitro или in vivo.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения иРНК можно объединять с сайтами-мишенями связывания, последовательностями-мишенями и/или с сайтами связывания микроРНК в целях обеспечения активности требуемой иРНК только в релевантных клетках. В еще одном предпочтительном варианте настоящего изобретения РНК можно объединять с микроРНК или короткошпилечной РНК (shPHK) по ходу транскрипции 3' поли(А)-хвоста.
Как правило, терапевтические эффекты могут достигаться в результате взаимодействия нуклеиновой кислоты с клеточными соединениями и органеллами. Такое взаимодействие само по себе может, например, активировать врожденную иммунную систему, как в случае конкретных CpG-олигонуклеотидов и последовательностей, разработанных с целью взаимодействия исключительно с toll-подобными и другими вне- или внутриклеточными рецепторами. Более того, захват клетками или введение нуклеиновых кислот (предпочтительно иРНК) в клетки может предназначаться для экспрессии нуклеотидных последовательностей, таких как гены в составе нуклеиновой кислоты (предпочтительно иРНК), может предназначаться для регуляции с понижением активности, сайленсинга или нокдаун-экспрессии эндогенного гена как следствие присутствия внутри клетки введенной экзогенной нуклеиновой кислоты, или может предназначаться для модификации последовательностей эндогенных нуклеиновых кислот, такой как репарация, вырезание, вставка или замена выбранных оснований или целых участков последовательностей эндогенных нуклеиновых кислот, или может предназначаться для подавления практически любых клеточных процессов вследствие присутствия внутри клетки и взаимодействия с введенной экзогенной нуклеиновой кислотой (предпочтительно иРНК). Сверхэкспрессия введенных экзогенных нуклеиновых кислот (предпочтительно иРНК) может предназначаться для компенсации или дополнения экспрессии эндогенных генов, прежде всего в случаях, когда эндогенный ген является дефектным или «молчащим», что приводит к отсутствию продукта или к получению непригодного, дефектного или не функционирующего продукта экспрессии генов, как в случае многих связанных с обменом веществ или наследственных заболеваний, таких как, например, кистозный фиброз, гемофилия или мышечная дистрофия, и это только некоторые примеры. Сверхэкспрессия введенных экзогенных нуклеиновых кислот (предпочтительно иРНК) также может предназначаться для того, чтобы продукт экспрессии взаимодействовал или подавлял любой эндогенный клеточный процесс, такой как регуляция генной экспрессии, трансдукция сигнала и другие клеточные процессы. Сверхэкспрессия введенных экзогенных нуклеиновых кислот (предпочтительно иРНК) также может предназначаться для индукции иммунного ответа в условиях конкретного организма, в котором находится трансфектированная или трансдуцированная клетка, или в котором она должна находиться. Примеры включают генетическую модификацию антиген-презентирующих клеток, таких как дендритные клетки, для презентации ими антигена с целью вакцинации. Другие примеры включают сверхэкспрессию цитокинов в опухолях с целью вызвать опухолеспецифичный иммунный ответ. Более того, сверхэкспрессия введенных экзогенных нуклеиновых кислот (предпочтительно иРНК) также может предназначаться для генерирования in vivo или ex vivo транзиентно генетически модифицированных клеток для клеточной терапии, таких как модифицированные Т-клетки, клетки-предшественники, стволовые или другие клетки для регенеративной медицины.
Регуляцию со снижением активности, сайленсинг или нокдаун-экспрессию эндогенных генов в терапевтических целях можно осуществлять, например, с использованием РНК-интерференции (RNAi) с рибозимами, антисмысловыми олигонуклеотидами, тРНК, длинными двухнитевыми РНК, причем такая регуляция со снижением активности может быть сиквенс-специфичной или неспецифичной, а также может приводить к гибели клетки, как в случае введения длинных двухнитевых РНК внутрь клеток. Регуляция со снижением активности, сайленсинг или нокдаун-экспрессия эндогенных или уже существующих генов могут оказывать благоприятное действие при лечении приобретенных, наследственных или спонтанно возникающих заболеваний, включая вирусные инфекции и рак. Можно также предусматривать введение нуклеиновых кислот в клетки в качестве превентивной меры в целях предотвращения, например, вирусной инфекции или новообразований. Регуляция со снижением активности, сайленсинг или нокдаун-экспрессия эндогенных генов могут проявляться на транскрипционном уровне и на трансляционном уровне. Многочисленные механизмы, известные специалистам в данной области техники, включают, например, эпигенетические модификации, изменения в структуре хроматина, селективное связывание факторов транскрипции введенной нуклеиновой кислотой, гибридизацию введенной нуклеиновой кислоты с комплементарными последовательностями в геномной ДНК, иРНК или других видах РНК за счет спаривания оснований, включая нетипичные механизмы спаривания оснований, такие как образование тройной спирали. Аналогичным образом, репарацию генов, изменения основания или последовательности можно осуществлять на уровне генома и на уровне иРНК, включая пропуск экзона. Изменения основания или последовательности можно осуществлять, например, за счет РНК-управляемого сайт-специфического расщепления ДНК, с использованием механизмов вырезания и вставки за счет транс-сплайсинга, транс-сплайсинга рибозимов, химерапластов, опосредованного сплайсосомами транс-сплайсинга РНК, или с использованием интронов группы II или перенаправленных интронов, или с использованием вирус-опосредованного инсерционного мутагенеза, или при помощи направленной геномной вставки с использованием прокариотических, эукариотических или вирусных интегразных систем. Так как нуклеиновые кислоты являются носителями схем создания живых систем, и так как они напрямую и косвенно принимают участие во многих клеточных процессах, теоретически на любой клеточный процесс возможно повлиять введением нуклеиновых кислот в клетки извне. Примечательно, что это введение можно проводить напрямую in vivo и ex vivo в культурах клеток или органов с последующей трансплантацией модифицированных таким образом органов или клеток реципиенту. Частицы для применения по настоящему изобретению в смеси с нуклеиновыми кислотами в качестве терапевтически активных агентов могут оказывать благоприятный эффект для всех вышеописанных целей.
Как упомянуто выше, РНК, предпочтительно иРНК, может содержать рибонуклеотидную последовательность, которая кодирует белок или его фрагмент, функция которого необходима или оказывает благоприятное действие в клетке или в ее окружении, например, белок, недостаток или поврежденная форма которого являются причиной нарушения или заболевания, и обеспечение которым способно смягчить или предотвратить нарушение или заболевание, или белок, который может способствовать благоприятному действию на организм в клетке или в ее окружении.
Безусловно, в последние годы РНК (прежде всего иРНК) приобретает все большее значение в качестве нового лекарственного препарата. В отличие от основанных на ДНК генных терапевтических средств, иРНК не требуется доставлять внутрь ядра, но она транслируется напрямую в белок в цитоплазме (см. статью: J Control Release, 150, 238-247, (2011) и статью: Eur J Pharm Biopharm, 71, 484-489, (2009)).
Кроме того, известны многие генетические расстройства, вызванные мутацией одного гена, которые являются кандидатами для терапевтического применения РНК, предпочтительно иРНК. Расстройства, вызванные мутациями одного гена, такие как кистозный фиброз, гемофилия и многие другие, могут быть доминантными или рецессивными в зависимости от вероятности и от появления такого признака у потомства. В то время как доминантный аллель характеризуется фенотипом у индивидуумов, для которых выявлена только одна копия этого аллеля, в случае рецессивного аллеля у индивидуума должны присутствовать две его копии, по одной от каждого родителя, чтобы признак проявился. Напротив, полигенные расстройства вызваны двумя или более генами, и часто соответствующее заболевание проявляется в легкой форме и связано с факторами окружающей среды. Примерами полигенных расстройств являются гипертензия, повышенный уровень холестерина, рак, нейродегенеративные расстройства, психические заболевания и другие. К тому же в этих случаях терапевтически активная РНК, предпочтительно иРНК, замещающая один или более таких генов, может оказывать благоприятное действие на таких пациентов. Более того, генетическое расстройство не обязательно должно передаваться по наследству от родительских генов, но также может быть вызвано новыми мутациями. В таких случаях терапевтически активная РНК, предпочтительно иРНК, предоставляющая правильную последовательность гена, также может оказывать благоприятное действие на пациентов.
Онлайн-каталог, содержащий на сегодняшний день 22993 записи о генах человека и генетических расстройствах вместе с соответствующими им генами и описанием их фенотипов, доступен на странице ONIM (Online Mendelian Inheritance in Man) (http://onim.org), генные последовательности каждого из них доступны в базе данных Uniprot (http://www.uniprot.org). В качестве примеров, но не ограничиваясь только перечисленными, в следующей таблице 2 перечислены некоторые врожденные заболевания и соответствующий(е) ген(ы). В связи с высокой степенью взаимодействия путей передачи клеточных сигналов, мутация конкретного гена вызывает множество патогенных симптомов, из которых в таблице 2 перечислены только характеристические.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтический белок, который кодируется РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, выбран из клеточных белков, перечисленных в таблице 2. Таким образом, молекула РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, может кодировать терапевтически активный клеточный белок, причем кодируемым терапевтически активным клеточным белком является один из белков, перечисленных в таблице 2, или его гомолог.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения терапевтически активный белок, который кодируется РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, выбран из секретируемых белков, перечисленных в таблице 2. Таким образом, РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, может кодировать терапевтически активный гибридный белок, где кодированный терапевтически активный белок или его гомолог является одним из перечисленных в таблице 2, а второй белок является сигнальным пептидом, обеспечивающим секрецию терапевтически активного белка. Сигнальный пептид представляет собой короткую включающую от 5 до 30 аминокислот в длину аминокислотную последовательность, находящуюся в N-концевом участке вышеуказанного терапевтически активного белка, и которая проводит гибридный белок по клеточному секреторному пути через определенные органеллы (т.е. через эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи или эндосомы). Таким образом, такой гибридный белок секретируется из клетки или из клеточной органеллы, или включен в клеточную мембрану (например, политопические трансмембранные белки) внутри или на поверхности клетки.
Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, могут кодировать указанные ниже, но не ограничиваясь только ими, белки генов, которые вызывают, провоцируют заболевания или защищают от них. Неограничивающие примеры расстройств, которые можно лечить (или предотвращать), включают вышеуказанный полипептид, белок или пептид, выбранные из группы, состоящей из соединений, представленных в следующей таблице 2.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения кодирующая последовательность РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, может быть транскрибирована и транслирована в часть белка или в полноразмерный белок с клеточной активностью на уровне, равном или более высоком, чем у нативного белка. В других вариантах осуществления изобретения РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, кодирует терапевтически или фармацевтически активный полипептид, белок или пептид, оказывающий терапевтический или профилактический эффект, причем вышеуказанный полипептид, белок или пептид выбраны из группы, состоящей из соединений, представленных в следующей таблице 2. РНК, предпочтительно иРНК, более конкретно, ее кодирующая последовательность, можно использовать для экспрессии части белка или полноразмерного белка с клеточной активностью на уровне, равном или более высоком, чем у нативного белка. Это может обеспечить лечение заболеваний, при которых может быть показано введение молекул РНК.
В представленной выше табл. 2 показаны примеры генов, дефекты в которых приводят к заболеваниям, которые можно лечить с использованием РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, где РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению включает рибонуклеотидную последовательность, которая кодирует полноразмерный вариант белка или его функциональный фрагмент описанного выше дефектного гена. В прежде всего предпочтительных вариантах можно упомянуть наследственные заболевания, которые, например, влияют на легкие, например, такие как недостаточность сурфактант-ассоциированного белка SPB (сурфактант-ассоциированный белок В), недостаточность АВСА3, кистозный фиброз и недостаточность α1-антитрипсина, или которые влияют на плазматические белки (например, врожденный гемохроматоз (недостаточность гепцидина), тромбоцитопеническая пурпура (ТРР, недостаточность ADAMTS 13) и которые вызывают нарушения свертывания крови (например, гемофилия а и в) и недостаточность компонентов системы комплемента (например, недостаточность белка С), состояния иммунодефицита, такие как, например, SCID (вызванное мутациями различных генов, таких как: RAG1, RAG2, JAK3, IL7R, CD45, CD3δ, CD3ε), или недостаточностью в связи с отсутствием аденозиндезаминазы, например, (ADA-SCID), септический гранулематоз (например, вызванный мутациями гена gp-91-phox, гена p47-phox, гена p67-phox или гена р33-phox) и заболевания накопления, такие как болезнь Гоше, болезнь Фабри, болезнь Краббе, MPS I, MPS II (синдром Гунтера), MPS VI, заболевания накопления гликогена типа II или мукополисарахаридозы.
Другие нарушения, для лечения которых можно использовать РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, включают нарушения, такие как SMN1-ассоциированная спинально-мышечная атрофия (SMA), боковой амиотрофический склероз (ALS), GALT-ассоциированная галактоземия, кистозный фиброз (CF), SLC3A1-ассоциированные нарушения, включающие цинстинурию, COL4A5-ассоциированные нарушения, включающие семейный гломерулонефрит с глухотой, недостаточность галактоцереброзидазы, X-связанная адренолейкодистрофия и адреномиелоневропатия, наследственная атаксия Фридрейха, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, TSC1- и TSC2-ассоциированный туберозный склероз, болезнь Санфилиппо (MPS IIIB), CTNS-ассоциированный цистиноз, FMR1-ассоциированные заболевания, которые включают синдром ломкой Х-хромосомы, ассоциированный с ломкой X-хромосомой синдром тремора/атаксии и ассоциированный с ломкой X-хромосомой синдром преждевременного истощения яичников, синдром Прадера-Вилли, наследственная геморрагическая телеангиэктазия (AT), болезнь Ниманна-Пика типа С1, заболевания, ассоциированные с нейронным восковидным липофусцинозом, включающие юношеский нейронный восковидный липофусциноз (JNCL), юношеская болезнь Баттена, болезнь Сантавуори-Халтиа, болезнь Янского-Бильшовского, а также недостаточность РТТ-1 и ТРР1, ассоциированная с ТРР1, EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 и EIF2B5 детская атаксия с гипомиелинизацией центральной нервной системы/исчезновением белого вещества мозга, CACNA1A- и CACNB4-ассоциированная эпизодическая атаксия типа 2, МЕСР2-ассоциированные нарушения, включающие классический синдром Ретта, МЕСР2-ассоциированную тяжелую энцефалопатию новорожденных и синдром РРМ-Х, CDKL5-ассоциированный атипичный синдром Ретта, спинобульбарная мышечная атрофия (SBMA), Notch-3-ассоциированную церебральную аутосомно-доминантную артериопатию с подкорковыми инфарктами и лейкоэнцефалопатией (CADASIL), SCN1A- и SCN1B-ассоциированные судорожные расстройства, полимераза G-ассоциированные расстройства, которые включают синдром Альперса-Гуттенлохера, POLG-ассоциированную врожденную сенсорную нейропатию с ангидрозом, дизартрию и офтальмопарез, и аутосомно-доминантную и рецессивно-прогрессивную внешнюю офтальмоплегию с делециями в митохондриальной ДНК, Х-ассоциированную гипоплазию надпочечников, Х-ассоциированную агаммаглобулинемию, болезнь Фабри, и болезнь Вильсона.
Все эти заболевания, при которых белок, например, фермент является дефектным, можно лечить с использованием РНК, предпочтительно иРНК, кодирующей любой из вышеуказанных белков по настоящему изобретению, что делает доступным белок или его функциональный фрагмент, кодируемый дефектным геном. Заместительная транскриптная терапия/заместительная ферментная терапия не оказывают благоприятного эффекта на генетический дефект, являющийся причиной заболевания, но увеличивают концентрацию фермента, дефицит которого наблюдается у пациента. Например, при болезни Помпе благодаря заместительной транскриптной терапии/заместительной ферментной терапии восстанавливается недостаток лизосомального фермента - кислой альфа-глюкозидазы (GAA).
Таким образом, не ограничивающие примеры белков, которые могут кодироваться иРНК по настоящему изобретению, включают эритропоэтин (ЕРО), гормон роста (соматотропин, hGH), регулятор трансмембранной проводимости при кистозном фиброзе (CFTR), факторы роста, такие как GM-SCF, G-CSF, MPS, белок С, гепцидин, АВСАЗ и сурфактант-ассоциированный белок В. Другие примеры заболеваний, которые можно лечить с использованием РНК по настоящему изобретению, включают гемофилию А/В, болезнь Фабри, CGD, ADAMTS13, болезнь Гурлера, опосредованную Х-хромосомой А-γ-глобулинемию, ассоциированное с аденозиндезаминазой иммунодефицитное состояние и респираторный дистресс-синдром новорожденных, который связан с SP-B. Прежде всего предпочтительно, РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, содержит последовательность, кодирующую сурфактант-ассоциированный белок В (SP-B) или эритропоэтин. Другие примеры белков, которые могут кодироваться РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, включают факторы роста, такие как гормон роста человека hGH, факторы ВМР-2 и ангиогенеза.
В еще одном варианте РНК, предпочтительно иРНК, может содержать рибонуклеотидную последовательность, которая кодирует полноразмерное антитело или его фрагмент (например, обе тяжелую и легкую цепи), которые можно использовать в терапевтических схемах лечения, например, для повышения иммунитета у субъекта. Соответствующие антитела и их применение в терапии известны в данной области техники.
В другом варианте РНК, предпочтительно иРНК, может кодировать функциональное моноклональное или поликлональное антитело, которое может быть пригодным для направленного действия и/или инактивации биологической мишени (например, стимулирующий цитокин, такой как фактор некроза опухоли). Аналогичным образом, РНК, предпочтительно иРНК, может кодировать, например, функциональные антитела против нефротического фактора, который используют при лечении мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита типа II или острого гемолитического уремического синдрома, или в другом варианте, может кодировать антитела против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), которые используют при лечении VEGF-опосредованных заболеваний, таких как рак.
В одном варианте РНК, предпочтительно иРНК, может содержать рибонуктеотидную последовательность, кодирующую антиген, который предпочтительно можно использовать в терапевтических схемах.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения РНК, предпочтительно иРНК, может содержать рибонуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид или белок, который можно использовать в технологиях редактирования генома. Редактирование генома является типом генной инженерии, в ходе которой в геном организма вставляют ДНК с делециями или заменами с использованием нуклеаз. Такие нуклеазы создают сайт-специфичные разрывы в требуемых положениях генома. Индуцированные разрывы подвергают репарации с использованием негомологичного соединения концов или гомологичной рекомбинации, что приводит к направленным мутациям в геноме, и тем самым к «редактированию» генома. Разрывы могут представлять собой либо однонитевые разрывы, либо двухнитевые разрывы (DSB), хотя двухнитевые разрывы (DSB) являются предпочтительными. В данной области техники известно множество систем редактирования генома с использованием различных полипептидов или белков, то есть, например, система CRISPR-Cas, мегануклеазы, цинк-пальцевые нуклеазы (ZFN) и нуклеаза на основе эффектора, подобного активатору транскрипции (TALEN). Методы геномной инженерии описаны в обзорной статье Trends in Biotechnology 31 (7), 397-405 (2013).
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения РНК, предпочтительно иРНК, может содержать рибонуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид или белок семейства белков Cas (CRISPR-ассоциированный белок), предпочтительно Cas9 (CRISPR-ассоциированный белок 9). Белки семейства Cas, предпочтительно Cas9, можно использовать в методах на основе CRISPR/Cas9 и/или в технологиях редактирования генома на основе CRISPR/Cas9. Системы CRISPR/Cas для редактирования, регуляции генома и направленного действия на геном описаны в обзорной статье Nat. Biotechnol. 32(4):347-355 (2014).
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, РНК, предпочтительно иРНК, может содержать рибонуклеотидную последовательность, кодирующую мегануклеазу. Мегануклеазы представляют собой эндодезоксирибонуклеазы, которые в отличие от «обычных эндодезоксирибонуклеаз» распознают большой сайт распознавания (например, последовательность двухнитевой ДНК, включающую от 12 до 40 пар оснований). В результате, соответствующий сайт в любом данном геноме существует только несколько раз, предпочтительно один раз. Следовательно, мегануклеазы рассматриваются как самые специфичные, существующие в природе ферменты рестрикции, и соответственно являются пригодными инструментами в технологиях редактирования генома.
В еще одном предпочтительном варианте РНК, предпочтительно иРНК, содержит рибонуклеотидную последовательность, кодирующую цинк-пальцевую нуклеазу (ZFN). ZFN представляют собой неприродные ферменты рестрикции, полученные при гибридизации связывающего ДНК цинк-пальцевого домена и расщепляющего ДНК домена. Цинк-пальцевые домены можно сконструировать для направленной доставки специфичных требуемых последовательностей ДНК, что позволяет цинк-пальцевым нуклеазам направленно действовать на уникальные последовательности в комплексных геномах. Используя преимущества механизма репарации эндогенной ДНК, ZFN можно использовать для точного изменения генома высших организмов и, следовательно, эти нуклеазы являются пригодными инструментами в технологиях редактирования генома.
