5'-КЭП-ТРИНУКЛЕОТИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ИЛИ 5'-КЭП-СОЕДИНЕНИЯ С БОЛЬШИМ КОЛИЧЕСТВОМ НУКЛЕОТИДОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ РНК, ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ И В ТЕРАПИИ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/11 C12N5/07 C07H21/02 A61K48/00 A61K31/7088 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к 5'-кэп соединениям, в частности к тринуклеотидам или к высшим гомологам (т. е. гомологам с числом нуклеотидов более 3), где 5'-кэп соединения содержат по меньшей мере один фосфотиоатный, фосфоселеноатный и/или боранофосфатный фрагмент в фосфатном мостике между первым и вторым нуклеотидом, и где второй нуклеотид заблокирован в своем 2'-положении. В частности, настоящее изобретение относится к стабилизации РНК такими 5'-кэп соединениями, в частности, в контексте использования РНК для экспрессии представляющего интерес пептида или белка, например в контексте вакцинации, и предлагает композиции, такие как фармацевтические композиции, и клетки, содержащие РНК, модифицированную таким 5'-кэп соединением, а также способы получения представляющего интерес пептида или белка с использованием композиций или клеток согласно настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает РНК, композиции или клетки для использования в терапии, в частности для использования в способе лечения заболевания или нарушения с помощью заместительной белковой терапии, геномной инженерии, генетического перепрограммирования или иммунотерапии; способ повышения стабильности РНК в клетках; способ увеличения экспрессии РНК в клетках; и способ получения РНК с 5'-кэп структурой.

Предпосылки создания изобретения

Концепция терапевтических средств, кодируемых нуклеиновыми кислотами, возникла в 1990 году, когда Wolff et al. (Science, 247: 1465-1468) показали, что прямая внутримышечная инъекция транскрибированной in vitro (IVT) мРНК или плазмидной ДНК (пДНК) в скелетные мышцы мышей приводила к экспрессии кодируемых белков в мышце, в которую производили инъекцию. Это открытие послужило основным стимулом для дальнейшего изучения применимости нуклеиновых кислот в терапии, в частности в иммунотерапии. Сначала изучали вакцины на основе ДНК против инфекционных патогенов (Cox et al., 1993, J. Virol. 67: 5664-5667; Davis et al., 1993, Hum. Mol. Genet. 2: 1847-1851; Ulmer et al., 1993, Science 259: 1745-1749; Wang et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 4156-4160). Кроме того, изучалась применимость нуклеиновых кислот в генной терапии против опухолей и для индукции специфического противоопухолевого иммунитета (Conry et al., 1994, Cancer Res. 54: 1164-1168; Conry et al., 1995, Gene Ther. 2: 59-65; Spooner et al., 1995, Gene Ther. 2: 173-180; Wang et al., 1995, Hum. Gene Ther. 6: 407-418).

Терапия на основе нуклеиновых кислот обладает рядом преимуществ. Например, производство терапевтических средств на основе нуклеиновых кислот является простым, относительно недорогим процессом, а терапевтические препараты на основе ДНК стабильны при длительном хранении. Однако, в частности, терапевтические средства на основе ДНК связаны со множеством потенциальных рисков с точки зрения безопасности, таких как индукция антител против ДНК (Gilkeson et al., 1995, J. Clin. Invest. 95: 1398-1402) и потенциальная интеграция трансгена в геном хозяина. Это может привести к инактивации клеточных генов, неконтролируемой долгосрочной экспрессии трансгена или онкогенезу, и, таким образом, этого обычно не делают в случае связанных с опухолями антигенов с онкогенным потенциалом, таких как erb-B2 (Bargmann et al., 1986, Nature 319: 226-230) и p53 (Greenblatt et al., 1994, Cancer Res. 54: 4855-4878).

Использование РНК представляет собой привлекательную альтернативу, позволяющую обойти потенциальные риски терапевтических средств на основе ДНК. Некоторые из преимуществ терапии на основе РНК - это временная экспрессия и не-трансформирующие свойства. Кроме того, для экспрессии трансгена необязательно транспортировать РНК в ядро, и, более того, она не может встраиваться в геном хозяина.

Для IVT РНК терапии применяли две различные стратегии, обе из которых были успешно протестированы на различных животных моделях. Либо РНК вводят пациенту напрямую разными путями (Hoerr et al., 2000, Eur. J. Immunol. 30: 1-7), либо дендритные клетки трансфицируют РНК IVT с использованием обычных способов трансфекции in vitro, а затем трансфицированные дендритные клетки вводят пациенту (Heiser et al., 2000, J. Immunol. 164: 5508-5514). Было показано, что иммунизация дендритными клетками, трансфицированными РНК, индуцирует антиген-специфические цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) in vitro и in vivo (Su et al., 2003, Cancer Res. 63: 2127-2133; Heiser et al., 2002), J. Clin. Invest. 109: 409-417). Кроме того, было показано, что прямая инъекция депротеинизированной РНК в лимфатические узлы лабораторных животных (интранодальная инъекция) приводит к поглощению указанной РНК в основном незрелыми дендритными клетками, вероятно, в результате процесса, называемого макропиноцитозом (см. DE 10 2008 061 522.6). Предполагается, что РНК транслируется, а экспрессируемый белок презентируется на молекулах MHC на поверхности антигенпрезентирующих клеток, вызывая иммунный ответ.

Основным недостатком терапии на основе РНК является нестабильность РНК in vivo. Деградация длинноцепочечной РНК с 5'-конца индуцируется в клетке так называемым декэпирующим ферментом Dcp2, который отщепляет m⁷GDP от цепи РНК. Таким образом, предполагается, что расщепление происходит между альфа- и бета-фосфатными группами РНК-кэпа.

Эукариотические матричные РНК (мРНК) несут особую структуру на 5'-конце, так называемую кэп-структуру. Она состоит из N⁷-метилированного гуанозинового компонента, который добавлен к первому транскрибируемому нуклеотиду РНК, обычно гуанозину, через 5'-5'-трифосфатный мостик. Соответственно, эту структуру часто называют m⁷GpppG. Структура m⁷GpppG необходима, среди прочего, для трансляции мРНК в кодируемый белок.

Клеточные мРНК у высших эукариот дополнительно модифицируются на 5'-конце путем метилирования в положении 2'-O первого нуклеотида после фрагмента m⁷Gppp. Эта структура называется кэп-1 (по сравнению с кэп-0 для неметилированной формы). Хотя эта модификация была описана более 40 лет назад, ее функция до недавнего времени оставалась неустановленной. Только в 2010 году впервые было сообщено, что 2'-O метилирование кэпа позволяет избежать распознавания белками, распознающими структуру кэп-0, такими как белки IFIT, особенно IFIT1. Связывание IFIT1 с мРНК кэп-0 нарушает связывание eIF4E для инициации трансляции при связывании с кэпом, что приводит к снижению эффективности трансляции.

Синтетические мРНК обычно получают транскрипцией in vitro из подходящей ДНК-матрицы (например, линеаризованной плазмидной ДНК) с использованием фаговой РНК-полимеразы (в основном РНК-полимеразы T7 или SP6). Кэпированные мРНК могут быть получены транскрипцией in vitro путем добавления в реакцию избытка кэп-динуклеотида, например, m⁷GpppG. Однако сообщалось, что кэп-динуклеотид m⁷GpppG может быть включен во время транскрипции in vitro в двух ориентациях, из которых только одна является функциональной. Поэтому были разработаны антиинвертируемые аналоги кэпа (ARCA), которые не могут быть встроены в обратной ориентации из-за модификаций в 2'- или 3'-положении m⁷-гуанозина. Соответственно, на лизате ретикулоцитов кролика и в дендритных клетках было продемонстрировано, что мРНК с кэпом ARCA демонстрируют более высокую эффективность трансляции по сравнению с РНК с кэпом m⁷GpppG.

В последнее десятилетие ARCA были дополнительно модифицированы в попытке стабилизировать мРНК против декэпирующих ферментов и повысить эффективность трансляции за счет увеличения аффинности к eIF4E. Модификации включают различные замены в мостиковом и немостиковом кислороде в фосфатном мостике, расширенные фосфатные группы и модификации гуанозина. Задача осложняется тем фактом, что аналоги кэп-структуры, инертные по отношению к декэпирующему ферменту Dcp1-Dcp2, не всегда являются хорошими субстратами для фактора инициации и, как следствие, плохо транслируются. Однако использование модифицированных фосфотиоатом аналогов кэпа на β-фосфате (β-S-ARCA или β-S-ARCA) привело к получению мРНК как с повышенной эффективностью трансляции, так и с удлиненным периодом полужизни, например в дендритных клетках, по сравнению с ARCA или m⁷GpppG. β-S-ARCA синтезируют как смесь двух диастереомеров, называемых D1 и D2, в зависимости от их характера элюирования при ВЭЖХ из-за введения стереогенного P-центра вследствие модификации серой. Интересно, что было показано, что эти диастереомеры обладают разными биологическими свойствами, в частности, в отношении устойчивости к ферментативному расщеплению (например, расщеплению Dcp2) и/или связыванию с eIF4E. В то время как в прошлом обычно использовали m⁷GpppG, мРНК с кэпом ARCA все больше и больше переходят в доклинические, а теперь уже и в клинические исследования.

Поскольку модификация положения 2'-O в кэп-динуклеотиде ингибирует включение фаговой РНК-полимеразой (что преимущественно используется в ARCA), только структуры кэп-0 могут быть котранскрипционно добавлены in vitro при использовании кэп-динуклеотида. Кэпирование in vitro транскрибированной РНК также может быть достигнуто посттранскрипционно с использованием соответствующих ферментов, например, из вируса осповакцины. Здесь может быть получена структура кэп-1. Однако такой процесс синтеза состоит из двух этапов: транскрипции и кэппинга, что делает его более трудоемким. Более того, сама 5'-последовательность РНК оказывает сильное влияние на эффективность кэпирования ферментами. Кроме того, данный способ ограничен использованием немодифицированных кэпов из-за специфичности ферментов. Таким образом, никакие полезные модификации, как описано выше (например, фосфотиоатные замены), не могут быть включены таким способом.

В качестве краткого резюме, РНК особенно хорошо подходят для клинического применения. Однако использование РНК в терапии в первую очередь ограничено коротким периодом полужизни РНК, в частности в цитоплазме, и/или распознаванием РНК белками, распознающими структуру кэп-0, такими как белки IFIT, в частности IFIT1 (что в итоге приводит к нарушению связывания РНК с eIF4E), в итоге и то, и другое приводит к низкой и/или недостаточной экспрессии белка. Таким образом, для РНК-терапии особое значение имеет повышение стабильности РНК и/или экспрессии РНК в клетках. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение РНК, которая особенно хорошо подходит для РНК-терапии, то есть обеспечение средств для особенно сильной стабилизации РНК и/или увеличения экспрессии РНК в клетках. Эта техническая проблема была решена согласно настоящему изобретению с использованием заявленных в формуле изобретения объектов изобретения.

Сущность изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает 5'-кэп соединение, имеющее 5'-кэп-структуру в соответствии с формулой (I):

формула (I)

где R¹ выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного алкинила, необязательно замещенного циклоалкила, необязательно замещенного гетероциклила, необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила;

R² и R³ независимо выбраны из группы, состоящей из H, галогена, OH и необязательно замещенного алкокси, или R² и R³ вместе образуют O-X-O, где X выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного CH₂, необязательно замещенного CH₂CH₂, необязательно замещенного CH₂CH₂CH₂, необязательно замещенного CH₂CH(CH₃) и необязательно замещенного C(CH₃)₂, или R² объединен с атомом водорода в положении 4' кольца, к которому присоединен R², с образованием –O-CH₂ или -CH₂-O-;

R⁴ и R⁶ независимо выбраны из группы, состоящей из O, S, Se и BH₃;

R⁵ выбран из группы, состоящей из S, Se и BH₃;

R⁷ представляет собой мононуклеотид или олигонуклеотид, содержащий от 2 до 9 оснований;

R⁸ представляет собой H, галоген или необязательно замещенный алкокси;

n составляет 1, 2 или 3; и

B представляет собой фрагмент пуринового или пиримидинового основания.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к композиции или набору, включающим 5'-кэп соединение из первого аспекта. Такой набор или композицию можно использовать для получения РНК с 5'-кэп структурой по настоящему изобретению.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к РНК, которая модифицирована 5'-кэп соединением из первого аспекта.

В четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию или клетку, содержащую РНК из третьего аспекта.

В особо предпочтительном варианте осуществления третьего и четвертого аспектов настоящего изобретения РНК дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес пептид или белок.

В пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения представляющего интерес пептида или белка, включающий стадию использования РНК из особо предпочтительного варианта осуществления третьего аспекта, или композицию или клетку из особо предпочтительного варианта осуществления четвертого аспекта.

В шестом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ экспрессии представляющего интерес пептида или белка у индивидуума, включающий стадию введения указанному индивидууму РНК из особо предпочтительного варианта осуществления третьего аспекта, или композиции или клетки из особо предпочтительного варианта осуществления четвертого аспекта.

В седьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает РНК из особо предпочтительного варианта осуществления третьего аспекта, или композицию или клетку из особо предпочтительного варианта осуществления четвертого аспекта для использования в терапии.

В восьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, включающий стадию введения указанному субъекту РНК из особо предпочтительного варианта осуществления третьего аспекта или композиции или клетки из особо предпочтительного варианта осуществления четвертого аспекта. Лечение заболевания или нарушения предпочтительно выбрано из группы, состоящей из заместительной белковой терапии, геномной инженерии, генетического перепрограммирования и иммунотерапии.

В девятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает РНК из особо предпочтительного варианта осуществления третьего аспекта или композицию или клетку из особо предпочтительного варианта осуществления четвертого аспекта для применения в способе лечения заболевания или нарушения у субъекта. Лечение заболевания или нарушения предпочтительно выбрано из группы, состоящей из заместительной белковой терапии, геномной инженерии, генетического перепрограммирования и иммунотерапии.

В десятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ повышения стабильности РНК в клетках (таких как незрелые антигенпрезентирующие клетки) и/или увеличения экспрессии РНК в клетках (таких как незрелые антигенпрезентирующие клетки), где указанный способ включает обеспечение указанной РНК со структурой согласно формуле (I), как определено в первом аспекте; и перенос указанной РНК, модифицированной структурой согласно формуле (I), в клетки.

В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения РНК с 5'-кэп структурой, где указанный способ включает проведение реакции транскрипции с использованием матричной нуклеиновой кислоты в присутствии 5'-кэп соединения из первого аспекта.

В дополнительных аспектах настоящее изобретение обеспечивает следующее:

- способ индукции иммунного ответа у индивидуума, включающий стадию введения указанному индивидууму РНК из предпочтительного варианта осуществления третьего аспекта или композиции (предпочтительно в форме вакцинной композиции) или клетки (предпочтительно незрелой антигенпрезентирующей клетки) из предпочтительного варианта осуществления четвертого аспекта; в одном варианте осуществления способ предназначен для индукции иммунного ответа против вируса, такого как вирус гриппа (A, B или C), цитомегаловирус (CMV) или респираторно-синцитиальный вирус (RSV);

- способ увеличения доли молекул MHC, которые презентируют представляющий интерес антиген на поверхности антигенпрезентирующей клетки, где указанный способ включает обеспечение РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, содержащий указанный представляющий интерес антиген или его антигенный пептид, где указанная РНК модифицирована структурой согласно формуле (I), как определено в первом аспекте; и перенос указанной РНК, модифицированной структурой, соответствующей формуле (I), в незрелую антигенпрезентирующую клетку; в одном варианте осуществления представляющий интерес антиген представляет собой антиген вируса (такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV) или его антигенный пептид;

- способ стимуляции и/или активации иммунных эффекторных клеток, включающий обеспечение РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, содержащий представляющий интерес антиген или его антигенный пептид, причем указанная РНК модифицирована структурой согласно формуле (I), как определено в первом аспекте; перенос указанной РНК, модифицированной структурой формулы (I), в незрелые антигенпрезентирующие клетки; и обеспечение контакта антигенпрезентирующих клеток с иммунными эффекторными клетками; в одном варианте осуществления представляющий интерес антиген представляет собой антиген вируса (такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV) или его антигенный пептид;

- способ индукции иммунного ответа у индивидуума, включающий обеспечение РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, содержащий представляющий интерес антиген или его антигенный пептид, причем указанная РНК модифицирована структурой согласно формуле (I), как определено в первом аспекте; и введение указанной РНК, модифицированной структурой согласно формуле (I), указанному индивидууму; в одном варианте осуществления представляющий интерес антиген представляет собой антиген вируса (такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV) или его антигенный пептид; и

- способ индукции иммунного ответа у индивидуума, включающий обеспечение РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, содержащий представляющий интерес антиген или его антигенный пептид, причем указанная РНК модифицирована структурой согласно формуле (I), как определено в первом аспекте; перенос указанной РНК, модифицированной структурой согласно формуле (I), в незрелые антигенпрезентирующие клетки; и введение антигенпрезентирующих клеток указанному индивидууму; в одном варианте осуществления представляющий интерес антиген представляет собой антиген вируса (такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV) или его антигенный пептид.

Дополнительные аспекты, а также преимущества и новые характеристики настоящего изобретения станут очевидны из следующего подробного описания, при необходимости в комбинации с прилагаемыми чертежами.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1: Синтез Р-имидазолидного предшественника (Im-pm^2'-OGpG) для синтеза иллюстративного 5'-кэп соединения по настоящему изобретению, m2^7,2'-OGppSpm^2'-OGpG (далее «Соединения 1»; OR = ОСН₃).

Фиг. 2: Синтез (A) и спектр МСВР (масс-спектрометрии высокого разрешения) (B) Соединения 1 (m2^7,2'-OGppSpm^2'-OGpG; OR = OCH₃).

Фиг. 3: Сравнение трансляционной способности РНК, кэпируемых котранскрипционно различными аналогами 5'-кэп-структуры. D1 бета-S-ARCA: D1 диастереомер бета-S-ARCA; D2 бета-S-ARCA: D2 диастереомер бета-S-ARCA; D1 Соединение 1: D1 диастереомер Соединения 1; D2 Соединение 1: Диастереомер D2 Соединения 1. Люциферазные РНК, содержащие соответствующие кэп-структуры, электропорировали в hiDC. Люциферазную активность регистрировали в течение 72 часов.

Фиг. 4: трансляция in vivo РНК, модифицированных различными аналогами 5'-кэп-структуры. РНК бета-S-ARCA D1/D2: РНК получали IVT с использованием диастереомера D1 или D2 бета-S-ARCA; D1/D2 РНК Соединения 1: РНК получали IVT с использованием диастереомера D1 или D2 Соединения 1; ферментативная РНК Кэп-0/Кэп-1: РНК получали IVT в отсутствие какого-либо аналога кэпа, а затем, на втором этапе, ферментативно кэпировали либо с использованием только кэпирующего фермента осповакцины (ферментативная Кэп-0 РНК), либо с использованием кэпирующего фермента осповакцины вместе с метилтрансферазой (ферментативная Кэп-1 РНК). На Фиг. 4 показан сигнал люциферазы через 6 часов (A), 24 часа (B) или 48 часов (C) после введения.

Фиг. 5: трансляция in vivo РНК мышиного эритропоэтина (mEPO), модифицированных различными аналогами 5'-кэпа, имеющими структуру кэп-0 (A) или структуру кэп-1 (B). ARCA G: РНК, ко-транскрипционно кэпированная с ARCA G; D1: РНК, котранскрипционно кэпированная диастереомером D1 бета-S-ARCA; Есар-0: ферментативно кэпированная РНК, обеспечивающая структуру кэп-0; ARCA G + Есар-1: РНК, котранскрипционно кэпированная с ARCA G, затем ферментативно кэпированная с использованием кэпирующего фермента вируса осповакцины и метилтрансферазы осповакцины, которые обеспечивают структуру кэп-1; D1+Есар-1: РНК, ко-транскрипционно кэпированная с диастереомером D1 бета-S-ARCA, затем ферментативно кэпированная с использованием кэпирующего фермента вируса осповакцины и метилтрансферазы вируса осповакцины, которые обеспечивают структуру кэп-1; Есар-1: ферментативно кэпированная РНК, обеспечивающая структуру кэп-1. мРНК mEPO (3 мкг), содержащую 1-метилпсевдоуридин (m1Ψ), готовили в TransIT® и вводили интраперитонеально мышам. На Фиг. 5 показаны уровни эритропоэтина в плазме мышей через 6 часов, 24 часа, 48 часов или 72 часа после инъекции.

Подробное описание настоящего изобретения

Хотя настоящее изобретение более подробно описывается ниже, следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретными методологиями, протоколами и реагентами, описанными в настоящей заявке, поскольку они могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, которое будет ограничено только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистом в данной области техники.

Далее элементы настоящего изобретения будут описаны более подробно. Эти элементы перечислены с конкретными вариантами осуществления, однако следует понимать, что они могут быть скомбинированы любым способом и в любых количествах для создания дополнительных вариантов осуществления. Различные описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления не должны толковаться как ограничивающие настоящее изобретение только явно описанными вариантами осуществления. Следует понимать, что настоящее описание поддерживает и охватывает варианты осуществления, которые объединяют явно описанные варианты осуществления с любым количеством раскрытых и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в настоящей заявке должны считаться раскрытыми в описании настоящей заявки, если контекст не указывает иное. Например, если в предпочтительном варианте осуществления R¹ представляет собой метил, а в другом предпочтительном варианте осуществления R⁵ представляет собой S, то в одном предпочтительном варианте осуществления R¹ представляет собой метил, а R⁵ представляет собой S. Аналогичным образом, если в предпочтительном варианте осуществления R⁷ представляет собой *pm^2'-OGpN, а в другом предпочтительном варианте осуществления вариант осуществления R⁸ представляет собой OCH₃, то в одном предпочтительном варианте осуществления R⁷ представляет собой *pm^2'-OGpN, а R⁸ представляет собой OCH₃.

Предпочтительно используемые в настоящей заявке термины определяются так, как описано в «A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).

В практике настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иное, обычные методы химии, биохимии и методы рекомбинантных ДНК, которые объяснены в литературе в данной области техники (см., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J Sambrook et al. Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

Во всем настоящем описании и формуле изобретения, которая следует ниже, если контекст не требует иного, слово «содержать» и его варианты, такие как «содержит» и «содержащий», будут пониматься как подразумевающие включение указанного члена, целого числа или этапа, или группы членов, целых чисел или этапов, но не исключение любого другого члена, целого числа или этапа, или группы членов, целых чисел или этапов. Термин «состоящий по существу из» означает исключение других элементов, целых чисел или шагов, имеющих какое-либо существенное значение. Термин «содержащий» охватывает термин «состоящий по существу из», который, в свою очередь, охватывает термин «состоящий из». Таким образом, в каждом случае в настоящей заявке термин «содержащий» может быть заменен термином «состоящий по существу из» или «состоящий из». Аналогичным образом, в каждом случае в настоящей заявке термин «состоящий по существу из» может быть заменен термином «состоящий из».

Термины в единственном числе (артикли «a», «an» и «the» в оригинале) и аналогичные ссылки, используемые в контексте описания изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), должны толковаться как охватывающие как единственное, так и множественное число, если в настоящей заявке не указано иное или если это явно не противоречит контексту. Перечисление диапазонов значений в настоящей заявке предназначено исключительно для использования в качестве сокращенного метода индивидуальной отсылки к каждому отдельному значению, попадающему в этот диапазон. Если в настоящем документе не указано иное, каждое такое отдельное значение включено в настоящее описание, как если бы оно было указано в настоящем документе индивидуально. Все способы, описанные в настоящей заявке, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящей заявке или если это явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как») в настоящем документе предназначено просто для лучшей иллюстрации изобретения и не накладывает ограничений на объем заявленного изобретения. Никакие формулировки в описании не следует толковать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент, как на существенный для практического осуществления изобретения.

В тексте данного описания цитируется несколько документов. Каждый из цитируемых здесь документов (включая все патенты, заявки на патенты, научные публикации, спецификации производителей, инструкции и т.д.), как выше, так и ниже, полностью включен в настоящее описание посредством ссылки. Ничто в настоящей заявке не должно толковаться как признание того, что изобретение не имеет права предшествования такому раскрытию как предшествующее изобретение.

Согласно изобретению, термин «нуклеиновая кислота» включает дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), рибонуклеиновую кислоту (РНК), их комбинации и их модифицированные формы. Этот термин включает геномную ДНК, кДНК, мРНК, рекомбинантно полученные и химически синтезированные молекулы. Согласно изобретению нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной, линейной или ковалентно замкнутой в круг. Согласно изобретению, нуклеиновая кислота может быть изолированной. Термин «изолированная нуклеиновая кислота» в соответствии с изобретением означает, что нуклеиновая кислота (i) была амплифицирована in vitro, например с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для ДНК или транскрипции in vitro (с использованием, например, РНК-полимеразы) для РНК; (ii) была получена рекомбинантно путем клонирования; (iii) была очищена, например, расщеплением и разделением с помощью гель-электрофореза; или (iv) была синтезирована, например, путем химического синтеза.

В контексте настоящего изобретения термин «ДНК» относится к молекуле, которая содержит дезоксирибонуклеотидные остатки и предпочтительно полностью или в значительной степени состоит из дезоксирибонуклеотидных остатков. «Дезоксирибонуклеотид» относится к нуклеотиду, в котором отсутствует гидроксильная группа в 2'-положении β-D-рибофуранозильной группы. Термин «ДНК» включает изолированную ДНК, такую как частично или полностью очищенная ДНК, по существу чистая ДНК, синтетическая ДНК и рекомбинантно полученная ДНК, и включает модифицированную ДНК, которая отличается от природной ДНК добавлением, делецией, заменой и/или изменением одного или более нуклеотидов. Такие изменения могут включать добавление ненуклеотидного материала, например, к концу (концам) ДНК или внутри ДНК, например, к одному или нескольким нуклеотидам ДНК. Нуклеотиды в молекулах ДНК могут также содержать нестандартные нуклеотиды, такие как неприродные нуклеотиды или химически синтезированные нуклеотиды. Эти измененные ДНК можно назвать аналогами, или аналогами природной ДНК.

В контексте настоящего изобретения термин «РНК» относится к молекуле, которая содержит рибонуклеотидные остатки и предпочтительно полностью или по существу состоит из рибонуклеотидных остатков. «Рибонуклеотид» относится к нуклеотиду с гидроксильной группой в 2'-положении β-D-рибофуранозильной группы. Термин «РНК» включает изолированную РНК, такую как частично или полностью очищенная РНК, по существу чистая РНК, синтетическая РНК и рекомбинантно созданная РНК, и включает модифицированную РНК, которая отличается от природной РНК добавлением, делецией, заменой и/или изменением одной или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут включать добавление ненуклеотидного материала, например, к концу (концам) РНК или внутри, например, к одному или нескольким нуклеотидам РНК. Нуклеотиды в молекулах РНК могут также содержать нестандартные нуклеотиды, такие как неприродные нуклеотиды или химически синтезированные нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Эти измененные/модифицированные нуклеотиды могут называться аналогами природных нуклеотидов, а соответствующие РНК, содержащие такие измененные/модифицированные нуклеотиды (т.е. измененные/модифицированные РНК), могут быть названы аналогами природных РНК. Молекула «по существу состоит из рибонуклеотидных остатков», если содержание рибонуклеотидных остатков в молекуле составляет по меньшей мере 40% (например, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%), исходя из общего количества нуклеотидных остатков в молекуле. Общее количество нуклеотидных остатков в молекуле представляет собой сумму всех нуклеотидных остатков (независимо от того, являются ли нуклеотидные остатки стандартными (т.е. природными) нуклеотидными остатками или их аналогами). В контексте настоящего изобретения РНК, предпочтительно мРНК, модифицирована 5'-кэп соединением по настоящему изобретению и предпочтительно содержит одну или несколько дополнительных модификаций для дальнейшей стабилизации РНК, как описано ниже.

Согласно изобретению РНК имеет длину по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 50, в частности по меньшей мере 100 нуклеотидов, например от 100 до 15000, более предпочтительно от 50 до 10000, более предпочтительно от 100 до 5000, в частности от 200 до 1000 нуклеотидов. РНК (в частности мРНК), которая кодирует пептид или белок, предпочтительно имеет длину по меньшей мере 50, более предпочтительно по меньшей мере 150, в частности по меньшей мере 200 нуклеотидов, например от 100 до 15000, более предпочтительно от 50 до 10000, более предпочтительно от 100 до 5000, в частности от 200 до 1000 нуклеотидов.

Согласно изобретению «РНК» охватывает мРНК, тРНК, рРНК, мяРНК, оцРНК, дцРНК и ингибирующую РНК, и предпочтительно представляет собой мРНК.

Согласно изобретению «дцРНК» означает двухцепочечную РНК и представляет собой РНК с двумя частично или полностью комплементарными цепями.

Согласно настоящему изобретению термин «мРНК» означает «матричную РНК» и относится к «транскрипту», который может быть получен с использованием матрицы ДНК и может кодировать пептид или белок. Обычно мРНК включает 5'-UTR, область, кодирующую пептид/белок, и 3'-UTR. В контексте настоящего изобретения мРНК предпочтительно генерируется транскрипцией in vitro (IVT) из матрицы ДНК. Как изложено выше, методология транскрипции in vitro известна квалифицированному специалисту, и множество наборов для транскрипции in vitro коммерчески доступны.

мРНК является одноцепочечной, но может содержать самокомплементарные последовательности, которые позволяют частям мРНК складываться и соединяться друг с другом с образованием двойных спиралей.

мРНК имеет ограниченный период полужизни в клетках и in vitro. Таким образом, согласно изобретению, стабильность и/или эффективность трансляции РНК может быть модифицирована по мере необходимости. Например, мРНК может быть стабилизирована, и/или ее трансляция может быть усилена одной или несколькими модификациями, имеющими стабилизирующий эффект и/или увеличивающими эффективность трансляции мРНК. Такие модификации описаны, например, в WO 2007/036366, раскрытие которого включено в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте. Чтобы увеличить экспрессию мРНК согласно настоящему изобретению, она может быть модифицирована в кодирующей области, то есть в последовательности, кодирующей экспрессируемый пептид или белок, предпочтительно без изменения последовательности экспрессируемого пептида или белка, например, для увеличения содержания GC с целью повышения стабильности мРНК и для оптимизации кодонов и, таким образом, для повышения трансляции в клетках.

РНК может быть выделена из клеток, может быть получена из матрицы ДНК или может быть химически синтезирована с использованием методов, известных в данной области техники. В предпочтительных вариантах осуществления РНК синтезируют in vitro из матрицы ДНК. В одном особо предпочтительном варианте осуществления РНК, в частности мРНК, получают транскрипцией in vitro с матрицы ДНК. Методология транскрипции in vitro известна специалисту в данной области техники; см., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989. Кроме того, коммерчески доступны различные наборы для транскрипции in vitro, например от Thermo Fisher Scientific (такие как набор TranscriptAid^TM T7, набор MEGAscript® T7, MAXIscript®), от New England BioLabs Inc. (например, набор HiScribe ™ T7, набор мРНК HiScribe ™ T7 ARCA), от Promega (например, системы RiboMAX™, HeLaScribe®, Riboprobe®), от Jena Bioscience (например, наборы транскрипции SP6 или T7) и от Epicenter (например, как AmpliScribe™). В одном особо предпочтительном варианте осуществления РНК представляет собой транскрибируемую in vitro РНК (РНК IVT). Для обеспечения модифицированной РНК соответствующие модифицированные нуклеотиды, такие как модифицированные природные нуклеотиды, неприродные нуклеотиды и/или модифицированные неприродные нуклеотиды, могут быть включены во время синтеза (предпочтительно транскрипции in vitro), или в РНК могут быть выполнены и/или к РНК после транскрипции могут быть добавлены определенные модификации.

РНК согласно настоящему изобретению по меньшей мере модифицирована 5'-кэп соединением по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления РНК согласно настоящему изобретению включает нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую пептид или белок, предпочтительно фармацевтически активный пептид или белок, и способна экспрессировать указанный пептид или белок, в частности, при переносе в клетку или субъекту. Таким образом, РНК согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит кодирующую область (открытую рамку считывания (ORF)), кодирующую пептид или белок, предпочтительно кодирующую фармацевтически активный пептид или белок. В этом отношении «открытая рамка считывания» или «ORF» представляет собой непрерывный участок кодонов, начинающийся стартовым кодоном и заканчивающийся стоп-кодоном.

В соответствии с изобретением термин «фармацевтически активный пептид или белок» означает пептид или белок, который можно использовать для лечения индивидуума, когда экспрессия пептида или белка может быть полезной, например для облегчения симптомов болезни или расстройства. Предпочтительно фармацевтически активный пептид или белок обладает лечебными или паллиативными свойствами и может быть введен для улучшения, облегчения, смягчения, обращения, отсрочки наступления или уменьшения тяжести одного или нескольких симптомов заболевания или нарушения. Предпочтительно фармацевтически активный пептид или белок оказывает положительный или благоприятный эффект на заболевания или патологическое состояние индивидуума при введении индивидууму в терапевтически эффективном количестве. Фармацевтически активный пептид или белок может обладать профилактическими свойствами и может использоваться для отсрочки начала заболевания или нарушения, или уменьшения тяжести такого заболевания или нарушения. Термин «фармацевтически активный пептид или белок» включает целые белки или полипептиды, а также может относиться к их фармацевтически активным фрагментам. Он также может включать фармацевтически активные аналоги пептида или белка.

Конкретные примеры фармацевтически активных пептидов и белков включают цитокины, молекулы адгезии (в частности, интегрины), иммуноглобулины (например, антитела), иммунологически активные соединения (например, антигены), гормоны, факторы роста, ингибиторы протеаз (например, альфа-1-антитрипсин), ферменты (например, тимидинкиназу вируса простого герпеса 1 типа (HSV1-TK), гексозаминидазу, фенилаланингидроксилазу, псевдохолинэстеразу, ферменты поджелудочной железы и лактазу), рецепторы (например, рецепторы фактора роста), регуляторы апоптоза, факторы транскрипции, белки-супрессоры опухолей, структурные белки, факторы перепрограммирования, геномно-инженерные белки и белки крови, но не ограничиваются ими.

В соответствии с изобретением термин «цитокины» относится к белкам, которые имеют молекулярную массу примерно от 5 до 20 кДа и которые участвуют в передаче сигналов клетки (например, паракринной, эндокринной и/или аутокринной передаче сигналов). В частности, при высвобождении цитокины влияют на поведение клеток вокруг места их высвобождения. Примеры цитокинов включают лимфокины, интерлейкины, хемокины, интерфероны и факторы некроза опухоли (TNF). Согласно настоящей заявке цитокины не включают гормоны или факторы роста. Цитокины отличаются от гормонов тем, что (i) они обычно действуют в гораздо более изменчивых концентрациях, чем гормоны, и (ii) обычно производятся широким кругом клеток (почти все ядерные клетки могут продуцировать цитокины). Интерфероны обычно обладают противовирусным, антипролиферативным и иммуномодулирующим действием. Интерфероны - это белки, которые изменяют и регулируют транскрипцию генов внутри клетки, связываясь с рецепторами интерферона на поверхности регулируемой клетки, тем самым предотвращая репликацию вируса в клетках. Интерфероны можно разделить на два типа. IFN-γ - единственный интерферон типа II; все остальные - интерфероны типа I. Интерфероны типа I и типа II различаются по структуре генов (гены интерферонов типа II имеют три экзона; типа I – один экзон), расположению на хромосоме (у человека гены типа II расположены на 12 хромосоме; гены интерферона типа I сцеплены и находятся на 9 хромосоме), а также по типам тканей, в которых они продуцируются (интерфероны I типа синтезируются повсеместно, типа II - лимфоцитами). Интерфероны типа I конкурентно ингибируют связывание друг друга с клеточными рецепторами, тогда как интерферон типа II имеет отдельный рецептор. Согласно изобретению, термин «интерферон» или «IFN» предпочтительно относится к интерферонам типа I, в частности интерферону альфа и интерферону бета. Конкретные примеры цитокинов включают эритропоэтин (EPO), колониестимулирующий фактор (CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор некроза опухоли (TNF), костный морфогенетический белок (BMP), интерферон альфа (IFNα), интерферон бета (IFNβ), интерферон гамма (INFγ), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкин 4 (IL-4), интерлейкин 10 (IL-10) и интерлейкин 11 (IL-11).

Согласно изобретению термин «гормоны» относится к классу сигнальных молекул, продуцируемых железами, причем передача сигналов обычно включает следующие стадии: (i) синтез гормона в конкретной ткани; (ii) хранение и секреция; (iii) транспорт гормона к его мишени; (iv) связывание гормона рецептором; (v) ретрансляция и усиление сигнала; и (vi) распад гормона. Гормоны отличаются от цитокинов тем, что (1) гормоны обычно действуют в менее изменчивых концентрациях и (2) обычно производятся определенными типами клеток. Конкретные примеры гормонов включают инсулин, вазопрессин, пролактин, адренокортикотропный гормон (АКТГ), гормон щитовидной железы, гормоны роста (такие как человеческий гормон роста или бычий соматотропин), окситоцин, предсердно-натрийуретический пептид (ПНП), глюкагон, соматостатин, холецистокинин, гастрин, лептины, катехоламины, гонадотропины, трофические гормоны и дофамин. В одном варианте осуществления «гормон» представляет собой пептид или белковый гормон, такой как инсулин, вазопрессин, пролактин, адренокортикотропный гормон (АКТГ), гормон щитовидной железы, гормоны роста (такие как гормон роста человека или бычий соматотропин), окситоцин, предсердный натрийуретический пептид (ANP), глюкагон, соматостатин, холецистокинин, гастрин и лептины.

Согласно изобретению термин «молекулы адгезии» относится к белкам, которые расположены на поверхности клетки и участвуют в связывании клетки с другими клетками или с экстрацеллюлярным матриксом (ЕСМ). Молекулы адгезии обычно являются трансмембранными рецепторами и могут быть классифицированы как кальций-независимые (например, интегрины, суперсемейство иммуноглобулинов, рецепторы хоминга лимфоцитов) и кальций-зависимые (кадгерины и селектины). Конкретными примерами молекул адгезии являются интегрины, рецепторы хоминга лимфоцитов, селектины (например, P-селектин) и адресины.

Интегрины также участвуют в передаче сигналов. В частности, при связывании лиганда интегрины модулируют клеточные сигнальные пути, например пути трансмембранных протеинкиназ, таких как рецепторные тирозинкиназы (RTK). Такая регуляция может привести к клеточному росту, делению, выживанию, дифференцировке или апоптозу. Конкретные примеры интегринов включают: α₁β₁, α₂β₁, α₃β₁, α₄β₁, α₅β₁, α₆β₁, α₇β₁, α_Lβ₂, α_Mβ₂, α_IIbβ₃, α_Vβ₁, α_Vβ₃, α_Vβ₅, α_Vβ₆, α_Vβ₈, и α₆β₄.

Согласно изобретению термин «иммуноглобулины» или «суперсемейство иммуноглобулинов» относится к молекулам, которые участвуют в процессах распознавания, связывания и/или адгезии клеток. Молекулы, принадлежащие к этому суперсемейству, имеют общую черту, заключающуюся в том, что они содержат область, известную как иммуноглобулиновый домен или складка. Члены суперсемейства иммуноглобулинов включают антитела (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM), Т-клеточные рецепторы (TCR), молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC), корецепторы (например, CD4, CD8, CD19), вспомогательные молекулы рецептора антигена (например, CD-3γ, CD3-δ, CD-3ε, CD79a, CD79b), костимулирующие или ингибирующие молекулы (например, CD28, CD80, CD86) и другие (например, CD147, CD90, CD7).

В соответствии с изобретением термин «иммунологически активное соединение» относится к любому соединению, изменяющему иммунный ответ, предпочтительно путем индукции и/или подавления созревания иммунных клеток, индукции и/или подавления биосинтеза цитокинов, и/или изменения гуморального иммунитета путем стимуляции продукции антител В-клетками. Иммунологически активные соединения обладают сильной иммуностимулирующей активностью, включая, помимо прочего, противовирусную и противоопухолевую активность, а также могут подавлять другие аспекты иммунного ответа, например, сдвигать иммунный ответ с иммунного ответа TH2, что полезно для лечения широкого спектра заболеваний, опосредованных TH2. Иммунологически активные соединения могут быть полезны в качестве адъювантов вакцины. Конкретные примеры иммунологически активных соединений включают интерлейкины, колониестимулирующий фактор (CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), эритропоэтин, фактор некроза опухоли (TNF), интерфероны, интегрины, адресины, селектины, хоминг-рецепторы и антигены, в частности, ассоциированные с опухолью антигены, ассоциированные с патогенами антигены (такие как бактериальные, паразитарные или вирусные антигены (например, один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9 или 10) антигенов вируса гриппа (A, B или C), CMV или RSV)), аллергены и аутоантигены.

В соответствии с изобретением термин «аутоантиген» или «самоантиген» относится к антигену, который происходит из организма субъекта (т.е. аутоантиген также может называться «аутологичный антиген») и который вызывает аномально сильный иммунный ответ против этой нормальной части тела. Такие сильные иммунные реакции против аутоантигенов могут быть причиной «аутоиммунных заболеваний».

В соответствии с изобретением термин «аллерген» относится к типу антигена, который происходит извне организма субъекта (т.е. аллерген также можно назвать «гетерологичным антигеном») и который вызывает аномально сильный иммунный ответ, при котором иммунная система субъекта борется с предполагаемой угрозой, которая в противном случае была бы безвредна для субъекта. «Аллергия» - это болезнь, вызванная такой энергичной иммунной реакцией на аллергены. Аллерген обычно представляет собой антиген, который способен стимулировать реакцию гиперчувствительности I типа у лиц с атопией через иммуноглобулин E (IgE). Конкретные примеры аллергенов включают аллергены, полученные из белков арахиса (например, Ara h 2.02), яичного альбумина, белков пыльцы трав (например, Phl p 5) и белков пылевых клещей (например, Der p 2).

Согласно изобретению термин «факторы роста» относится к молекулам, которые способны стимулировать клеточный рост, пролиферацию, заживление и/или клеточную дифференцировку. Обычно факторы роста действуют как сигнальные молекулы между клетками. Термин «факторы роста» включает определенные цитокины и гормоны, которые связываются со специфическими рецепторами на поверхности своих клеток-мишеней. Примеры факторов роста включают костные морфогенетические белки (BMP), факторы роста фибробластов (FGF), факторы роста эндотелия сосудов (VEGF), такие как VEGFA, эпидермальный фактор роста (EGF), инсулиноподобный фактор роста, эфрины, макрофагальный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, нейрегулины, нейротрофины (например, нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), фактор роста нервов (NGF)), фактор роста плаценты (PGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), реналазу (RNLS) (антиапоптотический фактор выживания), фактор роста T-клеток (TCGF), тромбопоэтин (TPO), трансформирующие факторы роста (трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β)) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α). В одном варианте осуществления «фактор роста» представляет собой пептидный или белковый фактор роста.