В другом предпочтительном варианте РНК, предпочтительно иРНК, может содержать рибонуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу на основе эффектора, подобного активатору транскрипции (TALEN). Нуклеазы TALEN являются ферментами рестрикции, которые можно сконструировать для расщепления специфичных последовательностей ДНК. Нуклеазы TALEN являются гибридными белками, в которых ДНК-связывающий домен TAL-эффектора соединен с ДНК-расщепляющим доменом нуклеазы. Эффекторы, подобные активатору транскрипции (TALE) можно сконструировать для связывания практически любой требуемой последовательности ДНК. Таким образом, при соединении с нуклеазой, можно расщеплять ДНК в требуемых специфичных положениях.
В еще одном из указанных выше вариантов, РНК содержит рибонуклеотидную последовательность, которая не предназначена для экспрессии в качестве белка или полипептида. Таким образом, следует понимать, что термин РНК означает не только любую полинуклеотидную последовательность, которая при включении в клетку транскрибируется в полипептид/белок или его фрагмент. Напротив, также предполагается, что РНК содержит рибонуклеотидную последовательность, которая транскрибируется только в (функциональную) РНК, при этом указанная РНК является конечным продуктом (и, соответственно, не требуется трансляция). В этом контексте предполагается, что РНК содержит рибонуклеотидную последовательность, которая предпочтительно обеспечивает генетическую информацию для последовательности siPHK или другой требуемой рибонуклеотидной последовательности.
Следует понимать, что частицы для применения в контексте настоящего изобретения могут включать единственный тип РНК, но в другом варианте могут включать комбинацию двух или более типов РНК, например, в форме частиц, включающих два или более типов РНК, в составе одной частицы или в форме смеси частиц, которые отличаются по типу содержащейся в них РНК.
Липидная композиция
Композиция согласно первому объекту настоящего изобретения и твердая композиция согласно третьему объекту настоящего изобретения включает частицы, которые включают РНК и липидную композицию.
Липидная композиция включает (i-a) производное холестерина формулы (I) или его соль, (i-b) фосфоглицерин формулы (II) или его соль, и (i-c) пегилированный фосфоглицерин формулы (III) или его соль. Могут присутствовать дополнительные липидные компоненты, однако липидными компонентами в липидной композиции, содержащейся в частицах, предпочтительно являются только компоненты (i-a), (i-b) и (i-c).
Компонент (i-a) липидной композиции представляет собой производное холестерина формулы (I) или его соль:
где
n равен 0 или 1,
R1 означает группу -(CH2)q-NH2 или группу -(CH2)r-NH-(CH2)s-NH2,
где q, r и s независимо равны целому числу от 2 до 6,
R2 означает группу -(CH2)t-NH2 или -(CH2)u-NH-(CH2)w-NH2,
где t, u и w независимо равны целому числу от 2 до 6,
R3 означает линейную алкандиильную группу, содержащую от 1 до 4 атомов углерода.
Соединения этой формулы и их получение описаны, например, в патенте США 5783565.
Целое число n в формуле I предпочтительно равно 0.
Целые числа q, r, s, t, u и w предпочтительно выбирают из 3 и 4.
Предпочтительно также R1 означает группу -(CH2)q-NH2 и R2 означает группу -(CH2)t-NH2 или группу -(CH2)u-NH-(CH2)w-NH2, или R2 означает группу -(CH2)t-NH2, и R1 означает группу -(CH2)q-NH2 или группу -(CH2)r-NH-(CH2)s-NH2. В обоих случаях, n также предпочтительно равен 0.
Солевые формы производного холестерина формулы (I) можно получить при протонировании кислотой одной или более содержащихся в соединении аминогрупп таким образом, что соединение несет катионный заряд. Следует понимать, что протонированная аминогруппа означает группу, где дополнительный атом водорода присоединен к атому азота в составе аминогруппы и в результате образуется четырехвалентный атом азота, несущий катионный заряд. Пригодными атомами азота в соединении формулы (I) являются атомы азота, содержащиеся в группе -N(R1)(R2), и атомы азота, содержащиеся в группах R1 и R2, соответственно. Следует понимать, что анион, действующий в качестве противоиона для каждой протонированной аминогруппы, в основном представляет собой физиологически приемлемый анион. В композициях по настоящему изобретению, соединение формулы (I) обычно образует соль с кислотными группами в составе РНК. Однако не исключены другие противоионы, и их примеры включают анионы хлорида, бромида, иодида, сульфата, нитрата, фосфата, гидрофосфата, дигидрофосфата, карбоната и гидрокарбоната.
Специалисту в данной области техники представляется очевидным, что соединение формулы (I) в качестве производного холестерина можно представить предпочтительной формулой (Ia):
или еще более предпочтительной формулой (Ib):
В формулах (Ia) и (Ib), определения и предпочтительные определения групп R1, R2, R3 и n представлены выше в отношении формулы (I).
Наиболее предпочтительным компонентом (i-a) липидной композиции является GL67 или его соль, где в отношении формулы (I), (Ia) и (Ib), n равен 0, R1 означает группу -(СН2)3-NH2 и R2 означает группу -(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2.
Компонентом (i-b) липидной композиции является фосфоглицерид формулы (II) или его соль:
где
R4 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 24 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 24 атомов углерода,
R5 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 24 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 24 атомов углерода.
Предпочтительно R4 и R5 каждый означает линейную алкильную группу, содержащую от 14 до 20 атомов, или каждый означает линейную алкенильную группу, содержащую одну или две двойных связей и от 14 до 20 атомов углерода. Более предпочтительно R4 и R5 каждый означает линейную алкенильную группу, содержащую одну двойную связь и от 14 до 20 атомов углерода.
Солевые формы соединения формулы (II) включают формы внутренних солей, где протон кислотной группы -ОН, присоединенный к атому фосфора Р, как показано в формуле (II), протонирует показанную в этой формуле аминогруппу. Такие солевые формы также включают соли, образованные кислотной -ОН группой с основанием, или соли, образованные аминогруппой с кислотой. И снова следует понимать, что соли в основном представляют собой соли, которые являются фармацевтически приемлемыми. В качестве солей с основанием следует упомянуть соли щелочных металлов, такие как соли натрия или калия, соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция или магния, или соли аммония. В качестве типичных солей, образованных с кислотой, следует упомянуть соль, образованную с кислотными группами РНК, но не исключены другие соли, и в качестве типичных солей можно указать соли неорганических кислот, такие как хлорид, бромид или иодид, сульфаты, нитраты, фосфаты, гидрофосфаты или дигидрофосфаты, карбонаты и гидрокарбонаты.
Наиболее предпочтительным компонентом (i-b) липидной композиции является 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) или его соль.
Компонентом (i-c) липидной композиции является пегилированный фосфоглицерид формулы (III) или его соль:
где
р равен целому числу от 5 до 200, предпочтительно от 10 до 170 и наиболее предпочтительно от 10 до 140,
R6 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 20 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 20 атомов углерода,
R7 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 20 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 20 атомов углерода.
Предпочтительно R6 и R7 каждый означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 20 атомов, более предпочтительно предпочтительно R6 и R7 каждый означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 16 атомов.
Таким образом, также предпочтительно в формуле (III) R6 и R7 каждый означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 16 атомов, а р равен целому числу от 10 до 140.
Солевые формы соединения формулы (III) в основном представляют собой фармацевтически приемлемые соли. Типичные соли соединения формулы (III) представляют собой соли, образованные с основанием, и следует упомянуть, например, соли щелочных металлов, такие как соли натрия или калия, щелочноземельных металлов, такие как соли кальция или магния, и соли аммония.
Строго предпочтительно компонентом (i-c) в липидной композиции является 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG (DMPE-PEG) или его соль, где фрагмент PEG (полиэтиленгликоль) содержит от 10 до 140 повторяющихся звеньев, то есть в этом строго предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, согласно формуле (III), R6 и R7 каждый означает линейную алкильную группу, содержащую 13 атомов, и р равен целому числу от 10 до 140. Наиболее предпочтительным компонентом (i-c) является 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG5000 (DMPE-PEG5000) или его соль, где 5000 означает среднечисловую молекулярную массу фрагмента PEG, что соответствует среднему значению р приблизительно 113.
Таким образом следует понимать, что прежде всего предпочтительной липидной композицией для применения в контексте настоящего изобретения является композиция, в которой:
компонент (i-a) представляет собой GL67 или его соль,
компонент (i-b) представляет собой 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG (DOPE) или его соль, и
компонент (i-c) представляет собой 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG (DMPE-PEG) или его соль, где фрагмент PEG (полиэтиленгликоль) содержит от 10 до 140 повторяющихся звеньев, и более предпочтительно 1,2-димиристоил-5и-глицеро-3-фосфоэтаноламин-РЕО5000 (DMPE-PEG5000) или его соль.
В липидной композиции, содержащейся в частицах по настоящему изобретению, молярное соотношение компонентов (i-a), (i-b) и (i-c), то есть (i-a)/(i-b)/(i-c), предпочтительно составляет 1:(от 0,5 до 5):(от 0,01 до 1), более предпочтительно 1:(от 1 до 5):(от 0,01 до 0,5) и наиболее предпочтительно 1:(от 1 до 3):(от 0,02 до 0,2).
Липидная композиция предпочтительно содержит компоненты (i-a), (i-b) и (i-c), которые являются только липидными компонентами.
Согласно указанному выше, строго предпочтительная композиция по первому объекту настоящего изобретения представляет собой композицию, которая включает:
(i) частицы, содержащиеся в жидкой фазе, где частицы включают иРНК и липидную композицию, и где липидная композиция включает:
(i-a) GL67 или его соль,
(i-b) 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG (DOPE) или его соль,
(i-c) 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG (DMPE-PEG) или его соль, где фрагмент PEG (полиэтиленгликоль) содержит от 10 до 140 повторяющихся звеньев, и более предпочтительно 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG5000 (DMPE-PEG5000) или его соль,
в молярном соотношении компонентов (i-a)/(i-b)/(i-c), 1:(от 1 до 3):(от 0,02 до 0,2) и
(ii) 2-пропандиол.
Аналогичным образом, строго предпочтительный вариант по третьему объекту настоящего изобретения относится к твердой композиции, включающей (i) частицы, включающие РНК и указанную выше липидную композицию, и (ii) 1.2-пропандиол, где твердую композицию получают при замораживании указанной выше строго предпочтительной композиции.