Согласно изобретению термин «ферменты» относится к макромолекулярным биологическим катализаторам, которые ускоряют химические реакции. Как и любой катализатор, ферменты не расходуются в реакции, которую они катализируют, и не изменяют равновесия указанной реакции. В отличие от многих других катализаторов, ферменты гораздо более специфичны. В одном варианте осуществления фермент важен для гомеостаза субъекта, например любое нарушение функции (в частности, снижение активности, которое может быть вызвано любой мутацией, делецией или снижением продукции) фермента приводит к заболеванию. Примеры ферментов включают ферменты биосинтеза или деградации холестерина, стероидогенные ферменты, киназы, нуклеазы, фосфодиэстеразы, метилазы, деметилазы, дегидрогеназы, целлюлазы, протеазы, липазы, фосфолипазы, ароматазы, цитохромы, аденилат или гуанилатциклазы и нейраминидазы, такие как тканевой активатор плазминогена, стрептокиназа, тимидинкиназа вируса простого герпеса типа 1 (HSV1-TK), гексозаминидаза, фенилаланингидроксилаза, псевдохолинэстераза, ферменты поджелудочной железы (например, амилаза, липаза и протеаза или их смеси (например, панкрелипаза)), и лактаза.

Согласно изобретению термин «рецепторы» относится к белковым молекулам, которые получают сигналы (в частности, химические сигналы, называемые лигандами) извне клетки. Связывание сигнала (например, лиганда) с рецептором вызывает некоторый ответ клетки, например внутриклеточную активацию киназы. Рецепторы включают трансмембранные рецепторы (такие, как связанные с ионным каналом (ионотропные) рецепторы, связанные с G-белком (метаботропные) рецепторы и рецепторы, связанные с ферментом) и внутриклеточные рецепторы (такие как цитоплазматические рецепторы и ядерные рецепторы). Конкретные примеры рецепторов включают рецепторы стероидных гормонов, рецепторы факторов роста и пептидные рецепторы (т.е. рецепторы, лиганды которых являются пептидами), такие как гликопротеиновый лиганд-1 P-селектина (PSGL-1). Термин «рецепторы факторов роста» относится к рецепторам, которые связываются с факторами роста. Рецепторы факторов роста являются первой ступенью сигнального каскада для дифференцировки и пролиферации клеток. Рецепторы фактора роста могут использовать пути JAK/STAT, MAP-киназы и PI3-киназы.

Согласно изобретению термин «ингибиторы протеаз» относится к молекулам, в частности пептидам или белкам, которые ингибируют функцию протеаз. Ингибиторы протеаз можно классифицировать по протеазе, которая ингибируется (например, ингибиторы аспарагиновых протеаз, ингибиторы цистеиновых протеаз, ингибиторы металлопротеаз, ингибиторы сериновых протеаз, ингибиторы треониновых протеаз, ингибиторы трипсина) или по механизму их действия (например, суицидные ингибиторы, такие как серпины). Конкретные примеры ингибиторов протеаз включают серпины, такие как альфа-1-антитрипсин, апротинин и бестатин.

Согласно настоящему изобретению термин «регуляторы апоптоза» относится к молекулам, в частности пептидам или белкам, которые модулируют апоптоз, т.е. которые либо активируют, либо ингибируют апоптоз. Регуляторы апоптоза можно разделить на два широких класса: те, которые модулируют функцию митохондрий, и те, которые регулируют каспазы. Первый класс включает белки (например, BCL-2, BCL-xL), которые действуют для сохранения целостности митохондрий, предотвращая потерю потенциала митохондриальной мембраны и/или высвобождение проапоптотических белков, таких как цитохром С, в цитозоль. Также к этому первому классу принадлежат проапоптотические белки (например, BAX, BAK, BIM), которые способствуют высвобождению цитохрома C. Второй класс включает белки, такие как ингибиторы белков апоптоза (например, XIAP) или FLIP, которые блокируют активацию каспаз. Конкретными примерами регуляторов апоптоза являются BAX, BCL-2, BCL-xL, BAK, BIM, XIAP и FLIP, в частности BAX.

Согласно изобретению, термин «факторы транскрипции» относится к белкам, которые регулируют скорость транскрипции генетической информации от ДНК к матричной РНК, в частности, путем связывания с определенной последовательностью ДНК. Факторы транскрипции могут регулировать деление клеток, рост и гибель клеток на протяжении всей жизни; миграцию и организацию клеток во время эмбрионального развития; и/или в ответ на сигналы извне клетки, такие как гормон. Факторы транскрипции содержат по меньшей мере один ДНК-связывающий домен, который связывается со специфической последовательностью ДНК, обычно смежной с генами, которые регулируются факторами транскрипции. Конкретные примеры факторов транскрипции включают ядерные факторы гепатоцитов, MECP2, фактор промотора инсулина 1, FOXP2, FOXP3, семейство белков STAT, p53, семейство белков HOX и белки SOX, такие как SOX2.

Согласно изобретению термин «белки-супрессоры опухолей» относится к молекулам, в частности пептидам или белкам, которые защищают клетку от одного из этапов на пути к раку. Белки-супрессоры опухоли (обычно кодируемые соответствующими генами-супрессорами опухоли) проявляют ослабляющий или репрессивный эффект на регуляцию клеточного цикла и/или способствуют апоптозу. Их функции могут быть одной или несколькими из следующих: репрессия генов, необходимых для продолжения клеточного цикла; связывание клеточного цикла с повреждением ДНК (пока поврежденная ДНК присутствует в клетке, деление клетки происходить не должно); инициация апоптоза, если поврежденная ДНК не может быть восстановлена; подавление метастазирования (например, предотвращение распространения опухолевых клеток, блокирование потери контактного ингибирования и ингибирование метастазирования); и репарация ДНК. Конкретные примеры белков-супрессоров опухолей включают р53, гомолог фосфатазы и тензина (PTEN), SWI/SNF (SWItch/сахароза неферментируемая), опухолевый супрессор фон Хиппеля-Линдау (pVHL) аденоматозного коли-полипоза (APC), CD95, супрессии канцерогенности 5 (ST5), супрессии канцерогенности 5 (ST5), супрессии канцерогенности 14 (ST14) и Yippee-подобный 3 (YPEL3).

Согласно изобретению термин «структурные белки» относится к белкам, которые придают жесткость и прочность биологическим компонентам, которые в ином случае являлись бы текучими. Структурные белки в основном волокнистые (например, коллаген и эластин), но также могут быть глобулярными (например, актин и тубулин). Обычно глобулярные белки растворимы как мономеры, но полимеризуются с образованием длинных волокон, которые, например, могут составлять цитоскелет. Другие структурные белки являются моторными белками (такими как миозин, кинезин и динеин), которые способны генерировать механические силы, и сурфактантными белками. Конкретные примеры структурных белков включают коллаген, фиброин, фибриноген, сурфактантный белок А, сурфактантный белок В, сурфактантный белок С, сурфактантный белок D, эластин, тубулин, актин и миозин.

В соответствии с изобретением термин «факторы перепрограммирования» или «факторы перепрограммирования транскрипции» относится к молекулам, в частности пептидам или белкам, которые при экспрессии в соматических клетках при необходимости вместе с другими агентами, такими как дополнительные факторы перепрограммирования, приводят к перепрограммированию или дедифференцировке указанных соматических клеток в клетки, обладающие характеристиками стволовых клеток, в частности, плюрипотентностью. Конкретные примеры факторов перепрограммирования включают OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, LIN28 и NANOG.

Согласно изобретению, термин «геномно-инженерные белки» относится к белкам, которые способны вставлять, удалять или заменять ДНК в геноме субъекта. Конкретные примеры геномно-инженерных белков включают мегануклеазы, нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), и ассоциированный с кластеризованными короткими палиндромными повторами с регулярными интервалами (CRISPR) белок 9 (CRISPR-Cas9).

Согласно изобретению термин «белки крови» относится к пептидам или белкам, которые присутствуют в плазме крови субъекта, в частности в плазме крови здорового субъекта. Белки крови выполняют разнообразные функции, такие как транспорт (например, альбумин, трансферрин), ферментативная активность (например, тромбин или церулоплазмин), свертывание крови (например, фибриноген), защита от патогенов (например, компоненты комплемента и иммуноглобулины), ингибиторы протеаз (например, альфа-1-антитрипсин) и т.д. Конкретные примеры белков крови включают тромбин, сывороточный альбумин, фактор VII, фактор VIII, инсулин, фактор IX, фактор X, тканевой активатор плазминогена, протеин C, фактор фон Виллебранда, антитромбин III, глюкоцереброзидазу, эритропоэтин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), модифицированный фактор VIII и антикоагулянты.

В соответствии с изобретением термин «белковая заместительная терапия» относится к медицинскому лечению, которое дополняет или заменяет пептид или белок, который имеет пониженную активность у пациента по сравнению со здоровым субъектом. Сниженная активность (включая нулевую активность, что может быть, когда пептид или белок отсутствует у пациента) может быть результатом (i) сниженной экспрессии пептида или белка (т.е. пептид или белок полностью функциональны, но их количество снижено) или (ii) присутствия одной или нескольких мутаций в аминокислотной последовательности экспрессируемого пептида или белка (т.е. пептид или белок не полностью функциональны). Например, такое снижение активности пептида или белка может быть результатом гена, кодирующего пептид или белок, но содержащего одну или несколько мутаций таким образом, что (i) экспрессия указанного гена снижается или подавляется, что приводит к уменьшенному количеству пептида или белка (которые все еще могут быть полностью функциональными) и/или (ii) аминокислотная последовательность пептида или белка, кодируемого указанным геном, содержит одну или несколько мутаций, что приводит к неполностью функциональному (или нефункциональному) пептиду или белку. Заболевания или нарушения, вызванные сниженной активностью пептида или белка у пациента, можно лечить путем замены или добавления пептида или белка (заместительной белковой терапии), например путем введения пациенту, страдающему таким заболеванием или нарушением, РНК (в частности, РНК по настоящему изобретению), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок. Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид или белок, может быть аутологичной или гетерологичной для пациента. Однако, если пониженная активность пептида или белка у пациента обусловлена одной или несколькими мутациями (т.е. приводящими к неполностью функциональному (или нефункциональному) пептиду или белку), предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид или белок, является гетерологичной для пациента, в частности полученной от здорового субъекта (того же вида), экспрессирующего пептид или белок в его нативной (т.е. немутантной) форме. Например, такая белковая заместительная терапия может включать стадию введения пациенту (i) РНК (в частности, РНК по настоящему изобретению), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный пептид или белок (где указанная нуклеотидная последовательность предпочтительно является гетерологичной и может быть получена от здорового субъекта) или (ii) композиции, например фармацевтической композиции, содержащей такую РНК, или, альтернативно, стадии (а) переноса РНК (в частности, РНК по настоящему изобретению), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую указанную пептид или белок (где указанная нуклеотидная последовательность предпочтительно является гетерологичной и может быть получена от здорового субъекта) в клетку (где указанная клетка может быть аутологичной для пациента) и (b) введения указанной трансфицированной клетки пациенту. В альтернативном варианте (i) РНК предпочтительно поглощается клетками (например, антигенпрезентирующими клетками, такими как моноциты, макрофаги или дендритные клетки, или другими клетками), и образуется (и при необходимости посттрансляционно модифицируется) продукт трансляции нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид или белок, с получением пептида или белка. В альтернативном варианте (ii) после введения трансфицированных клеток пациенту трансфицированные клетки предпочтительно экспрессируют пептид или белок.

Термин «геномная инженерия» относится к процессу, в котором ДНК вставляют, удаляют или заменяют в геноме субъекта, предпочтительно с использованием геномно-инженерных белков. Конкретные примеры геномно-инженерных белков включают мегануклеазы, нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), и ассоциированный с кластеризованными короткими палиндромными повторами с регулярными интервалами (CRISPR) белок 9 (CRISPR-Cas9).

Термин «генетическое перепрограммирование» относится к переустановке генетической программы клетки. Перепрограммированная клетка предпочтительно проявляет плюрипотентность.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок представляет собой ассоциированный с заболеванием пептид или белок, т.е. он причинно-следственной связью связан с заболеванием или нарушением.

Например, заболевание или нарушение может быть вызвано сниженной активностью пептида или белка. Снижение активности может быть результатом (i) сниженной экспрессии пептида или белка (т.е. пептид или белок полностью функциональны, но их количество уменьшено) или (ii) присутствия одной или нескольких мутаций в аминокислотной последовательности экспрессированного пептида или белка (т.е. пептид или белок не полностью функциональны). Например, такое снижение активности пептида или белка может быть результатом гена, кодирующего пептид или белок, но содержащего одну или несколько мутаций таким образом, что (i) экспрессия указанного гена снижается или подавляется, что приводит к снижению количества пептида или белка (которые все еще могут быть полностью функциональными) и/или (ii) аминокислотная последовательность пептида или белка, кодируемого указанным геном, содержит одну или несколько мутаций, что приводит к неполностью функциональному (или нефункциональному) пептиду или белку. Такие заболевания или нарушения, вызванные сниженной активностью пептида или белка у пациента, можно лечить путем замены или добавления пептида или белка (заместительной белковой терапии), например, путем введения пациенту, страдающему таким заболеванием или нарушением, РНК (в частности, РНК по настоящему изобретению), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок. Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид или белок, может быть аутологичной или гетерологичной для пациента. Однако, если сниженная активность пептида или белка у пациента обусловлена одной или несколькими мутациями (т.е. приводящими к неполностью функциональному (или нефункциональному) пептиду или белку), предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид или белок, является гетерологичной, в частности, полученной от здорового субъекта (того же вида), экспрессирующего пептид или белок в его нативной (т.е. немутантной) форме. Например, такая белковая заместительная терапия может включать стадию введения пациенту (i) РНК (в частности, РНК по настоящему изобретению), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный пептид или белок (где указанная нуклеотидная последовательность предпочтительно является гетерологичной и может быть получена от здорового субъекта) или (ii) композиции, например фармацевтической композиции, содержащей такую РНК, или, альтернативно, стадии (а) переноса РНК (в частности, РНК по настоящему изобретению), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую указанную пептид или белок (где указанная нуклеотидная последовательность предпочтительно является гетерологичной и может быть получена от здорового субъекта) в клетку (где указанная клетка может быть аутологичной для пациента) и (b) введение указанной трансфицированной клетки пациенту. В альтернативном варианте (i) РНК предпочтительно поглощается клетками (например, антигенпрезентирующими клетками, такими как моноциты, макрофаги или дендритные клетки, или другими клетками), и образуется (и при необходимости посттрансляционно модифицируется) продукт трансляции нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид или белок, с получением пептида или белка. В альтернативном варианте (ii) после введения трансфицированных клеток пациенту трансфицированные клетки предпочтительно экспрессируют пептид или белок.

В альтернативном варианте такие заболевания или расстройства, вызванные сниженной активностью пептида или белка у пациента, можно лечить с помощью геномной инженерии, например, путем замены последовательности ДНК, кодирующей пептид или белок (т.е. приводящей к неполностью функциональному (или нефункциональному) пептиду или белку) у пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, последовательностью ДНК, кодирующей пептид или белок в его нативной (т.е. немутантной) форме. Например, такая геномно-инженерная терапия может включать стадию введения пациенту (i) РНК (в частности, РНК по настоящему изобретению), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую геномно-инженерный белок, и (ii) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок в его нативной (т.е. немутантной) форме. При введении предпочтительно, чтобы РНК, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую геномно-инженерный белок, и ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок в его нативной (т.е. немутантной) форме, поглощались клетками (в частности, больными клетками), и формировался (и при необходимости, посттрансляционно модифицировался) продукт трансляции нуклеотидной последовательности, кодирующей геномно-инженерный белок, с получением геномно-инженерного белка, чтобы геномно-инженерный белок вместе с последовательностью ДНК, кодирующей пептид или белок в его нативной (т.е. немутантной) форме, действовал для замены мутированной последовательности ДНК в геноме клеток последовательностью ДНК, кодирующей пептид или белок в его нативной (т.е. немутантной) форме.

В другом альтернативном варианте такие заболевания или нарушения, вызванные сниженной активностью пептида или белка у пациента, можно лечить с помощью генетического перепрограммирования, например путем перепрограммирования соматических клеток (в частности аутологичных соматических клеток) пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, и введения указанных перепрограммированных клеток пациенту. Этот терапевтический подход может быть особенно полезным для пациентов, страдающих заболеванием или нарушением, которое вызывает истощение или исчезновение клеток, продуцирующих необходимый пептид или белок (например, гормон, такой как инсулин). Например, такая терапия с генетическим перепрограммированием может включать стадии (а) введения РНК (в частности, РНК по настоящему изобретению), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую один или несколько факторов перепрограммирования, в соматические клетки; (b) создания условий для развития клеток, имеющих характеристики стволовых клеток; и (c) введения пациенту клеток, имеющих характеристики стволовых клеток. В предпочтительном варианте осуществления соматические клетки являются аутологичными по отношению к пациенту. При введении клетки, обладающие характеристиками стволовых клеток, предпочтительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие необходимый пептид или белок.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как ассоциированный с заболеванием пептид или белок, представляет собой цитокин, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из эритропоэтина (ЕРО), интерлейкина 4 (IL-2) и интерлейкина 10 (IL-11), более предпочтительно EPO. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью цитокина, или заболевание или нарушение, при котором увеличение количества цитокина (i) улучшает, облегчает, смягчает или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения, и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) снижает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить с помощью соответствующей заместительной белковой терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения цитокина), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии с генетическим перепрограммированием, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушением, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как ассоциированный с заболеванием пептид или белок, представляет собой молекулу адгезии, в частности интегрин. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью молекулы адгезии, или заболевание или нарушение, где увеличение количества молекулы адгезии (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения, и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) уменьшает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить с помощью соответствующей заместительной белковой терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения молекулы адгезии), соответствующей терапии геномной инженерии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии с помощью генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушения, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как ассоциированный с заболеванием пептид или белок, представляет собой гормон, в частности вазопрессин, инсулин или гормон роста. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью гормона, или заболевание или расстройство, при котором увеличение количества гормона (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) уменьшает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить с помощью соответствующей заместительной белковой терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения гормона), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии с помощью генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушения, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как ассоциированный с заболеванием пептид или белок, представляет собой фактор роста, в частности VEGFA. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью фактора роста, или заболевание или нарушение, при котором увеличение количества фактора роста (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) уменьшает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить с помощью соответствующей заместительной белковой терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения фактора роста), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии с помощью генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушения, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как связанный с заболеванием пептид или белок, представляет собой фермент, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из тимидинкиназы вируса простого герпеса типа 1 (HSV1-TK), гексозаминидазы, фенилаланингидроксилазы, псевдохолинэстеразы, ферментов поджелудочной железы и лактазы. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью фермента, или заболевание или нарушение, при котором увеличение количества фермента (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения, и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) снижает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить с помощью соответствующей заместительной белковой терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения фермента), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии с генетическим перепрограммированием, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушения, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как ассоциированный с заболеванием пептид или белок, представляет собой рецептор, в частности рецепторы фактора роста. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью рецептора, или заболевание или нарушение, при этом увеличение количества рецептора (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) уменьшает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить с помощью соответствующей заместительной белковой терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения рецептора), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии с помощью генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушения, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как ассоциированный с заболеванием пептид или белок, является регулятором апоптоза, в частности BAX. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью регулятора апоптоза, или заболевание или нарушение, при котором увеличение количества регулятора апоптоза (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения, и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) уменьшает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить путем соответствующей белковой заместительной терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения регулятора апоптоза), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии с использованием генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушения, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как ассоциированный с заболеванием пептид или белок, представляет собой белок-супрессор опухоли, в частности р53. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью белка-супрессора опухоли, или заболевание или нарушение, где увеличение количества белка-супрессора опухоли (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения, и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) уменьшает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить с помощью соответствующей заместительной белковой терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения белка-супрессора опухоли), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушения, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как ассоциированный с заболеванием пептид или белок, представляет собой структурный белок, в частности сурфактантный белок B. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью структурного белка, или заболевание или нарушение, при котором увеличение количества структурного белка (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) уменьшает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить с помощью соответствующей заместительной белковой терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения структурного белка), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии с помощью генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушения, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как ассоциированный с заболеванием пептид или белок, представляет собой фактор транскрипции, в частности FOXP3. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью фактора транскрипции, или заболевание или нарушение, при котором увеличение количества фактора транскрипции (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) уменьшает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить с помощью соответствующей заместительной белковой терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения фактора транскрипции), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии с помощью генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушения, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как ассоциированный с заболеванием пептид или белок, представляет собой фактор перепрограммирования, например OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, LIN28 и NANOG. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью фактора перепрограммирования, или заболевание или нарушение, при котором увеличение количества фактора перепрограммирования (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения, и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) снижает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить с помощью соответствующей заместительной белковой терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения фактора перепрограммирования), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии с использованием генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или расстройством, или подверженного риску развития такого заболевания или расстройства, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как ассоциированный с заболеванием пептид или белок, представляет собой геномно-инженерный белок, в частности ассоциированный с кластеризованными короткими палиндромными повторами с регулярными интервалами (CRISPR) белок 9 (CRISPR-Cas9). Заболевание или расстройство, вызванное сниженной активностью геномно-инженерного белка, или заболевание или нарушение, при котором увеличение количества геномно-инженерного белка (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения, и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) уменьшает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить с помощью соответствующей заместительной белковой терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения геномно-инженерного белка), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии с использованием генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушения, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок, такой как ассоциированный с заболеванием пептид или белок, представляет собой белок крови, в частности фибриноген или альфа-1-антитрипсин. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью белка крови, или заболевание или нарушение, при котором увеличение количества белка в крови (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения, и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) уменьшает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить с помощью соответствующей заместительной белковой терапии, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения белка крови), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушения, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок представляет собой иммуноглобулин, в частности антитело. Заболевание или нарушение, вызванное сниженной активностью иммуноглобулина, или заболевание или нарушение, при котором увеличение количества иммуноглобулина (i) улучшает, облегчает, ослабляет или обращает один или несколько симптомов заболевания или нарушения и/или (ii) задерживает начало заболевания или нарушения и/или (iii) снижает тяжесть заболевания или нарушения, можно лечить соответствующей белковой заместительной терапией, как описано в настоящей заявке (например, путем замены или дополнения иммуноглобулина), соответствующей геномно-инженерной терапии, как описано в настоящей заявке, и/или терапии генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке. Пациента, страдающего таким заболеванием или нарушением, или подверженного риску развития такого заболевания или нарушения, можно лечить соответствующим образом.

В одном варианте осуществления фармацевтически активный пептид или белок представляет собой иммунологически активное соединение, в частности антиген, такой как ассоциированный с заболеванием антиген. Таким образом, другим примером ассоциированных с заболеванием пептидов или белков является ассоциированный с заболеванием антиген, т.е. антиген, который характерен для нарушения или заболевания и который в нормальных условиях, то есть у здорового человека, специфически экспрессируется в ограниченном количестве органов и/или тканей или на определенных стадиях развития (например, ассоциированный с заболеванием антиген может в нормальных условиях специфически экспрессироваться в нежизнеспособной ткани, в репродуктивных органах, например в яичках, в трофобластической ткани, например в плаценте или в клетках зародышевой линии), и экспрессируется или аномально экспрессируется в одной или нескольких пораженных тканях. В этом контексте «ограниченное количество» предпочтительно означает не более 3, более предпочтительно не более 2 или 1. Конкретными примерами антигена, связанного с заболеванием, являются антигены, связанные с опухолью, антигены, связанные с патогенами (например, антигены вируса (например, вируса гриппа (A, B или C), CMV или RSV) и аллергены. Заболевание или нарушение, которое характеризуется ассоциированным с заболеванием антигеном, можно лечить путем индукции иммунного ответа против указанного ассоциированного с заболеванием антигена у пациента, имеющего указанное заболевание или нарушение, или подверженного риску его развития. Например, в случае, если ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой ассоциированный с опухолью антиген, иммунотерапия может рассматриваться как иммунотерапия рака; в случае, если ассоциированный с заболеванием антиген является ассоциированным с патогеном антигеном (например, антигеном вируса (такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV), иммунотерапия может рассматриваться как иммунотерапия патогена; и в случае, если антиген, ассоциированный с заболеванием, представляет собой аллерген, иммунотерапия может считаться терапией, повышающей толерантность к аллергии, соответственно. Таким образом, РНК по настоящему изобретению может быть использована для получения ассоциированного с заболеванием антигена, которым вакцинируют индивидуума против злокачественного заболевания или инфекционного заболевания, или может быть использована для продукции аллергена, который приводит к толерантности к аллергии.

Термин «иммунотерапия» относится к лечению, предпочтительно включающему специфическую иммунную реакцию и/или иммунную эффекторную функцию (функции).

Используемый в настоящей заявке термин «де-дифференцировка» относится к потере специализации по форме или функции. В клетках де-дифференцировка приводит к менее коммитированной клетке. Термин «коммитированные» относится к клеткам, которые считаются постоянно приверженными определенной функции. Коммитированные клетки также называют «терминально дифференцированными клетками».

Используемый в настоящей заявке термин «дифференцировка» относится к адаптации клеток к определенной форме или функции. В клетках дифференцировка приводит к более коммитированной клетке.

«Дифференцированная клетка» - это зрелая клетка, которая претерпела прогрессивные изменения в процессе развития до более специализированной формы или функции. Дифференцировка клеток - это процесс, через который клетка созревает до явно специализированного типа клеток. Дифференцированные клетки имеют различные характеристики, выполняют определенные функции и с меньшей вероятностью делятся, чем их менее дифференцированные аналоги.

«Недифференцированная» клетка, например незрелая, эмбриональная или примитивная клетка, обычно имеет неспецифический внешний вид, может выполнять несколько неспецифических действий, и может плохо выполнять или вообще не выполнять функции, обычно выполняемые дифференцированными клетками.

«Соматическая клетка» относится к любым и всем дифференцированным клеткам и не включает стволовые клетки, половые клетки или гаметы. Предпочтительно термин «соматическая клетка» в данном описании относится к терминально дифференцированной клетке.

«Стволовая клетка» - это клетка, обладающая способностью самообновляться, оставаться недифференцированной и дифференцироваться. Стволовая клетка может делиться без ограничений, по меньшей мере в течение всей жизни животного, в котором она живет в естественных условиях. Стволовая клетка не дифференцируется окончательно; это не последняя стадия пути дифференцировки. Когда стволовая клетка делится, каждая дочерняя клетка может либо остаться стволовой клеткой, либо начать курс, ведущий к терминальной дифференцировке.

Термин «клетки, обладающие характеристиками стволовых клеток» используется в настоящей заявке для обозначения клеток, которые, хотя и происходят из дифференцированных соматических не-стволовых клеток, обладают одним или несколькими признаками, типичными для стволовых клеток, в частности эмбриональных стволовых клеток. Такие особенности включают морфологию эмбриональных стволовых клеток, такую как компактные колонии, высокое соотношение ядра к цитоплазме и выступающие ядрышки, нормальные кариотипы, экспрессию теломеразной активности, экспрессию маркеров клеточной поверхности, характерных для эмбриональных стволовых клеток, и/или экспрессию генов, которые характерны для эмбриональных стволовых клеток. Маркеры клеточной поверхности, которые характерны для эмбриональных стволовых клеток, выбирают, например, из группы, состоящей из специфичного для стадии эмбрионального антигена-3 (SSEA-3), SSEA-4, опухолевого антигена-1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81 и TRA-2-49/6E. Гены, характерные для эмбриональных стволовых клеток, выбирают, например, из группы, состоящей из эндогенного OCT4, эндогенного NANOG, фактора роста и дифференцировки 3 (GDF3), пониженной экспрессии 1 (REX1), фактора роста фибробластов 4 (FGF4), специфичного для эмбриональных клеток гена 1 (ESG1), связанного с плюрипотентностью развития 2 (DPPA2), DPPA4 и теломеразы обратной транскриптазы (TERT). В одном варианте осуществления одна или несколько характеристик, типичных для стволовых клеток, включают плюрипотентность. В одном варианте осуществления клетки, обладающие характеристиками стволовых клеток, проявляют плюрипотентное состояние. В одном варианте осуществления клетки, обладающие характеристиками стволовых клеток, обладают потенциалом развития для дифференцировки в развитые производные всех трех первичных зародышевых листков. В одном варианте осуществления первичный зародышевый листок представляет собой энтодерму, а развитое производное представляет собой кишечноподобную эпителиальную ткань. В дополнительном варианте осуществления первичный зародышевый листок представляет собой мезодерму, а развитое производное представляет собой поперечнополосатую мышцу и/или хрящ. В еще одном варианте осуществления первичный зародышевый листок представляет собой эктодерму, а развитое производное представляет собой нервную ткань и/или эпидермальную ткань. В одном предпочтительном варианте осуществления клетки, обладающие характеристиками стволовых клеток, обладают потенциалом развития для дифференцировки в клетки, экспрессирующие представляющий интерес пептид или белок. В соответствии с изобретением, как правило, термины «клетки, имеющие характеристики стволовых клеток», «клетки, обладающие свойствами стволовых клеток», «перепрограммированные клетки» и «дедифференцированные клетки» или аналогичные термины имеют сходные значения и используются здесь взаимозаменяемо.

В одном варианте осуществления РНК, в частности РНК, которая содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую пептид или белок, и которая должна быть экспрессирована в клетке, представляет собой одноцепочечную самореплицирующуюся РНК. В одном варианте осуществления самореплицирующаяся РНК представляет собой одноцепочечную РНК с положительным смыслом. В одном варианте осуществления самореплицирующаяся РНК представляет собой вирусную РНК или РНК, полученную из вирусной РНК. В одном варианте осуществления самореплицирующаяся РНК представляет собой альфавирусную геномную РНК или происходит от альфавирусной геномной РНК. В одном варианте осуществления самореплицирующаяся РНК представляет собой вектор экспрессии вирусного гена. В одном из вариантов осуществления вирус представляет собой вирус леса Семлики. В одном варианте осуществления самореплицирующаяся РНК содержит один или несколько трансгенов, которые в одном варианте осуществления, если РНК является вирусной РНК, могут частично или полностью заменять вирусные последовательности, такие как вирусные последовательности, кодирующие структурные белки.

Термин «нуклеозид» (сокращенно обозначаемый здесь как «N») относится к соединениям, которые можно рассматривать как нуклеотиды без фосфатной группы. Хотя нуклеозид представляет собой азотистое основание, связанное с сахаром (например, рибозой или дезоксирибозой), нуклеотид состоит из нуклеозида и одной или нескольких фосфатных групп. Примеры нуклеозидов включают цитидин, уридин, псевдоуридин, аденозин и гуанозин.

Пять стандартных нуклеозидов, которые обычно составляют нуклеиновые кислоты природного происхождения, - это уридин, аденозин, тимидин, цитидин и гуанозин. Пять нуклеозидов обычно обозначают их однобуквенными кодами U, A, T, C и G, соответственно. Однако тимидин чаще обозначают как «dT» («d» обозначает «дезокси»), поскольку он содержит 2'-дезоксирибофуранозный фрагмент, а не рибофуранозное кольцо, обнаруживаемое в уридине. Это связано с тем, что тимидин содержится в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК), а не в рибонуклеиновой кислоте (РНК). И наоборот, уридин содержится в РНК, а не в ДНК. Остальные три нуклеозида могут быть найдены как в РНК, так и в ДНК. В РНК они будут представлены как A, C и G, тогда как в ДНК они будут представлены как dA, dC и dG.

Фрагмент модифицированного пуринового (A или G) или пиримидинового (C, T или U) основания предпочтительно модифицирован одной или несколькими алкильными группами, более предпочтительно одной или несколькими C_1-4 алкильными группами, еще более предпочтительно одной или несколькими метильными группами. Конкретные примеры модифицированных фрагментов пуриновых или пиримидиновых оснований включают N⁷-алкил-гуанин, N⁶-алкил-аденин, 5-алкил-цитозин, 5-алкил-урацил и N(1)-алкил-урацил, такие как N⁷-C_1-4-алкил-гуанин, N⁶-C_1-4-алкил-аденин, 5-C_1-4-алкил-цитозин, 5-C_1-4-алкил-урацил и N(1)-C_1-4-алкил-урацил, предпочтительно N⁷-метил-гуанин, N⁶-метил-аденин, 5-метил-цитозин, 5-метил-урацил и N(1)-метил-урацил.

Термин «транскрипция in vitro» или «IVT» в контексте настоящего описания означает, что транскрипция (то есть генерация РНК) осуществляется бесклеточным способом, т.е. в IVT используются не живые/культивируемые клетки, а аппарат транскрипции, извлеченный из клеток (например, клеточные лизаты или их изолированные компоненты, включая РНК-полимеразу (предпочтительно полимеразу Т7, Т3 или SP6)).

Термин «модификация» в контексте модифицированной РНК (предпочтительно мРНК) согласно настоящему изобретению включает любую модификацию РНК (предпочтительно мРНК), которая в природе не присутствует в указанной РНК. В частности, термин «модификация» относится к обеспечению РНК (предпочтительно мРНК) с 5'-кэп структурой по настоящему изобретению. Например, обеспечение РНК (предпочтительно мРНК) с 5'-кэп структурой по настоящему изобретению может быть достигнуто путем транскрипции in vitro ДНК-матрицы в присутствии 5'-кэп соединения по настоящему изобретению, где указанная 5'-кэп структура ко-транскрипционно включается в сгенерированную цепь РНК, или РНК (предпочтительно мРНК) может быть получена, например, путем транскрипции in vitro, а 5'-кэп-структура может быть присоединена к РНК посттранскрипционно с использованием кэпирующих ферментов, например кэпирующих ферментов вируса осповакцины.

РНК (предпочтительно мРНК) может содержать дополнительные модификации, например для повышения ее стабильности и/или снижения иммуногенности и/или уменьшения цитотоксичности. Например, дополнительная модификация РНК, предпочтительно мРНК, модифицированной 5'-кэп-соединением по настоящему изобретению, может быть удлинением или усечением встречающегося в природе поли (A) хвоста, изменением 5'- или 3'-нетранслируемых областей (UTR), таким как введение UTR, не связанной с кодирующей областью указанной РНК, замена одного или нескольких природных нуклеотидов синтетическими нуклеотидами и/или оптимизация кодонов (например, для изменения, предпочтительно увеличения, содержания GC в РНК).

РНК (предпочтительно мРНК), имеющая немаскированную последовательность поли-А, транслируется более эффективно, чем РНК (предпочтительно мРНК), имеющая маскированную последовательность поли-А. Термин «поли(A) хвост» или «последовательность поли-A» относится к последовательности остатков аденозина (в частности, аденилила) (A), которая обычно расположена на 3'-конце молекулы РНК (предпочтительно мРНК), а «немаскированная последовательность поли-А» означает, что последовательность поли-А на 3'-конце молекулы РНК (предпочтительно мРНК) заканчивается на А последовательности поли-А, и за ней не следуют нуклеотиды, кроме А, расположенного на 3'-конце, то есть ниже по последовательности поли-А. Кроме того, длинная последовательность поли-А, имеющая длину около 120 нуклеотидов, приводит к оптимальной стабильности транскрипта и эффективности трансляции РНК (предпочтительно мРНК).

Следовательно, чтобы повысить стабильность и/или экспрессию РНК, предпочтительно мРНК, согласно настоящему изобретению, ее можно модифицировать так, чтобы она присутствовала вместе с последовательностью поли-А, предпочтительно имеющей длину от 10 до 500, более предпочтительно от 30 до 300, еще более предпочтительно от 65 до 200 и особенно от 100 до 150 остатков аденозина (в частности, аденилила). В особо предпочтительном варианте осуществления последовательность поли-А имеет длину приблизительно 120 аденозиновых (в частности, аденилильных) остатков. Для дальнейшего повышения стабильности и/или экспрессии РНК, предпочтительно мРНК, согласно изобретению, последовательность поли-А может быть демаскирована.

Кроме того, включение 3'-UTR в 3'-нетранслируемую область молекулы РНК (предпочтительно мРНК) может привести к повышению эффективности трансляции. Синергетический эффект может быть достигнут путем включения двух или более таких 3'-UTR (которые предпочтительно расположены в ориентации от головы к хвосту; см., например, Holtkamp et al., Blood 108, 4009-4017 (2006)). 3'-UTR могут быть аутологичными или гетерологичными по отношению к РНК (предпочтительно мРНК), в которую они введены. В одном конкретном варианте осуществления 3'-UTR происходит из гена или мРНК глобина, таких как ген или мРНК альфа2-глобина, альфа1-глобина или бета-глобина, предпочтительно бета-глобина, более предпочтительно бета-глобина человека. Например, РНК (предпочтительно мРНК) может быть модифицирована путем замены существующей 3'-UTR или вставки одной или нескольких, предпочтительно двух копий 3'-UTR, происходящих из гена глобина, такого как альфа2-глобин, альфа-1-глобин, бета-глобин, предпочтительно бета-глобин, более предпочтительно бета-глобин человека.

РНК (предпочтительно мРНК) согласно изобретению может содержать модифицированные рибонуклеотиды для повышения ее стабильности и/или снижения иммуногенности и/или уменьшения цитотоксичности. Например, в одном варианте осуществления в РНК (предпочтительно мРНК) согласно изобретению 5-метилцитидин частично или полностью, предпочтительно полностью, замещен цитидином. Альтернативно или дополнительно, в одном варианте осуществления, в РНК (предпочтительно мРНК) согласно изобретению псевдоуридин или N(1)-метилпсевдоуридин или 5-метилуридин частично или полностью, предпочтительно полностью, замещен уридином. РНК (предпочтительно мРНК), которая модифицирована псевдоуридином (заменяющим частично или полностью, предпочтительно полностью, уридин), в настоящей заявке называется «Ψ-модифицированной», тогда как термин «m1Ψ-модифицированная» означает, что РНК (предпочтительно мРНК) содержит N(1)-метилпсевдоуридин (замещающий частично или полностью, предпочтительно полностью, уридин). Кроме того, термин «m5U-модифицированная» означает, что РНК (предпочтительно мРНК) содержит 5-метилуридин (заменяющий частично или полностью, предпочтительно полностью, уридин). Такие Ψ-, m1Ψ- или m5U-модифицированные РНК по настоящему изобретению обычно проявляют пониженную иммуногенность по сравнению с их немодифицированными формами и, таким образом, предпочтительны в применениях, в которых следует избегать или минимизировать индукцию иммунного ответа (например, при терапии с заменой белка, геномно-инженерной терапии и терапии генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке).

Комбинация описанных выше модификаций, т.е. включение последовательности поли-А, демаскирование последовательности поли-А, включение одной или нескольких 3'-UTR и замена одного или нескольких природных нуклеотидов синтетическими нуклеотидами (например, 5-метилцитидином для цитидина и/или псевдоуридином (Ψ) или N(1)-метилпсевдоуридином (m1Ψ) или 5-метилуридином (m5U) для уридина) оказывает синергетическое влияние на стабильность РНК (предпочтительно мРНК) и повышает эффективность трансляции. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления РНК (предпочтительно мРНК) по настоящему изобретению не только модифицирована 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, но также содержит комбинацию трех вышеупомянутых модификаций, то есть (i) включение последовательности поли-А, демаскирование последовательности поли-А; (ii) включение одной или нескольких 3'-UTR; и (iii) замену одного или природных нуклеотидов синтетическими нуклеотидами (например, 5-метилцитидином для цитидина и/или псевдоуридином (Ψ) или N(1)-метилпсевдоуридином (m1Ψ) или 5-метилуридином (m5U) для уридина). При необходимости кодоны РНК (предпочтительно мРНК) по настоящему изобретению могут быть дополнительно оптимизированы, например, для увеличения содержания GC в РНК и/или для замены кодонов, которые редки в клетке (или у субъекта), где пептид или представляющий интерес белок должен экспрессироваться кодонами, которые являются синонимичными частым кодонам в указанной клетке (или у субъекта).

Термин «РНК-полимераза» в контексте настоящего описания относится к ДНК-зависимой РНК-полимеразе, которая продуцирует первичную транскрипционную РНК. Примеры РНК-полимераз, подходящих для генерации РНК IVT согласно настоящему изобретению, включают РНК-полимеразы Т7, Т3 и SP6. Предпочтительной РНК-полимеразой является РНК-полимераза Т7.

Термин «традиционный 5'-кэп» относится к кэп-структуре, обнаруживаемой на 5'-конце молекулы мРНК, и обычно состоящей из гуанозин-5'-трифосфата (Gppp), который через свой трифосфатный фрагмент связан с 5'-концом следующего нуклеотида мРНК (т.е. гуанозин связан с остальной частью мРНК через 5'-5' трифосфатную связь). Гуанозин может быть метилирован в положении N7 (что приводит к кэп-структуре m7Gppp).

Согласно настоящей заявке термин «кэп-0» означает структуру «m⁷GpppN», где N представляет собой любой нуклеозид, несущий фрагмент ОН в положении 2'. Согласно настоящей заявке термин «кэп-1» означает структуру «m⁷GpppNm», где Nm представляет собой любой нуклеозид, содержащий фрагмент ОСН₃ в положении 2'. Согласно настоящей заявке термин «кэп 2» означает структуру «m⁷GpppNmNm», где каждый Nm независимо представляет собой любой нуклеозид, несущий фрагмент OCH₃ в положении 2'.

В контексте настоящего изобретения термин «5'-кэп структура по настоящему изобретению» представляет собой аналог 5'-кэпа, который напоминает структуру обычного 5'-кэпа, но модифицирован, чтобы обладать способностью стабилизировать РНК (в конкретной мРНК) и/или увеличивать экспрессию РНК (в частности, экспрессию мРНК), при присоединении к ней, предпочтительно in vivo или в клетке. Клетка может быть любой клеткой, которая может быть трансфицирована РНК (предпочтительно мРНК) по настоящему изобретению, и предпочтительно является клеткой, полученной от субъекта, например, стволовой клеткой (например, мезенхимальной стволовой клеткой (MSC)) или антигенпрезентирующей клеткой (например, незрелой антигенпрезентирующей клеткой), такой как дендритная клетка (например, незрелая дендритная клетка). Предпочтительно 5'-кэп структура по настоящему изобретению, по меньшей мере, включает структуру «1-(N⁷-(R1)-гуанин-9-ил)-пентозо-5-ил- (фосфотиоатная связь)-N(R⁸)-» любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa) (т.е. где первый гуанин 5'-кэп структуры замещен в положении N⁷ на R¹ и соединен в положении N⁹ с C^1' из заместителей R² и R³, несущих пентозу; фосфотиоатная связь имеет структуру -O-P(O^-)(R⁴)-O-P(O^-)(R⁵)-O[-P(O^-)(R⁶)-O]_n; и N представляет собой любой нуклеозид, несущий основание B и замещенный в положении 2' на R⁸). Кроме того, если R⁷ в любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), ( IId), (IIe), (III) и (IIIa) представляет собой рибоолигонуклеотид, в котором группа ОН в положении 2' по меньшей мере рибозы на 5'-конце рибоолигонуклеотида заменена заместителем R^8', выбранным из группы, состоящей из Н, галогена и необязательно замещенного алкокси, и рибоза на 3'-конце рибоолигонуклеотида имеет свободную ОН-группу в положении 2', тогда 5'-кэп структура из настоящего изобретения предпочтительно включает в дополнение к структуре «1-(N⁷- (R¹)-гуанин-9-ил)-пентозо-5-ил-(фосфотиоатная связь)-N(R⁸)-» любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa), также любой нуклеозид, замещенный в положении 2' группой R^8' (вместе с любой межнуклеотидной связью между фрагментом N(R⁸) и фрагментом N(R^8'), а также любой межнуклеотидной связью между каждой парой фрагментов N(R^8') в случае рибоолигонуклеотида содержит более одного фрагмента N(R^8')). Например, если для обеспечения 5'-кэп структуры по настоящему изобретению соединение с 5'-кэпом формулы (I), где R⁷ представляет собой рибоолигонуклеотид формулы [pN(R^8')]₂pN (т.е. только нуклеозид на 3'-конце рибоолигонуклеотида имеет свободную группу ОН в положении 2', в то время как два других нуклеозида заменены на R8' в положении 2'), 5'-кэп структура по настоящему изобретению будет включать по меньшей мере структуру «1-(N⁷-(R¹)-гуанин-9-ил)-пентозо-5-ил-(фосфотиоатная связь)-N(R⁸)-[pN(R^8')]₂».

В соответствии с настоящей заявкой термин «5'-кэпированная РНК» означает РНК, которая на своем 5'-конце содержит кэп-структуру.

В контексте настоящей заявки термин «РНК, модифицированная 5'-кэп соединением по настоящему изобретению» означает РНК, которая содержит на своем 5'-конце структуру с 5'-кэпом по настоящему изобретению. Аналогичным образом, термин «мРНК, модифицированная 5'-кэп соединением по настоящему изобретению» означает мРНК, которая содержит на своем 5'-конце структуру с 5'-кэпом по настоящему изобретению. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления такая РНК (например, мРНК), модифицированная 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, по меньшей мере, содержит на своем 5'-конце структуру «1-(N⁷-(R¹)-гуанин-9-ил)-пентозо-5-ил-(фосфотиоатная связь)-N(R⁸)-» любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa) (т.е. где первый гуанин 5'-кэп структуры замещен в положении N⁷ группой R¹ и связан на N⁹ с C^1' пентозосодержащих заместителей R² и R³; фосфотиоатная связь имеет структуру -O-P(O^-)(R⁴)-O-P(O^-)(R⁵)-O-[-P(O^-)(R⁶)-O]_n; и N представляет собой любой нуклеозид, несущий основание B и замещенный в положении 2' на R⁸). Кроме того, если R⁷ в любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa) представляет собой рибоолигонуклеотид, в котором группа ОН в положении 2' по меньшей мере рибозы на 5'-конце рибоолигонуклеотида замещена заместителем R^8', выбранным из группы, состоящей из H, галогена и необязательно замещенного алкокси, и рибоза на 3'-конце рибоолигонуклеотида имеет свободную OH-группу в положении 2', то РНК (такая как мРНК), которая модифицирована 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, предпочтительно содержит на своем 5'-конце в дополнение к структуре «1-(N⁷-(R¹)-гуанин-9-ил)-пентозо-5-ил-(фосфотиоатная связь)-N (R⁸)-» любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa) также любой нуклеозид, замещенный в положении 2' группой R^8' (вместе с любой межнуклеотидной связью между фрагментом N(R⁸) и фрагментом N(R^8'), а также любой межнуклеотидной связью между каждой парой фрагментов N(R^8') в случае, если рибоолигонуклеотид содержит более одного фрагмента N(R^8')). Например, если РНК модифицирована 5'-кэп соединением по настоящему изобретению формулы (I), где R⁷ представляет собой рибоолигонуклеотид формулы [pN(R^8')]₂pN (т.е. только нуклеозид на 3'-конец рибоолигонуклеотида имеет свободную группу ОН в положении 2', тогда как два других нуклеозида замещены R^8' в положении 2'), модифицированная РНК будет содержать на своем 5'-конце по меньшей мере структуру «1-(N⁷-(R¹)-гуанин-9-ил)-пентозо-5-ил-(фосфотиоатная связь)-N(R⁸)-[pN(R^8')]₂».

Термин «повышение экспрессии РНК», предпочтительно в связи с РНК, модифицированной 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, предпочтительно означает уменьшение или даже ингибирование распознавания РНК белками, распознающими структуру кэп-0, например белками IFIT (в частности, IFIT1).

Согласно изобретению часть или фрагмент пептида или белка предпочтительно обладает по меньшей мере одним функциональным свойством пептида или белка, из которого они получены. Такие функциональные свойства включают фармакологическую активность, взаимодействие с другими пептидами или белками, ферментативную активность, взаимодействие с антителами и избирательное связывание нуклеиновых кислот. Например, фармакологически активный фрагмент пептида или белка обладает по меньшей мере одной из фармакологических активностей пептида или белка, из которого был получен фрагмент. Часть или фрагмент пептида или белка предпочтительно содержит последовательность из по меньшей мере 6, в частности по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 последовательных аминокислот пептида или белка. Часть или фрагмент пептида или белка предпочтительно содержит последовательность до 8, в частности до 10, до 12, до 15, до 20, до 30 или до 55 последовательных аминокислот пептида или белка.

Согласно изобретению аналог пептида или белка представляет собой модифицированную форму указанного пептида или белка, из которого он был получен, и обладает по меньшей мере одним функциональным свойством указанного пептида или белка. Например, фармакологически активный аналог пептида или белка имеет по меньшей мере одну из фармакологических активностей пептида или белка, из которого был получен аналог. Такие модификации включают любую химическую модификацию и включают одиночные или множественные замены, делеции и/или добавления любых молекул, связанных с белком или пептидом, таких как углеводы, липиды и/или белки или пептиды. В одном варианте осуществления «аналоги» белков или пептидов включают те модифицированные формы, которые возникают в результате гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, пальмитоилирования, миристоилирования, изопренилирования, липидирования, алкилирования, дериватизации, введения защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления или связывания с антителом или другим клеточным лигандом. Термин «аналог» также распространяется на все функциональные химические эквиваленты указанных белков и пептидов.

В контексте настоящего изобретения термин «вакцинная композиция» относится к антигенному препарату, который содержит РНК. Вакцинную композицию вводят индивидууму, чтобы стимулировать гуморальную и/или клеточную иммунную систему индивидуума против одного или нескольких антигенов. В этом контексте РНК может кодировать антиген, белок или пептид, содержащий указанный антиген, или антигенный пептид. Вакцинная композиция в контексте настоящего изобретения может дополнительно включать один или несколько адъювантов и/или вспомогательных веществ, и может применяться у индивидуума любым подходящим путем для того, чтобы вызвать защитную и/или терапевтическую иммунную реакцию против антигена.

«Антиген» по изобретению охватывает любое вещество, которое будет вызывать иммунный ответ, и/или любое вещество, против которого направлен иммунный ответ или иммунный механизм, такой как клеточный ответ. Это также включает ситуации, когда антиген процессируется в антигенные пептиды, и иммунный ответ или иммунный механизм направлен против одного или нескольких антигенных пептидов, в частности, если они представлены в контексте молекул MHC. В частности, «антиген» относится к любому веществу, предпочтительно пептиду или белку, которое специфически реагирует с антителами или Т-лимфоцитами (Т-клетками). Согласно настоящему изобретению термин «антиген» включает любую молекулу, которая содержит по меньшей мере один эпитоп, такой как эпитоп Т-клетки. Предпочтительно антиген в контексте настоящего изобретения представляет собой молекулу, которая, при необходимости после процессинга, индуцирует иммунную реакцию, которая предпочтительно является специфической для антигена (включая клетки, экспрессирующие антиген).

Согласно настоящему изобретению может быть использован любой подходящий антиген, который является кандидатом на иммунный ответ, причем иммунный ответ может быть как гуморальным, так и клеточным иммунным ответом. В контексте некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения антиген предпочтительно представлен клеткой, предпочтительно антигенпрезентирующей клеткой, в контексте молекул MHC, что приводит к иммунному ответу против антигена. Антиген предпочтительно представляет собой продукт, который соответствует или происходит от встречающегося в природе антигена. Такие природные антигены могут включать или могут происходить из аллергенов, вирусов (например, вируса гриппа (A, B или C), CMV или RSV), бактерий, грибов, паразитов и других инфекционных агентов и патогенов, или антиген также может быть опухолевым антигеном. Согласно настоящему изобретению антиген может соответствовать природному продукту, например, вирусному белку (например, белку вируса гриппа A, вируса гриппа B или вируса гриппа C, такому как PB1, PB1-F2, PB2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 или NEP/NS2 из вируса гриппа A, вируса гриппа B или вируса гриппа C) или его части.

В предпочтительном варианте осуществления антиген представляет собой опухолевый антиген, то есть часть опухолевой клетки, которая может происходить из цитоплазмы, поверхности клетки или ядра клетки, в частности антигенов, которые в основном встречаются внутриклеточно или в виде поверхностных антигенов опухолевых клеток. Например, опухолевые антигены включают карциноэмбриональный антиген, α1-фетопротеин, изоферритин и фетальный сульфогликопротеин, α2-H-ферропротеин и γ-фетопротеин, а также различные вирусные опухолевые антигены. Согласно настоящему изобретению опухолевый антиген предпочтительно включает любой антиген, который характерен для опухолей или рака, а также для опухолевых или раковых клеток в отношении типа и/или уровня экспрессии. В другом варианте осуществления антиген представляет собой ассоциированный с патогеном антиген, т.е. антиген, происходящий от патогена, например, вируса (такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV), бактерии, одноклеточного организма или паразита, например, вирусный антиген, такой как вирусный рибонуклеопротеин или белок оболочки. В частности, антиген должен быть презентирован молекулами MHC, что приводит к модуляции, в частности к активации клеток иммунной системы, предпочтительно лимфоцитов CD4+ и CD8+, в частности, посредством модуляции активности рецептора Т-клеток.

В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой опухолевый антиген, и настоящее изобретение включает стимуляцию противоопухолевого ответа CTL против опухолевых клеток, экспрессирующих такой опухолевый антиген и предпочтительно представляющих такой опухолевый антиген с MHC класса I.

Термин «иммуногенность» относится к относительной эффективности антигена при индукции иммунной реакции.

Термин «патоген» относится к патогенным микроорганизмам и включает вирусы, бактерии, грибы, одноклеточные организмы и паразитов. Примерами патогенных вирусов являются вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус гриппа (например, вирус гриппа A, вирус гриппа B или вирус гриппа C), респираторно-синцитиальный вирус (RSV), цитомегаловирус (CMV), вирус герпеса (HSV), вирус гепатита A (HAV), HBV, HCV, вирус папилломы и человеческий Т-лимфотрофный вирус (HTLV), такой как ВИЧ, CMV, HSV, HAV, HBV, HCV, вирус папилломы и HTLV, предпочтительно вирус гриппа, CMV, или RSV. К одноклеточным организмам относятся трипаносомы плазмодий, амебы и др.

Таким образом, в другом предпочтительном варианте осуществления антиген представляет собой один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) вирусных антигенов, то есть один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) антигенов вируса, причем вирус предпочтительно представляет собой вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV. Следовательно, в этом варианте осуществления настоящее изобретение предпочтительно включает выработку иммунного ответа против указанного вируса. Один или несколько вирусных антигенов предпочтительно выбирают из группы, состоящей из PB1, PB1-F2, PB2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 и NEP/NS2 гриппа A, гриппа B или гриппа C.

Примерами антигенов, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются p53, ART-4, BAGE, ss-катенин/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (или hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, предпочтительно MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, или MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Миозин/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 минорный BCR-abL, Plac-1, Pm1/RARa, PRAME, протеиназа 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 или RU2, SAGE, SART-1 или SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, сурвивин, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE и WT, предпочтительно WT-1.

«Часть или фрагмент антигена» или «антигенный пептид» в соответствии с изобретением предпочтительно представляет собой неполную презентацию антигена и способен вызывать иммунный ответ против антигена или клеток, характеризующихся экспрессией антигена и предпочтительно презентацией антигена.

В этом контексте в изобретении также используются пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, происходящие от антигенов, также называемые здесь «антигенными пептидами». Под «антигенным пептидом» или «антигенным пептидом, полученным из антигена» подразумевается олигопептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по существу соответствующую аминокислотной последовательности фрагмента или пептида антигена. Антигенный пептид может иметь любую длину.

Предпочтительно антигенные пептиды способны стимулировать иммунный ответ, предпочтительно клеточный ответ против антигена или клеток, характеризующихся экспрессией антигена и предпочтительно презентацией антигена. Предпочтительно антигенный пептид способен стимулировать клеточный ответ против клетки, характеризующейся презентацией антигена с MHC класса I, и предпочтительно способен стимулировать антиген-чувствительные CTL. Предпочтительно согласно изобретению антигенные пептиды представляют собой пептиды, презентированные MHC класса I и/или класса II, или могут подвергаться процессингу для получения пептидов, представленных MHC класса I и/или класса II. Предпочтительно пептиды антигена содержат аминокислотную последовательность, по существу соответствующую аминокислотной последовательности фрагмента антигена. Предпочтительно указанный фрагмент антигена представляет собой пептид, презентированный MHC класса I и/или класса II. Предпочтительно антигенный пептид по изобретению содержит аминокислотную последовательность, по существу соответствующую аминокислотной последовательности такого фрагмента, и процессируется для получения такого фрагмента, то есть пептида, презентируемого MHC класса I и/или класса II, полученного из антигена.

Если антигенный пептид должен быть презентирован непосредственно, то есть без процессинга, в частности без расщепления, он имеет длину, которая подходит для связывания с молекулой MHC, в частности с молекулой MHC класса I, и предпочтительно составляет 7-20 аминокислот по длине, более предпочтительно длиной 7-12 аминокислот, более предпочтительно длиной 8-11 аминокислот, в частности длиной 9 или 10 аминокислот. Предпочтительно последовательность антигенного пептида, который должен быть презентирован непосредственно, происходит от аминокислотной последовательности антигена, то есть ее последовательность по существу соответствует и предпочтительно полностью идентична фрагменту антигена.

Если антигенный пептид должен быть презентирован после процессинга, в частности после расщепления, пептид, полученный процессингом, имеет длину, которая подходит для связывания с молекулой MHC, в частности с молекулой MHC класса I, и предпочтительно составляет 7-20 аминокислот по длине, более предпочтительно длиной 7-12 аминокислот, более предпочтительно длиной 8-11 аминокислот, в частности длиной 9 или 10 аминокислот. Предпочтительно последовательность пептида, который должен быть презентирован после процессинга, происходит из аминокислотной последовательности антигена, то есть ее последовательность в основном соответствует и предпочтительно полностью идентична фрагменту антигена. Таким образом, антигенный пептид согласно изобретению в одном варианте осуществления включает последовательность из 7-20 аминокислот в длину, более предпочтительно из 7-12 аминокислот в длину, более предпочтительно из 8-11 аминокислот в длину, в частности из 9 или 10 аминокислот в длину, которая по существу соответствует и предпочтительно полностью идентична фрагменту антигена, и последующий процессинг антигенного пептида составляет презентируемый пептид. Однако антигенный пептид может также содержать последовательность, которая по существу соответствует и предпочтительно полностью идентична фрагменту антигена, который даже длиннее, чем указанная выше последовательность. В одном варианте осуществления антигенный пептид может включать полную последовательность антигена.

Пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, по существу соответствующие последовательности пептида, который презентирован MHC класса I, могут отличаться по одному или нескольким остаткам, которые не являются существенными для распознавания TCR пептида, презентированного MHC класса I, или для связывания пептида с MHC. Такие по существу соответствующие пептиды также способны стимулировать антиген-чувствительные CTL. Пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, отличающиеся от презентированного пептида по остаткам, которые не влияют на распознавание TCR, но улучшают стабильность связывания с MHC, могут улучшать иммуногенность антигенного пептида и могут упоминаться в настоящей заявке как «оптимизированный пептид». Используя существующие знания о том, какой из этих остатков может с большей вероятностью повлиять на связывание либо с MHC, либо с TCR, можно использовать рациональный подход к созданию по существу соответствующих пептидов. Получающиеся в результате пептиды, которые являются функциональными, рассматриваются как антигенные пептиды.

В одном варианте осуществления антигенный пептид, когда он презентирован в контексте MHC, такой как MHC антигенпрезентирующих клеток, распознается рецептором Т-клеток. Антигенный пептид, если он распознается рецептором Т-клетки, может индуцировать в присутствии соответствующих костимулирующих сигналов клональную экспансию Т-клетки, несущей Т-клеточный рецептор, специфически распознающей пептид антигена. Предпочтительно антигенные пептиды, в частности, если они презентированы в контексте молекул MHC, способны стимулировать иммунный ответ, предпочтительно клеточный ответ против антигена, от которого они происходят, или клеток, характеризующихся экспрессией антигена и предпочтительно характеризующихся презентацией антигена.

Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте в молекуле, такой как антиген, то есть к части или фрагменту молекулы, которая распознается иммунной системой, например которая распознается Т-клеткой, в частности когда они презентированы в контексте молекул MHC. Эпитоп белка предпочтительно включает непрерывную или прерывистую часть указанного белка и предпочтительно составляет от 5 до 100, предпочтительно от 5 до 50, более предпочтительно от 8 до 30, наиболее предпочтительно от 10 до 25 аминокислот в длину, например, эпитоп может предпочтительно иметь длину 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот. Особенно предпочтительно эпитоп в контексте настоящего изобретения является эпитопом Т-клеток.

Такие термины, как «эпитоп», «Т-клеточный эпитоп», «фрагмент антигена», «иммуногенный пептид» и «антигенный пептид» используются здесь взаимозаменяемо и предпочтительно относятся к неполному представлению антигена, который предпочтительно способен вызывать иммунный ответ против антигена или клетки, экспрессирующей или включающей и предпочтительно презентирующей антиген. Предпочтительно термины относятся к иммуногенной части антигена. Предпочтительно это часть антигена, которая распознается (т.е. специфически связывается) рецептором Т-клеток, в частности, если она презентирована в контексте молекул MHC. Определенные предпочтительные иммуногенные части связываются с молекулой MHC класса I или класса II.

Термин «мишень» означает агент, такой как клетка или ткань, который является мишенью для иммунного ответа, такого как клеточный иммунный ответ. Мишени включают клетки, которые презентируют антиген или антигенный эпитоп, то есть пептидный фрагмент, полученный из антигена. В одном варианте осуществления клетка-мишень представляет собой клетку, экспрессирующую антиген и предпочтительно презентирующую указанный антиген с MHC класса I.

Термин «часть» относится к доле. Что касается конкретной структуры, такой как аминокислотная последовательность или белок, термин «ее часть» может обозначать непрерывную или прерывистую часть указанной структуры.

Термины «часть» и «фрагмент» используются в настоящей заявке взаимозаменяемо и относятся к непрерывному элементу. Например, часть структуры, такая как аминокислотная последовательность или белок, относится к непрерывному элементу указанной структуры.

«Процессинг антигена» относится к расщеплению антигена на продукты процессинга, которые являются фрагментами указанного антигена (например, расщепление белка на пептиды) и ассоциации одного или нескольких из этих фрагментов (например, посредством связывания) с молекулами MHC для презентации клетками, предпочтительно антигенпрезентирующими клетками, специфическим Т-клеткам.

Под «антиген-чувствительными CTL» подразумевается CD8+ Т-клетка, которая реагирует на антиген или пептид, полученный из указанного антигена, который презентирован MHC класса I на поверхности антигенпрезентирующих клеток.

Согласно изобретению, чувствительность CTL может включать устойчивый приток кальция, деление клеток, продукцию цитокинов, таких как IFN-γ и TNF-α, повышающую регуляцию маркеров активации, таких как CD44 и CD69, и специфическое цитолитическое уничтожение клетки-мишени, экспрессирующей опухолевый антиген. Чувствительность CTL также можно определить с использованием искусственного репортера, который точно указывает чувствительность CTL.

Термины «иммунный ответ» и «иммунная реакция» используются в настоящей заявке взаимозаменяемо в их общепринятом значении и относятся к интегрированному ответу организма на антиген и предпочтительно относятся к клеточному иммунному ответу, гуморальному иммунному ответу или к ним обоим. Согласно изобретению термин «иммунный ответ на» или «иммунный ответ против» в отношении агента, такого как антиген, клетка или ткань, относится к иммунному ответу, такому как клеточный ответ, направленному против этого агента. Иммунный ответ может включать одну или несколько реакций, выбранных из группы, состоящей из выработки антител против одного или нескольких антигенов и размножения антиген-специфичных Т-лимфоцитов, предпочтительно CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, более предпочтительно CD8+ Т-лимфоцитов, которые могут быть обнаруживается в различных тестах на пролиферацию или продукцию цитокинов in vitro.

Термины «индуцирующий иммунный ответ» и «вызывающий иммунный ответ» и аналогичные термины в контексте настоящего изобретения относятся к индукции иммунного ответа, предпочтительно индукции клеточного иммунного ответа, гуморального иммунного ответа или того и другого. Иммунный ответ может быть защитным/превентивным/профилактическим и/или терапевтическим. Иммунный ответ может быть направлен против любого иммуногена, антигена или антигенного пептида, предпочтительно против антигена, ассоциированного с опухолью, или антигена, ассоциированного с патогеном (например, антигена вируса (такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV)). «Индукция» в этом контексте может означать, что иммунного ответа против определенного антигена или патогена до индукции не было, но это также может означать, что имелся определенный уровень иммунного ответа против конкретного антигена или патогена до индукции, а после индукции указанный иммунной ответ усилился. Таким образом, «индукция иммунного ответа» в данном контексте также включает «усиление иммунного ответа». Предпочтительно после индукции иммунного ответа у индивидуума указанный индивидуум защищен от развития заболевания, такого как инфекционное заболевание или раковое заболевание, или патологическое состояние облегчается за счет индукции иммунного ответа.

Термины «клеточный иммунный ответ», «клеточный ответ», «клеточно-опосредованный иммунитет» или аналогичные термины предназначены для включения клеточного ответа, направленного на клетки, характеризующиеся экспрессией антигена и/или презентацией антигена класса I или класса II MHC. Клеточный ответ относится к клеткам, называемым Т-клетками или Т-лимфоцитами, которые действуют как «хелперы» или «киллеры». Хелперные Т-клетки (также называемые CD4+ Т-клетками) играют центральную роль, регулируя иммунный ответ, а клетки-киллеры (также называемые цитотоксическими Т-клетками, цитолитическими Т-клетками, CD8+ Т-клетками или CTL) убивают клетки, такие как больные клетки.

Термин «гуморальный иммунный ответ» относится к процессу в живых организмах, при котором в ответ на агенты и организмы вырабатываются антитела, которые в конечном итоге нейтрализуют и/или устраняют эти агенты/организмы. Специфичность антительного ответа опосредуется Т- и/или В-клетками через мембранно-ассоциированные рецепторы, которые специфически связывают единственный антиген. После связывания соответствующего антигена и получения различных других активирующих сигналов В-лимфоциты делятся, в результате чего образуются В-клетки памяти, а также клоны секретирующих антитела плазматических клеток, каждый из которых продуцирует антитела, которые распознают идентичный антигенный эпитоп, который распознается его рецептором антигена. B-лимфоциты памяти остаются в спящем состоянии до тех пор, пока они впоследствии не активируются своим специфическим антигеном. Эти лимфоциты обеспечивают клеточную основу памяти и результирующую эскалацию реакции антител при повторном воздействии специфического антигена.

Используемый в настоящей заявке термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, которая способна специфически связываться с эпитопом антигена. В частности, термин «антитело» относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Термин «антитело» включает моноклональные антитела, рекомбинантные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела и комбинации любого из вышеперечисленных. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Вариабельные области и константные области также называются здесь вариабельными доменами и константными доменами, соответственно. Области VH и VL можно далее подразделить на гипервариабельные области, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), с вкраплениями более консервативных областей, называемых каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR VH обозначают как HCDR1, HCDR2 и HCDR3; CDR VL обозначают как LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антитела включают константную область тяжелой цепи (CH) и константную область легкой цепи (CL), где CH можно дополнительно подразделить на константный домен CH1, шарнирную область и константные домены CH2 и CH3 (расположенные от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: CH1, CH2, CH3). Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, полученными из природных источников или из рекомбинантных источников, и могут быть иммуноактивными частями интактных иммуноглобулинов. Антитела обычно представляют собой тетрамеры молекул иммуноглобулинов. Антитела могут существовать в различных формах, включая, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, Fv, Fab и F(ab)₂, а также одноцепочечные антитела и гуманизированные антитела.

Термин «иммуноглобулин» относится к белкам суперсемейства иммуноглобулинов, предпочтительно к антигенным рецепторам, таким как антитела или В-клеточный рецептор (BCR). Иммуноглобулины характеризуются структурным доменом, то есть доменом иммуноглобулина, имеющим характерную иммуноглобулиновую (Ig) складку. Этот термин охватывает мембраносвязанные иммуноглобулины, а также растворимые иммуноглобулины. Мембраносвязанные иммуноглобулины также называют поверхностными иммуноглобулинами или мембранными иммуноглобулинами, которые обычно являются частью BCR. Растворимые иммуноглобулины обычно называют антителами. Иммуноглобулины обычно содержат несколько цепей, обычно две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи, которые связаны дисульфидными связями. Эти цепи в основном состоят из иммуноглобулиновых доменов, таких как домен VL (вариабельная легкая цепь), домен CL (константная легкая цепь), домен VH (вариабельная тяжелая цепь) и домены CH (константная тяжелая цепь) CH1, CH2, CH3 и CH4. Существует пять типов тяжелых цепей иммуноглобулина млекопитающих, то есть α, δ, ε, γ и µ, которые составляют различные классы антител, то есть IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В отличие от тяжелых цепей растворимых иммуноглобулинов, тяжелые цепи мембранных или поверхностных иммуноглобулинов содержат трансмембранный домен и короткий цитоплазматический домен на их карбокси-конце. У млекопитающих есть два типа легких цепей: лямбда и каппа. Цепи иммуноглобулина включают вариабельную область и константную область. Константная область по существу консервативна в пределах различных изотипов иммуноглобулинов, при этом вариабельная часть очень разнообразна и отвечает за распознавание антигенов.

Термины «вакцинация» и «иммунизация» описывают процесс лечения человека по терапевтическим или профилактическим причинам и относятся к процедуре введения одного или нескольких иммуногенов или антигенов или их производных, в частности, в форме РНК, кодирующей их, как описано в настоящей заявке, для индивидуума, и стимулирующей иммунный ответ против указанного одного или нескольких иммуногенов, или антигена (антигенов), или клеток, характеризующихся презентацией указанного одного или нескольких иммуногенов или антигенов.

Под «клеткой, характеризующейся презентацией антигена» или «клеткой, презентирующей антиген», или «молекулами MHC, которые представляют антиген на поверхности антигенпрезентирующей клетки» или подобными выражениями подразумевается клетка, такая как больная клетка, в частности, опухолевая клетка или антигенпрезентирующая клетка, презентирующая антиген или антигенный пептид, либо непосредственно, либо после процессинга в контексте молекул MHC, предпочтительно молекул MHC класса I и/или MHC класса II, наиболее предпочтительно молекул MHC класса I.

В контексте настоящего изобретения такие термины, как «защищать», «предотвращать», «профилактический», «превентивный» или «защитный», относятся к профилактике или лечению, или и к тому и другому, в отношении возникновения и/или распространения заболевания у индивидуума, и, в частности, для сведения к минимуму вероятности развития у индивидуума болезни, или для задержки развития болезни. Например, индивидуум с риском заболевания может быть кандидатом на терапию для предотвращения заболевания. Профилактическое введение агента (например, РНК) или композиции (такой как фармацевтическая композиция, например, вакцинная композиция), описанных в настоящей заявке, может защищать реципиента от развития заболевания, например от заражения патогеном (например, вирусом, таким как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV) или от распространения или метастазирования существующих опухолей. Терапевтическое введение агента (например, РНК) или композиции (такой как фармацевтическая композиция), описанных в настоящем документе, может привести к ингибированию развития/роста заболевания. Это включает замедление прогрессирования/ роста заболевания, в частности нарушение прогрессирования заболевания, что предпочтительно приводит к устранению заболевания.

Термин «адъювант» относится к соединениям, которые при введении в комбинации с антигеном, антигенным пептидом или нуклеиновой кислотой (такой как РНК, предпочтительно мРНК), кодирующей указанный антиген или антигенный пептид, индивидууму продлевают или усиливают, или ускоряют иммунный ответ. В контексте настоящего изобретения РНК (предпочтительно мРНК) можно вводить с любыми адъювантами. Предполагается, что адъюванты проявляют свою биологическую активность с помощью одного или нескольких механизмов, включая увеличение поверхности антигена, продление удержания антигена в организме, замедление высвобождения антигена, нацеливание антигена на макрофаги, увеличение поглощения антигена, усиление процессинга антигена, стимуляцию высвобождения цитокинов, стимуляцию и активацию иммунных клеток, таких как B-клетки, макрофаги, дендритные клетки, T-клетки, и неспецифическую активацию иммунных клеток. Например, соединения, которые позволяют созревать DC, например липополисахариды или лиганд CD40, образуют класс подходящих адъювантов. Как правило, любой агент, который влияет на иммунную систему типа «сигнала опасности» (ЛПС, GP96, дцРНК и т.д.) или цитокины, такие как GM-CSF, можно использовать в качестве адъюванта, который позволяет усилить иммунный ответ и/или влияет на него контролируемым образом. CpG-олигодезоксинуклеотиды (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549) при необходимости также могут быть использованы в этом контексте. Дополнительные типы адъювантов включают масляные эмульсии (например, адъюванты Фрейнда), минеральные соединения (такие как квасцы), бактериальные продукты (такие как токсин Bordetella pertussis), липосомы, иммуностимулирующие комплексы, цитокины (например, монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, LT-α или факторы роста, например, hGH), липопептиды (например, Pam3Cys). В случае, если РНК (предпочтительно мРНК) по изобретению в одном варианте осуществления может кодировать иммуностимулирующий агент, и указанный иммуностимулирующий агент, кодируемый указанной РНК, должен действовать как первичный иммуностимулятор, однако, необходимо лишь относительно небольшое количество CpG ДНК (по сравнению с иммуностимуляцией только CpG ДНК). Примерами адъювантов являются монофосфорил-липид-A (MPL SmithKline Beecham, сапонины, такие как QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 и QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), неполный адъювант Фрейнда, полный адъювант Фрейнда, витамин Е, монтанид, квасцы, CpG-олигонуклеотиды и различные эмульсии типа вода-в-масле, которые получают из биологически разлагаемых масел, таких как сквален и/или токоферол. Особо предпочтительными адъювантами являются цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, LT-α, факторы роста, например, hGH, или липопептиды, такие как Pam3Cys, все из которых подходят для использования в качестве адъювантов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, или когда РНК по настоящему изобретению используют в терапии.

Такие термины, как «увеличение», «усиление» или «продление», предпочтительно относятся к увеличению, усилению или продлению по меньшей мере примерно на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 100%. Эти термины также могут относиться к увеличению, усилению или продлению от нуля или неопределяемого или не обнаруживаемого уровня до уровня более нуля или уровня, который можно измерить или обнаружить.

Такие термины, как «снижение», «уменьшение» или «ингибирование» относятся к способности вызывать общее снижение уровня, предпочтительно на 5% или более, 10% или более, 20% или более, более предпочтительно 50% или более, и наиболее предпочтительно 75% или более. Это также включает полное или практически полное уменьшение, то есть уменьшение до нуля или практически до нуля.

Такие термины, как «перенос», «трансфекция» или «введение в клетки» используются в настоящей заявке взаимозаменяемо и относятся к введению нуклеиновых кислот, в частности экзогенных или гетерологичных нуклеиновых кислот, предпочтительно РНК (такой как мРНК) в клетку. Согласно настоящему изобретению клетка может формировать часть органа, ткани и/или организма. Введение нуклеиновых кислот, в частности экзогенных или гетерологичных нуклеиновых кислот, предпочтительно РНК (такой как мРНК), в клетку можно проводить in vivo или in vitro.

«Антигенпрезентирующие клетки» (APC) представляют собой клетки, которые осуществляют представление антигена, в частности пептидных фрагментов белковых антигенов, в ассоциации с молекулами MHC на своей клеточной поверхности. Т-клетки могут распознавать этот комплекс, используя свой Т-клеточный рецептор (TCR). Антигенпрезентирующие клетки обрабатывают антигены и презентируют их Т-клеткам. Антигенпрезентирующая клетка включает моноциты/макрофаги, B-клетки и дендритные клетки (DC), но не ограничивается ими. В предпочтительном варианте осуществления APC согласно настоящему изобретению представляют собой клетки млекопитающего, предпочтительно человека, мыши или крысы.

Непрофессиональные антигенпрезентирующие клетки не экспрессируют постоянно белки MHC класса II, необходимые для взаимодействия с наивными Т-клетками; они экспрессируются только при стимуляции непрофессиональных антигенпрезентирующих клеток определенными цитокинами, такими как IFNγ.

Профессиональные антигенпрезентирующие клетки очень эффективны при интернализации антигена либо посредством фагоцитоза, либо посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, а затем осуществляют на своей мембране представление фрагмента антигена, связанного с молекулой MHC класса II. Т-лимфоциты распознают комплекс антигена-молекулы MHC класса II и взаимодействуют с ним на мембране антигенпрезентирующей клетки. Затем антигенпрезентирующая клетка вырабатывает дополнительный костимулирующий сигнал, что приводит к активации Т-клетки. Экспрессия костимулирующих молекул является определяющей особенностью профессиональных антигенпрезентирующих клеток.

Основными типами профессиональных антигенпрезентирующих клеток являются дендритные клетки, которые имеют самый широкий диапазон презентации антигена и, вероятно, являются наиболее важными антигенпрезентирующими клетками, макрофагами, B-клетками и некоторыми активированными эпителиальными клетками.

Дендритные клетки (DC) представляют собой популяции лейкоцитов, которые презентируют антигены, захваченные в периферических тканях, Т-клеткам через пути презентации антигенов как MHC класса II, так и I. Хорошо известно, что дендритные клетки являются мощными индукторами иммунных ответов, и активация этих клеток является критическим шагом для индукции иммунитета.

Дендритные клетки удобно разделять на «незрелые» и «зрелые» клетки, что можно использовать как простой способ различия двух хорошо охарактеризованных фенотипов. Однако эту номенклатуру не следует истолковывать так, чтобы исключить все возможные промежуточные стадии дифференцировки.

Незрелые дендритные клетки характеризуются как антигенпрезентирующие клетки с высокой способностью к захвату и процессингу антигена, что коррелирует с высокой экспрессией рецептора Fcγ и рецептора маннозы. Зрелый фенотип обычно характеризуется более низкой экспрессией этих маркеров, но высокой экспрессией молекул клеточной поверхности, ответственных за активацию Т-клеток, таких как MHC класса I и класса II, молекул адгезии (например, CD54 и CD11) и костимулирующих молекул (например, CD40, CD80, CD86 и 4-1 BB).

Созревание дендритных клеток обозначается как состояние активации дендритных клеток, при котором такие антигенпрезентирующие дендритные клетки приводят к праймированию Т-клеток, в то время как презентация незрелыми дендритными клетками приводит к толерантности. Созревание дендритных клеток в основном вызывается биомолекулами с микробными особенностями, обнаруживаемыми рецепторами врожденной иммунной системы (бактериальной ДНК, вирусной РНК, эндотоксином и т.д.), провоспалительными цитокинами (TNF, IL-1, IFN), лигированием CD40 на поверхности дендритных клеток посредством CD40L, и веществами, высвобождаемыми из клеток, подвергающихся стрессовой гибели клеток. Дендритные клетки могут быть получены путем культивирования клеток костного мозга in vitro с цитокинами, такими как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и фактор некроза опухоли альфа.

Термин «иммунореактивная клетка» или «эффекторная клетка» в контексте настоящего изобретения относится к клетке, которая выполняет эффекторные функции во время иммунной реакции. «Иммунореактивная клетка» предпочтительно способна связывать антиген или клетку, характеризующуюся экспрессией и/или презентацией антигена или антигенного пептида, полученного из антигена и опосредующего иммунный ответ. Например, такие клетки секретируют цитокины и/или хемокины, убивают микробы, секретируют антитела, распознают инфицированные или раковые клетки и, возможно, устраняют такие клетки. Например, иммунореактивные клетки включают Т-клетки (цитотоксические Т-клетки, хелперные Т-клетки, Т-клетки, инфильтрирующие опухоль), В-клетки, клетки-природные-киллеры, нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки. Предпочтительно в контексте настоящего изобретения «иммунореактивные клетки» представляют собой Т-клетки, предпочтительно CD4+ и/или CD8+ Т-клетки.

Предпочтительно «иммунореактивная клетка» распознает антиген или антигенный пептид, полученный из антигена с некоторой степенью специфичности, в частности, если он презентирован в контексте молекул MHC, таких как на поверхности антигенпрезентирующих клеток или патологических клеток, таких как опухолевые клетки. Предпочтительно указанное распознавание позволяет клетке, которая распознает антиген или антигенный пептид, полученный из указанного антигена, быть чувствительной или реактивной. Если клетка представляет собой хелперные Т-клетки (CD4+ Т-клетки), несущие рецепторы, которые распознают антиген или антигенный пептид, полученный из антигена в контексте молекул MHC класса II, такая чувствительность или реактивность может включать высвобождение цитокинов и/или активацию CD8+ лимфоцитов (CTL) и/или B-клеток. Если клетка представляет собой CTL, такая реакция или реактивность может включать устранение клеток, представленных в контексте молекул MHC класса I, то есть клеток, характеризующихся презентацией антигена с MHC класса I, например, через апоптоз или перфорин-опосредованный лизис клеток. Согласно изобретению, чувствительность CTL может включать устойчивый приток кальция, деление клеток, продукцию цитокинов, таких как IFN-и TNF-α, повышающую регуляцию маркеров активации, таких как CD44 и CD69, и специфическое цитолитическое уничтожение антиген-экспрессирующих клеток-мишеней. Чувствительность CTL также можно определить с использованием искусственного репортера, который точно указывает чувствительность CTL. Такие CTL, которые распознают антиген или антигенный пептид, полученный из антигена, и являются чувствительными или реактивными, также называются здесь «антиген-чувствительными CTL». Если клетка является В-клеткой, такая реакция может включать высвобождение иммуноглобулинов.

Термин «Т-клетка» или «Т-лимфоцит» относится к клеткам, полученным из тимуса, которые участвуют в различных клеточно-опосредованных иммунных реакциях, и включает Т-хелперные клетки (CD4+ Т-клетки) и цитотоксические Т-клетки (CTL, CD8+ Т-клетки), которые включают цитолитические Т-клетки.

Т-клетки принадлежат к группе белых кровяных телец, известных как лимфоциты, и играют центральную роль в клеточном иммунитете. Их можно отличить от других типов лимфоцитов, таких как В-клетки и клетки-природные киллеры, по наличию на их клеточной поверхности специального рецептора, называемого Т-клеточным рецептором (TCR). Тимус - главный орган, ответственный за созревание Т-клеток. Было обнаружено несколько различных популяций Т-клеток, каждая из которых выполняет свою функцию.

Т-хелперы помогают другим лейкоцитам в иммунологических процессах, включая созревание В-клеток в плазматические клетки и активацию цитотоксических Т-клеток и макрофагов, среди других функций. Эти клетки также известны как CD4+ Т-клетки, потому что они экспрессируют белок CD4 на своей поверхности. Хелперные Т-клетки активируются при презентации пептидных антигенов молекулами MHC класса II, которые экспрессируются на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC). После активации они быстро делятся и выделяют небольшие белки, называемые цитокинами, которые регулируют активный иммунный ответ или способствуют ему.

Цитотоксические Т-клетки разрушают инфицированные вирусом клетки и опухолевые клетки, а также участвуют в отторжении трансплантата. Эти клетки также известны как CD8+ Т-клетки, поскольку они экспрессируют гликопротеин CD8 на своей поверхности. Эти клетки распознают свои мишени, связываясь с антигеном, ассоциированным с MHC класса I, который присутствует на поверхности почти каждой клетки организма.

У большинства Т-клеток есть Т-клеточный рецептор (TCR), существующий в виде комплекса нескольких белков. Фактический Т-клеточный рецептор состоит из двух отдельных пептидных цепей, которые получены из независимых генов Т-клеточного рецептора альфа- и бета (TCRα и TCRβ) и называются цепями α- и β-TCR. γδ Т-клетки (гамма-дельта-Т-клетки) представляют собой небольшую субпопуляцию Т-клеток, которые обладают особым Т-клеточным рецептором (TCR) на своей поверхности. Однако в γδ Т-клетках TCR состоит из одной γ-цепи и одной δ-цепи. Эта группа Т-клеток встречается гораздо реже (2% от общего количества Т-клеток), чем αβ Т-клетки.

Структура Т-клеточного рецептора очень похожа на Fab-фрагменты иммуноглобулина, которые представляют собой области, определяемые как комбинированные легкие и тяжелые цепи плеча антитела. Каждая цепь TCR является членом суперсемейства иммуноглобулинов и обладает одним N-концевым иммуноглобулиновым (Ig)-вариабельным (V) доменом, одним Ig-константным (C) доменом, трансмембранной областью и коротким цитоплазматическим хвостом на С-конце. Вариабельный домен как α-цепи, так и β-цепи TCR имеет три гипервариабельных или определяющих комплементарность области (CDR), тогда как вариабельная область β-цепи имеет дополнительную область гипервариабельности (HV4), которая обычно не контактирует с антигеном и поэтому не считается CDR. CDR3 является основной CDR, ответственной за распознавание процессированного антигена, хотя было показано, что CDR1 α-цепи взаимодействует с N-концевой частью антигенного пептида, тогда как CDR1 β-цепи взаимодействует с C-концевой частью пептида. Считается, что CDR2 распознает MHC. Считается, что CDR4 β-цепи не участвует в распознавании антигена, но было показано, что она взаимодействует с суперантигенами. Константный домен домена TCR состоит из коротких соединительных последовательностей, в которых остаток цистеина образует дисульфидные связи, которые образуют связь между двумя цепями.

Термин «мононуклеарная клетка периферической крови» или «PBMC» относится к клетке периферической крови, имеющей круглое ядро. Эти клетки состоят из лимфоцитов (Т-клетки, В-клетки, NK-клетки) и моноцитов, тогда как эритроциты и тромбоциты не имеют ядер, а гранулоциты (нейтрофилы, базофилы и эозинофилы) имеют многодольчатые ядра. Эти клетки могут быть извлечены из цельной крови с помощью фиколла и градиентного центрифугирования, при котором кровь разделяется на верхний слой плазмы, за которым следует слой PBMC и нижняя фракция полиморфно-ядерных клеток (таких как нейтрофилы и эозинофилы) и эритроцитов.