Частицы
Композиция согласно первому объекту настоящего изобретения и твердая композиция согласно третьему объекту изобретения включают частицы, включающие РНК и липидную композицию, как описано выше.
Частицы обычно включают наночастицы, включающие РНК и липидную композицию, или микрочастицы, включающие РНК и липидную композицию. Как представляется очевидным специалисту в данной области техники, союз «или» используется в данном контексте неисключительным образом, если специально не указано иное. Таким образом ссылка на нано- или микрочастицы охватывает композиции, содержащие наночастицы, композиции, содержащие микрочастицы, и композиции, содержащие оба типа частиц, наночастицы и микрочастицы. Термин наночастицы, использованный в данном контексте, в основном относится к частицам с диаметром в нанометровом диапазоне, то есть диаметр составляет от 1 им или более до менее 1000 нм. Термин микрочастицы, использованный в данном контексте, в основном относится к частицам с диаметром в микрометровом диапазоне, то есть диаметр составляет от 1000 нм или более до 100 мкм или менее. Предпочтительно частицы состоят из наночастиц, включающих РНК и липидную композицию, или микрочастиц, включающих РНК и липидную композицию.
Частицы, содержащиеся в композициях по настоящему изобретению, предпочтительно характеризуются средним диаметром частиц в диапазоне от 1 до 5000 нм, более предпочтительно от 10 до 4000 нм и наиболее предпочтительно от 50 до 3000 нм.
Верхний предел диаметра отдельных частиц в составе композиций по настоящему изобретению составляет предпочтительно 20 мкм, более предпочтительно 10 мкм и наиболее предпочтительно 5 мкм. Таким образом, как представляется очевидным в связи с вышеуказанным, строго предпочтительный содержащий частицы состав характеризуется средним диаметром частиц в диапазоне от 50 до 3000 нм, и максимальным диаметром частиц 5 мкм.
Диаметры частиц и средний диаметр нано- или микрочастиц в составе, описанном в данном контексте, можно определить простым методом с использованием динамического светорассеяния (DLS). Обычно диаметры частиц и средний диаметр, описанные в данном контексте, обозначены как гидродинамические диаметры частиц в суспендированном состоянии, которые определены методом динамического светорассеяния. Так как действие температуры учитывается при измерении на приборе (например, фирмы Malvern ZetaSizer), и при представлении результатов, измеренные диаметры в основном не зависят от температуры. Однако измерение обычно проводят при комнатной температуре (25°C). В качестве суспензионной среды для измерения DLS при необходимости можно использовать, например, воду или воду, содержащую 1,2-пропандиол. В случае замороженной твердой композиции, диаметры частиц обычно определяют после размораживания композиции. В случаях, когда указан средний размер частиц или средний диаметр частиц, среднее значение обычно означает z- среднее, если не указано иное.
В частицах, содержащихся в композициях по настоящему изобретению, кислотные группы РНК обычно протонируют аминогруппы, содержащиеся в липидной композиции таким образом, что анионные молекулы РНК и катионные молекулы липида могут взаимодействовать, что предпочтительно приводит к формированию комплексов молекул РНК и молекул липидов.
Соотношение N/P, то есть отношение числа атомов азота из производного холестерина формулы (I) в липидной композиции к числу атомов Р фосфатных групп в РНК предпочтительно находится в диапазоне от 1 до 100, более предпочтительно от 1 до 30, и наиболее предпочтительно от 2 до 20.
Предпочтительно частицы присутствуют в форме липосом или липидных наночастиц.
В связи с указанным выше, строго предпочтительная композиция согласно первому объекту настоящего изобретения представляет собой композицию, которая включает:
(i) нано- или микрочастицы, содержащиеся в жидкой фазе, где нано- или микрочастицы включают иРНК и липидную композицию, и где липидная композиция включает:
(i-a) GL67 или его соль,
(i-b) 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG (DOPE) или его соль,
(i-c) 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG (DMPE-PEG) или его соль, где фрагмент PEG (полиэтиленгликоль) содержит от 10 до 140 повторяющихся звеньев, и более предпочтительно 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG5000 (DMPE-PEG5000) или его соль,
в молярном соотношении компонентов (i-a)/(i-b)/(i-c), 1:(от 1 до 3):(от 0,02 до 0,2), и где
соотношение N/P, то есть отношение числа атомов азота N в производном холестерина формулы (I) в липидной композиции к числу атомов Р фосфатных групп в иРНК находится в диапазоне от 2 до 20, и
(ii) 1,2-пропандиол.
Аналогичным образом, строго предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения по третьему объекту относится к твердой композиции, включающей (i) нано- или микрочастицы, включающие РНК и липидную композицию, указанную в предыдущем абзаце, и (ii) 1,2-пропандиол, при этом указанную твердую композицию получают при замораживании указанной выше строго предпочтительной композиции.
Кроме РНК и липидной композиции, частицы в составе композиций, согласно настоящему изобретению, могут включать один или более дополнительных компонентов, например, эксципиенты или добавки, которые обычно представляют собой фармацевтически приемлемые компоненты. Например, такие дополнительные компоненты могут способствовать транспорту к специфическим участкам или ускорять последующий захват частиц в специфических участках после их введения пациенту, или они могут способствовать стабилизации частиц или терапевтически активного агента, содержащегося в них.
Кроме РНК и липидной композиции, частицы, содержащиеся в композициях по первому и третьему объектах настоящего изобретения, могут включать, в качестве необязательной добавки или необязательных добавок, один или более компонентов, которые проявляют эффекторную функцию в процессе доставки терапевтического агента, и предпочтительно в процессе доставки РНК в качестве терапевтического агента в клетку. Такие компоненты могут представлять собой, но не ограничиваясь только ими, полианионы, другие липиды, экранирующие олигомеры или полимеры, полоксамеры (также известные как плюроники), полоксамины, лиганды направленного действия, эндосомолитические агенты, проникающие в клетку и сигнальные пептиды, магнитные и немагнитные наночастицы, ингибиторы РНКазы, флуоресцентные красители, радиоактивные изотопы или контрастные агенты для диагностической визуализации. Термин «эффекторная функция» означает любую функцию, которая способствует достижению требуемого биологического эффекта терапевтически активного агента в составе композиции, оказываемого вблизи или внутри биологической мишени или на окружение биологической мишени. Например, композиции для доставки нуклеиновой кислоты были разработаны с целью включения некодирующих нуклеиновых кислот или не являющихся нуклеиновыми кислотами полианионов в качестве «материалов-наполнителей» (см. статью Kichler и др., J Gene Med, 7, 1459-1467 (2005). Такие материалы-наполнители являются пригодными для снижения дозы нуклеиновой кислоты, требуемой для получения желаемого биологического эффекта с сохранением степени или уровня этого эффекта, полученного при более высокой дозе нуклеиновой кислоты при отсутствии такого материала-наполнителя. Полианионы, не являющиеся нуклеиновыми кислотами, также используют для достижения пролонгированной генной экспрессии in vivo при сниженной токсичности (см. статью Uchida и др., J Control Release, 155, 296-302 (2011)).
Другие типичные экранирующие полимеры, описанные в литературе, которые можно использовать в качестве компонентов содержащего частицы состава, содержащего комплекс рибонуклеиновой кислоты с катионным эксципиентом, включают гидроксиэтилкрахмал (HES: см. статью Noga и др., Journal of Controlled Release, 159(1), 92-103 (2012)), PAS/PA-полипептид (полипептид Pro, Ala, Ser (или Ala, Ser)), см. статью Schlapschy и др., Protein Eng Des Sel. 26(8), 489-501 (Aug, 2013)) или полисаркозин (Psar: см. статью Heller и др., Macromol Biosci, 14, 1380-1395 (2014)).
Лиганды направленного действия можно использовать, например, в содержащих частицы составах для доставки рибонуклеиновой кислоты с целью избирательной и улучшенной трансфекции клеток-мишеней (см. главу Philipp и Wagner в книге "Gene and Cell Therapy Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3-e изд., Глава 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton (2009)). Лиганд направленного действия может представлять собой любое соединение, придающее композициям по настоящему изобретению функцию распознавания мишени и/или связывания с мишенью напрямую или косвенно. Типичными лигандами направленного действия являются аналоги простациклина, раскрытые в международном патенте WO 2011/076391, такие как илопрост или трепростинил. Антитело также может действовать в качестве лиганда направленного действия. В качестве лигандов для частиц можно упомянуть фолиевую кислоту и N-ацетилгалактозамин. В более широком смысле мишень представляет собой отдельную биологическую структуру, с которой лиганд направленного действия может связываться специфически за счет молекулярного взаимодействия, и где такое связывание в конечном счете приведет к избирательному накоплению терапевтически активного агента, такого как включенная в композицию нуклеиновая кислота, в ткани-мишени и/или в клетке-мишени или в ее окружении. Лиганды направленного дейсвия могут быть связаны, например, с концевыми остатками экранирующего полимера.
Кроме того, пригодными компонентами композиций по настоящему изобретению являются эндосомолитические агенты, такие как эндосомолитические пептиды (см. статью Plank и др., Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35 (1998)) или любое другое соединение, предназначенное для повышения эндосомального высвобождения эндоцитозированной нуклеиновой кислоты. Аналогичным образом, пригодными компонентами композиции по настоящему изобретению в качестве медиаторов внутриклеточной доставки нуклеиновой кислоты в клетку являются проникающие в клетку пептиды (в другом контексте также известные как домены белковой трансдукции) (см. статью Lindgren и др., Trends Pharmacol Sci, 21, 99-103 (2000)). Так называемый ТАТ-пептид подпадает в данную классификацию и также выполняет функцию по обеспечению внутриядерной локализации (см. статью Rudolph и др., J Biol Chem, 278, 11411-11418 9999 (2003).
Частицы предпочтительно характеризуются содержанием активного вещества, выраженного как масса РНК в качестве активного вещества по отношению к общей массе частиц в содержащем частицы составе в диапазоне от 0,1 до 95 мас. %, более предпочтительно от 0,5 до 80 мас. %, наиболее предпочтительно от 1 до 50 мас. %.
Композиции, включающие частицы и 1,2-пропандиол Композиция по первому объекту настоящего изобретения и твердая композиция по третьему объекту настоящего изобретения включают частицы, включающие РНК и липидную композицию в смеси с 1,2-пропандиолом. Следует понимать, что информация, представленная выше в отношении пригодных и предпочтительных вариантов РНК, липидной композиции и содержащих их частиц, также применяется в данном контексте следующего обсуждения.
Так как композиция по первому объекту настоящего изобретения содержит РНК в качестве терапевтически активного агента и предназначена для введения терапевтически активного агента пациенту, то ее можно назвать терапевтической композицией или фармацевтической композицией.
В составе композиции по первому объекту настоящего изобретения, которая включает частицы, включающие РНК и липидную композицию в жидкой фазе, частицы, включающие РНК и липидную композицию, предпочтительно диспергированы в жидкой фазе. При использовании термина «диспергированные» подразумевается, что в этом случае частицы образуют дисперсную фазу в непрерывной жидкой фазе. Обычно предпочтительно, чтобы дисперсия представляла собой двухфазную дисперсию с одной непрерывной жидкой фазой и частицами, содержащими РНК и липидную композицию, диспергированными в ней в виде дисперсной фазы.
Композиция по первому объекту настоящего изобретения, в которой частицы, включающие РНК и липидную композицию, содержатся в жидкой фазе, предпочтительно включает частицы в количестве, которое обеспечивает концентрацию РНК в частицах от 0,01 до 50 мг/мл, более предпочтительно от 0,02 до 30 мг/мл и наиболее предпочтительно от 0,05 до 10 мг/мл в расчете на общий объем композиции.
Обычно 1,2-пропандиол содержится в качестве дополнительного компонента в жидкой фазе композиции по первому объекту настоящего изобретения, в которой содержатся частицы, включающие РНК и липидную композицию, предпочтительно в суспендированном состоянии. 1,2-Пропандиол предпочтительно растворен в жидкой фазе. Однако он может находиться в ассоциированной с частицами форме, содержащимися в жидкой фазе.
В составе композиции по первому объекту настоящего изобретения, которая включает частицы, содержащиеся в жидкой фазе, 1,2-пропандиол предпочтительно присутствует в концентрации от 0,1 до 50 мас./об. %, более предпочтительно от 0,2 до 30 мас./об. %, наиболее предпочтительно от 0,3 до 20 мас./об. %, где процентное значение означает массу 1,2-пропандиола в граммах в 100 мл общего объема композиции.
Жидкая фаза, в которой содержатся частицы, предпочтительно в диспергированном состоянии, обычно содержит воду в качестве растворителя. Водой обеспечивается предпочтительно 50% или более, наиболее предпочтительно 70% или более объема (в расчете на общий объем жидкой фазы при 20°C). Более предпочтительно, вода и 1,2-пропандиол являются единственными растворителями, содержащимися в жидкой фазе.
В качестве типичных, дополнительных, необязательных добавок в составе жидкой фазы можно упомянуть одну или более добавок, выбранных из солей, сахаров, органических растворителей и буферных веществ. В качестве буферных веществ можно выбрать вещества, которые обычно используют в фармацевтических или биологических областях применения.
Твердая композиция по третьему объекту настоящего изобретения содержит те же самые компоненты, что и композиция, которую можно замораживать для получения твердой композиции. Таким образом информация, представленная выше в отношении пригодных и предпочтительных вариантов РНК, липидной композиции, частиц, содержащих РНК и липидную композицию, 1,2-пропандиола и жидкой фазы и ее компонентов, также в равной степени применяется к композиции, включающей жидкую фазу, и к твердой композиции. Однако специалисту в данной области техники представляется очевидным, что жидкая фаза может находиться в твердой композиции. Соответственно, твердая композиция предпочтительно содержит дисперсию содержащего частицы состава терапевтического агента в составе твердой непрерывной фазы замороженной композиции. В связи с указанным выше, 1,2-пропандиол предпочтительно содержится в непрерывной фазе, в которой диспергирован содержащий частицы состав.
В соответствии с указанным выше, строго предпочтительная композиция по первому объекту изобретения представляет собой композицию, которая включает:
(i) нано- или микрочастицы, диспергированные в жидкой фазе, включающей воду в качестве растворителя, при этом нано- или микрочастицы включают иРНК и липидную композицию, где липидная композиция включает:
(i-a) GL67 или его соль,
(i-b) 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE),
(i-c) представляет собой 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG (DMPE-PEG) или его соль, где фрагмент PEG (полиэтиленгликоль) содержит от 10 до 140 повторяющихся звеньев, и более предпочтительно 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG5000 (DMPE-PEG5000) или его соль,
в молярном соотношении компонентов (i-a)/(i-b)/(i-c) 1: (от 1 до 3): (от 0,02 до 0,2),
и где соотношение N/P, то есть отношение числа атомов азота N в составе производного холестерина формулы (I) в составе липидной композиции к числу фосфатных групп Р в составе иРНК, составляет 2:1, и
(ii) 1,2-пропандиол в качестве дополнительного компонента в составе жидкой фазы, в которой суспендированы нано- или микрочастицы,
и где композиция содержит 1,2-пропандиол в количестве от 0,3 до 20 мас./об. % 1,2-пропандиола в расчете на общий объем композиции.
Аналогичным образом, строго предпочтительный вариант по третьему объекту настоящего изобретения относится к твердой композиции, включающей (i) нано- или микрочастицы, содержащие РНК и липидную композицию, описанную в предшествующем абзаце, и (ii) 1,2-пропандиол, причем эту твердую композицию получают при замораживании указанной выше строго предпочтительной композиции.
Применение в фармацевтической области
Как указано выше, молекулы РНК, предпочтительно иРНК, которые присутствуют в композициях по настоящему изобретению, как определено выше, прежде всего являются пригодными в медицинских учреждениях и при лечении определенных заболеваний, и, прежде всего при терапии на основе РНК. Таким образом композиции по настоящему изобретению, включающие молекулы РНК, являются пригодными в качестве фармацевтических композиций.
Прежде всего композиции по первому объекту настоящего изобретения являются пригодными для введения субъекту. Таким образом РНК, прежде всего иРНК, содержащиеся в таких композициях, можно также доставлять в организм субъекта. Предпочтительным способом введения композиции является введение в дыхательные пути или через них, прежде всего введение в легкие или назальное введение.
Однако специалисту в данной области техники представляется очевидным, что композицию по первому объекту настоящего изобретения можно также вводить другими способами введения, которые известны в данной области техники для содержащих частицы составов терапевтически активного агента, такими как внутривенное введение в форме дисперсии.
В данной области техники известны устройства для формирования аэрозольной формы из композиции, включающей частицы, содержащиеся в жидкости, или для распыления такой композиции, и такие устройства являются коммерчески доступными. Их можно использовать для осуществления введения композиции по первому объекту изобретения в дыхательные пути или через них, прежде всего для введения в легкие. Для введения через нос можно использовать, например, устройство для назального распыления или назального вливания.
Таким образом другой объект изобретения относится к устройству для формирования аэрозоля из содержащей частицы композиции, содержащейся в жидкости или для распыления такой композиции, при этом указанное устройство включает композицию по первому объекту изобретения. Устройство предпочтительно представляет собой ингалятор, выбранный из ингалятора с отмеренной дозой, небулайзер и устройство для назального распыления.
С помощью такого введения субъекту, РНК, содержащаяся в частицах, можно доставлять в клетки-мишени через дыхательные пути или через них. Термин «доставленный в клетки-мишени» предпочтительно означает перенос РНК, предпочтительно однонитевой РНК, такой как иРНК, в клетку.
Композицию можно вводить субъекту в пригодной дозе. Схема дозировки определяется лечащим врачом и клиническими факторами. Как хорошо известно в области медицины, дозировки для любого субъекта зависят от многих факторов, включая размер субъекта, площадь поверхности тела, возраст, конкретное предназначенное для введения соединение, пол, время и способ введения, общее состояние здоровья и одновременное введение других препаратов. Типичная доза терапевтически активных веществ может, например, находиться в диапазоне от 1 нг до нескольких граммов. Применительно к предпочтительному случаю терапии с помощью иРНК, дозировки иРНК, обеспечивающие экспрессию или ингибирование экспрессии, должны соответствовать этому диапазону, однако предусмотрены дозы ниже или выше этого типичного диапазона, прежде всего с учетом вышеупомянутых факторов. Как правило, схема при регулярном введении фармацевтической композиции должна составлять величину в диапазоне от 0,01 мкг до 10 мг на килограмм массы тела в сутки. Соответственно, если схема введения предусматривает непрерывное вливание, доза также должна находиться в диапазоне от 1 мкг до 10 мг на килограмм массы тела. Ход лечения можно контролировать при периодической оценке. Дозировки можно варьировать, но предпочтительная дозировка для введения иРНК в качестве компонентов композиции по настоящему изобретению составляет приблизительно от 106 до 1019 копий молекулы иРНК.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения, включающему введение композиции по первому объекту изобретения пациенту, предпочтительно с помощью введения в дыхательный пути или через них, более предпочтительно с использованием введения в дыхательные пути или назального введения. Таким образом РНК, содержащаяся в указанной композиции, может оказывать профилактическое или терапевтическое действие. Следует отметить, что термин «пациент» включает животных и людей.
С помощью введения композиции по настоящему изобретению, прежде всего по первому объекту настоящего изобретения, можно осуществлять лечение или профилактику заболеваний. Термин «заболевание» относится к любому предполагаемому патологическому состоянию, которое можно лечить, предотвращать или от которого можно вакцинировать, используя композицию по настоящему изобретению. Указанные заболевания могут, например, представлять собой наследственные, приобретенные, инфекционные или неинфекционные, возрастные, сердечно-сосудистые, метаболические, кишечные, опухолевые (прежде всего раковые) или генетические заболевания. В основе заболевания могут лежать, например, нарушения физиологических процессов, молекулярных процессов, биохимических реакций в организме, в основе которых, в свою очередь, могут лежать, например, генетический аппарат организма, поведенческие, социальные или экологические факторы, такие как воздействие химикатов или радиации.
Термины «лечение» или «излечение», использованные в данном контексте, в основном означают достижение требуемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Соответственно, лечение по настоящему изобретению может относиться к лечению (острых) состояний определенного заболевания, но может также относиться к профилактическому лечению в отношении полной или частичной профилактики заболевания или его симптома. Предпочтительно термин «лечение» следует понимать как терапевтическое действие в отношении частичного или полного излечения заболевания и/или побочных эффектов и/или симптомов, связанных с заболеванием. В этом отношении термин «острый» означает, что у субъекта наблюдаются симптомы заболевания. Другими словами, для субъекта, который нуждается в лечении, действительно требуется лечение, и термин «неотложное лечение» в контексте настоящего изобретения относится к мерам, принимасмым для фактического лечения заболевания после начала заболевания или проявления симптомов заболевания. Лечение также может представлять собой профилактические или превентивные меры, то есть меры, принимасмые для предотвращения заболевания, например, для предотвращения инфекции и/или начала заболевания. Ход лечения можно контролировать при периодической оценке.