Термин «главный комплекс гистосовместимости» и сокращение «MHC» включают молекулы MHC класса I и MHC класса II и относятся к комплексу генов, который встречается у всех позвоночных. Белки или молекулы MHC важны для передачи сигналов между лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками или патологическими клетками в иммунных реакциях, где белки или молекулы MHC связывают пептиды и презентируют их для распознавания рецепторами Т-клеток. Белки, кодируемые MHC, экспрессируются на поверхности клеток и отображают как собственные антигены (пептидные фрагменты из самой клетки), так и чужеродные антигены (например, фрагменты вторгшихся микроорганизмов) для Т-клетки.

Область MHC делится на три подгруппы: класс I, класс II и класс III. Белки MHC класса I содержат α-цепь и β2-микроглобулин (не часть MHC, кодируемую хромосомой 15). Они презентируют фрагменты антигена цитотоксическим Т-клеткам. На большинстве клеток иммунной системы, особенно на антигенпрезентирующих клетках, белки MHC класса II содержат α- и β-цепи и презентируют фрагменты антигена Т-хелперам. Область MHC класса III кодирует другие иммунные компоненты, такие как компоненты комплемента и некоторые компоненты, которые кодируют цитокины.

У людей гены в области MHC, которые кодируют антигенпрезентирующие белки на поверхности клетки, называются генами человеческого лейкоцитарного антигена (HLA). Однако аббревиатура MHC часто используется для обозначения генных продуктов HLA. Гены HLA включают девять так называемых классических генов MHC: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA и HLA-DRB1.

В одном предпочтительном варианте осуществления всех аспектов изобретения, относящихся к иммунотерапии или иммунным ответам, молекула MHC представляет собой молекулу HLA.

Термин «иммунные эффекторные функции» или «эффекторные функции» в контексте настоящего изобретения включает любые функции, опосредуемые компонентами иммунной системы, которые приводят, например, к уничтожению клеток. Предпочтительно эффекторные функции иммунной системы в контексте настоящего изобретения представляют собой эффекторные функции, опосредованные Т-клетками. Такие функции включают в случае хелперной Т-клетки (CD4+ Т-клетки) распознавание антигена или антигенного пептида, полученного из антигена в контексте молекул MHC класса II рецепторами Т-клеток, высвобождение цитокинов и/или активацию CD8+ лимфоцитов (CTL) и/или B-клеток, а в случае CTL распознавание антигена или антигенного пептида, полученного из антигена в контексте молекул MHC класса I рецепторами T-клеток, устранение клеток, презентированных в контексте молекул MHC класса I, то есть клеток, характеризующихся презентацией антигена с MHC класса I, например, посредством апоптоза или перфорин-опосредованного лизиса клеток, продукции цитокинов, таких как IFN-γ и TNF-α, и специфического цитолитического уничтожения антиген-экспрессирующих клеток-мишеней.

Термин «иммунные эффекторные клетки» в контексте настоящего изобретения относится к клеткам, которые проявляют эффекторные функции во время иммунной реакции. «Иммунные эффекторные клетки» предпочтительно способны связывать антиген или клетку, характеризующуюся презентацией антигена и опосредованной иммунным ответом. Например, такие клетки секретируют цитокины и/или хемокины, убивают микробы, секретируют антитела, распознают инфицированные или раковые клетки и, возможно, удаляют такие клетки. Например, иммунные эффекторные клетки включают Т-клетки (цитотоксические Т-клетки, хелперные Т-клетки, Т-клетки, инфильтрирующие опухоль), В-клетки, природные киллерные клетки, нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки. Предпочтительно в контексте настоящего изобретения «иммунные эффекторные клетки» представляют собой Т-клетки, предпочтительно клетки CD4+ и/или CD8+.

Предпочтительно «иммунная эффекторная клетка» распознает антиген или антигенный пептид, полученный из указанного антигена, с некоторой степенью специфичности, в частности, если он презентирован в контексте молекул MHC, таких как поверхность антигенпрезентирующих клеток или патологических клеток, таких как опухолевые клетки. Предпочтительно указанное распознавание позволяет клетке, которая распознает антиген или антигенный пептид, полученный из указанного антигена, быть чувствительной. Если клетка представляет собой хелперную Т-клетку (CD4+ Т-клетку), несущую рецепторы, которые распознают антиген или антигенный пептид, полученный из указанного антигена в контексте молекул МНС класса II, такая реакция может включать высвобождение цитокинов и/или активацию CD8+ лимфоцитов (CTL) и/или B-клеток. Если клетка представляет собой CTL, такая реакция может включать элиминацию клеток, презентированных в контексте молекул MHC класса I, то есть клеток, характеризующихся презентацией антигена с MHC класса I, например посредством апоптоза или перфорин-опосредованного лизиса клеток. Такие CTL, которые распознают антиген или антигенный пептид, полученный из указанного антигена, и являются чувствительными, также называются в настоящей заявке «антиген-чувствительными CTL». Если клетка является В-клеткой, такая реакция может включать высвобождение иммуноглобулинов.

Термин «период полужизни» относится к периоду времени, который необходим для устранения половины активности, количества или числа молекул. В контексте настоящего изобретения период полужизни РНК (предпочтительно мРНК) является показателем стабильности указанной РНК. Период полужизни РНК может влиять на «продолжительность экспрессии» РНК. Можно ожидать, что РНК, имеющая длительный период полужизни, будет экспрессироваться в течение длительного периода времени.

Конечно, если в соответствии с настоящим изобретением необходимо снизить стабильность и/или эффективность трансляции РНК, можно модифицировать РНК таким образом, чтобы вмешаться в функцию элементов, увеличивающих стабильность и/или эффективность трансляции РНК, как описано выше.

Термины «пациент», «индивидуум», «субъект» или «животное» используются взаимозаменяемо и относятся к позвоночным. Например, позвоночные животные в контексте настоящего изобретения - это млекопитающие, птицы (например, домашняя птица), рептилии, земноводные, костистые рыбы и хрящевые рыбы, в частности одомашненные животные из любых из вышеперечисленных, а также животные в неволе, такие как животные зоопарков, и предпочтительно млекопитающие. Млекопитающие в контексте настоящего изобретения включают людей, приматов, не являющихся людьми, домашних млекопитающих, таких как собаки, кошки, овцы, крупный рогатый скот, козы, свиньи, лошади и т.д., лабораторных млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, морские свинки и т.д., а также млекопитающих в неволе, таких как млекопитающие зоопарков, но не ограничиваются ими. Термин «животное», используемый в настоящей заявке, также включает людей. Термин «субъект» может также включать пациента, то есть животное, предпочтительно человека, страдающего заболеванием, предпочтительно заболеванием, описанным в настоящей заявке.

Согласно изобретению термин «хронический пациент» или «длительно болеющий пациент» относится к пациенту, страдающему хроническим заболеванием или нарушением. «Хроническое заболевание или нарушение» представляет собой заболевание или нарушение, которое является стойким и/или чьи эффекты (например, симптомы) сохраняются в течение по меньшей мере 3 недель, например по меньшей мере 4 недель, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 3 лет, по меньшей мере 4 лет, по меньшей мере 5 лет или по меньшей мере 10 лет, например, до 4 недель, до 1 месяца, до 2 месяцев, до 3 месяцев, до 4 месяцев, до 5 месяцев, до 6 месяцев, до 12 месяцев, до 2 лет, до 3 года или до 4 лет, до 5 лет, до 10 лет или в течение всей жизни пациента.

В соответствии с изобретением термин «опухоль» или «опухолевое заболевание» относится к набуханию или поражению, вызванному аномальным ростом клеток (называемых неопластическими клетками или опухолевыми клетками). Под «опухолевой клеткой» подразумевается аномальная клетка, которая растет путем быстрой неконтролируемой пролиферации клеток и продолжает расти после прекращения стимулов, инициировавших новый рост. Опухоли демонстрируют частичное или полное отсутствие структурной организации и функциональной координации с нормальной тканью и обычно образуют отдельную массу ткани, которая может быть доброкачественной, предраковой или злокачественной.

Предпочтительно опухолевое заболевание согласно изобретению представляет собой раковое заболевание, т.е. злокачественное заболевание, а опухолевая клетка представляет собой раковую клетку. Предпочтительно опухолевое заболевание характеризуется клетками, в которых антиген, то есть опухолевый антиген, экспрессируется или аномально экспрессируется. Предпочтительно опухолевое заболевание или опухолевые клетки характеризуются презентацией опухолевого антигена с MHC класса I.

«Аномальная экспрессия» означает, согласно изобретению, что экспрессия изменена, предпочтительно повышена, по сравнению с состоянием у здорового человека. Повышение экспрессии относится к увеличению по меньшей мере на 10%, в частности по меньшей мере на 20%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 100%. В одном варианте осуществления экспрессия обнаруживается только в патологической ткани, в то время как экспрессия в здоровой ткани подавляется.

Предпочтительно опухолевое заболевание согласно изобретению представляет собой рак, причем термин «рак» согласно изобретению включает лейкозы, семиномы, меланомы, тератомы, лимфомы, нейробластомы, глиомы, рак прямой кишки, рак эндометрия, рак почки, рак надпочечника, рак щитовидной железы, гемобластоз, рак кожи, злокачественную опухоль головного мозга, рак шейки матки, рак кишечника, рак печени, рак толстой кишки, рак желудка, рак тонкой кишки, рак головы и шеи, рак желудочно-кишечного тракта, рак лимфатических узлов, рак пищевода, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак уха, носа и горла (ЛОР), рак молочной железы, рак простаты, рак матки, рак яичника и рак легкого, и их метастазы. Их примерами являются карциномы легкого, карциномы молочной железы, карциномы простаты, карциномы толстой кишки, почечно-клеточные карциномы, карциномы шейки матки или метастазы типов рака или опухолей, описанных выше. Термин «рак» в соответствии с изобретением также включает метастазы рака.

В одном варианте осуществления РНК согласно изобретению представляет собой (модифицированную) РНК, в частности (модифицированную) мРНК, кодирующую пептид или белок. Согласно изобретению, термин «РНК, кодирующая пептид или белок» означает, что РНК, если она присутствует в подходящей среде, предпочтительно внутри клетки, может управлять сборкой аминокислот для получения, т.е. экспрессии, пептида или белка в процессе трансляции. Предпочтительно РНК (такая как мРНК) согласно изобретению способна взаимодействовать с клеточным механизмом трансляции, обеспечивая трансляцию пептида или белка.

«Кодирование» относится к неотъемлемому свойству конкретных последовательностей нуклеотидов в нуклеиновой кислоте служить в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих либо определенную последовательность нуклеотидов, либо определенную последовательность аминокислот. Таким образом, нуклеиновая кислота кодирует белок, если экспрессия (трансляция и при необходимости транскрипция) нуклеиновой кислоты продуцирует белок в клетке или другой биологической системе.

Термин «экспрессия» используется в соответствии с изобретением в его самом общем значении и включает продукцию РНК и/или пептидов или белков, например, путем транскрипции и/или трансляции. Что касается РНК, термин «экспрессия» или «трансляция» относится, в частности, к продукции пептидов или белков. Он также включает частичную экспрессию нуклеиновых кислот. Более того, экспрессия может быть временной или стабильной.

В контексте настоящего изобретения термин «транскрипция» относится к процессу, в котором генетический код в последовательности ДНК транскрибируется в РНК. Впоследствии РНК может быть транслирована в белок. Согласно настоящему изобретению термин «транскрипция» включает «транскрипцию in vitro», где термин «транскрипция in vitro» относится к процессу, в котором РНК, в частности мРНК, синтезируется in vitro в бесклеточной системе, предпочтительно с использованием соответствующих экстрактов клеток. Предпочтительно клонирующие векторы применяются для генерации транскриптов. Эти клонирующие векторы обычно обозначаются как векторы транскрипции и согласно настоящему изобретению охватываются термином «вектор». Согласно настоящему изобретению РНК, используемая в настоящем изобретении, может быть получена путем транскрипции in vitro соответствующей ДНК-матрицы. Промотор для контроля транскрипции может быть любым промотором любой РНК-полимеразы. Конкретными примерами РНК-полимераз являются РНК-полимеразы Т7, Т3 и SP6. Предпочтительно транскрипция in vitro согласно изобретению контролируется промотором Т7 или SP6. Матрица ДНК для транскрипции in vitro может быть получена путем клонирования нуклеиновой кислоты, в частности кДНК, и введения ее в соответствующий вектор для транскрипции in vitro. кДНК может быть получена обратной транскрипцией РНК.

Векторная матрица, содержащая кДНК, может содержать векторы, несущие разные вставки кДНК, которые после транскрипции приводят к образованию популяции разных молекул РНК, при необходимости способных экспрессировать разные пептиды или белки, или могут содержать векторы, несущие только один вид вставки кДНК, которая после транскрипции приводит только к популяции одного вида РНК, способного экспрессировать только один пептид или белок. Таким образом, можно получить РНК, способную экспрессировать только один пептид или белок, или получить композиции из разных РНК, такие как библиотеки РНК и РНК цельной клетки, способные экспрессировать более одного пептида или белка, например, композицию из пептидов или белков. Настоящее изобретение предусматривает введение всей такой РНК в клетки.

Используемый в настоящей заявке термин «вектор» включает любые векторы, известные специалисту в данной области техники, включая плазмидные векторы, космидные векторы, фаговые векторы, такие как лямбда-фаг, вирусные векторы, такие как аденовирусные или бакуловирусные векторы, ретро- или лентивирусные векторы, транспозоны или искусственные хромосомные векторы, такие как бактериальные искусственные хромосомы (BAC), искусственные хромосомы дрожжей (YAC) или искусственные хромосомы P1 (PAC). Указанные векторы включают векторы экспрессии, а также векторы клонирования. Векторы экспрессии включают плазмиды, а также вирусные векторы и обычно содержат необходимую кодирующую последовательность и соответствующие последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине (например, бактериях, дрожжах, растениях, насекомых или млекопитающих) или в системах экспрессии in vitro. Клонирующие векторы обычно используются для конструирования и амплификации определенного необходимого фрагмента ДНК и могут не иметь функциональных последовательностей, требующихся для экспрессии необходимых фрагментов ДНК.

Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид или белок, может быть клонирована в несколько типов векторов. Однако настоящее изобретение не следует рассматривать как ограничиваемое каким-либо конкретным вектором. Напротив, настоящее изобретение следует рассматривать как охватывающее большое количество векторов, которые легко доступны и хорошо известны в данной области техники. В конкретных вариантах осуществления вектор выбран из группы, состоящей из вирусного вектора, бактериального вектора и вектора из клеток млекопитающих. Многие такие системы являются коммерческими и широко доступны.

Вектор может быть предоставлен клетке в форме вирусного вектора. Технология вирусных векторов хорошо известна в данной области техники. Вирусы, которые можно использовать в качестве векторов, включают ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса и лентивирусы, но не ограничиваются ими. Предпочтительно вирус представляет собой хелпер-зависимый аденовирус (HD-Ad). Как правило, подходящий вектор содержит ориджин репликации, функционирующий по меньшей мере в одном организме, промоторную последовательность, удобные сайты рестрикционных эндонуклеаз и один или несколько селектируемых маркеров.

Специалисты в области молекулярной биологии обычно знают, как использовать промоторы, энхансеры и комбинации типов клеток для экспрессии белка. Используемые промоторы могут быть конститутивными, тканеспецифическими, индуцибельными и/или полезными в соответствующих условиях для управления высоким уровнем экспрессии введенного сегмента нуклеиновой кислоты, кодирующего пептид или белок. Промотор может быть гетерологичным или эндогенным. Конститутивные промоторные последовательности, которые можно использовать в соответствии с изобретением, включают немедленную раннюю цитомегаловирусную (CMV) промоторную последовательность, ранний промотор вируса обезьяны 40 (SV40), вирус опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), промотор вируса Молони, промотор вируса лейкоза птиц, немедленный ранний промотор вируса Эпштейна-Барр, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы гена человека, такие как, без ограничения, промотор актина, промотор миозина, промотор гемоглобина и промотор мышечного креатина, но не ограничиваются ими. Кроме того, изобретение не должно ограничиваться использованием конститутивных промоторов. Индуцибельные промоторы также рассматриваются как часть изобретения. Использование индуцибельного промотора в изобретении обеспечивает молекулярный переключатель, способный включать экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой она функционально связана, когда такая экспрессия необходима, или выключать экспрессию, когда экспрессия нежелательна. Примеры индуцибельных промоторов включают металлотиониновый промотор, глюкокортикоидный промотор, прогестероновый промотор и тетрациклиновый промотор, но не ограничиваются ими. Кроме того, изобретение включает использование тканеспецифического промотора, который активен только в необходимой ткани. Тканеспецифические промоторы хорошо известны в данной области техники, и включают промотор HER-2 и промоторные последовательности, связанные с PSA, но не ограничиваются ими.

Чтобы оценить экспрессию пептида или белка, вектор экспрессии, который должен быть введен в клетку, может также содержать либо селектируемый маркерный ген, либо репортерный ген, либо и то, и другое, чтобы облегчить идентификацию и отбор экспрессирующих клеток из популяции клеток, которые предназначены для трансфицирования или инфицирования вирусными векторами. В других вариантах осуществления селектируемый маркер может находиться на отдельном участке ДНК и использоваться в процедуре котрансфекции. Как селектируемые маркеры, так и репортерные гены могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями для обеспечения экспрессии в клетках. Подходящие селектируемые маркеры известны в данной области техники и включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как neo и т.п. Гены-репортеры используются для идентификации потенциально трансфицированных клеток и для оценки функциональности регуляторных последовательностей. Репортерные гены, кодирующие легко анализируемые белки, хорошо известны в данной области техники. В общем, репортерный ген - это ген, который не присутствует или не экспрессируется организмом или тканью реципиента и который кодирует белок, экспрессия которого проявляется некоторым легко обнаруживаемым свойством, например, ферментативной активностью. Экспрессию репортерного гена анализируют в подходящее время после того, как нуклеиновая кислота была введена в клетки-реципиенты. Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, бета-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу или ген зеленого флуоресцентного белка.

Вектор можно легко ввести в клетку любым способом в данной области техники. Например, вектор экспрессии может быть перенесен в клетку физическими, химическими или биологическими способами. Физические способы введения нуклеиновой кислоты в клетку включают осаждение фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и тому подобное. Способы получения клеток, содержащих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, хорошо известны в данной области техники. См., например, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), и Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).

Биологические способы введения представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетку включают использование векторов ДНК и РНК. Вирусные векторы, и особенно ретровирусные векторы, стали наиболее широко используемым методом встраивания генов в клетки млекопитающих, например, в клетки человека. Другие вирусные векторы могут происходить из лентивирусов, поксвирусов, вируса простого герпеса I, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов и т.п.

Химические средства для введения нуклеиновой кислоты в клетку включают коллоидные дисперсионные системы, такие как комплексы макромолекул, нанокапсулы, микросферы, шарики и системы на основе липидов, включая эмульсии масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой для использования в качестве средства доставки in vitro и in vivo является липосома (т.е. искусственная мембранная везикула). Приготовление и использование таких систем хорошо известно в данной области техники.

Независимо от метода, используемого для введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетку или иного способа повышения клеточного уровня пептида или белка в клетке, чтобы подтвердить присутствие и/или количество пептида или белка, или кодирующей его нуклеиновой кислоты в клетке, могут быть выполнены различные анализы. Такие анализы включают, например, Саузерн- и Нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР и ПЦР, а также анализы для обнаружения присутствия или отсутствия конкретного пептида, например, иммунологическими методами (ИФА и Вестерн-блоттинг).

Термин «клетка» означает любую клетку, которая может быть трансфицирована РНК (предпочтительно мРНК), причем трансфицируемая РНК предпочтительно представляет собой экзогенную или гетерологичную РНК. Клетка может быть получена от любого субъекта и в одном варианте осуществления может быть получена от пациента, страдающего нарушением или заболеванием. Если клетка получена от пациента, страдающего нарушением или заболеванием, клетка может содержать генетический материал, который гомологичен вводимой РНК, но в результате пептид или белок имеют пониженную активность. Снижение активности может быть результатом (i) пониженной экспрессии пептида или белка (т.е. пептид или белок полностью функционален, но его количество уменьшено) или (ii) присутствия одной или нескольких мутаций в аминокислотной последовательности экспрессируемого пептида или белка (т.е. пептид или белок не полностью функционален). Например, такой гомологичный генетический материал, который приводит к пептиду или белку, обладающему пониженной активностью, может быть геном, содержащим одну или несколько мутаций таким образом, что (i) экспрессия указанного гена, содержащего одну или несколько мутаций, снижается или подавляется, что приводит к уменьшенному количеству полностью функционального пептида или белка и/или (ii) аминокислотная последовательность пептида или белка, кодируемого указанным геном, содержит одну или несколько мутаций, что приводит к не полностью функциональному (или нефункциональному) пептиду или белку.

В случае, если в клетке или у пациента экспрессируется полностью функциональный пептид или белок, но в количестве, слишком низком для поддержания функций клетки или пациента (например, приводя к развитию заболевания или нарушения у пациента, у которого эта клетка содержится), будет полезна терапия для замены или дополнения указанного пептида или белка (заместительная белковая терапия). Такая заместительная белковая терапия может включать этап введения РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный пептид или белок (или композицию, такую как фармацевтическая композиция, содержащая такую РНК), пациенту, или, альтернативно, этапы (а) переноса РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный пептид или белок, в клетку (которая может быть получена от пациента), и (b) введение указанной трансфицированной клетки пациенту.

В случае, если снижение активности пептида или белка у пациента (и, таким образом, развитие заболевания или нарушения) связано с наличием одной или нескольких мутаций в аминокислотной последовательности указанного пептида или белка (т.е. пептид или белок не полностью функционален), может быть полезна геномно-инженерная терапия. Такая геномно-инженерная терапия может включать этап введения пациенту (i) РНК (в частности, РНК из настоящего изобретения), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую геномно-инженерный белок, и (ii) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок в его нативной (т.е. немутантной) форме.

В альтернативном варианте может быть полезна терапия с генетическим перепрограммированием, в частности для пациентов, страдающих заболеванием или нарушением, которое вызывает истощение или исчезновение клеток, продуцирующих необходимый пептид или белок (например, гормон, такой как инсулин). Например, такая терапия с генетическим перепрограммированием может включать этапы (а) введения РНК (в частности, РНК по настоящему изобретению), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую один или несколько факторов перепрограммирования, в соматические клетки; (b) создание условий для развития клеток, имеющих характеристики стволовых клеток; и (c) введение пациенту клеток, имеющих характеристики стволовых клеток. В предпочтительном варианте осуществления соматические клетки являются аутологичными по отношению к пациенту.

Термин «трансляция» в соответствии с изобретением относится к процессу в рибосомах клетки, посредством которого цепь мРНК направляет сборку последовательности аминокислот с образованием пептида или белка. Трансляция может осуществляться in vivo (например, в клетке, ткани или организме) или in vitro (например, с использованием бесклеточной системы).

Последовательности контроля экспрессии или регуляторная последовательность, которые, согласно изобретению, могут быть функционально связаны с нуклеиновой кислотой, могут быть гомологичными или гетерологичными по отношению к нуклеиновой кислоте. Кодирующая последовательность и регуляторная последовательность связаны вместе «функционально», если они связаны вместе ковалентно, так что транскрипция или трансляция кодирующей последовательности находится под контролем или под влиянием регуляторной последовательности. Если кодирующая последовательность должна транслироваться в функциональный белок с функциональной связью регуляторной последовательности с кодирующей последовательностью, индукция регуляторной последовательности приводит к транскрипции кодирующей последовательности, не вызывая сдвига рамки считывания в кодирующей последовательности или невозможность транслировать кодирующую последовательность в необходимый белок или пептид.

Термин «последовательность контроля экспрессии» или «регуляторная последовательность» включает, в соответствии с изобретением, промоторы, последовательности, связывающие рибосомы, и другие элементы контроля, которые контролируют транскрипцию нуклеиновой кислоты или трансляцию производной РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения регуляторные последовательности можно контролировать. Точная структура регуляторных последовательностей может варьироваться в зависимости от вида или типа клетки, но обычно включает 5'-нетранскрибируемые и 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, которые участвуют в инициации транскрипции или трансляции, такие как ТАТА-бокс, кэппинг-последовательность, СААТ-последовательность и т.п. В частности, 5'-нетранскрибируемые регуляторные последовательности содержат промоторную область, которая включает промоторную последовательность для контроля транскрипции функционально связанного гена. Регуляторные последовательности могут также включать энхансерные последовательности или активаторные последовательности, расположенные выше.

Согласно изобретению предпочтительно нуклеиновая кислота, такая как РНК (предпочтительно мРНК), кодирующая пептид или белок, однажды поглощенная или введенная, то есть трансфицированная или трансдуцированная, в клетку, которая может присутствовать in vitro или у субъекта, приводит к экспрессии указанного пептида или белка. Клетка может экспрессировать кодируемый пептид или белок внутриклеточно (например, в цитоплазме и/или в ядре), может секретировать кодируемый пептид или белок, или может экспрессировать его на поверхности.

В соответствии с изобретением такие термины, как «экспрессирующая нуклеиновую кислоту» и «кодирующая нуклеиновую кислоту» или аналогичные термины, используются в настоящей заявке взаимозаменяемо и в отношении конкретного пептида или полипептида, означают, что нуклеиновая кислота, если она присутствует в подходящей среде, предпочтительно внутри клетки, может быть экспрессирована с образованием указанного пептида или полипептида.

Согласно изобретению РНК должна переноситься в клетки либо in vitro, либо in vivo, например путем введения РНК интраперитонеально, внутримышечно или интрадермально, или, если клетки представляют собой незрелые антигенпрезентирующие клетки, в лимфатическую систему (такую как в лимфатические узлы). Согласно настоящему изобретению для введения РНК в клетки можно использовать любой метод, который подходит для переноса РНК в клетки. Предпочтительно РНК трансфицируют в клетки стандартными методами. Такие методы включают трансфекцию преципитатов нуклеиновых кислот фосфатом кальция, трансфекцию нуклеиновых кислот, которые связаны с ДЭАЭ, трансфекцию или инфицирование вирусами, несущими представляющие интерес нуклеиновые кислоты, электропорацию, липофекцию и микроинъекцию. Согласно настоящему изобретению введение нуклеиновой кислоты осуществляют либо в виде депротеинизированной нуклеиновой кислоты, либо в комбинации с реагентом для введения. Предпочтительно введение нуклеиновых кислот осуществляют в форме депротеинизированных нуклеиновых кислот. Предпочтительно РНК вводят в сочетании со стабилизирующими веществами, такими как ингибиторы РНКаз. В особо предпочтительном варианте осуществления РНК и/или композиции по настоящему изобретению вводят в виде депротеинизированной РНК, предпочтительно интраперитонеально, внутримышечно, путем интранодальной инъекции или трансдермальным введением. В случае антигенпрезентирующих клеток (таких как незрелые антигенпрезентирующие клетки), предпочтительно дендритных клеток (таких как незрелые дендритные клетки), общепринятый метод трансфекции не является абсолютно необходимым для введения депротеинизированной РНК в указанные клетки, поскольку, в частности, незрелые антигенпрезентирующие клетки, такие как незрелые дендритные клетки, способны захватывать депротеинизированную РНК за счет макропиноцитоза. Предпочтительно введение РНК, кодирующей представляющий интерес пептид или белок, в клетку приводит к экспрессии указанного пептида или представляющего интерес белка в клетке. В конкретных вариантах осуществления является предпочтительным таргетинг нуклеиновых кислот на конкретные клетки. В таких вариантах осуществления носитель, который применяется для введения нуклеиновой кислоты в клетку (например, ретровирус или липосома), представляет собой молекулу таргетинга. Например, молекула, такая как антитело, специфичное к белку поверхностной мембраны на клетке-мишени, или лиганд рецептора на клетке-мишени, может быть включена в носитель нуклеиновой кислоты или может быть связана с ним. В случае, если нуклеиновую кислоту вводят с помощью липосом, белки, которые связываются с белком поверхностной мембраны, который связан с эндоцитозом, могут быть включены в липосомную композицию для обеспечения таргетинга и/или поглощения. Такие белки включают капсидные белки или их фрагменты, которые специфичны для определенного типа клеток, антитела против белков, которые интернализуются, белки, которые нацелены на внутриклеточное местоположение и т.д.

Используемый в настоящей заявке термин «пептид» включает олиго- и полипептиды и относится к веществам, содержащим два или более, предпочтительно 3 или более, предпочтительно 4 или более, предпочтительно 6 или более, предпочтительно 8 или более, предпочтительно 10 или более, предпочтительно 13 или более, предпочтительно 16 или более, предпочтительно 21 или более, и предпочтительно до 8, 10, 20, 30, 40 или 50, в частности 100 аминокислот, ковалентно связанных пептидными связями. Термин «белок» предпочтительно относится к большим пептидам, предпочтительно к пептидам с более чем 100 аминокислотными остатками, но в целом термины «пептид» и «белок» являются синонимами и используются в настоящей заявке взаимозаменяемо.

Термин «иммунологически активное соединение» относится к любому соединению, изменяющему иммунный ответ, предпочтительно путем индукции и/или подавления созревания иммунных клеток, индукции и/или подавления биосинтеза цитокинов, и/или изменения гуморального иммунитета путем стимуляции продукции антител В-клетками. Иммунологически активные соединения обладают сильной иммуностимулирующей активностью, включая, помимо прочего, противовирусную и противоопухолевую активность, а также могут подавлять другие аспекты иммунного ответа, например, сдвигать иммунный ответ с иммунного ответа TH2, что полезно для лечения широкого спектра заболеваний, опосредованных TH2. Иммунологически активные соединения могут быть полезны в качестве адъювантов вакцины.

В одном варианте осуществления РНК (например, мРНК), которая кодирует антиген, такой как ассоциированный с заболеванием антиген, вводят млекопитающему, в частности, если необходимо лечение млекопитающего, страдающего заболеванием, включающим или экспрессирующим антиген (ассоциированный с заболеванием антиген). РНК предпочтительно поглощается антигенпрезентирующими клетками млекопитающего (моноцитами, макрофагами, дендритными клетками или другими клетками). Образуется антигенный продукт трансляции РНК, и этот продукт экспонируется на поверхности клеток для распознавания Т-клетками. В одном варианте осуществления антиген или продукт, продуцируемый путем необязательной обработки, экспонируется на поверхности клетки в контексте молекул MHC для распознавания Т-клетками через их Т-клеточный рецептор, что приводит к их активации.

Термин «часть молекул MHC, которые презентируют представляющий интерес антиген» относится к фракции молекул MHC на поверхности антигенпрезентирующей клетки, которые нагружены, т.е. связаны с конкретным антигеном или антигенным пептидом, полученным из указанного антигена, по отношению к общему количеству молекул MHC на поверхности клетки. В предпочтительном варианте осуществления РНК, модифицированная 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, способна увеличивать часть молекул MHC, которые презентируют представляющий интерес антиген, на поверхности антигенпрезентирующей клетки, в которую была перенесена РНК. Это можно сравнить с РНК, которая не несет структуру 5'-кэп соединения по настоящему изобретению, в частности, с РНК, которая несет обычный кэп РНК.

Согласно изобретению термины «заболевание», «нарушение» и «состояние» используются в настоящей заявке взаимозаменяемо и относятся к любому патологическому состоянию, включая инфекционные заболевания (т.е. заболевания, вызванные патогеном), опухолевые заболевания и нежелательное воспаление.

Под «находящимся в группе риска» подразумевается индивидуум, т.е. пациент, у которого, как установлено, вероятность развития заболевания выше, чем обычно, по сравнению с населением в целом. Кроме того, индивидуум, который болел или имеет заболевание в настоящее время, является субъектом с повышенным риском развития заболевания, поскольку у такого субъекта может продолжаться развитие заболевания.

Термин «in vivo» относится к ситуации в субъекте.

Термин «аутологичный» используется для описания всего, что происходит от одного и того же субъекта. Например, «аутологичная клетка» относится к клетке, полученной от одного и того же субъекта. Такие процедуры полезны, потому что они преодолевают иммунологический барьер, который в противном случае привел бы к отторжению.

Термин «гетерологичный» используется для описания чего-либо, состоящего из нескольких различных элементов. Например, перенос костного мозга одного человека другому представляет собой гетерологичный трансплантат. Гетерологичный ген - это ген, полученный из источника, отличного от субъекта.

Используемый в настоящей заявке термин «ненуклеотидный линкер» означает любой линкер из двух нуклеозидов, который не является фосфатом или производным фосфата (например, фосфотиоатом, боранофосфатом, имидофосфатом, алкиленфосфатом, фосфодитиоатом, алкилфосфонатом, фосфотриэфиром или фосфорамидитом). Предпочтительно ненуклеотидный линкер представляет собой пептид, амин, алифатический углеводород (например, алкил) или ароматический углеводород, где углеводороды при необходимости могут включать одну или несколько функциональных групп, включая гидрокси, амино, тиол, тиоэфир, эфир, амид, тиоамид, сложный эфир, мочевину или тиомочевину, но не ограничиваясь ими. Конкретный пример таких ненуклеотидных линкеров включает алкильный линкер, но не ограничивается им. Алкильный линкер может быть разветвленным или неразветвленным, циклическим или ациклическим, замещенным или незамещенным, насыщенным или ненасыщенным, хиральным, ахиральным, или рацемической смесью. Алкильные линкеры могут иметь от 2 до 18 атомов углерода, например, от 3 до 9 атомов углерода. Некоторые алкильные линкеры включают одну или несколько функциональных групп, включая гидрокси, амино, тиол, тиоэфир, простой эфир, амид, тиоамид, сложный эфир, мочевину и тиоэфир, но не ограничиваясь ими. Такие алкильные линкеры могут включать 1-пропанол, 1,2-пропандиол, 1,3-пропандиол, 1,2,3-пропантриол, триэтиленгликоль, гексаэтиленгликоль, полиэтиленгликольные линкеры (например, [-O-CH₂CH₂-]_c, (c = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9)), метильные линкеры, этильные линкеры, пропильные линкеры, бутильные линкеры или гексильные линкеры, но не ограничиваются этим. В некоторых вариантах осуществления ненуклеотидный линкер представляет собой глицерин или гомолог глицерина формулы HO-(CH₂)_o-CH(OH)-(CH₂)_p-OH, где o и p независимо представляют собой целые числа от 1 до 6, например, от 1 до 4 или от 1 до 3. В некоторых других вариантах осуществления ненуклеотидный линкер представляет собой производное 1,3-диамино-2-гидроксипропана, например, имеющее формулу HO-(CH₂)_m-C(O)NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-NHC(OMCH₂)_m-OH, где каждый m независимо представляет собой целое число от 0 до 10, например, от 0 до 6, от 2 до 6 или от 2 до 4.

Термин «алкил» относится к монорадикалу насыщенного линейного или разветвленного углеводорода. Предпочтительно алкильная группа содержит от 1 до 20 атомов углерода, например, от 1 до 12 или от 1 до 10 атомов углерода, то есть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода, более предпочтительно от 1 до 8 атомов углерода, например от 1 до 6 или от 1 до 4 атомов углерода. Примеры алкильных групп включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил (например, н-бутил, изобутил, трет-бутил), пентил (например, н-пентил, изопентил, втор-пентил, неопентил), 1,2-диметилпропил, изоамил, н-гексил, изогексил, втор-гексил, 2,2-диметилбутил, н-гептил, изогептил, н-октил, 2-этилгексил, н-нонил, н-децил и т.п. «Замещенный алкил» означает, что один или несколько (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с алкильной группой, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например от 1 до 5, от 1 до 4, или от 1 до 3, или 1 или 2) атомов водорода алкильной группы замещены заместителем, отличным от водорода (когда замещено более одного атома водорода, заместители могут быть одинаковыми или разными). Предпочтительно заместитель, отличный от водорода, является заместителем 1-го уровня, заместителем 2-го уровня или заместителем 3-го уровня, как определено в настоящей заявке, таким как галоген или необязательно замещенный арил. Примеры замещенного алкила включают трифторметил, 2,2,2-трихлорэтил, арилалкил (также называемый «аралкил», например, бензил, хлор(фенил) метил, 4-метилфенилметил, (2,4-диметилфенил)метил, о-фторфенилметил, 2-фенилпропил, 2-, 3- или 4-карбоксифенилалкил) или гетероарилалкил (также называемый «гетероаралкил»).

Термин «алкенил» относится к монорадикалу ненасыщенного линейного или разветвленного углеводорода, имеющего по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод. Как правило, максимальное количество двойных связей углерод-углерод в алкенильной группе может быть равно целому числу, которое рассчитывают путем деления количества атомов углерода в алкенильной группе на 2 и, если количество атомов углерода в алкенильной группе является нечетным, округляя результат деления до следующего целого числа. Например, для алкенильной группы, содержащей 9 атомов углерода, максимальное количество двойных связей углерод-углерод составляет 4. Предпочтительно алкенильная группа имеет от 1 до 4, то есть 1, 2, 3 или 4 двойных углерод-углеродных связей. Предпочтительно алкенильная группа содержит от 2 до 20 атомов углерода, например, от 2 до 12 или от 2 до 10 атомов углерода, т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода, более предпочтительно от 2 до 8 атомов углерода, например от 2 до 6 атомов углерода или от 2 до 4 атомов углерода. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления алкенильная группа содержит от 2 до 10 атомов углерода и 1, 2, 3, 4 или 5 двойных связей углерод-углерод, более предпочтительно она содержит от 2 до 8 атомов углерода и 1, 2, 3, или 4 двойные связи углерод-углерод, например, от 2 до 6 атомов углерода и 1, 2 или 3 двойные связи углерод-углерод, или от 2 до 4 атомов углерода и 1 или 2 двойные связи углерод-углерод. Углерод-углеродная двойная связь (связи) может быть в цис (Z) или транс (E) конфигурации. Примеры алкенильных групп включают этенил (т.е. винил), 1-пропенил, 2-пропенил (т.е. аллил), 1-бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-пентенил, 4-пентенил, 1-гексенил, 2-гексенил, 3-гексенил, 4-гексенил, 5-гексенил, 1-гептенил, 2-гептенил, 3-гептенил, 4-гептенил, 5-гептенил, 6-гептенил, 1-октенил, 2-октенил, 3-октенил, 4-октенил, 5-октенил, 6-октенил, 7-октенил, 1-ноненил, 2-ноненил, 3-ноненил, 4-ноненил, 5-ноненил, 6-ноненил, 7-ноненил, 8-ноненил, 1-деценил, 2-деценил, 3-деценил, 4-деценил, 5-деценил, 6-деценил, 7-деценил, 8-деценил, 9-деценил и т.п. Если алкенильная группа присоединена к атому азота, двойная связь не может быть альфа по отношению к атому азота. «Замещенный алкенил» означает, что один или несколько (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с алкенильной группой, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например, от 1 до 5, от 1 до 4, или от 1 до 3, или 1 или 2) атомов водорода алкенильной группы замещены заместителем, отличным от водорода (при замене более чем одного атома водорода заместители могут быть одинаковыми или разными). Предпочтительно заместитель, отличный от водорода, является заместителем 1-го уровня, заместителем 2-го уровня или заместителем 3-го уровня, как определено в настоящей заявке, таким как галоген или необязательно замещенный арил. Примером замещенного алкенила является стирил (т.е. 2-фенилвинил).

Термин «алкинил» относится к монорадикалу ненасыщенного линейного или разветвленного углеводорода, имеющему по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод. Как правило, максимальное количество тройных связей углерод-углерод в алкинильной группе может быть равно целому числу, которое рассчитывают путем деления количества атомов углерода в алкинильной группе на 2 и, если количество атомов углерода в алкинильной группе является нечетным, округляя результат деления до следующего целого числа. Например, для алкинильной группы, содержащей 9 атомов углерода, максимальное количество тройных связей углерод-углерод составляет 4. Предпочтительно, алкинильная группа имеет от 1 до 4, т.е. 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно 1 или 2 углерод-углеродные тройные связи. Предпочтительно, алкинильная группа содержит от 2 до 20 атомов углерода, например, от 2 до 12 или от 2 до 10 атомов углерода, т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода, более предпочтительно от 2 до 8 атомов углерода, например, от 2 до 6 атомов углерода или от 2 до 4 атомов углерода. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления алкинильная группа содержит от 2 до 10 атомов углерода и 1, 2, 3, 4 или 5 (предпочтительно 1, 2 или 3) тройных углерод-углеродных связей, более предпочтительно она содержит от 2 до 8 атомов углерода и 1, 2, 3 или 4 (предпочтительно 1 или 2) тройные углерод-углеродные связи, например, от 2 до 6 атомов углерода и 1, 2 или 3 тройные углерод-углеродные связи, или от 2 до 4 атомов углерода и 1 или 2 тройные углерод-углеродные связи. Примеры алкинильных групп включают этинил, 1-пропинил (т.е. -C≡CCH₃), 2-пропинил (т.е. CH₂C≡CH или пропаргил), 1-бутинил, 2-бутинил, 3-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-пентинил, 4-пентинил, 1-гексинил, 2-гексинил, 3-гексинил, 4-гексинил, 5-гексинил, 1-гептинил, 2-гептинил, 3-гептинил, 4-гептинил, 5-гептинил, 6-гептинил, 1-октинил, 2-октинил, 3-октинил, 4-октинил, 5-октинил, 6-октинил, 7-октинил, 1-нонилил, 2-нонинил, 3-нонинил, 4-нонинил, 5-нонинил, 6-нонинил, 7-нонинил, 8-нонинил, 1-децинил, 2-децинил, 3-децинил, 4-децинил, 5-децинил, 6-децинил, 7-децинил, 8-децинил, 9-децинил и т.п.. Если алкинильная группа присоединена к атому азота, тройная связь не может быть альфа по отношению к атому азота. «Замещенный алкинил» означает, что один или несколько (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с алкинильной группой, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например, от 1 до 5, от 1 до 4, или от 1 до 3, или 1 или 2) атомов водорода алкинильной группы замещены заместителем, отличным от водорода (при замене более чем одного атома водорода заместители могут быть одинаковыми или разными). Предпочтительно заместитель, отличный от водорода, является заместителем 1-го уровня, заместителем 2-го уровня или заместителем 3-го уровня, как определено в данном описании, таким как галоген или необязательно замещенный арил.