В основном РНК, предпочтительно иРНК, включена в эффективном количестве в композицию по настоящему изобретению. Термин «эффективное количество» относится к количеству, достаточному для индукции детектируемой терапевтической ответной реакции у субъекта, которому назначено введение фармацевтической композиции. В соответствии с вышеизложенным, содержание РНК, предпочтительно иРНК, в фармацевтической композиции в соответствии с указанным выше первым объектом настоящего изобретения, не ограничивается при условии, что она является пригодной для лечения, как описано выше. Как указано выше, композиция по первому объекту изобретения, в которой частицы, включающие РНК и липидную композицию, содержатся в жидкой фазе, предпочтительно включает частицы в количестве, достаточном для обеспечения концентрации содержащейся в частицах РНК на уровне от 0,01 до 50 мг/мл, более предпочтительно от 0,02 до 30 мг/мл и наиболее предпочтительно от 0,05 до 10 мг/мл в расчете на общий объем композиции.
Согласно настоящему изобретению, термин «фармацевтическая композиция» относится к композиции по настоящему изобретению, прежде всего к композиции по первому объекту настоящего изобретения, предназначенной для введения субъекту. Типичные субъекты включают млекопитающее, такое как собака, кошка, свинья, крупный рогатый скот, овца, лошадь, грызун, например, крыса, мышь и морская свинка, или примат, например, горилла, шимпанзе и человек. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, субъектом является человек.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в терапии на основе РНК. Как указано выше, молекула РНК, предпочтительно иРНК, включает последовательность, кодирующую белок, и соответственно, ее можно использовать в терапии на основе РНК, где РНК, предпочтительно иРНК кодирует терапевтически или фармацевтически активный полипептид или белок, оказывающий терапевтическое или профилактическое действие. Таким образом в предпочтительных вариантах фармацевтическую композицию по изобретению можно использовать в терапии на основе РНК при лечении или профилактике заболевания, указанного выше в табл. 2. Соответственно, терапию на основе РНК по настоящему изобретению можно использовать при лечении или профилактике, как указано выше в табл. 2.
Таким образом фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать при терапии на основе РНК в случаях, когда дефектные гены, описанные выше в табл. 2, приводят к заболеванию, которое можно лечить или предотвращать с использованием заместительной транскриптной/заместительной ферментной терапии с использованием молекулы РНК, предпочтительно иРНК по настоящему изобретению, где молекула РНК кодирует полноразмерный вариант белка или его функциональный фрагмент, которые компенсируют описанный дефектный ген.
В других вариантах фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в терапии на основе РНК согласно настоящему изобретению, где РНК, предпочтительно иРНК кодирует терапевтически или фармацевтически активный полипептид, белок или пептид, обладающий терапевтическим или профилактическим действием, где указанный полипептид, белок или пептид выбирают из группы, кодируемой генами, как указано в табл. 2.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению прежде всего является пригодной для применения в терапии на основе РНК при лечении или профилактике заболеваний легких. В качестве типичных заболеваний можно упомянуть дефицит альфа-1-антитрипсина, астму, кистозный фиброз, дисфункцию метаболизма сурфактанта или первичную цилиарную дискинезию, как указано в выше в табл. 2.
В других типичных вариантах осуществления изобретения фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в терапии на основе РНК при лечении или профилактике лизосомальных заболеваний, таких как болезнь Гоше, болезнь Фабри, мукополисахаридоз (MPS) I, мукополисахаридоз II (синдром Гюнтера), мукополисахаридоз VI и болезни накопления гликогена, такие как, например, болезнь накопления гликогена типа I (болезнь фон Гирке), типа II (болезнь Помпе), типа III (болезнь Кори), типа IV (болезнь Андерсена), типа V (болезнь Мак-Ардла), типа VI (болезнь Герса), типа VII (болезнь Таури), типа VIII, типа IX, типа X, типа XI (синдром Фанкони-Бикеля), типа XI или типа 0. Заместительная транскриптная терапия/заместительная ферментная терапия не оказывают благоприятного эффекта на генетический дефект, являющийся причиной заболевания, но увеличивают концентрацию фермента, дефицит которого наблюдается у пациента. Например, при болезни Помпе благодаря заместительной транскриптной терапии/заместительной ферментной терапии восстанавливается концентрация недостаточного лизосомального фермента - кислой альфа-глюкозидазы (GAA).
В соответствии с дополнительными примерами, терапевтические схемы терапии на основе РНК по настоящему изобретению можно использовать для лечения рака, сердечно-сосудистого заболевания, вирусной инфекции, иммунной дисфункции, аутоиммунного заболевания, неврологического расстройства, наследственных метаболических нарушений или генетического нарушения, или любого заболевания, при котором белок или белковый фрагмент, продуцируемый в клетке, может оказать благоприятное влияние на пациента. Примеры онкологических заболеваний включают рак головы и шеи, рак молочной железы, рак почек, рак мочевого пузыря, рак легких, рак предстательной железы, рак костей, рак мозга, рак шейки матки, рак анального канала, рак ободочной кишки, колоректальный рак, рак аппендикса, рак глаза, рак желудка, лейкоз, лимфому, рак печени, рак кожи, рак яичников, рак полового члена, рак поджелудочной железы, рак яичек, рак щитовидной железы, рак влагалища, рак вульвы, рак эндометрия, рак сердца и саркому. Примеры сердечно-сосудистых заболеваний включают атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, легочно-сердечную недостаточность и кардиомиопатию. Примеры иммунных дисфункций и аутоиммунных заболеваний включают, но не ограничиваясь только ими, ревматические заболевания, рассеянный склероз и астму. Примеры вирусных инфекций включают, но не ограничиваясь только ими, инфекции, вызываемые вирусом иммунодефицита человека, вирусом простого герпеса, вирусом папилломы человека, а также вирусами гепатита В и С. Примеры неврологических расстройств включают, но не ограничиваясь только ими, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз и деменцию. Примеры наследственных метаболических расстройств включают, но не ограничиваясь только ими, болезнь Гоше и фенилкетонурию.
Способы получения
Специалистам в данной области техники известны пригодные способы получения частиц, включающих нуклеиновую кислоту и липидную композицию в жидкой фазе, и эти способы можно оптимизировать для получения композиций согласно первому объекту настоящего изобретения, где частицы включают РНК в смеси с описанной выше липидной композицией.
Например, липосомы в виде частиц, включающих РНК и липидную композицию, можно получить простым способом при регидратации липидной композиции, то есть при регидратации липидных пленок при необходимости с последующим использованием методов гомогенизации, таких как обработка ультразвуком или экструзия. Альтернативным подходом является вливание липидной композиции, растворенной в органическом растворителе, в воду или водной раствор. Типичным методом, который можно использовать, например, для формирования липидных наночастиц, является метод замещения растворителя.
В качестве альтернативного способа получения композиций по изобретению, где частицы содержатся в жидкой фазе, можно упомянуть методы осаждения, такие как наноосаждение частиц.
1,2-Пропандиол можно добавлять простым способом в жидкую фазу, где содержатся включающие РНК и липидную композицию частицы, или которая предназначена для получения частиц. Добавление 1,2-пропандиола в жидкую фазу можно осуществлять на одной или более различных стадий, включая стадии до, в течение или после получения частиц, содержащих РНК и липидную композицию в жидкой фазе.
Таким образом, как было указано выше, другой объект изобретения относится к способу получения композиции согласно первому объекту изобретения, причем указанный способ включает следующие этапы:
а) растворение и смешивание компонентов липидной композиции в органическом растворителе с последующей лиофилизацией липидной композиции,
б) регидратация лиофилизированной липидной композиции при добавлении воды,
в) объединение регидратированной липидной композиции с водным раствором РНК, что обеспечивает формирование частиц, включающих РНК и липидную композицию, которые содержатся в жидкой фазе, и
г) добавление 1,2-пропандиола.
Добавление 1,2-пропандиола можно осуществлять простым способом, например, при его добавлении одновременно с водой на этапе б), при его добавлении в регидратированную липидную композицию после этапа б), при его добавлении одновременно с водным раствором РНК на этапе в), или при его добавлении в жидкую фазу после этапа в), в которой содержатся частицы, включающие РНК и липидную композицию. Следует понимать, что добавление можно осуществлять на одном или более этапов, например, на различных стадиях способа.
Твердую композицию по третьему объекту изобретения можно получить способом, включающим:
первый этап получения композиции по описанному выше первому объекту изобретения способом, включающим
а) растворение и смешивание компонентов липидной композиции в органическом растворителе с последующей лиофилизацией липидной композиции,
б) регидратация лиофилизированной липидной композиции при добавлении воды,
в) объединение регидратированной липидной композиции с водным раствором РНК, что обеспечивает формирование частиц, включающих РНК и липидную композицию, которые содержатся в жидкой фазе, и
г) добавление 1,2-пропандиола,
и второй этап замораживания композиции, полученной на первом этапе.
В данном способе добавление 1,2-пропандиола также можно осуществлять простым способом, например, при добавлении одновременно с водой на этапе б), при добавлении 1,2-пропандиола одновременно с водным раствором РНК на этапе в), или при его добавлении на этапе в) в жидкую фазу, в которой содержатся частицы, содержащие РНК и липидную композицию. Следует понимать, что добавление можно осуществлять на одном или более этапов, например, на различных стадиях способа.
Стадию замораживания в качестве второго этапа обычно осуществляют, подвергая суспензионную композицию действию достаточно низких температур (например, при -10°C или менее, предпочтительно при -20°C или менее) в пригодном контейнере. В качестве охлаждающей среды можно использовать, например, охлажденный воздух или охлажденные жидкости.
В связи с этим, как обсуждалось выше, твердой композицией по третьему объекту настоящего изобретения является композиция, в составе которой можно сохранять частицы, включающие РНК. В этом случае, следует понимать, что композицию по первому объекту изобретения также можно восстановить из твердой композиции по третьему объекту изобретения при размораживании твердой композиции.
Таким образом, в другом объекте настоящего изобретения предлагается также способ получения композиции по указанному выше первому объекту, причем указанный способ включает:
первый этап получения композиции по указанному выше первому объекту способом, включающим:
а) растворение и смешивание компонентов липидной композиции в органическом растворителе с последующей лиофилизацией липидной композиции,
б) регидратацию липидной композиции при добавлении воды,
в) объединение регидратированной липидной композиции с водным раствором РНК, чтобы обеспечить формирование частиц, включающих РНК и липидную композицию, которые содержатся в жидкой фазе, и
г) добавление 1,2-пропандиола,
второй этап замораживания композиции, полученной на первом этапе, и третий этап размораживания замороженной композиции, полученной на втором этапе.
Краткое изложение важных объектов изобретения представлено в следующих пунктах. Следует понимать, что представленные в этих пунктах элементы составляют часть общего раскрытия настоящего изобретения, так что информация, представленная в предыдущей части описания, например, относительно дополнительных предпочтительных вариантов осуществления или дополнительных признаков, также относится к элементам, описанным в следующих пунктах.
1. Композиция, включающая
(i) частицы, содержащиеся в жидкой фазе, где частицы включают РНК и липидную композицию, и где липидная композиция включает:
(i-a) производное холестерина формулы (I) или его соль:
где
n равен 0 или 1, предпочтительно 0,
R1 означает группу -(CH2)q-NH2 или группу -(CH2)r-NH-(CH2)s-NH2,
где q, r и s независимо равны целому числу от 2 до 6,
R2 означает группу -(CH2)t-NH2 или -(CH2)u-NH-(CH2)w-NH2,
где t, u и w независимо равны целому числу от 2 до 6,
R3 означает линейную алкандиильную группу, содержащую от 1 до 4 атомов углерода,
(i-b) фосфоглицерид формулы (II) или его соль:
где
R4 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 24 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 24 атомов углерода,
R5 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 24 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 24 атомов углерода.
(i-c) пегилированный фосфоглицерид формулы (III) или его соль:
где
р равен целому числу от 5 до 200, предпочтительно от 10 до 170 и наиболее предпочтительно от 10 до 140,
R6 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 20 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 20 атомов углерода,
R7 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 20 атомов углерода, или линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 20 атомов углерода,
и
(ii) 1,2-пропандиол.
2. Композиция по п. 1, где РНК представляет собой иРНК.
3. Композиция по п. 1 или п. 2, где в формуле (I), n равен 0, a R1 означает группу -(CH2)3-NH2, a R2 означает группу -(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2.
4. Композиция по п. 1 или п. 2, где производным холестерина формулы (I) является GL67.
5. Композиция по любому из пунктов 1-4, где в формуле (II), R4 и R5 каждый означает линейную алкенильную группу, содержащую одну двойную связь и от 14 до 20 атомов углерода.
6. Композиция по любому из пунктов 1-4, где фосфоглицеридом формулы (II) является 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
7. Композиция по любому из пунктов 1-6, где в формуле (III), R6 и R7 каждый означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 16 атомов углерода и р равен целому числу от 10 до 140.
8. Композиция по любому из пунктов 1-6, где пегилированным фосфоглицеридом формулы (III) является 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG (DMPE-PEG), где фрагмент PEG (полиэтиленгликоль) содержит от 10 до 140 повторяющихся звеньев и более предпочтительно 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG5000 (DMPE-PEG5000).
9. Композиция по любому из пунктов 1-8, где молярное соотношение компонентов (i-a)/(i-b)/(i-c) в липидной композиции составляет
1:(от 0,5 до 5):(от 0,01 до 1),
более предпочтительно 1:(от 1 до 5):(от 0,01 до 0,5)
наиболее предпочтительно 1:(от 1 до 3):(от 0,02 до 0,2).
10. Композиция по любому из пунктов 1-9, где частицами являются нано- или микрочастицы.
11. Композиция по любому из пунктов 1-10, где частицы характеризуются средним диаметром частиц в диапазоне от 1 до 5000 нм, более предпочтительно от 10 до 4000 нм и наиболее предпочтительно от 50 до 3000 нм.
12. Композиция по любому из пунктов 1-11, где частицы характеризуются максимальным диаметром частиц 20 мкм, более предпочтительно 10 мкм и наиболее предпочтительно 5 мкм.
13. Композиция по любому из пунктов 1-12, где соотношение N/P, то есть отношение числа атомов азота в производном холестерина формулы (I) к числу атомов Р фосфатных групп в РНК предпочтительно находится в диапазоне от 1 до 100, более предпочтительно от 1 до 30 и наиболее предпочтительно от 2 до 20.
14. Композиция по любому из пунктов 1-13, где частицы характеризуются содержанием активного вещества, выраженным как масса РНК по отношению к общей массе частиц в диапазоне от 0,1 до 95%, более предпочтительно от 0,5 до 80%, наиболее предпочтительно от 1 до 50.%.
15. Композиция по любому из пунктов 1-14, которая включает частицы, включающие РНК и липидную композицию в количестве, которое обеспечивает концентрацию РНК от 0,01 до 50 мг/мл, более предпочтительно от 0,02 до 30 мг/мл и наиболее предпочтительно от 0,05 до 10 мг/мл в расчете на общий объем композиции.
16. Композиция по любому из пунктов 1-15, где частицы, включающие РНК и липидную композицию, диспергированы в жидкой фазе.
17. Композиция по любому из пунктов 1-16, где 1,2-пропандиол содержится в жидкой фазе, в которой содержатся частицы.
18. Композиция по любому из пунктов 1-17, где 1,2-пропандиол содержится в концентрации от 0,1 до 50 мас./об. %, более предпочтительно от 0,2 до 30 мас./об. %, наиболее предпочтительно от 0,3 до 20 мас./об. %, в расчете на общий объем композиции.
19. Композиция по любому из пунктов 1-18, где жидкая фаза, в которой содержатся частицы, включает воду.
20. Композиция по п. 19, где водой обеспечивается предпочтительно 50 об. % или более, предпочтительно 70 об. % или более объема в расчете на общий объем жидкой фазы.
21. Композиция по любому из пунктов 1-20, где вода и 1,2-пропандиол являются единственными растворителями, содержащихся в жидкой фазе.
22. Композиция по любому из пунктов 1-21, где жидкая фаза, в которой содержатся частицы, включает буферное вещество.
23. Способ получения композиции по любому из пунктов 1-22, причем указанный способ включает следующие этапы:
а) растворение и смешивание компонентов липидной композиции в органическом растворителе с последующей лиофилизацией липидной композиции,
б) регидратация липидной композиции при добавлении воды,
в) объединение регидратированной липидной композиции с водным раствором РНК, чтобы обеспечить формирование частиц, включающих РНК и липидную композицию, которые содержатся в жидкой фазе, и
г) добавление 1,2-пропандиола.
24. Твердая композиция, включающая
(i) частицы, включающие РНК и липидную композицию, и
(ii) 1,2-пропандиол,
и указанную композицию получают при замораживании композиции по любому из пунктов 1-22.
25. Композиция по любому из пунктов 1-22 для применения при лечении или профилактике заболевания с помощью терапии на основе РНК.
26. Композиция для применения по п. 25, где заболевание, предназначенное для лечения или профилактики, представляет собой заболевание легких.
27. Композиция для применения по п. 25 или п. 26, где лечение или профилактика включает введение композиции в дыхательные пути или через них, предпочтительно введение в легкие или назальное введение.
28. Способ лечения, включающий введение композиции по любому из пунктов 1-22 пациенту, предпочтительно введение в дыхательные пути или через них, более предпочтительно в легкие или назальное введение.
29. Способ по п. 28 для лечения заболевания легких.
30. Устройство для формирования аэрозоля из содержащей частицы композиции, содержащейся в жидкости, или для распыления такой композиции, причем указанное устройство включает композицию по пунктам 1-22.
31. Устройство по п. 30, где устройство представляет собой ингалятор, выбранный из ингалятора с отмеренной дозой, небулайзера или устройства для назального распыления.
Пример I
Нанесение комплексов в культуры ALI
Методы
Формирование комплекса РНК-липид при соотношении N/P5 (и N/P3)
Исходные растворы GL67, DOPE и DMPE-PEG5000 получали при концентрации 10-20 мг/мл каждого препарата в смеси трет-бутанол/вода, 9:1. Липиды смешивали в молярном соотношении 1:2:0,05 (GL67/DOPE/DMPE-PEG5000), причем общая масса липидов составляла 5 мг, замораживали при -80°C в течение ночи и лиофилизировали в течение по меньшей мере 96 ч. Перед применением сухую липидную смесь регидратировали при добавлении 400 мкл 5 об./об. %-ного пропиленгликоля (при этом общая концентрация липидов составляла 12,5 мг/мл) с последующей инкубацией при КТ в течение 30 мин без встряхивания, затем перемешивали на мешалке типа Vortex в течение 10 с и обрабатывали ультразвуком на водяной бане при 37°C в течение 10 мин. Образовавшуюся смесь липосом разбавляли для формирования комплекса с иРНК. Для этой цели 69,65 мкл (87,69 мкл для соотношения N/P3) воды смешивали с 10,24 мкл пропиленгликоля и перемешивали на мешалке Vortex в течение 3 с. Затем добавляли 45,10 мкл (27,06 мкл для соотношения N/P3) смеси липосом, смесь перемешивали на мешалке типа Vortex в течение 10 с, уравновешивали при 39°C в течение 3 мин. 125 мкл раствора иРНК в воде (конц. 0,5 мг/мл) уравновешивали при 39°C в течение 3 мин. Для сборки комплекса в шприц с тонкой иглой (BD Micro-Fine инсулиновый шприц, 0,5 мл U40, 8 мм, 07468060 Becton Dickinson), набирали разбавленную иРНК и быстро вводили в разбавленные липосомы, немедленно перемешивали на мешалке типа Vortex в течение 10 с и инкубировали при КТ в течение 10 мин для сборки комплекса. Затем комплексы хранили на льду.
Обработка культуры ALI
Культуру MucilAir™-ALI получали на фирме Epithelix (Франция). За 5 дней до трансфекции проводили промывку слизи для удаления скопившейся слизи на верхней поверхности. На верхнюю сторону добавляли 200 мкл раствора PBS 1 и инкубировали при 37°C в течение 20 мин. Для отделения слизи от верхней поверхности на верхней поверхности проводили три возвратно-поступательных движения с использованием пипетки и 100 мкл верхней жидкости. PBS-/- из верхней поверхности культуры MucilAir ™ удаляли при осторожном отсасывании без повреждения эпителия. В день трансфекции культуры ALI снова промывали 200 мкл PBS-/-, а затем промывали 200 мкл соответствующего разбавителя комплекса иРНК (вода или 5%-ный пропиленгликоль). Разбавитель немедленно удаляли с верхней поверхности культур ALI при осторожном отсасывании без повреждения эпителия. Затем каждую лунку трансфектировали с использованием 3 мкг общего комплекса иРНК в объеме 50 мкл. Составы разбавляли соответствующим разбавителем, добавляли на верхнюю поверхность культуры ALI и инкубировали в течение 6 ч при 37°C и 5% СО2. Затем раствор комплекса удаляли, слой клеток промывали PBS-/-, и культуры ALI выдерживали в течение 24 ч при 37°C и 5% СО2.