Термин «арил» или «ароматическое кольцо» относится к монорадикалу ароматического циклического углеводорода. Предпочтительно арильная группа содержит от 3 до 14 (например, от 5 до 10, таких как 5, 6 или 10) атомов углерода, которые могут быть расположены в одном кольце (например, фенильном) или двух или более конденсированных кольцах (например, нафтильных). Примеры арильных групп включают циклопропенил, циклопентадиенил, фенил, инденил, нафтил, азуленил, флуоренил, антрил и фенантрил. Предпочтительно, «арил» относится к моноциклическому кольцу, содержащему 6 атомов углерода, или к ароматической бициклической кольцевой системе, содержащей 10 атомов углерода. Предпочтительными примерами являются фенил и нафтил. «Замещенный арил» означает, что один или несколько (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с арильной группой, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например, от 1 до 5, от 1 до 4, или от 1 до 3, или 1 или 2) атомов водорода арильной группы замещены заместителем, отличным от водорода (когда замещено более одного атома водорода, заместителями могут быть одинаковыми или разными). Предпочтительно заместитель, отличный от водорода, является заместителем 1-го уровня, заместителем 2-го уровня или заместителем 3-го уровня, как указано здесь, например, галогеном, CN, нитро, -OR¹¹ (например, -ОН), -SR¹¹ (например, -SH), -N(R¹²)(R¹³) (например, -NH₂), =Z (например, =O, =S или =NH), алкилом (например, C_1-6 алкилом), алкенилом (например, C_2-6 алкенилом) и алкинилом (например, C_2-6 алкинилом). Примеры замещенного арила включают бифенил, 2-фторфенил, анилинил, 3-нитрофенил, 4-гидроксифенил, метоксифенил (т.е. 2-, 3- или 4-метоксифенил) и 4-этоксифенил.

Термин «гетероарил» или «гетероароматическое кольцо» означает арильную группу, как определено выше, в которой один или несколько атомов углерода в арильной группе замещены гетероатомами O, S или N. Предпочтительно гетероарил означает пяти- или шести-членное ароматическое моноциклическое кольцо, в котором 1, 2 или 3 атома углерода заменены одинаковыми или разными гетероатомами O, N или S. В альтернативном варианте это означает ароматическую бициклическую или трициклическую кольцевую систему, в которой 1, 2, 3, 4 или 5 атомов углерода замещены одинаковыми или разными гетероатомами O, N или S. Предпочтительно в каждом кольце гетероарильной группы максимальное количество атомов O равно 1, максимальное количество атомов S равно 1, а максимальное общее количество атомов O и S составляет 2. Примеры гетероарильных групп включают фуранил, тиенил, оксазолил, изоксазолил, оксадиазолил, пирролил, имидазолил, пиразолил, триазолил, тетразолил, тиазолил, изотиазолил, тиадиазолил, пиридил, пиримидинил, пиразинил, триазинил, бензофуранил, индолил, изоиндолил, бензотиенил, 1H-индазолил, бензимидазолил, бензоксазолил, индоксазинил, бензизоксазолил, бензотиазолил, бензизотиазолил, бензотриазолил, хинолинил, изохинолинил, бензодиазинил, хиноксалинил, хиназолинил, бензотриазинил, пиридазинил, феноксазинил, тиазолопиридинил, пирролотиазолил, фенотиазинил, изобензофуранил, хроменил, ксантенил, пирролизинил, индолизинил, индазолил, пуринил, хинолизинил, фталазинил, нафтиридинил, циннолинил, птеридинил, карбазолил, фенантридинил, акридинил, перимидинил, фенантролинил и феназинил. Примеры 5- или 6-членных гетероарильных групп включают фуранил, тиенил, оксазолил, изоксазолил, оксадиазолил, пирролил, имидазолил (например, 2-имидазолил), пиразолил, триазолил, тетразолил, тиазолил, изотиазолил, тиадиазолил, пиридил (например, 4-пиридил), пиримидинил, пиразинил, триазинил и пиридазинил. «Замещенный гетероарил» означает, что один или несколько (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с гетероарильной группой, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например, от 1 до 5, от 1 до 4, или от 1 до 3, или 1 или 2) атомов водорода гетероарильной группы замещены заместителем, отличным от водорода (когда замещено более одного атома водорода, заместители могут быть одинаковыми или разными). Предпочтительно заместитель, отличный от водорода, является заместителем 1-го уровня, заместителем 2-го уровня или заместителем 3-го уровня, как указано в настоящем описании, например галогеном, -CN, нитро, -OR¹¹ (например, -ОН), -SR¹¹ (например, -SH), -N(R¹²)(R¹³) (например, -NH₂), =Z (например, =O, =S или =NH), алкилом (например, C_1-6 алкилом), алкенилом (например, C_2-6 алкенилом) и алкинилом (например, C_2-6 алкинилом). Примеры замещенного гетероарила включают 3-фенилпирролил, 2,3'-бифурил, 4-метилпиридил, 2- или 3-этилиндолил.

Термин «циклоалкил» или «циклоалифатический» представляет собой циклические неароматические версии «алкила» и «алкенила», содержащие предпочтительно от 3 до 14 атомов углерода, например от 3 до 10 атомов углерода, т.е. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода, более предпочтительно от 3 до 7 атомов углерода. В одном варианте осуществления циклоалкильная группа имеет 1, 2 или более (предпочтительно 1 или 2) двойных связей. Типичные циклоалкильные группы включают циклопропил, циклопропенил, циклобутил, циклобутенил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил, циклогептенил, циклооктил, циклооктенил, циклононил, циклононенил, циклодецил, циклодеценил и адамантил. Термин «циклоалкил» также включает его бициклические и трициклические варианты. Если образуются бициклические кольца, предпочтительно, чтобы соответствующие кольца были соединены друг с другом двумя соседними атомами углерода, однако в альтернативном варианте два кольца связаны через один и тот же атом углерода, т.е. они формируют спиро кольцевые системы, либо они формируют «мостиковые» кольцевые системы. Предпочтительные примеры циклоалкила включают C₃-C₈-циклоалкил, в частности циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексенил, циклогексадиенил, циклогептил, циклооктил, спиро[3,3]гептил, спиро[3,4]октил, спиро[4,3]октил, спиро[4,5]деканил, бицикло[4.1.0]гептил, бицикло[3.2.0]гептил, бицикло[2.2.1]гептил (т.е. норборнил), бицикло[2.2.2]октил, бицикло[5.1.0]октил, бицикло[4.2.0]октил, бицикло[4.3.0]нонил, 1,2,3,4-тетрагидронафтил (т.е. тетралинил) и бицикло[4.4.0]деканил (т.е. декалинил). «Замещенный циклоалкил» означает, что один или несколько (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с циклоалкильной группой, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например, от 1 до 5, от 1 до 4, или от 1 до 3, или 1 или 2) атомов водорода циклоалкильной группы замещены заместителем, отличным от водорода (когда замещено более одного атома водорода, заместители могут быть одинаковыми или разными). Предпочтительно заместитель, отличный от водорода, является заместителем 1-го уровня, заместителем 2-го уровня или заместителем 3-го уровня, как указано в настоящем описании, например, галогеном, -CN, нитро, -OR¹¹ (например, -ОН), -SR¹¹ (например, -SH), -N(R¹²)(R¹³) (например, -NH₂), =Z (например, =O, =S или =NH), алкилом (например, C_1-6 алкилом), алкенилом (например, C_2-6 алкенилом) и алкинилом (например, C_2-6 алкинилом). Примеры замещенного циклоалкила включают оксоциклогексил, оксоциклопентил, фторциклогексил и оксоциклогексенил.

Термин «гетероциклил» или «гетероциклическое кольцо» означает циклоалкильную группу, как определено выше, где 1, 2, 3 или 4 атома углерода в циклоалкильной группе заменены гетероатомами кислорода, азота, кремния, селена, фосфора или серы, предпочтительно O, S или N. Гетероциклильная группа предпочтительно имеет 1 или 2 кольца, содержащих от 3 до 10, например, 3, 4, 5, 6 или 7 кольцевых атомов. Предпочтительно в каждом кольце гетероциклильной группы максимальное количество атомов O равно 1, максимальное количество атомов S равно 1, а максимальное общее количество атомов O и S равно 2. Термин «гетероциклил» также означает частично или полностью гидрированные формы (такие как дигидро-, тетрагидро- или пергидроформы) вышеупомянутых гетероарильных групп. Типичные гетероциклильные группы включают морфолинил, пирролидинил, имидазолидинил, пиразолидинил, пиперидинил (также называемый пиперидилом), пиперазинил, ди- и тетрагидрофуранил, ди- и тетрагидротиенил, ди- и тетрагидропиранил, уротропинил, лактоны, лактамы, циклические имиды, и циклические ангидриды. «Замещенный гетероциклил» означает, что один или несколько (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с гетероциклильной группой, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например, от 1 до 5, от 1 до 4, или от 1 до 3, или 1 или 2) атомов водорода гетероциклильной группы замещены заместителем, отличным от водорода (когда замещено более одного атома водорода, заместители могут быть одинаковыми или разными). Предпочтительно заместитель, отличный от водорода, является заместителем 1-го уровня, заместителем 2-го уровня или заместителем 3-го уровня, как указано в настоящей заявке, например, галогеном, -CN, нитро, -OR¹¹ (например, -OH), -SR¹¹ (например, -SH), -N(R¹²)(R¹³) (например, -NH₂), =Z (например, =O, =S или =NH), алкилом (например, C_1-6 алкилом), алкенилом (например, C_2-6 алкенилом) и алкинилом (например, C_2-6 алкинилом).

Термин «ароматический», используемый в контексте углеводородов, означает, что вся молекула должна быть ароматической. Например, если моноциклический арил гидрирован (частично или полностью), полученная гидрированная циклическая структура классифицируется как циклоалкил для целей настоящего изобретения. Аналогичным образом, если би- или полициклический арил (такой как нафтил) гидрирован, полученная гидрированная би- или полициклическая структура (такая как 1,2-дигидронафтил) классифицируется как циклоалкил для целей настоящего изобретения (даже если одно кольцо, например, в 1,2-дигидронафтиле, все еще является ароматическим). В настоящей заявке проводится аналогичное различие между гетероарилом и гетероциклилом. Например, индолинил, т.е. дигидровариант индолила, классифицируется как гетероциклил для целей настоящего изобретения, поскольку только одно кольцо бициклической структуры является ароматическим, а один из атомов кольца является гетероатомом.

Термин «галоген» или «гало» означает фтор, хлор, бром или йод, предпочтительно фтор. Термин «гидрокси» означает ОН. Термин «алкокси» означает О-алкил, где алкил является таким, как определено выше, и включает метокси, этокси, пропокси, бутокси, изобутокси, втор-бутокси, пентокси, гексилокси, гептилокси, октилокси, нонилокси и децилокси. Термин «замещенный алкокси» означает O-(замещенный алкил), где замещенный алкил имеет значения, указанные выше, и включает 2-метоксиэтокси. Термин «нитро» означает NO₂. Термин «циано» означает группу -CN. Термин «изоциано» означает группу -NC. Термин «цианато» означает группу -OCN. Термин «изоцианато» означает группу -NCO. Термин «тиоцианато» означает группу -SCN. Термин «изотиоцианато» означает группу -NCS. Термин «азидо» означает N₃.

Термин «амино» включает незамещенный амино (т.е. группу -NH₂) и замещенный амино (т.е. моно- или двузамещенный амино, в котором один или два атома водорода были замещены группой, отличной от водорода). Таким образом, термин «амино» означает группу N(R¹²)(R¹³), где R¹² и R¹³ в каждом случае независимо выбраны из группы, состоящей из -H, алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, арила, гетероарила и гетероциклила, или R¹² и R¹³ могут соединяться вместе с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием группы -N=CR¹⁵R¹⁶, где каждая из алкильных, алкенильных, алкинильных, циклоалкильных, арильных, гетероарильных и гетероциклильных групп при необходимости замещена одной или несколькими (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с алкильной, алкенильной, алкинильной, циклоалкильной, арильной, гетероарильной или гетероциклильной группой, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например от 1 до 5, от 1 до 4, или от 1 до 3, или 1, или 2) независимо выбранными R³⁰; R¹⁵ и R¹⁶ независимо выбраны из группы, состоящей из -H, алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, арила, гетероарила, гетероциклила и -NH_yR²⁰_2-y, или R¹⁵ и R¹⁶ могут соединяться вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием кольца, которое при необходимости замещено одним или несколькими (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с кольцом, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например, от 1 до 5, от 1 до 4, или от 1 до 3, или 1 или 2) независимо выбранными R³⁰, где каждая из алкильных, алкенильных, алкинильных, циклоалкильных, арильных, гетероарильных и гетероциклильных групп при необходимости замещена одной или несколькими (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с алкильной, алкенильной, алкинильной, циклоалкильной, арильной, гетероарильной или гетероциклильной группой, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например от 1 до 5, от 1 до 4, или от 1 до 3, или 1 или 2) независимо выбранными R³⁰; y представляет собой целое число от 0 до 2; R²⁰ выбран из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, арила, гетероарила и гетероциклила, где каждая из алкильных, алкенильных, алкинильных, циклоалкильных, арильных, гетероарильных и гетероциклильных групп при необходимости замещена одной или несколькими (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с алкильной, алкенильной, алкинильной, циклоалкильной, арильной, гетероарильной или гетероциклильной группой, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например от 1 до 5, от 1 до 4 или от 1 до 3, или 1 или 2) независимо выбранными R³⁰; и R³⁰ представляет собой заместитель 1-го (или 2-го или 3-го) уровня.

Термин «имино» означает группу -N(R¹⁴)-, в которой обе свободные валентности атома азота могут связываться с одним другим атомом (например, C), что приводит к двойной связи (например, C=N(R¹⁴)) или с разными атомами (например, двумя атомами C), что приводит к двум одинарным связям (например, C-N(R¹⁴)-C). В каждом случае R¹⁴ выбран из группы, состоящей из H, алкила, алкенила, алкинила, циклоалкила, арила, гетероарила и гетероциклила, где каждая из алкильной, алкенильной, алкинильной, циклоалкильной, арильной, гетероарильной и гетероциклильной групп при необходимости замещена одним или несколькими (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с алкильной, алкенильной, алкинильной, циклоалкильной, арильной, гетероарильной или гетероциклильной группой, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например от 1 до 5, от 1 до 4, или от 1 до 3, или 1 или 2) независимо выбранными R³⁰; и R³⁰ представляет собой заместитель 1-го (или 2-го или 3-го) уровня.

Термин «необязательно замещенный» указывает, что один или несколько (например, от 1 до максимального числа атомов водорода, связанных с фрагментом, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или до 10, например, от 1 до 5, от 1 до 4, или от 1 до 3, или 1 или 2) атомов водорода могут быть замещены группой/заместителем (т.е. заместителем 1-го уровня), отличным от водорода, таким как алкил (предпочтительно, C_1-6 алкил), алкенил (предпочтительно, C_2-6 алкенил), алкинил (предпочтительно, C_2-6 алкинил), арил (предпочтительно, 3-14-членный арил), гетероарил (предпочтительно, 3-14-членный гетероарил), циклоалкил (предпочтительно 3-14-членный циклоалкил), гетероциклил (предпочтительно 3-14-членный гетероциклил), галоген, -CN, -NC, -NCO, -CNO, -SCN,
-NCS, -N₃, -NO₂, -OR⁷¹, -N(R⁷²)(R⁷³), -ON(R⁷²)(R⁷³), -N⁺(-O^-)(R⁷²)(R⁷³), -S(O)_0-2R⁷¹ (т.е -SR⁷¹, -S(O)R⁷¹, или -S(O)₂R⁷¹), -S(O)_0-2OR⁷¹ (например, -S(O)_1-2OR⁷¹), -OS(O)_0-2OR⁷¹ (например, -OS(O)_1-2OR⁷¹), -S(O)_0-2N(R⁷²)(R⁷³) (например, -S(O)_1-2N(R⁷²)(R⁷³)), -OS(O)_0-2N(R⁷²)(R⁷³) (например, -OS(O)_1-2N(R⁷²)(R⁷³)), -N(R⁷¹)S(O)_0-2R⁷¹ (например, -N(R⁷¹)S(O)_1-2R⁷¹), -NR⁷¹S(O)_0-2OR⁷¹ (например, -NR⁷¹S(O)_1-2OR⁷¹), -NR⁷¹S(O)_0-2N(R⁷²)(R⁷³) (например, -NR⁷¹S(O)_1-2N(R⁷²)(R⁷³)), -C(=Z¹)R⁷¹, -C(=Z¹)Z¹R⁷¹, -Z¹C(=Z¹)R⁷¹, и -Z¹C(=Z¹)Z¹R⁷¹, и/или любые два заместителя 1-го уровня, которые связаны с одним и тем же атомом углерода циклоалкильной или гетероциклильной группы, могут объединяться вместе с образованием =Z¹, где каждая из алкильной, алкенильной, алкинильной, арильной, гетероарильной, циклоалкильной и гетероциклильной группы заместителя 1-го уровня может сама быть замещена одним или несколькими (например, одним, двумя или тремя) заместителями (т.е. заместителями 2-го уровня), выбранными из группы, состоящей из C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, 3-14-членного арила, 3-14-членного гетероарила, 3-14-членного циклоалкила, 3-14-членного гетероциклила, галогена, -CF₃, -CN, -NC, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -N₃, -NO₂, -OR⁸¹, -N(R⁸²)(R⁸³), -ON(R⁸²)(R⁸³),
-N⁺(-O^-)(R⁸²)(R⁸³), -S(O)_0-2R⁸¹ (т.е -SR⁸¹, -S(O)R⁸¹, или -S(O)₂R⁸¹), -S(O)_0-2OR⁸¹ (например, -S(O)_1-2OR⁸¹), -OS(O)_0-2R⁸¹ (например, -OS(O)_1-2R⁸¹), -OS(O)_0-2OR⁸¹ (например, -OS(O)_1-2OR⁸¹), -S(O)_0-2N(R⁸²)(R⁸³) (например, -S(O)_1-2N(R⁸²)(R⁸³)), -OS(O)_0-2N(R⁸²)(R⁸³) (например, -OS(O)_1-2N(R⁸²)(R⁸³)), -N(R⁸¹)S(O)_0-2R⁸¹ (например, -N(R⁸¹)S(O)_1-2R⁸¹), -NR⁸¹S(O)_0-2OR⁸¹ (например, -NR⁸¹S(O)_1-2OR⁸¹), -NR⁸¹S(O)_0-2N(R⁸²)(R⁸³) (например, -NR⁸¹S(O)_1-2N(R⁸²)(R⁸³)), -C(=Z²)R⁸¹, -C(=Z²)Z²R⁸¹, -Z²C(=Z²)R⁸¹, и -Z²C(=Z²)Z²R⁸¹, и/или любые два заместителя 2-го уровня, которые связаны с одним и тем же атомом углерода циклоалкильной или гетероциклильной группы, могут соединяться вместе с образованием = Z², где каждая из C_1-6 алкильной, C_2-6 алкенильной, C_2-6 алкинильной, 3-14-членной арильной, 3-14-членной гетероарильной, 3-14-членной циклоалкильной, 3-14-членной гетероциклильной группы заместителя 2-го уровня при необходимости замещена одним или несколькими (например, одним, двумя или тремя) заместителями ( т.е. заместителями 3-го уровня), независимо выбранными из группы, состоящей из C_1-3 алкила, галогена, -CF₃, -CN, -NC, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -N₃, -NO₂, -OH, -O(C_1-3 алкила), -OCF₃,
-S(C_1-3 алкила), -NH₂, -NH(C_1-3 алкила), -N(C_1-3 алкила)₂, -NHS(O)₂(C_1-3 алкила), -S(O)₂NH_2-z(C_1-3 алкила)_z, -C(=O)(C_1-3 алкила), -C(=O)OH, -C(=O)O(C_1-3 алкила), -C(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -OC(=O)(C_1-3 алкила), -OC(=O)O(C_1-3 алкила), -OC(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=O)(C_1-3 алкила), -NHC(=O)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=NH)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, и -N(C_1-3 алкил)C(=NH)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, где z равно 0, 1 или 2, и C_1-3 алкил представляет собой метил, этил, пропил или изопропил, и/или любые два заместителя 3-го уровня, которые связаны с одним и тем же атомом углерода циклоалкильной или гетероциклильной группы могут объединяться с образованием =O, =S, =NH или =N(C_1-3 алкила);

где

R⁷¹, R⁷² и R⁷³ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, 3-7-членного циклоалкила, 5- или 6-членного арила, 5- или 6-членного гетероарила и 3-7-членного гетероциклила, где каждая из С_1-6 алкильной, С_2-6 алкенильной, С_2-6 алкинильной, 3-7-членной циклоалкильной, 5- или 6-членной арильной, 5- или 6-членной гетероарильной и 3-7-членной гетероциклильной группы при необходимости замещена одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из группы, состоящей из C_1-3 алкила, галогена, -CF₃, -CN, -NC, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -N₃, -NO₂, -OH, -O(C_1-3 алкила), -OCF₃, -S(C_1-3 алкила), -NH₂, -NH(C_1-3 алкила), -N(C_1-3 алкил)₂, -NHS(O)₂(C_1-3 алкила), -S(O)₂NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -C(=O)(C_1-3 алкила), -C(=O)OH, -C(=O)O(C_1-3 алкила), -C(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -OC(=O)(C_1-3 алкила), -OC(=O)O(C_1-3 алкила), -OC(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=O)(C_1-3 алкила), -NHC(=O)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=NH)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, и -N(C_1-3 алкил)C(=NH)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, где z представляет собой 0, 1 или 2, а C_1-3 алкил представляет собой метил, этил, пропил или изопропил,

или R⁷² и R⁷³ могут соединяться вместе с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 5- или 6-членного кольца, которое при необходимости замещено одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из группы, состоящей из C_1-3 алкила, галогена, -CF₃, -CN, -NC, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -N₃, -NO₂, -OH,
-O(C_1-3 алкила), -OCF₃, -S(C_1-3 алкила), -NH₂, -NH(C_1-3 алкила), -N(C_1-3 алкил)₂, -NHS(O)₂(C_1-3 алкила), -S(O)₂NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -C(=O)(C_1-3 алкила), -C(=O)OH, -C(=O)O(C_1-3 алкила), -C(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -OC(=O)(C_1-3 алкила), -OC(=O)O(C_1-3 алкила), -OC(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=O)(C_1-3 алкила), -NHC(=O)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=NH)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, и -N(C_1-3 алкил)C(=NH)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, где z равно 0, 1 или 2, а C_1-3 алкил представляет собой метил, этил, пропил или изопропил;

R⁸¹, R⁸² и R⁸³ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C_1-4 алкила, C_2-4 алкенила, C_2-4 алкинила, 3-6-членного циклоалкила, 5- или 6-членного арила, 5- или 6-членного гетероарила и 3-6-членного гетероциклила, где каждая из С_1-4 алкильной, С_2-4 алкенильной, С_2-4 алкинильной, 3-6-членной циклоалкильной, 5- или 6-членной арильной, 5- или 6-членной гетероарильной и 3-6-членной гетероциклильной группы при необходимости замещена одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из группы, состоящей из C_1-3 алкила, галогена, -CF₃, -CN, -NC, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -N₃, -NO₂, -OH, -O(C_1-3 алкила), -OCF₃, -S(C_1-3 алкила), -NH₂, -NH(C_1-3 алкила), -N(C_1-3 алкил)₂, -NHS(O)₂(C_1-3 алкила), -S(O)₂NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -C(=O)(C_1-3 алкила), -C(=O)OH, -C(=O)O(C_1-3 алкила), -C(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -OC(=O)(C_1-3 алкила), -OC(=O)O(C_1-3 алкила), -OC(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=O)(C_1-3 алкила), -NHC(=O)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=NH)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, и -N(C_1-3 алкил)C(=NH)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, где z равно 0, 1 или 2, а C_1-3 алкил представляет собой метил, этил, пропил или изопропил,

или R⁸² и R⁸³ могут соединяться вместе с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 5- или 6-членного кольца, которое при необходимости замещено одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из группы, состоящей из C_1-3 алкила, галогена, -CF₃, -CN, -NC, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -N₃, -NO₂, -OH,
-O(C_1-3 алкила), -OCF₃, -S(C_1-3 алкила), -NH₂, -NH(C_1-3 алкила), -N(C_1-3 алкил)₂, -NHS(O)₂(C_1-3 алкила), -S(O)₂NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -C(=O)(C_1-3 алкила), -C(=O)OH, -C(=O)O(C_1-3 алкила), -C(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -OC(=O)(C_1-3 алкила), -OC(=O)O(C_1-3 алкила), -OC(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=O)(C_1-3 алкила), -NHC(=O)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=NH)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, и -N(C_1-3 алкил)C(=NH)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, где z равно 0, 1 или 2, а C_1-3 алкил представляет собой метил, этил, пропил или изопропил;

Z¹ и Z² независимо выбраны из O, S и N(R⁸⁴), где R⁸⁴ представляет собой -H или C_1-3 алкил.

Типичные заместители 1-го уровня предпочтительно выбраны из группы, состоящей из C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, 3-14-членного (например, 5- или 6-членного) арила, 3-14-членного (например, 5- или 6-членного) гетероарила, 3-14-членного (например, 3-7-членного) циклоалкила, 3-14-членного (например, 3-7-членного) гетероциклила, галогена, -CN, -NC, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -N₃,
-NO₂, -OR⁷¹, -N(R⁷²)(R⁷³), -S(O)_0-2R⁷¹, -S(O)_0-2OR⁷¹, -OS(O)_0-2R⁷¹, -OS(O)_0-2OR⁷¹, -S(O)_0-2N(R⁷²)(R⁷³), -OS(O)_0-2N(R⁷²)(R⁷³), -N(R⁷¹)S(O)_0-2R⁷¹, -NR⁷¹S(O)_0-2OR⁷¹, -C(=Z¹)R⁷¹, -C(=Z¹)Z¹R⁷¹, -Z¹C(=Z¹)R⁷¹, и -Z¹C(=Z¹)Z¹R⁷¹, такого как C_1-4 алкил, C_2-4 алкенил, C_2-4 алкинил, 5- или 6-членный арил, 5- или 6-членный гетероарил, 3-7- членный циклоалкил, 3-7-членный гетероциклил, галоген, -CF₃, -CN, -NC, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -N₃,-NO₂, -OH, -O(C_1-3 алкил), -S(C_1-3 алкил), -NH₂, -NH(C_1-3 алкил), -N(C_1-3 алкил)₂, -NHS(O)₂(C_1-3 алкил), -S(O)₂NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -C(=O)OH, -C(=O)O(C_1-3 алкил), -C(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=O)(C_1-3 алкил), -NHC(=NH)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, и -N(C_1-3 алкил)C(=NH)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, где z равно 0, 1 или 2, а C_1-3 алкил представляет собой метил, этил, пропил или изопропил; Z¹ независимо выбран из O, S, NH и N(CH₃); и R⁷¹, R⁷² и R⁷³ имеют значения, указанные выше, или предпочтительно независимо выбраны из группы, состоящей из H, C_1-4 алкила, C_2-4 алкенила, C_2-4 алкинила, 5- или 6-членного циклоалкила, 5- или 6-членного арила, 5- или 6-членного гетероарила и 5- или 6-членного гетероциклила, где каждая из алкильных, алкенильных, алкинильных, циклоалкильных, арильных, гетероарильных и гетероциклильных групп при необходимости замещена одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из группы, состоящей из C_1-3 алкила, галогена, -CF₃, -CN, -NC, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -N₃, -NO₂, -OH, -O(C_1-3 алкила), -OCF₃, -S(C_1-3 алкила), -NH₂, -NH(C_1-3 алкила), -N(C_1-3 алкил)₂, -NHS(O)₂(C_1-3 алкила), -S(O)₂NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -C(=O)OH, -C(=O)O(C_1-3 алкила), -C(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=O)(C_1-3 алкила), -NHC(=NH)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, и -N(C_1-3 алкил)C(=NH)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, где z равно 0, 1 или 2, а C_1-3 алкил представляет собой метил, этил, пропил или изопропил; или R⁷² и R⁷³ могут соединяться вместе с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 5- или 6-членного кольца, которое при необходимости замещено одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из группы, состоящей из C_1-3 алкила, галогена, -CF₃, -CN, -NC, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -N₃, -NO₂, -OH, -O(C_1-3 алкила), -OCF₃, -S(C_1-3 алкила), -NH₂, -NH(C_1-3 алкила), -N(C_1-3 алкил)₂, -NHS(O)₂(C_1-3 алкила), -S(O)₂NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -C(=O)OH, -C(=O)O(C_1-3 алкила), -C(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=O)(C_1-3 алкила), -NHC(=NH)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, и -N(C_1-3 алкил)C(=NH)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, где z равно 0, 1 или 2, а C_1-3 алкил представляет собой метил, этил, пропил или изопропил.

Типичные заместители 2-го уровня предпочтительно выбраны из группы, состоящей из С_1-4 алкила, С_2-4 алкенила, С_2-4 алкинила, 5- или 6-членного арила, 5- или 6-членного гетероарила, 5- или 6-членного циклоалкила, 5- или 6-членного гетероциклила, галогена, -CF₃, -CN, -NC, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -N₃,
-NO₂, -OH, -O(C_1-3 алкила), -OCF₃, -S(C_1-3 алкила), -NH₂, -NH(C_1-3 алкила), -N(C_1-3 алкил)₂,
-NHS(O)₂(C_1-3 алкила), -S(O)₂NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -C(=O)OH, -C(=O)O(C_1-3 алкила), -C(=O)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, -NHC(=O)(C_1-3 алкила), -NHC(=NH)NH_z-2(C_1-3 алкил)_z, и -N(C_1-3 алкил)C(=NH)NH_2-z(C_1-3 алкил)_z, где z равно 0, 1 или 2, а C_1-3 алкил представляет собой метил, этил, пропил или изопропил. Особо предпочтительные заместители 2-го уровня включают 4-морфолинил, гомоморфолинил, 4-пиперидинил, гомопиперидинил (т.е. азепанил, в частности 4-азепанил), 4-пиперазинил, гомопиперазинил (т.е. диазепанил, в частности 2,4-диазепанил), N-метил-пиперазин-4-ил, N-метил-гомопиперазинил, -CH₂CH₂OCH₃, -OCH₂CH₂OCH₃, -CH₂CH₂NH_2-z(CH₃)_z, -OCH₂CH₂NH_2-z(CH₃)_z,-CF₃, и -OCF₃.

Типичные заместители 3-го уровня предпочтительно выбраны из группы, состоящей из фенила, фуранила, пирролила, тиенила, имидазолила, оксазолила, изоксазолила, тиазолила, пиридила, пиразинила, пиримидинила, пиридазинила, частично и полностью гидрогенизированных форм вышеуказанных групп, морфолино, C_1-3 алкила, галогена, -NC, -NCO, -CNO, -SCN, -NCS, -N₃, -CF₃, -OH, -OCH₃, -OCF₃, -SCH₃, -NH_2-z(CH₃)_z, -C(=O)OH, и -C(=O)OCH₃, где z равно 0, 1 или 2.

Термин «необязательный» или «необязательно», используемый в настоящей заявке, означает, что описанное далее событие, обстоятельство или условие может произойти или не произойти, и что описание включает случаи, когда указанное событие, обстоятельство или условие происходит, и случаи, когда оно не происходит.

«Изомеры» представляют собой соединения, имеющие одну и ту же молекулярную формулу, но различающиеся структурой («структурные изомеры») или геометрическим расположением функциональных групп и/или атомов («стереоизомеры»). «Энантиомеры» представляют собой пару стереоизомеров, которые не могут накладываться друг на друга в зеркальном отображении. «Рацемическая смесь» или «рацемат» содержит пару энантиомеров в равных количествах и обозначается префиксом (±). «Диастереомеры» представляют собой стереоизомеры, которые не являются энантиомерами. «Таутомеры» - это структурные изомеры одного и того же химического вещества, которые самопроизвольно превращаются друг в друга, даже в чистом виде.

5'-кэп соединение по настоящему изобретению или РНК, модифицированная с помощью 5'-кэп соединения по настоящему изобретению, могут быть мечены изотопом, т.е. один или несколько атомов заменены соответствующим атомом, имеющим такое же количество протонов, но отличающимся по количеству нейтронов. Например, атом водорода можно заменить атомом дейтерия. Примеры изотопов, которые можно использовать в 5'-кэп соединении из настоящего изобретения или РНК, модифицированной 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, включают дейтерий, ¹¹C, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸F, ³²S, ³⁶Cl, и ¹²⁵I. Термин «изотопно обогащенный» означает, что наличие изотопа выходит за пределы естественного изобилия. 5'-кэп соединение по настоящему изобретению, которое мечено изотопами, или РНК, модифицированные таким изотопно-меченным 5'-кэп соединением по настоящей заявке, могут быть получены с использованием соответственно меченных изотопами нуклеотидов во время транскрипции in vitro или путем добавления таких соответственно меченных изотопами нуклеотидов после транскрипции.

Фраза «стереохимическая конфигурация у атома P, содержащего заместитель R⁵, соответствует таковой у атома P_β диастереомера D1 бета-S-ARCA» означает, что атом фосфора, содержащий заместитель R⁵ и имеющий хиральный центр, и, следовательно, способный к существованию в любой из двух стереохимических конфигураций, присутствует преимущественно в одной необходимой стереохимической конфигурации, т.е. у атома P_β диастереомера D1 бета-S-ARCA. В случае атома P_β диастереомера D1 бета-S-ARCA это может быть либо (R) конфигурация, либо (S) конфигурация. Предпочтительно более 50% представляющей интерес группы имеет необходимую стереохимическую конфигурацию, предпочтительно по меньшей мере 75% представляющей интерес группы имеет необходимую стереохимическую конфигурацию, более предпочтительно по меньшей мере 90% представляющей интерес группы имеет необходимую стереохимическую конфигурацию, еще более предпочтительно по меньшей мере 95% представляющей интерес группы имеет необходимую стереохимическую конфигурацию, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% представляющей интерес группы имеет необходимую стереохимическую конфигурацию.

Диастереомер D1 бета-S-ARCA (β-S-ARCA) имеет следующую структуру:

«Диастереомер D1 бета-S-ARCA» или «бета-S-ARCA(D1)» представляет собой диастереомер бета-S-ARCA, который элюируется первым на колонке ВЭЖХ по сравнению с диастереомером D2 бета-S-ARCA (бета-S-ARCA(D2)) и, таким образом, имеет более короткое время удерживания. ВЭЖХ предпочтительно представляет собой аналитическую ВЭЖХ. В одном варианте осуществления для разделения используют колонку Supelcosil LC-18-T RP, предпочтительно формата: 5 мкм, 4,6 × 250 мм, при этом может применяться скорость потока 1,3 мл/мин. В одном варианте осуществления используют градиент метанола в ацетате аммония, например, 0-25% линейный градиент метанола в 0,05 М ацетате аммония, pH = 5,9, в течение 15 минут. УФ-детекцию (VWD) можно осуществлять при 260 нм, а флуоресцентную детекцию (FLD) можно осуществлять при возбуждении при 280 нм и детекции при 337 нм.

Термин «природный», используемый в настоящей заявке в контексте объекта, относится к тому факту, что объект может быть найден в природе. Например, белок, аминокислота или нуклеиновая кислота, присутствующие в организме (включая вирусы), которые можно выделить из природного источника и которые не были намеренно модифицированы человеком в лаборатории, являются природными.

Настоящее изобретение относится к модификации РНК, предпочтительно мРНК, для увеличения стабильности и/или экспрессии указанной РНК, предпочтительно в иммунных клетках, более предпочтительно в незрелых иммунных клетках, еще более предпочтительно в незрелых антигенпрезентирующих клетках и наиболее предпочтительно в незрелых дендритных клетках. Модифицированная РНК, описанная в настоящем изобретении, особенно полезна для вакцинации РНК.

5'-кэп соединение

В первом аспекте настоящая заявка обеспечивает 5'-кэп соединение, имеющее 5'-кэп структуру в соответствии с формулой (I):

Формула (I)

где R¹ выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного алкинила, необязательно замещенного циклоалкила, необязательно замещенного гетероциклила, необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила;

R² и R³ независимо выбраны из группы, состоящей из H, галогена, OH и необязательно замещенного алкокси, или R² и R³ вместе образуют O-X-O, где X выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного CH₂, необязательно замещенного CH₂CH₂, необязательно замещенного CH₂CH₂CH₂, необязательно замещенного CH₂CH(CH₃) и необязательно замещенного C(CH₃)₂, или R² объединен с атомом водорода в положении 4' кольца, к которому присоединен R², с образованием –O-CH₂- или -CH₂-O-;

R⁴ и R⁶ независимо выбраны из группы, состоящей из O, S, Se и BH₃;

R⁵ выбран из группы, состоящей из S, Se и BH₃;

R⁷ представляет собой мононуклеотид или олигонуклеотид, содержащий 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 (например, 2, 3, 4, 5 или 6) оснований;

R⁸ представляет собой H, галоген или необязательно замещенный алкокси;

n равен 1, 2 или 3; и

B представляет собой фрагмент из пуринового или пиримидинового основания.

В одном из вариантов осуществления 5'-кэп соединение имеет формулу (Ia)

формула (Ia)

где R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, n и B имеют значения, указанные выше или ниже, а R¹ выбран так, что 5'-кэп соединение не ингибирует трансляцию РНК, содержащей указанное 5'-кэп соединение. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ia) R¹ выбран таким образом, что кэпированная РНК, в частности, 5'-кэп структура кэпированной РНК распознается механизмом инициации трансляции, предпочтительно in vivo и in vitro, предпочтительно кэпированная РНК, в частности 5'-кэп структура кэпированной РНК, распознается механизмом инициации трансляции эукариот. Например, специалист в данной области техники может определить, распознается ли кэпированная РНК или 5'-кэп структура кэпированной РНК механизмом инициации трансляции эукариот, путем определения аффинности эукариотического фактора инициации трансляции eIF4E к указанной кэпированной РНК или к указанной 5'-кэп структуре.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ia) R¹ выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного C₁-C₄ алкила (например, метила, этила, пропила, бутила, бензила, фенилэтила и нафтилметила, любого из которых может быть при необходимости замещен); необязательно замещенного C₂-C₄ алкенила (например, этенила, пропенила или бутенила, любой из которых может быть при необходимости замещен) и необязательно замещенного арила. В предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ia) R¹ выбран из группы, состоящей из C₁-C₄ алкила и необязательно замещенного арила. В предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ia) R¹ выбран из группы, состоящей из метила, этила, необязательно замещенного бензила, необязательно замещенного фенилэтила и необязательно замещенного нафтилметила. В предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ia) R¹ представляет собой метил или этил, более предпочтительно метил.

В одном из вариантов осуществления 5'-кэп соединение имеет формулу (Ib)

Формула (Ib)

где R¹, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, n и B имеют значения, указанные выше (в частности, в отношении одной или нескольких формул (I) и (Ia)) или ниже, и конфигурация R² и R³ является такой что 5'-кэп соединение может быть включено в цепь РНК только в одной ориентации. Pasquinelli et al. (1995, RNA J. 1: 957-967) продемонстрировали, что во время транскрипции in vitro РНК-полимеразы бактериофагов используют 7-метилгуанозиновую единицу для инициации транскрипции, при этом около 40-50% транскриптов с кэпом обладают кэп-динуклеотидом в обратной ориентации (т.е. исходный продукт реакции - Gpppm⁷GpN). По сравнению с РНК, содержащими кэп-структуру в правильной ориентации, РНК, содержащие кэп-структуру в обратной ориентации (также называемые РНК с инвертированным кэпом), не являются функциональными по отношению к трансляции кодируемых белков. Таким образом, необходимо включить кэп в правильной ориентации, т.е. в результате получить РНК со структурой кэпа, по существу соответствующей m⁷GpppGpN и т.д. Было показано, что инвертированная интеграция кэп-динуклеотида ингибируется заменой либо 2'-, либо 3'-OH группы метилированного гуанозинового звена (Stepinski et al., 2001; RNA J. 7: 1486-1495; Peng et al., 2002; Org. Lett. 24: 161-164). РНК, которые синтезируются в присутствии таких «антиинвертируемых аналогов кэпа», т.е. ARCA, транслируются более эффективно, чем РНК, которые транскрибируются in vitro в присутствии обычного 5'-кэпа m⁷GpppG. Кроме того, Kore et al. (J. Am. Chem. Soc. 2009, 131: 6364-6365) обнаружили, что аналоги кэпа динуклеотидной мРНК, модифицированные заблокированной нуклеиновой кислотой (LNA), также не включаются в инвертированной ориентации в цепь РНК.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ib) R¹ выбран таким образом, чтобы эукариотический аппарат инициации трансляции был способен распознавать РНК, кэпированную 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, и по меньшей мере один (или оба) из R² и R³ выбраны таким образом, что 5'-кэп соединение не может быть включено в инвертированной ориентации в цепь РНК.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ib) R² и R³ независимо выбраны из группы, состоящей из H, F, OH, метокси, этокси, пропокси и 2-метоксиэтокси. В предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ib) один из R² и R³ представляет собой ОН, а другой не является ОН. В другом предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ib) по меньшей мере один из R² и R³ не является ОН. Например, в одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ib) R² выбран из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси, пропокси и 2-метоксиэтокси, предпочтительно из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси и пропокси.

В любом из вариантов осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ib), описанного выше, кольцевая структура, содержащая заместители R² и R³, может иметь стереохимическую конфигурацию рибозы. В этом варианте осуществления предпочтительно по меньшей мере один из R² и R³ не является ОН.

В тех из приведенных выше вариантов осуществления, где R² (или R³) не является ОН, он предпочтительно выбран из группы, состоящей из H, галогена и необязательно замещенного C₁-C₁₀ алкокси, более предпочтительно из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси, пропокси и 2-метоксиэтокси, более предпочтительно из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси и пропокси. Более предпочтительно он представляет собой метокси.

В предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ib), в частности, когда кольцевая структура, содержащая заместители R² и R³, имеет стереохимическую конфигурацию рибозы, R² представляет собой ОН, а R³ представляет собой метокси, или R² представляет собой метокси, а R³ представляет собой ОН.

В одном из вариантов осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ib) R² и R³ вместе образуют O-X-O, где X выбран из группы, состоящей из CH₂ и C(CH₃)₂, оба из которых могут быть при необходимости замещены.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ib) стереохимическая конфигурация кольцевой структуры, включающей заместители R² и R³, не соответствует стереохимической конфигурации рибозы. Например, стереохимическая конфигурация кольцевой структуры, включающей заместители R² и R³, может соответствовать стереохимической конфигурации арабинозы, ксилозы или ликсозы, в частности, когда стереохимическая конфигурация указанной кольцевой структуры соответствует конфигурации арабинозы. В этих вариантах осуществления предпочтительно оба из R² и R³ являются ОН. Однако в этих вариантах осуществления также возможно, что R² и R³ выбраны, как указано выше.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединение имеет формулу (Ic)

Формула (Iс)

где R¹, R², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁸, n и B имеют значения, указанные выше (в частности, в отношении одной или нескольких формул (I), (Ia) и (Ib)) или ниже, а R⁵ представляет собой S или Se, предпочтительно S. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ic) R⁵ представляет собой S или Se, предпочтительно S, а n равно 1 или 2. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ic) R⁵ представляет собой S, а n равно 1 или 2, предпочтительно 1. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления 5'-кэп-соединения формулы (Ic) предпочтительно R⁴ и R⁶ независимо выбраны из группы, состоящей из O, Se и S, более предпочтительно из группы, состоящей из O и S. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления, где n равно 2 или 3, следует понимать, что R⁶ может быть независимо выбран для каждого [R⁶PO₂] компонента. Например, если n равен 2, 5'-кэп соединение содержит два компонента [R⁶PO₂], где два остатка R⁶ могут быть одинаковыми (например, R⁶ в обоих компонентах [R⁶PO₂] представляет собой O) или разными (например, R⁶ в одном компоненте [R⁶PO₂] представляет собой O, тогда как R⁶ в другом компоненте [R⁶PO₂] представляет собой S). В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ic) R⁵ представляет собой S или Se, предпочтительно S, n равен 1 или 2, предпочтительно 1, и R⁴ и R⁶ независимо выбраны из группы, состоящей из O и S, более предпочтительно R⁴ и R⁶ представляют собой О. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ic) R⁵ представляет собой S, n представляет собой 1 или 2, предпочтительно 1, и R⁴ и R⁶ представляют собой О.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ic) стереохимическая конфигурация у атома P, содержащего заместитель R⁵, соответствует таковой у атома P_β диастереомера D1 бета-S-ARCA.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединение имеет формулу (Id)

Формула (Id)

где R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁸, n и B имеют значения, указанные выше (в частности, в отношении одной или нескольких формул (I), (Ia), (Ib) и (Ic)) или ниже, и R⁷ своим 5'-концом связан с кольцом, к которому присоединен R⁸. В одном варианте осуществления 5'-кэп-соединения формулы (Id) R⁷ представляет собой рибомононуклеотид или рибоолигонуклеотид. В одном предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Id) R⁷ представляет собой рибонуклеотид, имеющий свободную ОН-группу в положении 2'. В другом предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп-соединения формулы (Id) R⁷ представляет собой рибоолигонуклеотид, где как фрагмент рибозы на 3'-конце рибоолигонуклеотида, так и фрагмент рибозы на 5'-конце рибоолигонуклеотида имеют свободную группу ОН в положении 2'. В другом предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Id) R⁷ представляет собой рибоолигонуклеотид, в котором группа ОН в положении 2' по меньшей мере рибозы на 5'-конце рибоолигонуклеотида замещена заместителем, выбранным из группы, состоящей из H, галогена и необязательно замещенного алкокси (такого как H, F, метокси, этокси, пропокси или 2-метоксиэтокси, предпочтительно H, F, метокси, этокси или пропокси, наиболее предпочтительно метокси), и рибоза на 3'-конце рибоолигонуклеотида имеет свободную группу ОН в положении 2'. В любом из приведенных выше вариантов осуществления формулы (Id) предпочтительно межнуклеотидная связь между мононуклеотидом или олигонуклеотидом и кольцом, к которому присоединен R⁷, выбрана из группы, состоящей из фосфата, фосфотиоата, боранофосфата, имидофосфата, алкиленфосфата, фосфодитиоата, алкилфосфоната, фосфотриэфира, фосфоамидита и ненуклеотидного линкера, предпочтительно из группы, состоящей из фосфата, фосфотиоата и фосфодитиоата (в одном варианте осуществления межнуклеотидная связь между мононуклеотидом или олигонуклеотидом и кольцом, к которому присоединен R⁷, является фосфатом). В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления формулы (Id), где R⁷ представляет собой олигонуклеотид, в частности рибоолигонуклеотид, предпочтительно межнуклеотидная связь (связи) между нуклеотидами в олигонуклеотиде выбрана из группы, состоящей из фосфата, фосфотиоата, боранофосфата, имидофосфата, алкиленфосфата, фосфодитиоата, алкилфосфоната, фосфотриэфира, фосфоамидита, и ненуклеотидного линкера, предпочтительно из группы, состоящей из фосфата, фосфотиоата и фосфодитиоата связи (в одном варианте осуществления межнуклеотидная связь (связи) между нуклеотидами в олигонуклеотиде представляет собой фосфат). В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Id) R⁷ представляет собой *[pN(R^8')]_a[pN]_b, где * указывает точку присоединения R⁷ к кольцу, к которому присоединен R⁷; каждый N(R^8') представляет собой нуклеозид (предпочтительно аденозин, гуанозин, уридин, 5-метилуридин или цитидин), который замещен R^8' (выбранным из группы, состоящей из H, галогена и необязательно замещенного алкокси, предпочтительно из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси, пропокси и 2-метоксиэтокси, более предпочтительно из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси и пропокси, наиболее предпочтительно метокси) в положении 2'; каждый N представляет собой рибонуклеозид (предпочтительно аденозин, гуанозин, уридин, 5-метилуридин или цитидин), имеющий свободную группу ОН в положении 2'; каждый p представляет собой фосфатную группу; а равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8; b равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9; и a+b равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 (предпочтительно a равен 0, 1 или 2; b равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и a + b равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6). В одном из вариантов осуществления 5'-кэп соединения формулы (Id) R⁷ представляет собой *pGpN или *pG, где N представляет собой аденозин, гуанозин, уридин, 5-метилуридин или цитидин, и где * указывает точку присоединения R⁷ к кольцу, к которому присоединен R⁷. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Id) R⁷ представляет собой *pm^2'-OGpN, где N представляет собой аденозин, гуанозин, уридин, 5-метилуридин или цитидин, и где * указывает точку присоединения R⁷ к кольцу, к которому присоединен R⁷.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединение имеет формулу (Ie)

Формула (Ie)

где R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ и n имеют значения, указанные выше (в частности, в отношении одной или нескольких формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), и (Id)) или ниже, а B представляет собой природный пуриновый или пиримидиновый фрагмент основания или его модифицированную форму. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ie) B выбран из группы, состоящей из гуанина, аденина, цитозина, тимина, урацила и их модифицированных форм, предпочтительно из группы, состоящей из гуанина, аденина, цитозина, урацила и их модифицированных форм, более предпочтительно из группы, состоящей из гуанина, аденина, цитозина и их модифицированных форм, более предпочтительно из группы, состоящей из гуанина, аденина и их модифицированных форм. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ie) модифицированный пуриновый или пиримидиновый фрагмент основания модифицирован одной или несколькими алкильными группами, предпочтительно одной или несколькими C_1-4 алкильными группами, более предпочтительно одной или несколькими метильными группами. В предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ie) фрагмент из модифицированного пуринового или пиримидинового основания выбран из группы, состоящей из N⁷-алкилгуанина, N⁶-алкиладенина, 5-алкилцитозина, 5-алкилурацила и N(1)-алкилурацила, предпочтительно из группы, состоящей из N⁷-C_1-4 алкилгуанина, N⁶-C_1-4 алкиладенина, 5-C_1-4 алкилцитозина, 5-C_1-4 алкилурацила и N(1)-C_1-4 алкилурацила, более предпочтительно из группы, состоящей из N⁷-метилгуанина, N⁶-метиладенина, 5-метилцитозина, 5-метил-урацила и N(1)-метилурацила. В предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ie) природный пуриновый или пиримидиновый фрагмент основания представляет собой G или A, предпочтительно G. В более предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (Ie) B представляет собой G или A, предпочтительно G.

В любом из вышеуказанных вариантов осуществления 5'-кэп соединения любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) и (Ie) предпочтительно R⁸ выбран из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси, пропокси и 2-метоксиэтокси, более предпочтительно из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси и пропокси. Наиболее предпочтительно в любом из вышеуказанных вариантов осуществления 5'-кэп соединения любой одной из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) и (Ie) R⁸ представляет собой метокси.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединение имеет формулу (II)

Формула (II)

где R¹ выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного C₁-C₄ алкила и необязательно замещенного арила;

R² и R³ независимо выбраны из группы, состоящей из H, F, OH, метокси, этокси, пропокси и 2-метоксиэтокси;

R⁴ и R⁶ независимо выбраны из группы, состоящей из O и S;

R⁵ представляет собой S или Se;

R⁷ представляет собой рибомононуклеотид или рибоолигонуклеотид, содержащий 2, 3, 4, 5 или 6 (например, 2 или 3) оснований;

R⁸ выбран из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси, пропокси и 2-метоксиэтокси;

n равен 1, 2 или 3; и

B представляет собой фрагмент из пуринового или пиримидинового основания.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединение имеет формулу (IIa)

Формула (IIa)

где R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, n и B имеют значения, указанные выше (в частности, в отношении одной или нескольких формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie) и (II)) или ниже, а R¹ выбран из группы, состоящей из метила, этила, бензила, фенилэтила и нафтилметила, более предпочтительно из группы, состоящей из метила и этила. В предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIa) R¹ представляет собой метил или этил, более предпочтительно метил.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединение имеет формулу (IIb)

формула (IIb)

где R¹, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, n и B имеют значения, указанные выше (в частности, в отношении одной или нескольких формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II) и (IIa)) или ниже, и по меньшей мере один из R² и R³ не является OH. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIb) один из R² и R³ представляет собой ОН, а другой не является ОН. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIb) кольцевая структура, содержащая заместители R² и R³, имеет стереохимическую конфигурацию рибозы. В этом варианте осуществления предпочтительно по меньшей мере один из R² и R³ не является ОН. В тех из приведенных выше вариантов осуществления, где R² (или R³) не представляет собой ОН, он предпочтительно выбран из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси и пропокси. Более предпочтительно он представляет собой метокси.

В предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIb), в частности, когда кольцевая структура, содержащая заместители R² и R³, имеет стереохимическую конфигурацию рибозы, R² представляет собой ОН, а R³ представляет собой метокси, или R² представляет собой метокси, а R³ представляет собой ОН.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIb) стереохимическая конфигурация кольцевой структуры, содержащей заместители R² и R³, не соответствует стереохимической конфигурации рибозы. Например, стереохимическая конфигурация кольцевой структуры, включающей заместители R² и R³, может соответствовать стереохимической конфигурации арабинозы, ксилозы или ликсозы, в частности, когда стереохимическая конфигурация указанной кольцевой структуры соответствует конфигурации арабинозы. В этих вариантах осуществления предпочтительно оба из R² и R³ представляют собой ОН. Однако в этих вариантах осуществления также возможно, что R² и R³ выбраны, как указано выше.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединение имеет формулу (IIc)

формула (IIc)

где R¹, R², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁸, n и B имеют значения, указанные выше (в частности, в отношении одной или нескольких формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa) и (IIb)) или ниже. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIc) n равен 1 или 2. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления, где n равен 2 или 3, следует понимать, что R⁶ может быть независимо выбран для каждого [R⁶PO₂] фрагмента. Например, если n равен 2, 5'-кэп соединение содержит два фрагмента [R⁶PO₂], где два остатка R⁶ могут быть одинаковыми (например, R⁶ в обоих фрагментах [R⁶PO₂] представляет собой O) или разными (например, R⁶ в одном фрагменте [R⁶PO₂] представляет собой О, тогда как R⁶ в другом фрагменте [R⁶PO₂] представляет собой S). В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIc) R⁴ и R⁶ представляют собой О. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения из формулы (IIc) n равен 1 или 2, предпочтительно 1, а R⁴ и R⁶ представляют собой О.

В одном варианте осуществления с 5'-кэп соединение имеет формулу (IId)

где R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁸, n и B имеют значения, указанные выше (в частности, в отношении одной или нескольких формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb) и (IIc)) или ниже, а R⁷ связан своим 5'-концом с кольцом, к которому присоединен R⁸. В одном предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IId) R⁷ представляет собой рибонуклеотид, имеющий свободную ОН-группу в положении 2'. В другом предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IId) R⁷ представляет собой рибоолигонуклеотид, где оба фрагмент рибозы на 3'-конце рибоолигонуклеотида и фрагмент рибозы на 5'-конце рибоолигонуклеотида имеют свободную OH-группу в положении 2'. В другом предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IId) R⁷ представляет собой рибоолигонуклеотид, где группа ОН в положении 2' по меньшей мере рибозы на 5'-конце рибоолигонуклеотида замещена заместителем, выбранным из группы, состоящей из H, галогена и необязательно замещенного алкокси (такой, как H, F, метокси, этокси, пропокси или 2-метоксиэтокси, предпочтительно H, F, метокси, этокси или пропокси, наиболее предпочтительно метокси), а рибоза на 3'-конце рибоолигонуклеотида имеет свободную группу ОН в положении 2'. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления формулы (IId) предпочтительно межнуклеотидная связь между мононуклеотидом или олигонуклеотидом и кольцом, к которому присоединен R⁷, выбрана из группы, состоящей из фосфата, фосфотиоата, боранофосфата, имидофосфата, алкиленфосфата, фосфодитиоата, алкилфосфоната, фосфотриэфира, фосфороамидита и ненуклеотидного линкера, более предпочтительно межнуклеотидная связь между мононуклеотидом или олигонуклеотидом и кольцом, к которому присоединен R⁷, является фосфатом. В любом из вышеперечисленных вариантов осуществления формулы (IId), где R⁷ представляет собой олигонуклеотид, в частности рибоолигонуклеотид, предпочтительно межнуклеотидная связь (связи) между нуклеотидами в олигонуклеотиде выбрана из группы, состоящей из фосфата, фосфотиоата, боранофосфата, имидофосфата, алкиленфосфата, фосфодитиоата, алкилфосфоната, фосфотриэфира, фосфоамидита и ненуклеотидного линкера, более предпочтительно межнуклеотидная связь (связи) между нуклеотидами в олигонуклеотиде представляет собой фосфат. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IId) R⁷ представляет собой *[pN(R^8')]_a[pN]_b, где * указывает точку присоединения R⁷ к кольцу, к которому присоединен R⁷; каждый N(R^8') представляет собой нуклеозид (предпочтительно аденозин, гуанозин, уридин, 5-метилуридин или цитидин), который замещен R^8' (выбранным из группы, состоящей из H, галогена и необязательно замещенного алкокси, предпочтительно из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси, пропокси и 2-метоксиэтокси, более предпочтительно из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси и пропокси, наиболее предпочтительно метокси) в положении 2'; каждый N представляет собой рибонуклеозид (предпочтительно аденозин, гуанозин, уридин, 5-метилуридин или цитидин), имеющий свободную группу ОН в положении 2'; каждый p представляет собой фосфатную группу; а равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8; b равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9; и a + b равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 (предпочтительно a равен 0, 1 или 2; b равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и a + b равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6). В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IId) R⁷ представляет собой *pGpN или *pG, где N представляет собой аденозин, гуанозин, уридин, 5-метилуридин или цитидин, и где * указывает точку присоединения R⁷ к кольцу, к которому присоединен R⁷. В одном из вариантов осуществления 5'-кэп соединения формулы (IId) R⁷ представляет собой *pm^2'-OGpN, где N представляет собой аденозин, гуанозин, уридин, 5-метилуридин или цитидин, и где * указывает точку присоединения R⁷ к кольцу, к которому присоединен R⁷.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединение имеет формулу (IIe)

формула (IIe)

где R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ и n имеют значения, указанные выше (в частности, в отношении одной или нескольких формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc) и (IId)) или ниже, а B представляет собой фрагмент из природного пуринового или пиримидинового основания или его модифицированную форму. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIe) B выбран из группы, состоящей из гуанина, аденина, цитозина, тимина, урацила и их модифицированных форм, предпочтительно из группы, состоящей из гуанина, аденина, цитозина, урацила и их модифицированных форм, более предпочтительно из группы, состоящей из гуанина, аденина, цитозина и их модифицированных форм, более предпочтительно из группы, состоящей из гуанина, аденина и их модифицированных форм. В одном варианте осуществления 5'-кэп-соединения формулы (IIe) фрагмент из модифицированного пуринового или пиримидинового основания модифицирован одной или несколькими алкильными группами, предпочтительно одной или несколькими C_1-4 алкильными группами, более предпочтительно одной или несколькими метильными группами. В предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIe) фрагмент из модифицированного пуринового или пиримидинового основания выбран из группы, состоящей из N⁷-алкилгуанина, N⁶-алкиладенина, 5-алкилцитозина, 5-алкилурацила и N(1)-алкилурацила, предпочтительно из группы, состоящей из N⁷-C_1-4 алкилгуанина, N⁶-C_1-4 алкиладенина, 5-C_1-4 алкилцитозина, 5-C_1-4 алкилурацила и N(1)-C_1-4 алкилурацила, более предпочтительно из группы, состоящей из N⁷-метилгуанина, N⁶-метиладенина, 5-метилцитозина, 5-метилурацила и N(1)-метилурацила. В предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIe) фрагмент из природного пуринового или пиримидинового основания представляет собой G или A, предпочтительно G. В более предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIe) B представляет собой G или A, предпочтительно G.

В любом из вышеуказанных вариантов осуществления 5'-кэп соединения любой из формул (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) и (IIe) R⁸ предпочтительно выбран из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси и пропокси. Наиболее предпочтительно в любом из вышеуказанных вариантов осуществления 5'-кэп соединения любой одной из формул (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) и (IIe) R⁸ представляет собой метокси.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединение имеет формулу (III)

формула (III)

где R¹ представляет собой метил, этил, бензил, фенилэтил или нафтилметил, более предпочтительно метил или этил;

R² и R³ независимо выбраны из группы, состоящей из H, F, OH и метокси, где предпочтительно по меньшей мере один из R² и R³ не является OH;

R⁷ представляет собой рибомононуклеотид, рибодинуклеотид или риботринуклеотид, связанный своим 5'-концом с кольцом, к которому присоединен R⁸, где межнуклеотидная связь между рибомонуклеотидом, рибодинуклеотидом или риботринуклеотидом и кольцом, к которому присоединен R⁷, выбрана из группы, состоящей из фосфата, фосфотиоата и фосфодитиоата, и где, если R⁷ представляет собой рибодинуклеотид или риботринуклеотид, межнуклеотидная связь (связи) между нуклеотидами в рибодинуклеотиде или риботринуклеотиде выбрана (выбраны) из группы, состоящей из фосфата, фосфотиоата и фосфодитиоата;

R⁸ выбран из группы, состоящей из H, F и метокси;

n равен 1 или 2; и

B выбран из группы, состоящей из гуанина, аденина, цитозина, тимина и урацила, предпочтительно из группы, состоящей из гуанина, аденина, цитозина и урацила, более предпочтительно из группы, состоящей из гуанина, аденина и цитозина, более предпочтительно из группы, состоящей из гуанина и аденина.

В одном варианте осуществления 5'-кэп соединение имеет формулу (IIIa)

формула (IIIa)

где R¹ представляет собой метил или этил; один из R² и R³ представляет собой ОСН₃, а другой - ОН (например, R² представляет собой ОСН₃, а R³ представляет собой ОН, или R² представляет собой ОН, а R³ представляет собой ОСН₃); R⁸ представляет собой метокси; n равен 1; межнуклеотидная связь между рибодинуклеотидом, рибодинуклеотидом или риботринуклеотидом и кольцом, к которому присоединен R⁷, представляет собой фосфат или фосфотиоат, предпочтительно фосфат, и где, если R⁷ представляет собой рибодинуклеотид или риботринуклеотид, межнуклеотидная связь (связи) между рибодинуклеотидом или риботринуклеотидом представляет(ют) собой фосфат или фосфотиоат, предпочтительно фосфат; и B представляет собой гуанин или аденин, предпочтительно гуанин. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIIa) R⁷ представляет собой рибомононуклеотид, имеющий свободную ОН-группу в положении 2'. В другом предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIIa) R⁷ представляет собой рибодинуклеотид или риботринуклеотид, где как фрагмент рибозы на 3'-конце рибодинуклеотида или риботринуклеотида, так и фрагмент рибозы на 5'-конце рибодинуклеотида или риботринуклеотида имеют свободную группу ОН в положении 2'. В другом предпочтительном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIIa) R⁷ представляет собой рибодинуклеотид или риботринуклеотид, где ОН-группа в положении 2' по меньшей мере рибозы на 5'-конце рибодинуклеотида или риботринуклеотида замещена заместителем, выбранным из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси, пропокси и 2-метоксиэтокси (предпочтительно из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси и пропокси, наиболее предпочтительно указанным заместителем является метокси), а рибоза на 3'-конце рибодинуклеотида или риботринуклеотида имеет свободную ОН-группу в положении 2'. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIIa) R⁷ представляет собой *pGpN или *pG, где N представляет собой аденозин, гуанозин, уридин, 5-метилуридин или цитидин, и где * указывает точку присоединения R⁷ к кольцу, к которому присоединен R⁷. В одном варианте осуществления 5'-кэп соединения формулы (IIIa), R⁷ представляет собой *pm^2'-OGpN, где N представляет собой аденозин, гуанозин, уридин, 5-метилуридин или цитидин, и где * указывает точку присоединения R⁷ к кольцу, к которому присоединен R⁷.

5'-кэп-соединения по настоящему изобретению можно синтезировать, исходя из коммерчески доступных соединений (таких как (pN)_2-4), используя стандартные процедуры. Эти олигонуклеотиды можно превратить в соответствующие производные P-имидазолида путем их реакции с имидазолом в присутствии системы активации (например, 2,2'-дитиодипиридина/трифенилфосфина (2,2'-DTDP); см. Фиг. 1 и Mukaiyama and Hashimoto 1971 (Bull. Chem. Soc. Jpn. 44, 2284 (1971)). Нуклеотидная субъединица, несущая модифицированный фосфатный мостик (например, m2^7,2’-OMeGDPβS), может быть синтезирована, как описано в Kowalska et al. 2008 (RNA 14, 1119-1131 (2008)). Далее, два предшественника могут быть связаны с получением конечного 5'-кэп соединения по настоящему изобретению; см., например, Фиг. 2. Диастереоизомеры можно разделить с помощью ОФ-ВЭЖХ (например, с использованием колонки Discovery Amide RP C16).

Предпочтительно, когда 5'-кэп соединение по настоящему изобретению используют для получения соответственно 5'-кэпированной РНК, структура 5'-кэпа при переносе 5'-кэп-РНК в клетки способна повышать стабильность РНК, снижать или ингибировать распознавание РНК белками, распознающими структуру кэп-0, например белками IFIT (в частности, IFIT1), повышать эффективность трансляции РНК, продлять трансляцию РНК, увеличивать общую экспрессию белка РНК, и/или, если РНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген, повышать иммунный ответ против указанного антигена по сравнению с той же РНК без 5'-кэп структуры. Если РНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген, предпочтительно клетки являются незрелыми антигенпрезентирующими клетками, такими как незрелые дендритные клетки. Специалист в данной области техники может легко определить, способна ли 5'-кэп структура 5'-кэпированной РНК выполнять указанные выше функции, например, путем генерации двух РНК, например, путем транскрипции in vitro, которые отличаются только 5'-кэп структурой, где одна из РНК несет 5'-кэп структуру согласно любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II) , (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa), а другая РНК (контрольная РНК) (i) не содержит 5'-кэп структуры; (ii) несет обычную 5'-кэп мРНК, то есть метил-7-гуанозиновый кэп; или (iii) несет любой другой кэп, с которым функция структуры 5'-кэпа согласно любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III), и (IIIa) будет сопоставимой. Например, сравнительная РНК может нести 5'-кэп структуру, которая соответствует диастереомеру D2 бета-S-ARCA. Особо предпочтительно 5'-кэп структура 5'-кэпированной РНК при переносе модифицированной РНК в клетки способна повышать стабильность РНК, уменьшать или ингибировать распознавание РНК белками, распознающими структуру кэп-0, например, белками IFIT (в частности, IFIT1), повышать эффективность трансляции РНК, продлять трансляцию РНК, увеличивать общую экспрессию белка РНК и/или, если РНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген, усиливать иммунный ответ против указанного антигена по сравнению с эталонной РНК, такой как такая же РНК, имеющая обычный 5'-кэп мРНК.

Предпочтительно стабильность и эффективность трансляции РНК, модифицированной 5'-кэп соединением по настоящему изобретению (в частности, 5'-кэп соединением согласно любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa)) могут быть изменены по мере необходимости. Например, РНК может быть стабилизирована, и ее трансляция может быть усилена одной или несколькими модификациями, обеспечивающими стабилизирующий эффект и/или эффект увеличения эффективности трансляции. Такие модификации, например, описаны в WO 2007/036366, включенном в настоящее описание посредством ссылки.

Например, РНК, имеющая немаскированную последовательность поли-А (немаскированный хвост поли-А), транслируется более эффективно, чем РНК, имеющая маскированную последовательность поли-А. Термин «последовательность поли-А» относится к последовательности остатков аденила (А), которая обычно расположена на 3'-конце молекулы РНК, а «немаскированная последовательность поли-А» означает, что последовательность поли-А на 3'-конце молекулы РНК заканчивается А из последовательности поли-А, и за ним не следуют другие нуклеотиды, кроме А, расположенного на 3'-конце, то есть ниже по последовательности поли-А. Кроме того, длинная последовательность поли-А, состоящая примерно из 120 нуклеотидов, обеспечивает оптимальную стабильность транскрипта и эффективность трансляции.

Таким образом, РНК, предпочтительно мРНК, модифицированная 5'-кэп соединением по настоящему изобретению (в частности, с 5'-кэп соединением согласно любой из формул (I), (Ia), (Ib), ( Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa)) может предпочтительно дополнительно содержать поли-А хвост длиной от 10 до 500, предпочтительно длиной от 30 до 300, более предпочтительно длиной от 65 до 200, более предпочтительно длиной от 100 до 150 нуклеотидов, например, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 нуклеотидов, предпочтительно 120 нуклеотидов. Предпочтительно указанная последовательность поли-А представляет собой немаскированную последовательность поли-А. Таким образом, предпочтительно РНК, предпочтительно мРНК, модифицированная 5'-кэп соединением по настоящему изобретению (в частности, 5'-кэп соединением согласно любой из формул (I), (Ia), (Ib) , (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa)) представляет собой немаскированный поли-А хвост длиной от 10 до 500, предпочтительно длиной от 30 до 300, более предпочтительно длиной от 65 до 200, более предпочтительно длиной от 100 до 150 нуклеотидов, например, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 нуклеотидов, предпочтительно 120 нуклеотидов.

Кроме того, включение 3'-нетранслируемой области (UTR) в 3'-нетранслируемую область молекулы РНК может привести к повышению эффективности трансляции. Синергетический эффект может быть достигнут путем включения двух или более таких 3'-UTR. 3'-UTR могут быть аутологичными или гетерологичными по отношению к РНК, в которую они введены, например, это может быть 3'-UTR мРНК бета-глобина. Таким образом, предпочтительно РНК, предпочтительно мРНК, модифицированная 5'-кэп соединением по настоящему изобретению (в частности, 5'-кэп соединением согласно любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa)) могут дополнительно содержать одну или несколько копий, предпочтительно две копии 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) гена бета-глобина, предпочтительно гена бета-глобина человека.

Кроме того, замена уридина на псевдоуридин или N(1)-метилпсевдоуридин или 5-метилуридин (m5U), приводящая к Ψ-, m1Ψ- или m5U-модифицированным РНК, может снизить иммуногенность модифицированных таким образом РНК. Следовательно, предпочтительно в РНК, предпочтительно мРНК, модифицированной 5'-кэп соединением по настоящему изобретению (в частности, 5'-кэп соединением согласно любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa)) псевдоуридин или N(1)-метилпсевдоуридин или 5-метилуридин (m5U) частично или полностью, предпочтительно полностью, замещает уридин. То есть, в одном предпочтительном варианте осуществления РНК по изобретению является Ψ- или m1Ψ- или m5U-модифицированной, или любой их комбинацией (например, Ψ- и m1Ψ-модифицированной, или Ψ- и m5U-модифицированной, или m1Ψ- и m5U-модифицированной, или Ψ- и m1Ψ- и m5U-модифицированной).

В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеозид, заменяющий один или несколько уридинов в РНК, может быть одним или несколькими из 3-метил-уридина (m3U), 5-метокси-уридина (mo5U), 5-аза-уридина, 6-аза-уридина, 2-тио-5-аза-уридина, 2-тио-уридина (s2U), 4-тио-уридина (s4U), 4-тио-псевдоуридина, 2-тио-псевдоуридина, 5-гидрокси-уридина (ho5U), 5-аминоаллил-уридина, 5-галоген-уридина (например, 5-йод-уридина или 5-бром-уридина), уридин-5-оксиуксусной кислоты (cmo5U), метилового эфира уридин-5-оксиуксусной кислоты (mcmo5U), 5-карбоксиметил-уридина (cm5U), 1-карбоксиметил-псевдоуридина, 5-карбоксигидроксиметил-уридина (chm5U), метилового эфира 5-карбоксигидроксиметил-уридина (mchm5U), 5-метоксикарбонилметил-уридина (mcm5U), 5-метоксикарбонилметил-2-тио-уридина (mcm5s2U), 5-аминометил-2-тио-уридина (nm5s2U), 5-метиламинометил-уридина (mnm5U), 1-этил-псевдоуридина, 5-метиламинометил-2-тио-уридина (mnm5s2U), 5-метиламинометил-2-селено-уридина (mnm5se2U), 5-карбамоилметил-уридина (ncm5U), 5-карбоксиметиламинометил-уридина (cmnm5U), 5-карбоксиметиламинометил-2-тио-уридина (cmnm5s2U), 5-пропинил-уридина, 1-пропинил-псевдоуридина, 5-тауринометил-уридина (τm5U), 1-тауринометил-псевдоуридина, 5-тауринометил-2-тио-уридина (τm5s2U), 1-тауринометил-4-тио-псевдоуридина, 5-метил-2-тио-уридина (m5s2U), 1-метил-4-тио-псевдоуридина (m1s4ψ), 4-тио-1-метил-псевдоуридина, 3-метил-псевдоуридина (m3ψ), 2-тио-1-метил-псевдоуридина, 1-метил-1-деаза-псевдоуридина, 2-тио-1-метил-1-деаза-псевдоуридина, дигидроуридина (D), дигидропсевдоуридина, 5,6-дигидроуридина, 5-метил-дигидроуридина (m5D), 2-тио-дигидроуридина, 2-тио-дигидропсевдоуридина, 2-метокси-уридина, 2-метокси-4-тио-уридина, 4-метокси-псевдоуридина, 4-метокси-2-тио-псевдоуридина, N1-метил-псевдоуридина, 3-(3-амино-3-карбоксипропил)уридина (acp3U), 1-метил-3-(3-амино-3-карбоксипропил)псевдоуридина (acp3 ψ), 5-(изопентениламинометил)уридина (inm5U), 5-(изопентениламинометил)-2-тиоуридина (inm5s2U), α-тиоуридина, 2′-O-метилуридина (Um), 5,2′-O-диметил-уридина (m5Um), 2′-O-метил-псевдоуридина (ψm), 2-тио-2′-O-метил-уридина (s2Um), 5-метоксикарбонилметил-2′-О-метил-уридина (mcm5Um), 5-карбамоилметил-2'-O-метил-уридина (ncm5Um), 5-карбоксиметиламинометил-2'-O-метил-уридина (cmnm5Um), 3,2'-O-диметил-уридина (m3Um), 5-(изопентениламинометил)-2'-O-метил-уридина (inm5Um), 1-тио-уридина, дезокситимидина, 2'-F-ара-уридина, 2'-F-уридина, 2'- ОН-ара-уридина, 5-(2-карбометоксивинил)уридина, 5-[3-(1-E-пропениламино)уридина или любого другого модифицированного уридина, известного в данной области техники.

Особо предпочтительно РНК, предпочтительно мРНК, модифицированная 5'-кэп соединением по настоящему изобретению (в частности, 5'-кэп соединением согласно любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa)) модифицирована комбинацией описанных выше модификаций, т.е. по меньшей мере двумя (например, по меньшей мере 3 или всеми 4) из следующих модификаций: включение последовательности поли-А, демаскирование последовательности поли-А, включение одной или нескольких 3'-UTR, и замена уридина псевдоуридином или N(1)-метилпсевдоуридином, или 5-метилуридином, или их комбинации.

В особо предпочтительном варианте осуществления РНК, предпочтительно мРНК, модифицированная 5'-кэп соединением по настоящему изобретению (в частности, 5'-кэп соединением согласно любой из формул (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III) и (IIIa)) кодирует фармацевтически активный пептид или белок, например выбранный из группы, состоящей из цитокинов, таких как эритропоэтин; молекул адгезии, таких как интегрин; иммуноглобулинов; иммунологически активных соединений, например, антигенов, таких как опухоль-ассоциированные антигены, патоген-ассоциированные антигены (например, один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) антигенов вируса, таких как один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) антигенов вируса гриппа (A, B или C), CMV или RSV), аллергены или аутоантигены; гормонов, таких как вазопрессин, инсулин или гормон роста; факторов роста, таких как VEGFA; ферментов, такие как тимидинкиназа вируса простого герпеса типа 1 (HSV1-TK), гексозаминидаза, фенилаланингидроксилаза, псевдохолинэстераза, ферменты поджелудочной железы или лактаза; рецепторов, таких как рецепторы фактора роста; ингибиторов протеаз, таких как альфа-1-антитрипсин; регуляторов апоптоза, таких как BAX; факторов транскрипции, таких как FOXP3; белков-супрессоров опухолей, таких как р53; структурных белков, таких как сурфактантные белки; факторов перепрограммирования, таких как OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, LIN28 или NANOG; геномно-инженерных белков, таких как ассоциированный с кластеризованными короткими палиндромными повторами с регулярными интервалами (CRISPR) белок 9 (CRISPR-Cas9); и белков крови, таких как фибриноген. Например, фармацевтически активный пептид или белок может быть пептидом или белком, содержащим иммуноген, антиген или антигенный пептид, где пептид или белок может быть подвергнут процессингу после экспрессии с получением указанного иммуногена, антигена или антигенного пептида. В альтернативном варианте сам пептид или белок может быть иммуногеном, антигеном или антигенным пептидом.

Композиции и наборы

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию или набор, включающий 5'-кэп соединение по настоящему изобретению. Такую композицию или набор можно использовать для обеспечения РНК с 5'-кэп структурой по настоящему изобретению и/или для повышения стабильности РНК, например в соответствующих способах, раскрытых в настоящей заявке. В одном варианте осуществления этого аспекта набор может дополнительно содержать реагенты, обычно используемые в реакциях транскрипции in vitro (например, NTP, РНК-полимеразу, один или несколько буферов и/или матрицу ДНК) и/или инструкции по применению.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию, предпочтительно фармацевтическую композицию, содержащую РНК (предпочтительно мРНК), модифицированную 5'-кэп соединением по настоящему изобретению (такая композиция, содержащая РНК по настоящему изобретению, также упоминается здесь как композиция РНК по настоящему изобретению). Композиция, в частности фармацевтическая композиция, в этом аспекте может содержать РНК (предпочтительно мРНК), модифицированную 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает РНК (предпочтительно мРНК), модифицированную 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и одно или несколько дополнительных/ добавочных активных соединений.

В дополнительном аспекте настоящая заявка обеспечивает фармацевтическую композицию, как определено в настоящей заявке, для применения в терапии.

Например, в частности, в тех вариантах осуществления, где РНК, модифицированная 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, включает нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут использоваться в заместительной белковой терапии, геномно-инженерной терапии, терапии перепрограммирования генома или иммунотерапии.

Иллюстративные применения белковой заместительной терапии для РНК или фармацевтических композиций по настоящему изобретению включают лечение (включая профилактическое лечение) состояния, расстройства или заболевания, вызванного сниженной активностью пептида или белка, например анемии (замещающий белок: например, эритропоэтин), диабета (замещающий белок: например, вазопрессин), врожденного заболевания легких (замещающий белок: например, сурфактантный белок B), астмы (замещающий белок: например, FOXP3), инфаркта миокарда (замещающий белок: например, VEGFA), меланомы (замещающий белок: например, BAX), аутоиммунного диабета (замещающий белок: например, IL-4), аутоиммунного миокардита (замещающий белок: например, IL-10), воспаления (замещающие белки: например, Р-селектина гликопротеиновый лиганд-1 (PSGL-1)), Sialyl-Lewisx (SLeX) и IL-10)), дефицита фактора VII (замещающий белок: например, фактор VIIa), гемофилии A (замещающий белок: например, фактор VIII), гемофилии B (замещающий белок: например, фактор IX), дефицита фактора X (замещающий белок: например, фактор X), дефицита фактора XI (замещающий белок: например, фактор XI), дефицита фактора XIII (замещающий белок: например, фактор XIII), болезни фон Виллебранда (замещающий белок: например, фактор фон Виллебранда), дефицита протеина C (замещающий белок: например, протеин C), дефицита антитромбина (замещающий белок: например, антитромбин III), дефицита фибриногена (замещающий белок: например, фибриноген), наследственного ангионевротического отека (замещающий белок: например, ингибитор C1-эстеразы), дефицита α1-PI (замещающий белок: например, альфа-1 ингибитор протеиназ), болезни Гоше (замещающий белок: например, глюкоцереброзидаза), мукополисахаридоза I (замещающий белок: например, альфа-L-идуронидаза), мукополисахаридоза II (замещающий белок: например, идуронатсульфатаза), мукополисахаридоза VI (замещающий белок: например, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатаза), мукополисахаридоза IVA (замещающий белок: например, N-ацетилгалактозамин-6-сульфатаза), мукополисахаридоза IIIA (замещающий белок: например, гепарансульфатсульфатаза), болезни Фабри (замещающий белок: например, альфа-галактозидаза A), болезни Помпе (замещающий белок: например, альфа-глюкозидаза), болезни Ниманна-Пика типа B (замещающий белок: например, кислая сфингомиелиназа), альфа-маннозидоза (замещающий белок: например, альфа-маннозидаза), метахроматической лейкодистрофии (замещающий белок: например, арилсульфатаза A), дефицита LAL (замещающий белок: например, липаза лизосомальной кислоты (LAL)), дефицита сахароизомальтазы (замещающий белок: например, сахароза-изомальтаза), дефицита ADA (замещающий белок: например, аденозиндезаминаза (ADA)), первичного дефицита IGF-1 (замещающий белок: например, инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1)), гипофосфатазии (замещающий белок: например, щелочная фосфатаза) и острой перемежающейся порфирии (замещающий белок: например, порфобилиногендезаминаза).

Иллюстративные применения геномно-инженерной терапии для РНК или фармацевтических композиций по настоящему изобретению включают лечение (включая профилактическое лечение) состояния, нарушения или заболевания, выбранного из группы, состоящей из Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита (X-SCID) (коррекция с помощью ДНК, кодирующей общую гамма-цепь рецептора интерлейкина-2 (IL-2Rγ)), пигментной ксеродермы (коррекция нативной, т.е. немутантной ДНК), а также состояний, расстройств и заболеваний, указанных выше в отношении иллюстративных применений заместительной белковой терапии. Дополнительная геномно-инженерная терапия для РНК или фармацевтических композиций по настоящему изобретению включает редактирование генома с использованием, например, CRISPR/CAS.

Иллюстративные применения терапии с генетическим перепрограммированием для РНК или фармацевтических композиций по настоящему изобретению включают лечение (включая профилактическое лечение) любого из состояний, нарушений и заболеваний, указанных выше в отношении иллюстративных применений заместительной белковой терапии и/или иллюстративных применений геномно-инженерной терапии.

Иллюстративные иммунотерапевтические применения фармацевтических композиций по настоящему изобретению включают лечение (включая профилактическое лечение) состояния, нарушения или заболевания, выбранного из группы, состоящей из инфекционных заболеваний (например, вызванных патогеном, таким как вирусы (например, вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV), бактерии, грибки или другие микроорганизмы); нежелательного воспаления (например, иммунного расстройства); и рака.

Рак (медицинский термин: злокачественное новообразование) - это класс заболеваний, при которых группа клеток демонстрирует неконтролируемый рост (деление за пределы нормы), инвазию (вторжение и разрушение соседних тканей), а иногда и метастазирование (распространение в другие места в тело через лимфу или кровь). Эти три злокачественных свойства раковых опухолей отличают их от доброкачественных опухолей, которые являются само-ограниченными, не характеризуются инвазией и не метастазируют. Большинство видов рака образуют опухоль, то есть опухоль или поражение, образованное аномальным ростом клеток (называемых неопластическими клетками или опухолевыми клетками), но некоторые, например, лейкоз, не образуют опухоли. Термин «рак» в соответствии с изобретением включает лейкозы, семиномы, меланомы, тератомы, лимфомы, нейробластомы, глиомы, рак прямой кишки, рак эндометрия, рак почки, рак надпочечника, рак щитовидной железы, гемобластоз, рак кожи, злокачественную опухоль головного мозга, рак шейки матки, рак кишечника, рак печени, рак толстой кишки, рак желудка, рак тонкой кишки, рак головы и шеи, рак желудочно-кишечного тракта, рак лимфатических узлов, рак пищевода, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак уха, носа и горла (ЛОР), рак молочной железы, рак простаты, рак матки, рак яичника и рак легкого, и их метастазы. Их примерами являются карциномы легких, карциномы молочной железы, карциномы простаты, карциномы толстой кишки, почечно-клеточные карциномы, карциномы шейки матки, или метастазы типов рака или опухолей, описанных выше. Термин «рак» согласно изобретению также включает метастазы рака.

Примеры рака, который можно лечить с помощью РНК и фармацевтических композиций по настоящему изобретению, включают злокачественную меланому, все типы карцином (толстой кишки, почечно-клеточную, мочевого пузыря, предстательной железы, немелкоклеточную и мелкоклеточную карциному легкого и т.д.), лимфомы, саркомы, бластомы, глиомы и др.

Злокачественная меланома – тяжелая разновидность рака кожи. Она обусловлена неконтролируемым ростом пигментных клеток, называемых меланоцитами.

Согласно изобретению «карцинома» представляет собой злокачественную опухоль, происходящую из эпителиальных клеток. Эта группа представляет собой наиболее распространенные виды рака, включая распространенные формы рака молочной железы, простаты, легкого и толстой кишки.

Лимфома и лейкоз - это злокачественные новообразования, происходящие из гемопоэтических (кроветворных) клеток.

Саркома - это злокачественная опухоль, которая возникает из трансформированных клеток в одной из многих тканей, которые развиваются из эмбриональной мезодермы. Таким образом, саркомы включают опухоли костей, хрящей, жировой, мышечной, сосудистой и кроветворной тканей.

Бластная опухоль или бластома - это опухоль (обычно злокачественная), напоминающая незрелую или эмбриональную ткань. Многие из этих опухолей чаще всего встречаются у детей.

Глиома - это тип опухоли, которая развивается в головном или спинном мозге. Она называется глиомой, потому что возникает из глиальных клеток. Наиболее частым местом появления глиом является головной мозг.

Под «метастазированием» подразумевается распространение раковых клеток из исходного участка на другую часть тела. Формирование метастазов - очень сложный процесс, который зависит от отделения злокачественных клеток от первичной опухоли, инвазии внеклеточного матрикса, проникновения через базальные мембраны эндотелия в полость тела и сосуды, а затем, после переноса кровью, инфильтрации органов-мишеней. Наконец, рост новой опухоли, то есть вторичной опухоли или метастатической опухоли, в целевом участке зависит от ангиогенеза. Метастазирование опухоли часто происходит даже после удаления первичной опухоли, поскольку опухолевые клетки или компоненты могут оставаться и развивать метастатический потенциал. В одном варианте осуществления термин «метастаз» согласно изобретению относится к «отдаленному метастазу», который относится к метастазу, удаленному от первичной опухоли и региональной системы лимфатических узлов.