Детектирование сигнала tdTomato с помощью флуоресцентной микроскопии
Для детектирования положительного сигнала tdTomato использовали флуоресцентное изображение через 24 ч после трансфекции. Соответствующее изображение в каждой лунке получали с использованием следующих параметров: экспозиция 500 мс, усиление 1,5, интенсивность 30%.
Результаты
Для обработки культур ALI использовали иРНК, кодирующую tdTomato. Обработанные лунки анализировали на наличие белка tdTomato через 24 ч после обработки. На фиг. 1 представлены типичные изображения.
Как показано на фиг. 1, добавление пропиленгликоля значительно повышает уровень иРНК, которая доставляется в клетки и транслируется в белок. Этот эффект можно наблюдать как при соотношении N/P 3, так и при соотношении N/P 5.
Пример II
Назальное введение комплексов
Методы
Формирование комплекса РНК-липид
Комплексы формировали, как описано ранее в примере I.
Лечение животных
Мышей Balb/c (Charles River Laboratories) лечили комплексами в дозе иРНК 10 мкг/40 мкл. Раствор вводили по одной капле в ноздри животного после анестезии с использованием ингаляции изофлурана (Isothesia, Henry Shine, Германия).
Детектирование уровня люциферазы в ткани носа
Через 5 ч после введения, в ноздри каждого животного вводили интраназально (метод вдыхания носом) 1,5 мг D-люциферина, растворенного в 50 мкл PBS. Биолюминесцентную визуализацию проводили с использованием программы IVIS 100 in vivo в системе визуализации (Perkin Elmer, США). Немедленно после визуализации животных умерщвляли цервикальной дислокацией. Изображения анализировали с использованием программного обеспечения Living Image software (Perkin Elmer, США) при измерении излучения в заданной исследуемой области (ROI). Значения указаны как среднее излучение [p/s/cm2/sr] (фотоны/с/см2/стерадиан).
Результаты
Для лечения мышей Balb/c при вдыхании носом использовали иРНК, кодирующую люциферазу светлячков, в составе комплекса при N/P 5. Результаты анализа носовой ткани по активности люциферазы через 5 ч после лечения (фиг. 2) свидетельствуют о том, что раствор комплексов в 5%-ном пропиленгликоле приводит к повышению активности репортерного белка в носовой ткани по сравнению с теми же самыми комплексами в отсутствии пропиленгликоля (0% PG, вода).
Пример III
Стабильность размера частиц в ходе цикла замораживание-размораживание
Методы
Формирование частиц
Частицы формировали, как описано в примере 1.
Замораживание раствора частиц
После формирования частицы замораживали при выдерживании при -20°C в течение по меньшей мере 16 ч.
Измерение размера
Гидродинамический диаметр частиц определяли методом динамического светорассеяния на анализаторе частиц ZetaSizer Nano ZS (Malvern instruments). Для корректного измерения, вместо состава буферного раствора, используемого программным обеспечением для расчета вязкости растворов, при необходимости прибор настраивали с использованием раствора, содержащего 1,2-пропандиол.
Результаты
Были сформулированы частицы. После их получения измеряли размер свежеприготовленных частиц в растворе в присутствии или отсутствии 1,2-пропандиола. Частицы замораживали при -20°C в течение 16 ч и размораживали при выдерживании при КТ. Затем снова измеряли размер частиц в размороженных растворах. Для поддержания активности, отклонение размера частиц до замораживания и после размораживания должно быть минимальным. Как показано на фиг. 3, для частиц, которые были заморожены в растворе, не содержащем 1,2-пропандиол, наблюдалось значительное увеличение размера за счет процессов агрегации в ходе замораживания. В присутствии 1,2-пропандиола после цикла замораживание-размораживание размер частиц остается стабильным.
Фигуры
На фиг. 1 представлен уровень сигнала tdTomato после трансфекции с использованием комплексов GL67 в различных растворах эксципиентов (вода (0% пропиленгликоля) или 5% пропиленгликоль) при соотношениях N/P 3 или 5.
На фиг. 2 представлена активность люциферазы в носовой полости мышей Balb/c через 5 ч после лечения комплексами GL67 в воде или 5%-ном растворе пропиленгликоля.
На фиг. 3 представлен размер частиц перед замораживанием и после размораживания в присутствии или отсутствии 1,2-пропандиола.
Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно: к композиции для лечения или профилактики заболевания с помощью терапии на основе иРНК; к способу ее получения; к ее применению при лечении или профилактике заболевания с помощью терапии на основе иРНК. Предложенная композиция содержит (i) частицы, находящиеся в жидкой фазе, где частицы включают иРНК и липидную композицию, и (ii) 1,2-пропандиол, причем липидная композиция включает: (i-a) производное холестерина формулы (I) или его фармацевтически или физиологически приемлемую соль
где n равен 0, R1 означает группу -(CH2)q-NH2 или группу -(CH2)r-NH-(CH2)s-NH2, R2 означает группу -(CH2)t-NH2 или группу -(CH2)u-NH-(CH2)w-NH2, в которых q, r, s t, u, w независимо являются целым числом от 2 до 6; (i-b) фосфоглицерид формулы (II) или его фармацевтически или физиологически приемлемую соль
где R4 и R5 каждый означает линейную алкенильную группу, содержащую 10-24 атомов углерода и от 1 до 3 двойных связей; (i-c) пегилированный фосфоглицерид формулы (III) или его фармацевтически или физиологически приемлемую соль
где р равен целому числу от 5 до 200, R6 и R7 каждый означает линейную алкильную группу, содержащую 10-20 атомов углерода. Предложенный способ характеризуется следующими этапами: а) растворяют и смешивают компоненты липидной композиции в органическом растворителе с последующей ее лиофилизацией; б) регидратируют лиофилизированную липидную композицию при добавлении воды; в) объединяют регидратированную липидную композицию с водным раствором РНК; г) добавляют 1,2-пропандиол. Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности трансфекции составов на основе иРНК и липидов. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.
1. Композиция для лечения или профилактики заболевания с помощью терапии на основе иРНК, включающая
(i) частицы, содержащиеся в жидкой фазе, где частицы включают иРНК и липидную композицию, и где липидная композиция включает:
(i-a) производное холестерина формулы (I) или его фармацевтически приемлемая или физиологически приемлемая соль:
где
n равен 0,
R1 означает группу -(CH2)q-NH2 или группу -(CH2)r-NH-(CH2)s-NH2,
где q, r и s независимо равны целому числу от 2 до 6,
R2 означает группу -(CH2)t-NH2 или группу -(CH2)u-NH-(CH2)w-NH2,
где t, u и w независимо равны целому числу от 2 до 6,
(i-b) фосфоглицерид формулы (II) или его фармацевтически приемлемая или физиологически приемлемая соль:
где
R4 означает линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 24 атомов углерода,
R5 означает линейную алкенильную группу, содержащую от 1 до 3 двойных связей и от 10 до 24 атомов углерода,
(i-c) пегилированный фосфоглицерид формулы (III) или его фармацевтически приемлемая или физиологически приемлемая соль:
где
р равен целому числу от 5 до 200,
R6 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 20 атомов углерода,
R7 означает линейную алкильную группу, содержащую от 10 до 20 атомов углерода,
и
(ii) 1,2-пропандиол.
2. Композиция по п. 1, где производным холестерина формулы (I) является GL67.
3. Композиция по п. 1 или 2, где фосфоглицеридом формулы (II) является 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин.
4. Композиция по любому из пп. 1-3, где пегилированным фосфоглицеридом формулы (III) является 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-PEG5000.
5. Композиция по любому из пп. 1-4, где молярное соотношение компонентов (i-a):(i-b):(i-c) в липидной композиции составляет 1:(от 0,5 до 5):(от 0,01 до 1).
6. Композиция по любому из пп. 1-5, где частицы характеризуются средним диаметром частиц в диапазоне от 1 до 5000 нм.
7. Композиция по любому из пп. 1-6, где соотношение N/P, то есть отношение числа атомов азота в производном холестерина формулы (I) к числу атомов Р фосфатных групп в иРНК находится в диапазоне от 1 до 100.
8. Композиция по любому из пп. 1-7, где 1,2-пропандиол содержится в концентрации от 0,1 до 50 мас./об.% в расчете на общий объем композиции.
9. Композиция по любому из пп. 1-8, где жидкая фаза, в которой содержатся частицы, включает воду.
10. Композиция по любому из пп. 1-9, где в пегилированном фосфоглицериде формулы (III) р равен целому числу от 10 до 170 и предпочтительно от 10 до 140.
11. Способ получения композиции по любому из пп. 1-10, причем указанный способ включает следующие этапы:
а) растворение и смешивание компонентов липидной композиции в органическом растворителе с последующей лиофилизацией липидной композиции,
б) регидратация лиофилизированной липидной композиции при добавлении воды,
в) объединение регидратированной липидной композиции с водным раствором РНК, чтобы обеспечить формирование частиц, включающих РНК и липидную композицию, которые содержатся в жидкой фазе, и
г) добавление 1,2-пропандиола.
12. Применение композиции по любому из пп. 1-10 при лечении или профилактике заболевания с помощью терапии на основе иРНК.
13. Применение по п. 12, где заболевание, предназначенное для лечения или профилактики, представляет собой заболевание легких.
14. Применение по п. 12 или 13, где лечение или профилактика включает введение композиции в дыхательные пути или через них, предпочтительно в легкие или назальное введение.
| Andries O | |||
| et al | |||
| Приспособление для получения кинематографических стерео снимков | 1919 |
|
SU67A1 |
| Разборный с внутренней печью кипятильник | 1922 |
|
SU9A1 |
| Топка с несколькими решетками для твердого топлива | 1918 |
|
SU8A1 |
| Устройство для модуляции яркости световых лучей на приемной станции электрического телескопа | 1923 |
|
SU2136A1 |
| WO 2018089540 A1, 17.05.2018 | |||
| МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ, НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2012 |
|
RU2648950C2 |
| Фильтр для воздуха | 1929 |
|
SU28860A1 |