Примеры иммунных нарушений включают аутоиммунные заболевания (например, сахарный диабет, артрит (включая ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит и псориатический артрит), рассеянный склероз, энцефаломиелит, миастению гравис, системную красную волчанку, аутоиммунный тиреоидит, дерматит (включая атопический дерматит и экзематозный дерматит), псориаз, синдром Шегрена, болезнь Крона, афтозную язву, ирит, конъюнктивит, кератоконъюнктивит, язвенный колит, астму, аллергическую астму, сепсис и септический шок, воспалительную болезнь кишечника, кожную красную волчанку, склеродерму, вагинит, проктит, лекарственные высыпания, обратимые лепрозные реакции, узловатую лепрозную эритему, аутоиммунный увеит, аллергический энцефаломиелит, острую некротизирующую геморрагическую энцефалопатию, идиопатическую двустороннюю прогрессирующую нейросенсорную потеря слуха, апластическую анемию, чистую эритроцитарную анемию, идиопатическую тромбоцитопению, полихондрит, гранулематоз Вегенера, хронический активный гепатит, синдром Стивенса-Джонсона, гломерулонефрит, идиопатическую целиакию, плоский лишай, болезнь Грейвса, саркоидоз, первичный билиарный цирроз, задний увеит и интерстициальный фиброз легких, болезнь трансплантат против хозяина, случаи трансплантации, и аллергию, такую как атопическая аллергия; но не ограничиваются ими.

Примеры вирусов включают вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус Эпштейна-Барр (EBV), цитомегаловирус (CMV) (например, CMV5), вирусы герпеса человека (HHV) (например, HHV6, 7 или 8), вирусы простого герпеса (HSV), вирус бычьего герпеса (BHV) (например, BHV4), вирус герпеса лошадей (EHV) (например, EHV2), вирусы Т-клеточного лейкоза человека (HTLV)5, вирус ветряной оспы (VZV), вирус кори, паповавирусы (JC и BK), вирусы гепатита (например, HBV или HCV), вирус миксомы, аденовирус, парвовирусы, вирус полиомы, вирусы гриппа (например, вирус гриппа A, вирус гриппа B или вирус гриппа C), респираторно-синцитиальный вирус (RSV), папилломавирусы и поксвирусы, такие как вирус коровьей оспы и вирус контагиозного моллюска (MCV), а также лиссавирусы, но не ограничиваются ими. Такой вирус может экспрессировать или не экспрессировать ингибитор апоптоза. Примеры заболеваний, вызванных вирусной инфекцией, включают ветряную оспу, цитомегаловирусные инфекции, генитальный герпес, гепатит B и C, грипп и опоясывающий лишай, а также бешенство, но не ограничиваются ими.

Примеры бактерий включают Campylobacter jejuni, виды Enterobacter, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Escherichia coli (например, Е. coli O157: H7), стрептококки группы A, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, листерии, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, S. pneumoniae, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, а также Borrelia и Rickettsia, но не ограничиваются ими. Примеры заболеваний, вызванных бактериальной инфекцией, включают сибирскую язву, холеру, дифтерию, пищевые болезни, проказу, менингит, язвенную болезнь, пневмонию, сепсис, септический шок, сифилис, столбняк, туберкулез, брюшной тиф, инфекции мочевыводящих путей, болезнь Лайма и пятнистую лихорадку Скалистых гор, но не ограничиваются ими.

Конкретные примеры инфекционных заболеваний, которые можно лечить с помощью РНК или фармацевтических композиций по настоящему изобретению, включают вирусные инфекционные заболевания, такие как СПИД (ВИЧ), гепатит A, B или C, герпес, опоясывающий лишай (ветряную оспу), краснуху (вирус краснухи), желтую лихорадку, лихорадку денге; инфекционные заболевания, вызванные флавивирусами; грипп; инфекционные заболевания, вызванные RSV; инфекционные заболевания, вызванные CMV; геморрагические инфекционные заболевания (вирусы Марбург или Эбола); бактериальные инфекционные заболевания (такие как болезнь легионеров (Legionella), язву желудка (Helicobacter), холеру (Vibrio), инфекции, вызванные кишечной палочкой, стафилококками, сальмонеллой или стрептококками (столбняк); инфекции, вызываемые простейшими патогенами, такие как малярия, сонная болезнь, лейшманиоз, токсоплазмоз, то есть инфекции, вызываемые Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania и Toxoplasma, или грибковые инфекции, которые вызваны, например, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis или Candida albicans.

Для применения согласно изобретению, в частности, в форме фармацевтической композиции (например, вакцинной композиции), РНК может представлять собой депротеинизированную РНК или может быть встроена в носитель, например, липосомы или другие частицы для переноса генов, и предпочтительно в форме депротеинизированной РНК.

РНК (предпочтительно мРНК), модифицированная 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть использованы по отдельности или в сочетании с одним или несколькими дополнительными/добавочными активными соединениями, которые можно применять до, одновременно или после введения РНК или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Такое одно или несколько дополнительных/добавочных активных соединений включают иммунодепрессанты (например, для применений, в которых следует избегать или минимизировать индукцию иммунного ответа (например, в заместительной белковой терапии, геномно-инженерной терапии и терапии генетического перепрограммирования, как описано в настоящей заявке)), нуклеиновые кислоты (например, плазмиды), содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок (в частности, в геномно-инженерной терапии, где, например, указанная нуклеотидная последовательность должна быть встроена в геном пациента, например, для того, чтобы заменить соответствующую мутантную нуклеотидную последовательность в геноме пациента), соединения для дифференцировки клеток (например, соединения, которые индуцируют дифференцировку клеток, обладающих характеристиками стволовых клеток, в клетки, экспрессирующие пептид или белок (в частности, фармацевтически активный пептид или белок), в частности в терапии генетического перепрограммирования), химиотерапевтические препараты для онкологических больных (например, гемцитабин, этопофос, цисплатин, карбоплатин), противовирусные агенты, противопаразитарные агенты, антибактериальные агенты, иммунотерапевтические агенты (например, антигены или их фрагменты (в частности, их иммуногенные фрагменты)) и адъюванты, и, если их применяют одновременно с РНК по настоящему изобретению, могут присутствовать в фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

В частности, в случае вакцинной композиции одно или несколько дополнительных/ добавочных активных соединений могут включать иммунотерапевтический агент, предпочтительно иммунотерапевтический агент, индуцирующий или проявляющий целенаправленную, то есть специфическую иммунную реакцию. Таким образом, в одном варианте осуществления РНК и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать в сочетании с иммунотерапевтическим агентом, предпочтительно иммунотерапевтическим агентом, индуцирующим или проявляющим направленную, то есть специфическую иммунную реакцию. Такие иммунотерапевтические агенты включают агенты, направленные против ассоциированного с заболеванием антигена, такие как терапевтические антитела или агенты, индуцирующие иммунный ответ, направленный против ассоциированного с заболеванием антигена или клеток, экспрессирующих ассоциированный с заболеванием антиген. Подходящие иммунотерапевтические агенты включают белки или пептиды, индуцирующие В-клеточный или Т-клеточный ответ против ассоциированного с заболеванием антигена или клеток, экспрессирующих ассоциированный с заболеванием антиген. Эти белки или пептиды могут содержать последовательность, по существу соответствующую или идентичную последовательности ассоциированного с заболеванием антигена, или одного или нескольких его фрагментов. В одном варианте осуществления белок или пептид содержит последовательность презентированного MHC пептида, полученного из ассоциированного с заболеванием антигена. Вместо введения белка или пептида также можно вводить нуклеиновую кислоту, предпочтительно РНК, такую как мРНК, кодирующую белок или пептид. РНК, кодирующая белок или пептид, может представлять собой РНК (предпочтительно мРНК), модифицированную 5'-кэп-соединением по настоящему изобретению. Альтернативно или дополнительно, РНК, кодирующая белок или пептид, может быть другой РНК, не соответствующей настоящему изобретению, которую можно вводить одновременно (в этом случае РНК может составлять часть фармацевтической композиции по изобретению) и/или до и/или после введения фармацевтической композиции по изобретению. Соответственно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может использоваться при генетической вакцинации, где иммунный ответ стимулируют введением в индивидуальную подходящую молекулу нуклеиновой кислоты (ДНК или мРНК), которая кодирует антиген или его фрагмент.

В одном варианте осуществления ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой ассоциированный с опухолью антиген. В этом варианте осуществления РНК (предпочтительно мРНК), модифицированная 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, и фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть полезны при лечении рака или метастазов рака. Предпочтительно больной орган или ткань характеризуется больными клетками, такими как раковые клетки, экспрессирующие ассоциированный с заболеванием антиген и/или характеризующиеся ассоциацией связанного с заболеванием антигена с их поверхностью. Иммунизация интактным или практически интактным антигеном, ассоциированным с опухолью, или его фрагментами, такими как пептиды или нуклеиновые кислоты класса I и II класса MHC, в частности мРНК, кодирующая такой антиген или фрагмент, позволяет вызвать ответ MHC класса I и/или класса II и, таким образом, стимулирует Т-клетки, такие как цитотоксические Т-лимфоциты CD8+, которые способны лизировать раковые клетки, и/или Т-клетки CD4+. Такая иммунизация может также вызывать гуморальный иммунный ответ (ответ В-клеток), приводящий к продукции антител против антигена, ассоциированного с опухолью. Кроме того, антигенпрезентирующие клетки (APC), такие как дендритные клетки (DC), могут быть загружены пептидами, презентированными MHC класса I, непосредственно или путем трансфекции нуклеиновыми кислотами, кодирующими опухолевые антигены или пептиды опухолевых антигенов, in vitro, и введены пациенту.

Согласно настоящему изобретению ассоциированный с опухолью антиген предпочтительно включает любой антиген, который характерен для опухолей или рака, а также для опухолевых или раковых клеток в отношении типа и/или уровня экспрессии. В одном варианте осуществления термин «ассоциированный с опухолью антиген» относится к белкам, которые в нормальных условиях, то есть у здорового человека, специфически экспрессируются в ограниченном количестве органов и/или тканей или на определенных стадиях развития, например ассоциированный с опухолью антиген может в нормальных условиях специфически экспрессироваться в ткани желудка, предпочтительно в слизистой оболочке желудка, в репродуктивных органах, например в яичках, в трофобластической ткани, например в плаценте или в клетках зародышевой линии, и экспрессируется или аберрантно экспрессируется в одной или нескольких опухолях или раковых тканях. В этом контексте «ограниченное количество» предпочтительно означает не более 3, более предпочтительно не более 2 или 1. Антигены, ассоциированные с опухолью, в контексте настоящего изобретения включают, например, дифференцировочные антигены, предпочтительно дифференцировочные антигены, специфичные для определенного типа клеток, т.е. белки, которые в нормальных условиях специфически экспрессируются в определенном типе клеток на определенной стадии дифференцировки, раковые/тестикулярные антигены, то есть белки, которые в нормальных условиях специфически экспрессируются в семенниках, а иногда и в плаценте, и специфические антигены зародышевой линии. В контексте настоящего изобретения ассоциированный с опухолью антиген предпочтительно ассоциирован с клеточной поверхностью раковой клетки и предпочтительно не экспрессируется в нормальных тканях или экспрессируется очень редко. Предпочтительно ассоциированный с опухолью антиген или аберрантная экспрессия ассоциированного с опухолью антигена идентифицируют раковые клетки. В контексте настоящего изобретения ассоциированный с опухолью антиген, который экспрессируется раковой клеткой у индивидуума, например, пациента, страдающего раковым заболеванием, предпочтительно представляет собой собственный белок у указанного индивидуума. В предпочтительных вариантах осуществления ассоциированный с опухолью антиген в контексте настоящего изобретения экспрессируется в нормальных условиях, в частности, в ткани или органе, которые не являются необходимыми, то есть в тканях или органах, которые при повреждении иммунной системой не приводят к смерти индивидуума, либо в органах или структурах тела, которые недоступны или едва доступны для иммунной системы. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность ассоциированного с опухолью антигена идентична между ассоциированным с опухолью антигеном, который экспрессируется в нормальных тканях, и ассоциированным с опухолью антигеном, который экспрессируется в раковых тканях. Предпочтительно ассоциированный с опухолью антиген представлен в контексте молекул MHC раковой клеткой, в которой он экспрессируется.

Примерами диференцировочных антигенов, которые идеально соответствуют критериям опухоль-ассоциированных антигенов, предусмотренных настоящим изобретением в качестве структур-мишеней в иммунотерапии опухолей, в частности, при вакцинации против опухолей, являются белки клеточной поверхности семейства клаудина, такие как CLDN6 и CLDN18.2. Эти дифференцировочные антигены экспрессируются в опухолях различного происхождения и особенно подходят в качестве структур-мишеней в связи с опосредованной антителами иммунотерапией рака из-за их селективной экспрессии (отсутствия экспрессии в нормальной ткани, для которой возможно проявление токсичности) и локализации на плазматической мембране.

Конкретными примерами антигенов, которые могут применяться в настоящем изобретении, являются антигены, которые явно указаны в настоящей заявке, включая p53 и WT-1.

РНК или фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению обычно применяются в «фармацевтически приемлемых количествах» и в «фармацевтически приемлемых препаратах». Термин «фармацевтически приемлемый» относится к нетоксичности материала, который не влияет на действие активного агента (агентов) фармацевтической композиции.

«Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое само по себе или в сочетании с дополнительными дозировками приводит к необходимой реакции или необходимому эффекту. В случае терапии определенного заболевания или конкретного состояния необходимая реакция связана с торможением развития болезни. Это включает замедление прогрессирования болезни, в частности, остановку прогрессирования болезни. Необходимой реакцией на терапию заболевания или состояния также может быть замедление возникновения или ингибирование возникновения заболевания или состояния. Эффективное количество композиции согласно настоящему изобретению зависит от состояния или заболевания, тяжести заболевания, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физиологическое состояние, рост и массу тела, продолжительность лечения, тип необязательной сопутствующей терапии, конкретного пути введения и подобных факторов. В случае, если реакция пациента на начальную дозу недостаточна, могут применяться более высокие дозировки (или более высокие эффективные дозировки, которые могут быть достигнуты более локализованным путем введения). В общем, для лечения, или для индукции или усиления иммунной реакции у человека предпочтительно готовят и применяют дозы РНК в диапазоне от 1 нг до 700 мкг, от 1 нг до 500 мкг, от 1 нг до 300 мкг, от 1 нг до 200 мкг, или от 1 нг до 100 мкг.

Согласно настоящему изобретению применение РНК (такой как мРНК) осуществляют либо в виде депротеинизированной нуклеиновой кислоты, либо в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами. Предпочтительно введение нуклеиновых кислот осуществляют в форме депротеинизированных нуклеиновых кислот. Предпочтительно РНК вводят в сочетании со стабилизирующими веществами, такими как ингибиторы РНКаз. Настоящее изобретение также предусматривает повторное введение нуклеиновых кислот в клетки для обеспечения устойчивой экспрессии в течение продолжительных периодов времени. Однако из-за присутствия 5'-кэп-структуры по настоящему изобретению и, возможно, других стабилизирующих модификаций, РНК по настоящему изобретению предпочтительно демонстрируют то преимущество, что их можно вводить реже, чем РНК, не содержащие 5'-кэп-структуру из настоящего изобретения. Таким образом, использование РНК по настоящему изобретению предпочтительно обеспечивает пользу для пациента, заключающуюся в том, что, например, в отношении заместительной белковой терапии, требуется меньшее количество введений (таких как инъекции) РНК (или фармацевтических композиций) по настоящему изобретению для достижения необходимого эффекта (например, экспрессии необходимого пептида или белка в количестве, достаточном для поддержания функций пациента (например, для поддержания гомеостаза пациента)). Таким образом, в одном варианте осуществления РНК по изобретению (например, композицию РНК или фармацевтическую композицию по изобретению) вводят пациенту (например, путем инъекции, такой как интраперитонеальная, внутримышечная или интрадермальная инъекция) не более одного раза в сутки (то есть период времени между двумя введениями составляет по меньшей мере 24 часа, например, по меньшей мере 30 часов, по меньшей мере 36 часов или по меньшей мере 42 часа), предпочтительно не более одного раза в два дня (т.е. период времени между двумя введениями составляет по меньшей мере 48 часов, например, по меньшей мере 54 часа, по меньшей мере 60 часов или по меньшей мере 66 часов), предпочтительно не более одного раза в три дня (т.е. период времени между двумя введениями составляет по меньшей мере 72 часа, например, по меньшей мере 78 часов, по меньшей мере 84 часов или 90 часов) или не более одного раза в четыре дня (т.е. период времени между двумя введениями составляет по меньшей мере 96 часов, например, по меньшей мере 102 часа, по меньшей мере 108 часов или по меньшей мере 114 часов). Соответственно, настоящее изобретение особенно полезно для хронических пациентов и/или длительно болеющих пациентов, например, пациентов, которые лечатся в течение длительного периода времени, например, которые получают РНК по изобретению (например, композицию РНК или фармацевтическую композицию по изобретению) в течение длительного периода времени, при этом длительный период времени предпочтительно составляет по меньшей мере 1 неделю, например, по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 3 недели, по меньшей мере 4 недели, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 2 года, по меньшей мере 3 года, по меньшей мере 4 года, по меньшей мере 5 лет или по меньшей мере 10 лет, например, до 2 недель, до 3 недель, до 4 недель, до 1 месяца, до 2 месяцев, до 3 месяцев, до 4 месяцев, до 5 месяцев, до 6 месяцев, до 12 месяцев, до 2 лет, до 3 лет или до 4 лет, до 5 лет, до 10 лет или в течение всей жизни пациента. Таким образом, в одном варианте осуществления РНК по настоящему изобретению (например, композицию РНК или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению) вводят хроническому пациенту или длительно болеющему пациенту (например, путем инъекции, такой как интраперитонеальная, внутримышечная или интрадермальная инъекция) не более одного раза в сутки (т.е. период времени между двумя введениями составляет по меньшей мере 24 часа, например, по меньшей мере 30 часов, по меньшей мере 36 часов или по меньшей мере 42 часа), предпочтительно не более одного раза в два дня (т.е. период между двумя введениями составляет по меньшей мере 48 часов, например, по меньшей мере 54 часа, по меньшей мере 60 часов или по меньшей мере 66 часов), предпочтительно не чаще одного раза в три дня (т.е. период времени между двумя введениями составляет по меньшей мере 72 часа, например, по меньшей мере 78 часов, по меньшей мере 84 часа или по меньшей мере 90 часов) или не более одного раза в четыре дня (то есть период времени между двумя введениями составляет по меньшей мере 96 часов, например, по меньшей мере 102 часа, по меньшей мере 108 часов или не менее 114 часов) в течение длительного периода времени, в частности, по меньшей мере 1 недели, например, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, по меньшей мере 4 недель, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 3 лет, по меньшей мере 4 лет, по меньшей мере 5 лет или по меньшей мере 10 лет, например, до 2 недель, до 3 недель, до 4 недель, до 1 месяца, до 2 месяцев, до 3 месяцев, до 4 месяцев, до 5 месяцев, до 6 месяцев, до 12 месяцев, до 2 лет, до 3 лет или до 4 лет, до 5 лет, до 10 лет или в течение всей жизни хронического или длительно болеющего пациента.

Клетки можно трансфицировать с любыми вспомогательными веществами (в частности, носителями), с которыми РНК может быть связана, например, путем образования комплексов с РНК или образования везикул, в которые РНК заключена или инкапсулирована, что приводит к повышению стабильности РНК по сравнению с депротеинизированной РНК. Вспомогательные вещества (в частности, носители), используемые согласно изобретению, включают, например, липидсодержащие носители, такие как катионные липиды, липосомы, в частности катионные липосомы, мицеллы и наночастицы. Катионные липиды могут формировать комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. В соответствии с изобретением можно использовать любой катионный липид. Кроме того, клетки могут быть взяты у индивидуума, клетки могут быть трансфицированы РНК или фармацевтической композицией по изобретению, и трансфицированные клетки могут быть введены индивидууму.

Предпочтительно введение РНК, кодирующей пептид или полипептид, в клетку, в частности в клетку, присутствующую in vivo, приводит к экспрессии указанного пептида или полипептида в клетке. В конкретных вариантах осуществления предпочтительным является таргетинг нуклеиновых кислот на конкретные клетки. В таких вариантах осуществления носитель, который применяется для введения нуклеиновой кислоты в клетку (например, ретровирус или липосома), представляет собой таргетирующую молекулу. Например, молекула, такая как антитело, которая специфична к белку поверхностной мембраны на клетке-мишени или лиганду рецептора на клетке-мишени, может быть включена в носитель нуклеиновой кислоты или может быть связана с ним. В случае, если нуклеиновую кислоту вводят с помощью липосом, белки, которые связываются с белком поверхностной мембраны, ассоциированным с эндоцитозом, могут быть включены в липосомную композицию для обеспечения таргетинга и/или поглощения. Такие белки включают капсидные белки или их фрагменты, которые специфичны для определенного типа клеток, антитела против белков, которые интернализуются, белки, нацеленные на внутриклеточную локализацию, и т.д.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описанная здесь кэпированная РНК может присутствовать в липоплексных частицах РНК. Липоплексные частицы РНК и композиции, содержащие липоплексные частицы РНК, описанные в настоящей заявке, полезны для доставки кэпированной РНК, описанной в настоящем документе, в ткань-мишень после парентерального введения, в частности после внутривенного введения. Липоплексные частицы РНК могут быть получены с использованием липосом, которые могут быть приготовлены путем инъекции раствора липидов в этаноле в воду или подходящую водную фазу. В одном варианте осуществления водная фаза имеет кислый pH. В одном варианте осуществления водная фаза содержит уксусную кислоту, например, в количестве примерно 5 мМ. В одном варианте осуществления липосомы и липоплексные частицы РНК содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид. В одном варианте осуществления по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмоний пропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний пропан (DOTAP). В одном варианте осуществления по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC). В одном варианте осуществления по меньшей мере один катионный липид включает 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмоний пропан (DOTMA), а по меньшей мере один дополнительный липид включает 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn- глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE). В одном варианте осуществления липосомы и липоплексные частицы РНК содержат 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмоний пропан (DOTMA) и 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE). Липосомы можно использовать для получения липоплексных частиц РНК путем смешивания липосом с РНК. Конкретные липоплексные частицы РНК, нацеленные на селезенку, описаны в WO 2013/143683, включенном в настоящее описание посредством ссылки. Было обнаружено, что липоплексные частицы РНК, имеющие суммарный отрицательный заряд, могут быть использованы для преимущественного таргетинга на ткань селезенки или клетки селезенки, такие как антигенпрезентирующие клетки, в частности дендритные клетки. Соответственно, после введения липоплексных частиц РНК происходит накопление РНК и/или экспрессия РНК в селезенке. Таким образом, липоплексные частицы РНК по настоящему описанию можно использовать для экспрессии РНК в селезенке. В одном из вариантов осуществления после введения липоплексных частиц РНК не происходит или практически не происходит накопления РНК и/или экспрессии РНК в легких и/или печени. В одном варианте осуществления после введения липоплексных частиц РНК происходит накопление РНК и/или экспрессия РНК в антигенпрезентирующих клетках, таких как профессиональные антигенпрезентирующие клетки в селезенке. Таким образом, липоплексные частицы РНК по настоящему описанию можно использовать для экспрессии РНК в таких антигенпрезентирующих клетках. В одном варианте осуществления антигенпрезентирующие клетки представляют собой дендритные клетки и/или макрофаги.

Термин «вспомогательное вещество» при использовании в настоящей заявке предназначен для обозначения всех веществ в фармацевтической композиции, которые не являются активными агентами (например, которые являются терапевтически неактивными ингредиентами, которые не проявляют никакого терапевтического эффекта в используемом количестве/концентрации), например солей, носителей, связующих агентов, любрикантов, загустителей, поверхностно-активных агентов, диспергирующих агентов, консервантов, эмульгаторов, буферных агентов, смачивающих агентов, ароматизаторов, красителей, стабилизирующих агентов (таких как ингибиторы РНКазы) или антиоксидантов, все из которых предпочтительно являются фармацевтически приемлемыми.

«Фармацевтически приемлемые соли» включают, например кислотно-аддитивные соли, которые могут, например, быть образованы с использованием фармацевтически приемлемой кислоты, такой как соляная кислота, серная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, уксусная кислота, бензойная кислота, лимонная кислота, винная кислота, угольная кислота или фосфорная кислота. Кроме того, подходящие фармацевтически приемлемые соли могут включать соли щелочных металлов (например, соли натрия или калия); соли щелочноземельных металлов (например, соли кальция или магния); соли аммония (NH₄⁺); и соли, образованные с подходящими органическими лигандами (например, четвертичным аммонием и катионами амина, образованными с использованием противоанионов, таких как галогенид, гидроксид, карбоксилат, сульфат, фосфат, нитрат, алкилсульфонат и арилсульфонат). Иллюстративные примеры фармацевтически приемлемых солей включают ацетат, адипат, альгинат, аргинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бикарбонат, бисульфат, битартрат, борат, бромид, бутират, кальция эдетат, камфорат, камфорсульфонат, камсилат, карбонат, хлорид, цитрат, клавуланат, циклопентанпропионат, диглюконат, дигидрохлорид, додецилсульфат, эдетат, эдисилат, эстолат, эзилат, этансульфонат, формиат, фумарат, галактат, галактуронат, глюцептат, глюкогептонат, глюконат, глутамат, глицерофосфат, гликолиларсанилат, гемисульфат, гептонат, гексаноат, гексилрезорцинат, гидрабамин, гидробромид, гидрохлорид, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, гидроксинафтоат, иодид, изобутират, изотионат, лактат, лактобионат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, миндалят, мезилат, метансульфонат, метилсульфат, мукат, 2-нафталинсульфонат, напсилат, никотинат, нитрат, N-метилглюкамина аммонийную соль, олеат, оксалат, памоат (эмбонат), пальмитат, пантотенат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат/дифосфат, фталат, пикрат, пивалат, полигалактуронат, пропионат, салицилат, стеарат, сульфат, суберат, сукцинат, таннат, тартрат, теоклат, тозилат, триэтиодид, ундеканоат, валерат и т.п., но не ограничиваются ими (см., например, S.M. Berge et al., «Pharmaceutical Salts», J. Pharm. Sci., 66, pp. 1-19 (1977)). Соли, которые не являются фармацевтически приемлемыми, могут быть использованы для получения фармацевтически приемлемых солей и включены в настоящее изобретение.

Композиции согласно настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый носитель. Используемый в настоящей заявке термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию, и т.п., которые являются физиологически совместимыми. «Фармацевтически приемлемый носитель» может быть в форме твердого, полутвердого, жидкого вещества или их комбинаций.

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии, стерильные неводные растворы или дисперсии, и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных агентов известно в данной области техники. За исключением случаев, когда любая обычная среда или агент несовместимы с активным агентом, предполагается их использование в фармацевтических композициях по настоящему изобретению. Примеры фармацевтически приемлемых носителей для инъекционного состава включают воду, изотонический буферный солевой раствор (например, раствор Рингера или Рингер-лактат), этанол, полиолы (например, глицерин), полиалкиленгликоли (например, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), гидрированные нафталины и в частности, биосовместимые лактидные полимеры (например, сополимеры лактида/гликолида или сополимеры полиоксиэтилена/полиоксипропилена).

Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и тому подобное; (2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и тому подобное; и (3) металл-хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбитол, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.

Подходящие буферные агенты для использования в фармацевтических композициях по изобретению включают уксусную кислоту в соли, лимонную кислоту в соли, борную кислоту в соли и фосфорную кислоту в соли.

Подходящие консерванты для использования в фармацевтических композициях по изобретению включают различные антибактериальные и противогрибковые агенты, такие как бензалкония хлорид, хлорбутанол, парабен, сорбиновая кислота и мертиолят. Предотвращение присутствия микроорганизмов также может быть обеспечено процедурами стерилизации (например, стерилизующей фильтрацией), в частности стерилизующей микрофильтрацией).

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может применяться у индивидуума любым путем, предпочтительно парентерально. Выражения «парентеральное введение» и «вводимый парентерально» в контексте настоящего описания означают способы введения, отличные от энтерального введения («энтеральное введение» и «вводимое энтерально» в контексте настоящего описания означают, что вводимое лекарство попадает в желудок и/или кишечник). Парентеральное введение обычно осуществляют путем инъекции и/или инфузии, и оно включает внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интратекальное, интракапсулярное, внутрикостное, интраорбитальное, внутрисердечное, интранодальное, интрадермальное, интраперитонеальное, транстрахеальное, подкожное, субкутикулярное, внутрисуставное, субкапсулярное, интрацеребральное, интрацеребровентрикулярное, субарахноидальное, интраспинальное, эпидуральное, интрастернальное и местное введение, но не ограничивается ими. Для применений, отличных от иммунотерапии (например, для заместительной белковой терапии, геномно-инженерной терапии или терапии генетического перепрограммирования), фармацевтическую композицию по изобретению вводят интраперитонеально, внутримышечно или интрадермально. Для иммунотерапевтических применений фармацевтическую композицию по изобретению предпочтительно вводят внутривенно, интраперитонеально, внутримышечно, подкожно, внутрилимфатически, итрадермально или интранодально, более предпочтительно интрадермально или интранодально, например, путем интранодальной инъекции.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить множеством способов, известных в данной области техники. Как будет понятно специалисту в данной области техники, путь и/или способ введения будут варьироваться в зависимости от необходимых результатов.

Активные агенты (т.е. РНК по изобретению и, при необходимости, одно или несколько дополнительных/добавочных активных соединений) могут быть приготовлены с носителями, которые будут защищать соединения от быстрого высвобождения, такими как состав с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы доставки. Могут использоваться биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы приготовления таких составов обычно известны специалистам в данной области техники. См., например, «Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems», J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Для применения активного агента (то есть РНК по изобретению и, при необходимости, одного или нескольких дополнительных/добавочных активных соединений) определенными путями введения может быть необходимо покрыть активный агент или совместно ввести соединение с материалом для предотвращения его инактивации и/или повышения эффективности активного агента (в частности, РНК по изобретению), подлежащего трансляции. Например, активный агент может быть введен индивидууму в подходящем носителе, например, липидсодержащих носителях (в частности, катионных липидах), липосомах (таких как эмульсии CGF вода-в-масле-в-воде, а также в обычных липосомах (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7: 27 (1984)), в частности катионных липосомах), мицеллах, наночастицах, в которых заключена или инкапсулирована РНК, или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический раствор и водные буферные растворы.

Фармацевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть приготовлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и сложные органические эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования материала покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и за счет использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительно включать в фармацевтическую композицию изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция композиций для инъекций может быть достигнута путем включения в композицию агента, замедляющего абсорбцию, например, моностеаратных солей и желатина.

Обычно дисперсии готовят путем включения активного агента в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация (лиофильная сушка), которые обеспечивают порошок активного агента плюс любого дополнительного необходимого ингредиента из его раствора, предварительно стерилизованного фильтрацией.

Режимы дозирования корректируют для обеспечения оптимального необходимого ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно вводить один болюс, можно вводить несколько разделенных доз с течением времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от потребностей терапевтической ситуации. Особо предпочтительно составлять фармацевтические композиции в виде стандартной лекарственной формы для простоты введения и единообразия дозировки. Используемая в настоящей заявке стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве стандартных доз для индивидуумов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заранее определенное количество активного агента, рассчитанное на достижение необходимого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению продиктована и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик активного агента и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, и (b) ограничений, присущих области приготовления такого активного агента для лечения чувствительности у индивидуумов. Количество активного агента (в частности, количество РНК), которое может быть объединено с материалом носителя для получения фармацевтической композиции (такой как однодозовая лекарственная форма), будет варьироваться в зависимости от индивидуума, которого лечат, и конкретного способа введения. Количество активного агента, которое можно объединить с материалом носителя для получения однодозовой лекарственной формы, обычно будет таким количеством композиции, которое оказывает терапевтический эффект.

Обычно из 100% (для фармацевтических составов/композиций) количество активного агента (в частности, количества РНК по настоящему изобретению, при необходимости вместе с одним или несколькими дополнительными/добавочными активными соединениями, если они присутствуют в фармацевтических составах/композициях) будет составлять примерно от 0,01% до 99%, предпочтительно примерно от 0,1% до 70%, наиболее предпочтительно примерно от 1% до 30%, при этом остальное предпочтительно состоит из одного или нескольких фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.

Количество активного агента, например, РНК по настоящему изобретению, в стандартной лекарственной форме и/или при введении индивидууму или при использовании в терапии может варьироваться примерно от 0,001 мг до 1000 мг (например, примерно от 0,01 мг до 500 мг, примерно от 0,1 мг до 100 мг, например приблизительно от 1 мг до 50 мг) на единицу, введение или терапию. В некоторых вариантах осуществления подходящее количество такого активного агента может быть рассчитано с использованием массы или площади поверхности тела человека, включая количества примерно от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг (например, приблизительно от 0,2 мг/кг до 5 мг/кг) или примерно от 0,1 мг/м² до 400 мг/м² (например, приблизительно от 0,3 мг/м² до 350 мг/м² или примерно от 1 мг/м² до 200 мг/м²).

Независимо от выбранного пути введения активные агенты (т.е. РНК и, возможно, одно или несколько дополнительных/добавочных активных соединений), которые можно использовать в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции по настоящему изобретению готовят в виде фармацевтически приемлемых дозированных форм обычными способами, известными специалистам в данной области техники (см., например, Remington, «The Science and Practice of Pharmacy» edited by Allen, Loyd V., Jr., 22nd edition, Pharmaceutical Sciences, September 2012; Ansel et al., «Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems», 7th edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999).

Фактические уровни дозировки активных агентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению можно варьировать, чтобы получить количество активного агента, которое эффективно для достижения необходимого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения без токсичности для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от множества фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых композиций по настоящему изобретению, способ введения, время введения, скорость выведения конкретного применяемого активного агента, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в комбинации с конкретными применяемыми композициями, возраст, пол, массу тела, состояние, общее состояние здоровья и предшествующий медицинский анамнез пациента, которого лечат, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины.

Врач или ветеринар, являющийся средним специалистом в данной области техники, может легко определить и прописать эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с доз активных агентов, используемых в фармацевтической композиции, на уровнях ниже, чем требуемые для достижения необходимого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу до тех пор, пока не будет достигнут необходимый эффект. В общем, подходящей суточной дозой фармацевтической композиции по изобретению будет такое количество активного агента, которое является самой низкой дозой, эффективной для получения терапевтического эффекта. Такая эффективная доза обычно зависит от факторов, описанных выше. Предпочтительно введение является парентеральным, таким как внутривенное, внутримышечное, интраперитонеальное или подкожное, предпочтительно проксимально от участка-мишени. Введение также может быть внутриопухолевым. Если необходимо, эффективная суточная доза фармацевтической композиции может быть введена в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более субдоз, вводимых отдельно с соответствующими интервалами в течение дня, при необходимости в стандартных лекарственных формах. Хотя можно вводить активный агент (в частности, РНК) по настоящему изобретению отдельно, предпочтительно вводить активный агент в виде фармацевтического состава/ композиции.

В одном варианте осуществления РНК или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить путем инфузии, предпочтительно медленной непрерывной инфузии в течение длительного периода, например, более 24 часов, для уменьшения токсических побочных эффектов. Введение также можно осуществлять путем непрерывной инфузии в течение периода от 2 до 24 часов, например, от 2 до 12 часов. Такой режим можно повторять один или несколько раз по мере необходимости, например, через 6 или 12 месяцев.

Фармацевтическая композиция по изобретению может быть приготовлена для парентерального введения путем инъекции, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Составы для инъекций могут быть представлены в виде стандартных дозированных форм (например, во флаконе, в многодозовом контейнере) и с добавленным консервантом. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может иметь такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и может содержать агенты для составления композиций, такие как суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие агенты. В качестве альтернативы агент может быть в форме порошка для смешивания с подходящим носителем (например, стерильной апирогенной водой) перед использованием. Обычно фармацевтические композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости фармацевтическая композиция может также включать солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Обычно ингредиенты поставляются либо по отдельности, либо в смеси в стандартной лекарственной форме, например в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. Если фармацевтическую композицию следует вводить путем инфузии, ее можно отпускать в виде флакона для инфузии, содержащего стерильную воду или физиологический раствор фармацевтического качества. Если композицию вводят путем инъекции, может быть предоставлена ампула стерильной воды для инъекций или физиологического раствора, чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.

Фармацевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в данной области техники. Например, в предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по изобретению может быть введена с помощью устройства для подкожных инъекций без иглы, такого как устройства, описанные в патентах US 5,399,163; US 5,383,851; US 5,312,335; US 5,064,413; US 4,941,880; US 4,790,824; или US 4,596,556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей, используемых в настоящем изобретении, включают имплантаты, описанные в патенте US 4,487,603, в котором раскрывается имплантируемый микроинфузионный насос для дозирования лекарства с контролируемой скоростью; US 4,486,194, в котором раскрыто терапевтическое устройство для введения лекарственных средств через кожу; US 4,447,233, в котором раскрыт насос для инфузии лекарств для доставки лекарства с точной скоростью инфузии; US 4,447,224, в котором раскрывается имплантируемый инфузионный аппарат с регулируемым потоком для непрерывной доставки лекарственного средства; патенте US 4,439,196, в котором раскрыта осмотическая система доставки лекарственного средства, имеющая многокамерные отсеки; и US 4,475,196, в котором раскрыта система осмотической доставки лекарственного средства.

Многие другие такие имплантаты, системы доставки и модули известны специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления РНК или фармацевтические композиции по изобретению могут быть составлены для обеспечения надлежащего распределения in vivo. Например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) исключает многие высокогидрофильные соединения. Чтобы гарантировать, что РНК или фармацевтические композиции по изобретению пересекают ГЭБ (если это необходимо), они могут быть составлены, например, в липосомах. Относительно способов производства липосом см., например, US 4,522,811; US 5,374,548; и US 5,399,331. Липосомы могут содержать один или несколько фрагментов, которые селективно транспортируются в определенные клетки или органы и, таким образом, улучшают направленную доставку лекарственного средства (см., например, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Примеры таргетинговых групп включают фолат или биотин (см., например, US 5,416,016, Low et al.); маннозиды (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); антитела (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); и рецептор сурфактантного белка А (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134).

В одном варианте осуществления изобретения РНК по изобретению составлена в липосомах. В более предпочтительном варианте липосомы включают таргетинговый фрагмент. В наиболее предпочтительном варианте осуществления РНК в липосомах доставляется болюсной инъекцией к месту, проксимальному к необходимой области. Такая композиция на основе липосом должна быть текучей до такой степени, чтобы ее можно было легко набирать через шприц, должна быть стабильной в условиях производства и хранения, и ее следует защищать от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы.

«Терапевтически эффективное количество» для лечения можно измерить по объективным ответам, которые могут быть полными или частичными. Полный ответ (ПО) определяется как отсутствие клинических, радиологических или других признаков состояния, расстройства или заболевания. Частичный ответ (ЧО) является результатом снижения заболеваемости более чем на 50%. Среднее время до прогрессирования - это показатель, характеризующий стойкость объективного ответа.

«Терапевтически эффективное количество» для лечения также можно измерить по его способности стабилизировать прогрессирование состояния, нарушения или заболевания, например с помощью соответствующих систем моделей животных и/или анализов in vitro, известных специалисту в данной области техники. Терапевтически эффективное количество активного агента (в частности, РНК по изобретению) относится к количеству, которое обеспечивает необходимую реакцию или необходимый эффект по отдельности или вместе с дополнительными дозами. В случае лечения конкретного заболевания или конкретного состояния необходимая реакция предпочтительно относится к ингибированию течения заболевания. Это включает замедление прогрессирования заболевания и, в частности, прерывание или регрессию развития болезни. Необходимая реакция при лечении заболевания или состояния также может быть отсрочкой начала или предупреждением наступления указанного заболевания или указанного состояния. Таким образом, терапевтически эффективное количество активного агента может вылечить, излечить, облегчить, ослабить, изменить, отрегулировать, нейтрализовать, улучшить или повлиять на состояние, нарушение или заболевание, или симптомы состояния, нарушения или заболевания, или предрасположенность к состоянию, нарушению или заболеванию у индивидуума. Средний специалист в данной области техники сможет определить такие количества на основе таких факторов, как заболевание, нарушение или состояние, подлежащее лечению, тяжесть заболевания, нарушения или состояния, параметры пациента, подлежащего лечению (включая возраст, физиологическое состояние, размер и массу тела), продолжительность лечения, тип сопутствующей терапии (при ее наличии), конкретный способ введения и аналогичные факторы. Соответственно, вводимые дозы активных агентов, описанных в настоящей заявке, могут зависеть от различных таких параметров. В случае, если реакция у индивидуума/пациента недостаточна при начальной дозе, можно использовать более высокие дозы (или, по сути, более высокие дозы, достигаемые другим, более локализованным путем введения).

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может иметь форму вакцинного препарата, содержащего РНК по настоящему изобретению, кодирующую по меньшей мере один антиген, такой как антиген, как описано выше, или его фрагмент (в частности, его иммуногенный фрагмент).

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также, если необходимо, может быть представлена в упаковке, наборе или дозирующем устройстве, которые могут содержать одну или несколько стандартных дозированных форм, включающих активный агент (т.е. РНК и, возможно, одно или несколько дополнительных/ добавочных активных соединений). Упаковка может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. К упаковке, набору или дозатору может прилагаться инструкция по применению.

Одно или несколько дополнительных/добавочных активных соединений могут включать иммуномодулирующий агент, такой как анти-CTL-A4, или анти-PD1, или анти-PDL1, или антирегуляторные Т-клеточные реагенты, такие как анти-CD25-антитело или циклофосфамид.

Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить вместе с добавочными веществами, повышающими иммунитет, такими как один или несколько адъювантов, и могут содержать одно или несколько веществ, усиливающих иммунитет, для дальнейшего повышения их эффективности, предпочтительно для достижения синергетического эффекта иммуностимуляции.

Термин «адъювант» относится к соединениям, которые при введении в комбинации с антигеном, антигенным пептидом или нуклеиновой кислотой (такой как РНК, предпочтительно мРНК), кодирующей указанный антиген или антигенный пептид, индивидууму продлевают или усиливают, или ускоряют иммунный ответ. В контексте настоящего изобретения РНК (предпочтительно мРНК) можно вводить с любыми адъювантами. Предполагается, что адъюванты проявляют свою биологическую активность с помощью одного или нескольких механизмов, включая увеличение поверхности антигена, продление удержания антигена в организме, замедление высвобождения антигена, таргетинг антигена на макрофаги, увеличение поглощения антигена, усиление процессинга антигена, стимуляцию высвобождения цитокинов, стимуляцию и активацию иммунных клеток, таких как B-клетки, макрофаги, дендритные клетки, T-клетки, и неспецифическую активацию иммунных клеток. Например, соединения, которые обеспечивают созревание DC, например, липополисахариды или лиганд CD40 образуют класс подходящих адъювантов. Как правило, любой агент, который влияет на иммунную систему типа «сигнала опасности» (ЛПС, GP96, дцРНК и т.д.), или цитокины, такие как ГМ-КСФ, можно использовать в качестве адъюванта, который позволяет усилить иммунный ответ, и/или влияет на него контролируемым образом. CpG-олигодезоксинуклеотиды (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549) при необходимости также могут быть использованы в этом контексте. Дополнительные типы адъювантов включают масляные эмульсии (например, адъюванты Фрейнда), минеральные соединения (такие как квасцы), бактериальные продукты (такие как токсин Bordetella pertussis), липосомы, иммуностимулирующие комплексы, цитокины (например, монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, LT-α или факторы роста, например, hGH), липопептиды (например, Pam3Cys). Однако в случае, если РНК (предпочтительно мРНК) по изобретению в одном варианте осуществления может кодировать иммуностимулирующий агент, и указанный иммуностимулирующий агент, кодируемый указанной РНК, должен действовать как первичный иммуностимулятор, необходимо лишь относительно небольшое количество CpG ДНК (по сравнению с иммуностимуляцией одной CpG ДНК). Примерами адъювантов являются монофосфорил-липид-A (MPL SmithKline Beecham), сапонины, такие как QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 и QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), неполные адъюванты Фрейнда, полные адъюванты Фрейнда, витамин Е, монтанид, квасцы, CpG-олигонуклеотиды и различные эмульсии типа вода-в- масле, которые получают из биологически разлагаемых масел, таких как сквален и/или токоферол. Особо предпочтительными адъювантами являются цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, LT-α, факторы роста, например, hGH или липопептиды, такие как Pam3Cys, все из которых подходят для использования в качестве адъювантов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, или когда РНК (в частности, мРНК) по настоящему изобретению используют в терапии.

Лечение может проводиться дома, в кабинете врача, клинике, поликлинике или в больнице. Обычно лечение начинается под наблюдением врача, чтобы медицинский персонал мог внимательно наблюдать за результатами лечения и вносить необходимые коррективы. Продолжительность лечения зависит от возраста и состояния пациента, а также от того, как пациент реагирует на лечение.

Индивидуум, имеющий более высокий риск развития состояния, нарушения или заболевания, может получать профилактическое лечение для подавления или отсрочки появления симптомов состояния, нарушения или заболевания.

Термин «лечение» известен среднему специалисту в данной области техники и включает применение или введение активного агента (например, фармацевтической композиции, содержащей указанный активный агент), как описано в настоящей заявке (например, РНК, такой как мРНК, или фармацевтической композиции, содержащей РНК, такую как мРНК) или процедуру для индивидуума/пациента, или применение или введение активного агента (например, фармацевтической композиции, содержащей указанный активный агент), как описано в настоящей заявке (например, РНК, такой как мРНК, или фармацевтической композиции, содержащей РНК, такой как мРНК), или процедуру с клеткой, клеточной культурой, клеточной линией, образцом, тканью или органом, выделенным от человека, у которого отмечено состояние, нарушение или заболевание, симптом состояния, нарушения или заболевания, или предрасположенность к состоянию, нарушению или заболеванию, с целью вылечить, излечить, облегчить, ослабить, изменить, отрегулировать, нейтрализовать, улучшить или повлиять или предотвратить состояние, нарушение или заболевание, симптомы состояния, нарушения или заболевания, или предрасположенность к состоянию, нарушению или заболеванию (например, для предотвращения или устранения заболевания, включая уменьшение размера опухоли или количества опухолей у индивидуума; остановки или замедления развития заболевания у индивидуума; подавления или замедления развития нового заболевания у индивидуума; уменьшения частоты или тяжести симптомов и/или рецидивов у индивидуума, который в настоящее время или ранее имел заболевание; и/или продления, т.е. увеличения продолжительности жизни индивидуума). В частности, термин «лечение заболевания» включает лечение, сокращение продолжительности, облегчение, предотвращение, замедление, или ингибирование прогрессирования или ухудшения, или предотвращение или отсрочку начала заболевания или его симптомов. Следовательно, термин «лечение» «может включать профилактическое лечение состояния, нарушения или заболевания, или симптома состояния, нарушения или заболевания. Активный агент, при использовании в лечении, включает РНК по изобретению, а также одно или несколько дополнительных/добавочных активных соединений, описанных в настоящей заявке, и включает другие терапевтически активные соединения, которые могут быть малыми молекулами, пептидами, пептидомиметиками, полипептидами/белками, антителами, другими полинуклеотидами, такие как ДНК или дцРНК, клетками, вирусами, рибозимами и антисмысловыми олигонуклеотидами, но не ограничивается ими.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению практически не содержит дцРНК, предпочтительно практически не содержит дцРНК и ДНК.

Термин «практически не содержит дцРНК», используемый в настоящей заявке в связи с препаратом РНК, содержащим РНК, модифицированную 5'-кэп соединением по настоящей заявке, в частности фармацевтической композицией, особенно фармацевтической композицией, содержащей РНК, модифицированную 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, означает, что количество дцРНК в препарате РНК или фармацевтической композиции таково, что указанный препарат РНК или фармацевтическая композиция при введении индивидууму по существу не вызывает нежелательного ответа (такого как нежелательная индукция воспалительных цитокинов (например, IFN-α) и/или нежелательная активация эффекторного фермента, приводящая к ингибированию синтеза белка из РНК по изобретению) у указанного индивидуума. Предпочтительно термины «по существу не содержит дцРНК» и «по существу не вызывает нежелательного ответа» означают, что при введении индивидууму указанный препарат РНК или фармацевтическая композиция приводит к трансляции РНК в пептид или белок в течение по меньшей мере 10 часов (например, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 22 часов, по меньшей мере 24 часов, по меньшей мере 30 часов, по меньшей мере 36 часов, по меньшей мере 42 часов, по меньшей мере 48 часов, по меньшей мере 54 часов, по меньшей мере 60 часов, по меньшей мере 66 часов, по меньшей мере 72 часов, по меньшей мере 78 часов, по меньшей мере 84 часов, по меньшей мере 90 часов или по меньшей мере 96 часов) после применения. Например, содержание дцРНК в препарате РНК или фармацевтической композиции может составлять самое большее 5 мас. % (предпочтительно самое большее 4 мас. %, самое большее 3 мас. %, самое большее 2 мас. %, самое большее 1 мас. %, самое большее 0,5 мас. %, самое большее 0,1 мас. %, самое большее 0,05 мас. %, самое большее 0,01 мас. %, самое большее 0,005 мас. %, самое большее 0,001 мас. %), в расчете на общую массу указанного препарата РНК или фармацевтической композиции.

Термин «по существу не содержащий ДНК», используемый в настоящей заявке в связи с препаратом РНК, содержащим РНК, модифицированную 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, в частности с фармацевтической композицией, особенно с фармацевтической композицией, содержащей РНК, модифицированную с помощью 5'-кэп соединения по настоящему изобретению, означает, что количество ДНК в препарате РНК или фармацевтической композиции может составлять самое большее 5 мас. % (предпочтительно самое большее 4 мас. %, самое большее 3 мас. %, самое большее 2 мас. %, самое большее 1 мас. %, самое большее 0,5 мас. %, самое большее 0,1 мас. %, самое большее 0,05 мас. %, самое большее 0,01 мас. %, самое большее 0,005 мас. %, самое большее 0,001 мас. %), на основе общей массы указанного препарата РНК или фармацевтической композиции.

Термин «по существу не содержащий дцРНК и ДНК», используемый в настоящей заявке в сочетании с препаратом РНК, содержащим РНК, модифицированную 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, в частности фармацевтической композицией, особенно фармацевтической композицией, содержащей РНК, модифицированную 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, означает, что указанный препарат РНК или фармацевтическая композиция по существу не содержат дцРНК, как указано выше (например, трансляция длится по меньшей мере 10 часов после введения и/или содержание дцРНК составляет самое большее 5 мас. %) и практически не содержит ДНК, как указано выше (например, содержание ДНК составляет самое большее 5 мас. %).

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по изобретению представляет собой вакцинную композицию.

Вакцинная композиция по настоящему изобретению может рассматриваться как фармацевтическая композиция по настоящему изобретению для конкретного применения (например, вакцинации). Таким образом, один или несколько признаков и вариантов осуществления, описанных выше в связи с фармацевтической композицией по настоящему изобретению (например, способ введения; присутствие других компонентов (таких как один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ и/или разбавителей и/или адъювантов и/или одно или несколько дополнительных/ добавочных активных соединений); количество активного агента (агентов); фармацевтически приемлемые соли и т.д.) также могут применяться к вакцинной композиции по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления указанная вакцинная композиция дополнительно содержит один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ и/или разбавителей. Указанная вакцинная композиция может дополнительно содержать соединения или вещества, которые способны усиливать и/или поддерживать иммунную реакцию у человека. Например, вакцинная композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать адъювант, как описано выше, или цитокины, например интерлейкин-12 (IL-12), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) или интерлейкин-18 (IL-18). Кроме того, вакцинная композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать вещества, стабилизирующие РНК, такие как ингибиторы РНКазы, фармацевтически приемлемые соли или буферы, консерванты (такие как бензалкония хлорид, хлорбутанол, парабен или мертиолят), смачивающие агенты, эмульгирующие агенты и/или дополнительные лекарства или активные агенты.

В особо предпочтительном варианте осуществления РНК присутствует в вакцинной композиции согласно настоящему изобретению в форме «депротеинизированной» РНК.

Особо предпочтительно вакцинная композиция по настоящему изобретению приготовлена для парентерального введения, например для внутривенного, интраперитонеального, внутримышечного, подкожного, внутрилимфатического, интрадермального или интранодального введения, более предпочтительно для интрадермального или интранодального введения, такого как интранодальная инъекция. Вакцинные композицию по настоящему изобретению наиболее предпочтительно готовят для инъекции в лимфатические узлы, предпочтительно паховые лимфатические узлы, для инъекции в лимфатические сосуды и/или селезенку.

Предпочтительно вакцинная композиция находится в форме водного или неводного раствора, который изотоничен крови реципиента, т.е. индивидуума, который должен быть вакцинирован. Например, можно использовать раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия или физиологический раствор с фосфатным буфером (ФБР). В частности, вакцинная композиция предпочтительно является стерильной и содержит указанную выше РНК в терапевтически эффективном количестве.

В предпочтительном варианте осуществления вакцинная композиция по существу не содержит дцРНК, предпочтительно по существу не содержит дцРНК и ДНК.

Клетки

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает клетку, содержащую РНК, которая модифицирована 5'-кэп соединением по настоящей заявке, где РНК предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок. В этом предпочтительном варианте осуществления клетки, где РНК по изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, эта клетка может быть использована для продукции указанного пептида или белка, например в соответствующем способе продукции пептида или белка, описанном в настоящей заявке, или для экспрессии указанного пептида или белка у индивидуума путем введения указанной клетки индивидууму, например, в соответствующем способе экспрессии пептида или белка, описанном в настоящей заявке.

В предпочтительном варианте осуществления клетка представляет собой антигенпрезентирующую клетку, такую как зрелая антигенпрезентирующая клетка, и может быть выбрана из группы, состоящей из макрофагов, моноцитов, B-клеток и дендритных клеток.

В особо предпочтительном варианте осуществления клетку согласно настоящему изобретению готовят в виде фармацевтической композиции, как описано выше, где указанная фармацевтическая композиция предпочтительно подходит для экспрессии пептида или белка, такого как фармацевтически активный пептид или белок. В альтернативном варианте осуществления клетку согласно настоящему изобретению готовят как фармацевтическую композицию, как описано выше, где указанная фармацевтическая композиция предпочтительно является подходящей для индукции иммунного ответа при введении индивидууму, причем иммунный ответ предпочтительно направлен против белка или пептида, кодируемого РНК или антигеном, и/или иммуногеном, состоящим из белка или пептида, кодируемого РНК, присутствующей в незрелой антигенпрезентирующей клетке по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую незрелую антигенпрезентирующую клетку в соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения.

Способы и использование

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения РНК с 5'-кэп-структурой, где указанный способ включает выполнение реакции транскрипции с использованием матричной нуклеиновой кислоты в присутствии 5'-кэп соединения из первого аспекта. В одном варианте осуществления матричная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. Реакцию транскрипции можно проводить in vivo или in vitro, но предпочтительно проводить in vitro. В одном варианте осуществления реакцию транскрипции проводят с использованием РНК-полимеразы, выбранной из группы, состоящей из РНК-полимераз Т3, Т7 и SP6. РНК может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, где пептид или белок предпочтительно является фармацевтически активным пептидом или белком, как описано в настоящей заявке. В одном варианте осуществления способ осуществляют при отсутствии 2'-O-рибозометилтрансферазы. В альтернативном варианте осуществления способ осуществляют в присутствии 2'-O-рибозометилтрансферазы.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ повышения стабильности РНК в клетках и/или увеличения экспрессии РНК в клетках, где указанный способ включает обеспечение указанной РНК со структурой согласно формуле (I), как определено в первом аспекте; и перенос указанной РНК, модифицированной структурой согласно формуле (I), в клетки. Предпочтительно указанные клетки представляют собой антигенпрезентирующие клетки, такие как незрелые антигенпрезентирующие клетки, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из моноцитов, макрофагов, глиальных клеток, В-клеток и дендритных клеток. Чтобы оценить стабильность РНК в незрелой антигенпрезентирующей клетке, специалист может выявить присутствие исследуемой РНК или количественно определить РНК в клетке через определенные моменты времени после введения указанной РНК, например с использованием RT-ПЦР в режиме реального времени. Экспрессия РНК в клетках может быть определена с использованием РНК, кодирующей маркерный белок, такой как люцифераза или зеленый флуоресцентный белок, предпочтительно d2EGFP, но может быть использован любой другой маркерный белок, известный специалисту в данной области техники, и определения экспрессии указанного маркерного белка в определенные моменты времени после введения РНК. В одном варианте осуществления стадию обеспечения указанной РНК структуры согласно формуле (I) проводят при отсутствии 2'-O-рибозометилтрансферазы. В альтернативном варианте осуществления способ проводят в присутствии 2'-O-рибозометилтрансферазы.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения представляющего интерес пептида или белка, включающий стадию использования РНК, композиции РНК или клетки по изобретению, где в каждом случае РНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок. В одном варианте осуществления пептид или белок представляет собой фармацевтически активный белок, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из цитокинов, таких как эритропоэтин; молекул адгезии, таких как интегрин; иммуноглобулинов; иммунологически активных соединений, например антигенов, таких как опухоль-ассоциированные антигены, патоген-ассоциированные антигены (например, один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) антигенов вируса, такого как один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) антигенов вируса гриппа (A, B или C), CMV или RSV), аллергены или аутоантигены; гормонов, таких как вазопрессин, инсулин или гормон роста; факторов роста, таких как VEGFA; ферментов, таких как тимидинкиназа типа 1 вируса простого герпеса (HSV1-TK), гексозаминидаза, фенилаланингидроксилаза, псевдохолинэстераза, ферменты поджелудочной железы или лактаза; рецепторов, таких как рецепторы фактора роста; ингибиторов протеаз, таких как альфа-1-антитрипсин; регуляторов апоптоза, таких как BAX; факторов транскрипции, таких как FOXP3; белков-супрессоров опухолей, такие как р53; структурных белков, таких как сурфактантные белки; факторов перепрограммирования, таких как OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, LIN28 или NANOG; геномно-инженерных белков, таких как ассоциированный с кластеризованными короткими палиндромными повторами с регулярными интервалами (CRISPR) белок 9 (CRISPR-Cas9); и белков крови, таких как фибриноген. В одном варианте осуществления способа с использованием РНК или композиции РНК способ может включать стадию переноса указанной РНК или композиции РНК в клетку. В этом отношении можно использовать любой способ, который подходит для переноса РНК в клетки. Предпочтительно РНК трансфицируют в клетки стандартными способами, как описано в настоящей заявке, например, преципитацией фосфатом кальция, трансфекцией ДЭАЭ, электропорацией, липофекцией или микроинъекцией. Клетка может быть любой клеткой, которая может быть трансфицирована РНК, и предпочтительно представляет собой антигенпрезентирующую клетку, такую как незрелая антигенпрезентирующая клетка, более предпочтительно выбранная из группы, состоящей из макрофагов, моноцитов, В-клеток и дендритных клеток. Способ получения представляющего интерес пептида или белка может быть осуществлен in vivo или in vitro, но предпочтительно осуществляется in vitro.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ экспрессии пептида или белка у индивидуума, включающий стадию введения указанному индивидууму РНК, композиции РНК или клетки по изобретению, где в каждом случае РНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок. В одном варианте осуществления пептид или белок представляет собой фармацевтически активный белок, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из цитокинов, таких как эритропоэтин; молекул адгезии, таких как интегрин; иммуноглобулинов; иммунологически активных соединений, например антигенов, таких как опухоль-ассоциированные антигены, патоген-ассоциированные антигены (например, один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) антигенов вируса, такого как один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) антигенов вируса гриппа (A, B или C), CMV или RSV), аллергены или аутоантигены; гормонов, таких как вазопрессин, инсулин или гормон роста; факторов роста, таких как VEGFA; ферментов, таких как тимидинкиназа типа 1 вируса простого герпеса (HSV1-TK), гексозаминидаза, фенилаланингидроксилаза, псевдохолинэстераза, ферменты поджелудочной железы или лактаза; рецепторов, таких как рецепторы фактора роста; ингибиторов протеаз, таких как альфа-1-антитрипсин; регуляторов апоптоза, таких как BAX; факторов транскрипции, таких как FOXP3; белков-супрессоров опухолей, таких как р53; структурных белков, таких как сурфактантные белки; факторов перепрограммирования, таких как OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, LIN28 или NANOG; геномно-инженерных белков, таких как ассоциированный с кластеризованными короткими палиндромными повторами с регулярными интервалами (CRISPR) белок 9 (CRISPR-Cas9); и белков крови, таких как фибриноген. РНК, композиция РНК или клетка по изобретению могут быть введены любым путем, например, описанным выше в отношении фармацевтических композиций по изобретению.

В дополнительных аспектах настоящее изобретение обеспечивает (i) РНК, композицию РНК или клетку по изобретению для использования в терапии, в частности для использования в способе лечения заболевания или нарушения у субъекта; (ii) способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, включающий стадию введения указанному субъекту РНК, композиции РНК или клетки по изобретению; и (iii) применение РНК, композиции РНК или клетки по изобретению для приготовления лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения у субъекта, где в каждом из (i) - (iii) РНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, который предпочтительно представляет собой пептид или белок, ассоциированный с заболеванием. В одном варианте осуществления этих аспектов (i) - (iii) лечение заболевания или нарушения выбрано из группы, состоящей из белковой заместительной терапии, геномной инженерии, генетического перепрограммирования и иммунотерапии, как описано в настоящей заявке. Предпочтительно пептид или белок представляет собой фармацевтически активный белок, более предпочтительно выбранный из группы, состоящей из цитокинов, таких как эритропоэтин; молекул адгезии, таких как интегрин; иммуноглобулинов; иммунологически активных соединений, например антигенов, такие как опухоль-ассоциированные антигены, патоген-ассоциированные антигены (например, один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) антигенов вируса, такого как один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) антигенов вируса гриппа (A, B или C), CMV или RSV), аллергены или аутоантигены; гормонов, таких как вазопрессин, инсулин или гормон роста; факторов роста, таких как VEGFA; ферментов, таких как тимидинкиназа типа 1 вируса простого герпеса (HSV1-TK), гексозаминидаза, фенилаланингидроксилаза, псевдохолинэстераза, ферменты поджелудочной железы или лактаза; рецепторов, таких как рецепторы фактора роста; ингибиторов протеаз, таких как альфа-1-антитрипсин; регуляторов апоптоза, таких как BAX; факторов транскрипции, такие как FOXP3; белков-супрессоров опухолей, таких как р53; структурных белков, таких как сурфактантные белки; факторов перепрограммирования, таких как OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, LIN28 или NANOG; геномно-инженерных белков, таких как ассоциированный с кластеризованными короткими палиндромными повторами с регулярными интервалами (CRISPR) белок 9 (CRISPR-Cas9); и белков крови, таких как фибриноген. В одном варианте осуществления заболевание или нарушение выбрано из заболеваний и нарушений, раскрытых в настоящей заявке, например иллюстративных заболеваний и нарушений, описанных в настоящей заявке в отношении заместительной белковой терапии, геномно-инженерной терапии, терапии генетического перепрограммирования и/или иммунотерапии. РНК, композицию РНК или клетку по изобретению можно вводить любым путем и/или в любом режиме или количестве, например теми способами и/или в тех режимах и/или количествах, описанных выше в отношении фармацевтических композиций по изобретению. В одном варианте осуществления РНК, композицию РНК или клетку по изобретению вводят субъекту (например, путем инъекции, такой как интраперитонеальная, внутримышечная или интрадермальная инъекция) не более одного раза в сутки, предпочтительно не более одного раза в два дня, предпочтительно не более одного раза в три дня или не чаще одного раза в четыре дня. В одном варианте осуществления РНК, композицию РНК или клетку по изобретению вводят хроническому пациенту или длительно болеющему пациенту (например, путем инъекции, такой как интраперитонеальная, внутримышечная или внутрикожная инъекция) в течение длительного периода времени, в частности по меньшей мере 1 недели, например по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 3 недели, по меньшей мере 4 недели, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 2 года, по меньшей мере 3 года, по меньшей мере 4 года, по меньшей мере 5 лет или по меньшей мере 10 лет, например, до 2 недель, до 3 недель, до 4 недель, до 1 месяца, до 2 месяцев, до 3 месяцев, до 4 месяцев, до 5 месяцев, до 6 месяцев, до 12 месяцев, до 2 лет, до 3 лет или до 4 лет, до 5 лет, до 10 лет или в течение всей жизни пациента. В одном варианте осуществления РНК по настоящему изобретению (например, композицию РНК или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению) вводят хроническому пациенту или пациенту с длительным заболеванием (например, путем инъекции, такой как интраперитонеальная, внутримышечная или интрадермальная инъекция) самое большее один раз в сутки (т.е. период времени между двумя введениями составляет по меньшей мере 24 часа, например, по меньшей мере 30 часов, по меньшей мере 36 часов или по меньшей мере 42 часа), предпочтительно не более одного раза в два дня (т.е. период времени между двумя введениями составляет по меньшей мере 48 часов, например по меньшей мере 54 часа, по меньшей мере 60 часов или по меньшей мере 66 часов), предпочтительно не более одного раза в три дня (т.е. период времени между двумя введениями составляет по меньшей мере 72 часа, например, по меньшей мере 78 часов, по меньшей мере 84 часа или по меньшей мере 90 часов) или не чаще одного раза в четыре дня (то есть период времени между двумя введениями составляет по меньшей мере 96 часов, например, по меньшей мере 102 часа, по меньшей мере 108 часов, или по меньшей мере 114 часов) в течение длительного периода времени, то есть по меньшей мере 1 недели, например по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, по меньшей мере 4 недель, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 3 лет, по меньшей мере 4 лет, по меньшей мере 5 лет или по меньшей мере 10 лет, например до 2 недель, до 3 недель, до 4 недель, до 1 месяца, до 2 месяцев, до 3 месяцев, до 4 месяцев, до 5 месяцев, до 6 месяцев, до 12 месяцев, до 2 лет, до 3 лет или до 4 лет, до 5 лет, до 10 лет или в течение всей жизни пациента.

В дополнительных аспектах настоящее изобретение обеспечивает следующее:

(I) Предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума, включающий стадию введения указанному индивидууму вакцинной композиции из второго аспекта или незрелой антигенпрезентирующей клетки из третьего аспекта. Предпочтительно указанный иммунный ответ специфически направлен против белка или пептида, кодируемого РНК, входящей в состав вакцинной композиции, или незрелой антигенпрезентирующей клетки по настоящему изобретению, или специфически направлен против антигена, содержащегося в указанном белке или пептиде. Указанный иммунный ответ может быть терапевтическим и/или защитным. Особо предпочтительно указанную вакцинную композиция и указанные незрелые антигенпрезентирующие клетки, предпочтительно незрелые дендритные клетки, вводят парентерально, как указано выше для второго аспекта настоящего изобретения, предпочтительно путем интранодальной инъекции, предпочтительно путем инъекции в паховые лимфатические узлы. В одном варианте осуществления способ предназначен для индукции иммунного ответа против вируса, такого как ответ против вируса гриппа (A, B или C), CMV или RSV.

(II) Обеспечен способ увеличения доли молекул MHC, которые представляют представляющий интерес антиген (например, антиген вируса, такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV) на поверхности антигенпрезентирующей клетки, где указанный способ включает обеспечение РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, содержащий указанный представляющий интерес антиген (например, антиген вируса, такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV) или его антигенный пептид, причем указанная РНК модифицирована структурой согласно формуле (I), как определено в первом аспекте; и перенос указанной РНК, модифицированной структурой, соответствующей формуле (I), в незрелую антигенпрезентирующую клетку. В одном варианте осуществления стадию обеспечения РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, содержащий представляющий интерес антиген (например, антиген вирус, такой как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV), или его антигенный пептид, причем указанная РНК модифицирована структурой согласно формуле (I), выполняют в отсутствие 2'-O-рибозометилтрансферазы. В альтернативном варианте осуществления указанную стадию проводят в присутствии 2'-O-рибозометилтрансферазы. Не ограничиваясь какой-либо теорией, предполагается, что модификация РНК с помощью 5'-кэп соединения по настоящему изобретению увеличивает стабильность и/или экспрессию указанной РНК, в частности, в незрелых антигенпрезентирующих клетках, например, незрелых дендритных клетках. Эта повышенная стабильность и/или экспрессия приводит к накоплению белка или пептида, кодируемого указанной РНК. Указанный белок или пептид может содержать антиген или антигенный пептид. Таким образом, после процессинга указанного белка антигены или антигенные пептиды могут быть загружены на молекулы MHC на поверхности антигенпрезентирующей клетки. В альтернативном варианте указанный белок или пептид может сам быть антигеном или антигенным пептидом и может быть загружен на молекулы MHC без процессинга. Предполагается, что РНК, кодирующая конкретный белок или пептид, содержащий антиген или антигенный пептид, которая была модифицирована 5'-кэп соединением по настоящему изобретению, увеличивает долю/фракцию молекул MHC на клеточной поверхности антигенпрезентирующей клетки, которые презентируют пептид, полученный из белка или пептида, кодируемого указанной РНК, по сравнению с той же РНК, имеющей обычную 5'-кэп структуру, предпочтительно по сравнению с эталонной РНК, такой как та же РНК, имеющая 5'-кэп структуру ARCA. Поскольку плотность молекул MHC, презентирующих конкретный антиген на поверхности антигенпрезентирующей клетки, является решающей для интенсивности индуцированного иммунного ответа, специфичного для указанного конкретного антигена, предполагается, что повышение стабильности антиген-кодирующей РНК, которая была введена в антигенпрезентирующие клетки, приводит к усилению иммунного ответа против указанного конкретного антигена.

(III) Предложен способ стимуляции и/или активации эффекторных иммунных клеток, включающий получение РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, содержащий представляющий интерес антиген (например, антиген вируса, такого как вирус гриппа (A , B или C), CMV или RSV) или его антигенный пептид, причем указанная РНК модифицирована структурой в соответствии с формулой (I), как определено в первом аспекте; перенос указанной РНК, модифицированной структурой формулы (I), в незрелые антигенпрезентирующие клетки; и обеспечение контакта антигенпрезентирующих клеток с иммунными эффекторными клетками. Предпочтительно указанные иммунные эффекторные клетки активируются и/или стимулируются антиген-специфически. Предпочтительно с помощью этого способа количество антиген-специфических эффекторных клеток, предпочтительно Т-клеток, увеличивается. Предпочтительно незрелые антигенпрезентирующие клетки представляют собой незрелые дендритные клетки. В одном варианте осуществления стадию получения РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, содержащий представляющий интерес антиген (например, антиген вируса, такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV) или его антигенный пептид, где указанная РНК модифицирована структурой, соответствующей формуле (I), осуществляют при отсутствии 2'-O-рибозометилтрансферазы. В альтернативном варианте осуществления указанную стадию проводят в присутствии 2'-O-рибозометилтрансферазы. В предпочтительном варианте осуществления эффекторные иммунные клетки представляют собой Т-клетки, предпочтительно клетки CD4+ и/или CD8+. В одном варианте осуществления стадию переноса указанной РНК в незрелые антигенпрезентирующие клетки выполняют in vitro любым способом переноса нуклеиновой кислоты, например способом трансфекции, известным специалистам в данной области техники, таким как липофекция, электропорация или микроинъекция, как описано выше. В другом варианте осуществления стадию переноса указанной РНК в незрелые антигенпрезентирующие клетки выполняют in vivo, например путем введения РНК индивидууму, предпочтительно парентеральным введением, предпочтительно внутрилимфатическим введением, предпочтительно путем инъекции в лимфатический узел (узлы), то есть путем интранодальной инъекции, путем инъекции в лимфатические сосуды или путем инъекции в селезенку. Предпочтительно указанное введение представляет собой интранодальную инъекцию РНК, которая предпочтительно поглощается незрелыми дендритными клетками в лимфатическом узле (узлах). Вводимая РНК предпочтительно имеет форму «депротеинизированной» РНК. В одном варианте осуществления стадию контактирования антигенпрезентирующих клеток с иммунными эффекторными клетками выполняют in vitro, например в чашке для культуры ткани. В другом варианте осуществления стадию контактирования антигенпрезентирующих клеток с иммунными эффекторными клетками осуществляют in vivo. В этом варианте осуществления стадия переноса РНК в незрелые антигенпрезентирующие клетки может быть выполнена in vitro или in vivo, как описано выше. Для контакта антигенпрезентирующих клеток, в которые РНК была перенесена in vitro, с иммунными эффекторными клетками in vivo, антигенпрезентирующие клетки вводят индивидууму, предпочтительно парентерально, например путем внутривенной, внутримышечной, подкожной, интранодальной, внутрилимфатической или интраперитонеальной инъекции, предпочтительно путем инъекции в лимфатическую систему, например путем инъекции в лимфатический сосуд (сосуды), селезенку и/или лимфатический узел (узлы), предпочтительно паховый лимфатический узел (узлы). В одном варианте осуществления способ может дополнительно включать стадию дифференцировки незрелых антигенпрезентирующих клеток в зрелые антигенпрезентирующие клетки после переноса РНК в незрелые антигенпрезентирующие клетки и перед контактированием антигенпрезентирующих клеток с иммунными эффекторными клетками. Стадия дифференцировки может быть выполнена in vitro или in vivo. Например, РНК может быть перенесена в незрелые антигенпрезентирующие клетки, предпочтительно в незрелые дендритные клетки, незрелые антигенпрезентирующие клетки дифференцируются in vitro, а дифференцированные зрелые антигенпрезентирующие клетки, предпочтительно зрелые дендритные клетки, контактируют с иммунными эффекторными клетками in vitro или in vivo, как описано выше, предпочтительно in vivo. Незрелые антигенпрезентирующие клетки, в которые РНК переносят in vitro, могут быть выделены от индивидуума, например от пациента, которого необходимо иммунизировать, или они могут быть дифференцированы из гемопоэтических стволовых клеток.

Стимуляция и/или активация иммунных эффекторных клеток, в частности Т-клеток, обычно связана с размножением, цитотоксической реактивностью и/или секрецией цитокинов иммунными эффекторными клетками. Таким образом, специалист в данной области техники может определить, стимулируются ли и/или активируются ли иммунные эффекторные клетки, с помощью простых тестов in vitro, обычно выполняемых с использованием Т-клеток. Такие Т-клетки могут быть предоставлены трансформированными Т-клеточными линиями, такими как Т-клеточные гибридомы или Т-клетки, которые были выделены от млекопитающего, такого как грызун, например мышь или крыса. Подходящие Т-клеточные гибридомы коммерчески доступны или могут быть получены известными методами. Т-клетки могут быть выделены от млекопитающего известными методами (см. Shimonkevitz et al., 1983, J. Exp. Med. 158: 303-316). Подходящие экспериментальные условия для проверки активации и/или стимуляции Т-клеток описаны ниже для стадий (1) - (4). Т-клетки экспрессируют подходящий маркер, который можно тестировать и который указывает активацию Т-клеток или модуляцию активности Т-клеток. Для этой цели может быть использована мышиная Т-клеточная гибридома DO11.10, поскольку указанная гибридома экспрессирует интерлейкин-2 (IL-2) при активации. Концентрации IL-2 могут быть измерены для проверки активации/стимуляции Т-клеток или для определения того, способна ли композиция модулировать активность указанной Т-клеточной гибридомы. Этот тест выполняют со следующими стадиями: (1) получение Т-клеток из Т-клеточной гибридомы или путем выделения от млекопитающих; (2) культивирование Т-клеток в условиях, допускающих пролиферацию; (3) обеспечение контакта пролиферирующих Т-клеток с антигенпрезентирующей клеткой, которая контактировала с антигеном или кодирующей его нуклеиновой кислотой; и (4) тестирование Т-клеток на маркер, например определение продукции IL-2. Клетки, которые используются для теста, культивируют в условиях, допускающих пролиферацию. Например, Т-клеточную гибридому DO11.10 адекватно культивируют при 37°C и 5% CO₂ в полной среде (RPMI 1640, с добавлением 10% ЭТС, пенициллина/стрептомицина, L-глутамина и 5х10^-5 M 2-меркаптоэтанола). Сигналы активации Т-клеток передаются антигенпрезентирующими клетками, которые были загружены подходящим антигенным пептидом.

В альтернативном варианте модуляция активности Т-клеток может быть подтверждена путем определения изменений или пролиферации антиген-специфических Т-клеток, что может быть измерено, например, известными методами радиоактивной метки. Например, меченый нуклеотид может быть добавлен в тестовую культуральную среду. Включение таких меченых нуклеотидов в ДНК может служить индикатором пролиферации Т-клеток. Этот тест не применим для Т-клеток, которые не требуют презентации антигена для их пролиферации, таких как Т-клеточные гибридомы. Этот тест полезен для определения модуляции активности Т-клеток в случае нетрансформированных Т-клеток, которые были выделены от млекопитающего.

(IV) Предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума, включающий обеспечение РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, содержащий представляющий интерес антиген (например, антиген вируса, такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV) или его антигенный пептид, причем указанная РНК модифицирована структурой согласно формуле (I), как определено в первом аспекте; и введение указанной РНК, модифицированной структурой согласно формуле (I), указанному индивидууму. В одном варианте осуществления РНК вводят путем интранодальной инъекции или интрадермально. Представляющим интерес антигеном может быть любой антиген (например, антиген вируса (A, B или C), такой как вирус гриппа, CMV или RSV) и предпочтительно такой, как определено выше. В предпочтительном варианте осуществления указанную РНК вводят в форме депротеинизированной РНК, предпочтительно парентерально, например путем внутривенной, внутримышечной, подкожной, интранодальной, интрадермальной, внутрилимфатической или интраперитонеальной инъекции, предпочтительно путем инъекции в лимфатическую систему, например путем инъекции в лимфатический сосуд (сосуды), селезенку и/или лимфатический узел (узлы), предпочтительно паховый лимфатический узел (узлы). Предпочтительно вводимая РНК поглощается незрелыми дендритными клетками индивидуума. Предпочтительно иммунный ответ является защитным и/или терапевтическим, например полезен для лечения и/или профилактики заболеваний, таких как раковые заболевания или инфекционные заболевания. В одном варианте осуществления этап обеспечения РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, содержащий представляющий интерес антиген (например, антиген вируса, такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV) или его антигенный пептид, где указанная РНК модифицирована структурой, соответствующей формуле (I), осуществляют при отсутствии 2'-O-рибозометилтрансферазы. В альтернативном варианте осуществления указанную стадию проводят в присутствии 2'-O-рибозометилтрансферазы.

(V) Предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума, включающий обеспечение РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, содержащий представляющий интерес антиген (например, антиген вируса, такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV) или его антигенный пептид, причем указанная РНК модифицирована структурой согласно формуле (I), как определено в первом аспекте; перенос указанной РНК, модифицированной структурой согласно формуле (I), в незрелые антигенпрезентирующие клетки; и введение антигенпрезентирующих клеток указанному индивидууму. В одном варианте осуществления стадию обеспечения РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, содержащий представляющий интерес антиген (например, антиген вируса, такого как вирус гриппа (A, B или C), CMV или RSV) или его антигенный пептид, где указанная РНК модифицирована структурой согласно формуле (I), осуществляют при отсутствии 2'-O-рибозометилтрансферазы. В альтернативном варианте осуществления указанную стадию выполняют в присутствии 2'-O-рибозометилтрансферазы. В этом аспекте настоящего изобретения РНК переносят в незрелые антигенпрезентирующие клетки in vitro любым способом переноса нуклеиновой кислоты, например трансфекцией, такой как липофекция, электропорация или микроинъекция, известным специалисту в данной области техники, как описано выше. Предпочтительно незрелые антигенпрезентирующие клетки представляют собой незрелые дендритные клетки. Незрелые антигенпрезентирующие клетки, в которые переносят РНК in vitro, могут быть выделены от индивидуума, например от пациента, который должен быть иммунизирован, или они могут быть дифференцированы из гемопоэтических стволовых клеток, при этом гемопоэтические стволовые клетки могут быть выделены от индивидуума. Незрелые антигенпрезентирующие клетки или гемопоэтические стволовые клетки могут быть выделены от индивидуума путем лейкафереза. Предпочтительно незрелые антигенпрезентирующие клетки представляют собой незрелые дендритные клетки. Предпочтительно незрелые антигенпрезентирующие клетки выделяют от индивидуума, подлежащего иммунизации, РНК переносят в указанные выделенные клетки, и клетки переносят обратно указанному индивиду, предпочтительно путем парентерального введения, например путем внутривенной, внутримышечной, подкожной, интранодальной, внутрилимфатической или интраперитонеальной инъекции, предпочтительно путем инъекции в лимфатическую систему, например путем инъекции в лимфатический сосуд (сосуды), селезенку и/или лимфатический узел (узлы), предпочтительно паховый лимфатический узел (узлы).

Способность вызывать иммунную реакцию, включая пригодность для вакцинации против целевого заболевания, можно легко определить с помощью тестов in vivo. Например, композицию, например вакцинную композицию или фармацевтическую композицию, можно вводить млекопитающему, такому как лабораторное животное, например мышь, крыса, кролик и т.д., и можно взять образцы крови у указанного животного перед введением композиции и в определенные моменты времени после введения композиции, например через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 недель после введения. Сыворотка может быть получена из образцов крови, и может быть определено образование антител, генерируемых при введении/иммунизации. Например, может быть определена концентрация антител. Кроме того, из крови и/или лимфатической системы млекопитающего можно выделить Т-клетки, которые можно проверить на их реактивность против антигена, используемого для иммунизации. Можно использовать любую систему считывания, известную специалисту в данной области техники, например можно использовать анализы пролиферации, анализы секреции цитокинов, анализы для проверки цитотоксической активности или анализ тетрамеров и т.д. Кроме того, повышение иммунной реактивности также может быть определено путем анализа количества антиген-специфических Т-клеток, их цитотоксического потенциала или характера их секреции цитокинов, как изложено выше.

Как продемонстрировано в примерах настоящей заявки, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что с помощью 5'-кэп соединений из настоящего изобретения можно включать кэп-1 структуры бета-S-ARCA в РНК за одну стадию, тем самым объединив положительные эффекты тиозамещения с определяющим кэп-1 2'-O-метилированием.

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами, которые демонстрируют предпочтительные варианты осуществления изобретения, и их не следует интерпретировать как ограничение объема настоящего изобретения, определенного в формуле изобретения. Те примеры, которые не охватываются прилагаемой формулой изобретения, приведены только для сравнения.

Примеры

Сокращения

ч: час (часы)

мМ: миллимолярный (10^-3 моль/л)

NTP: нуклеозидтрифосфат

Пример 1 - Синтез аналогов кэпа

Для получения со-транскрипционно кэпированной мРНК, транскрибированной in vitro, было сконструировано 5'-кэп соединение по изобретению (Соединение 1, соединение формулы (I)), как показано на Фиг. 2 (OR = OCH₃). Соединение 1 содержит фосфотиоатную замену в бета-положении 5'-5'-трифосфатного мостика, концевое 2'-O метилирование, чтобы избежать включения в инвертированной ориентации, внутреннее 2'-O метилирование, отражающее структуру кэп-1, плюс дополнительный гуанозиновый фрагмент, который обеспечивает включение фаговой РНК-полимеразой. Синтез и использование модифицированного кэп-тринуклеотида описывается ниже.

5'-кэп соединения по настоящему изобретению и другие аналоги кэпа можно синтезировать, исходя из коммерчески доступных олигонуклеотидов, таких как (pN)_2-4, с использованием стандартных процедур. Для m₂^7,2-OGpp_Spm^2'-OGpG (Соединение 1) 5'-фосфорилированный 2'-O-метилированный дигуанозин 5',3'-динуклеотид (pm^2'-OGpG) был получен коммерчески и использован в качестве исходного материала без дополнительной обработки. Динуклеотид превращали в соответствующее производное P-имидазолида (Im-pm^2'-OGpG) путем взаимодействия с 10 экв. имидазола в ДМФА в присутствии 3 экв. системы активации 2,2'-дитиодипиридин/трифенилфосфин (см. Фиг. 1; Mukaiyama and Hashimoto 1971). Нуклеотидная субъединица, 2'-O-метилгуанозин 5'-O-(2-тиодифосфат) (m2^7,2'-OMeGDPβS), была синтезирована, как описано ранее (Kowalska et al 2008). Затем m2^7,2'-OMeGDPβS и P-имидазолид Im-pm^2'-OGpG были связаны в ДМФА в присутствии избытка ZnCl₂ (8 экв.) с кэп-аналогом (m₂^7,2-OGpp_Spm^2'-OGpG, 38% выход по ВЭЖХ; Фиг. 2) в виде смеси двух диастереоизомеров (D1 и D2, названных в соответствии с порядком элюирования из колонки ОФ-ВЭЖХ). Диастереоизомеры разделяли с помощью ОФ-ВЭЖХ (колонка Discovery Amide RP C16) на чистые диастереоизомеры D1 и D2.

Спектроскопические данные:

m₂^7,2'-OGpp_Sp^2'-OGpG (Соединение 1)

(D1): ¹H ЯМР (400 MГц; D₂O) δ 9,07 (s; 1H); 8,16 (s; 1H); 8,07 (s; 1H); 5,97 (d; J = 2,24 Гц; 1H); 5,87 (d; J = 5,98 Гц; 1H); 5,82 (d; J = 5,48 Гц; 1H); 4,85 - 5,00 (m; 1H); 4,74 - 4,87 (m; 2H; частично перекрывается с сигналом HDO); 4,61 (t; J = 5,35 Гц; 1H); 4,51 (t; J = 4,36 Гц; 2H); 4,12 - 4,48 (m; 9H); 4,07 (s; 3H); 3,58 (s; 3H); 3,43 (s; 3H); ³¹P ЯМР (162 MГц; D₂O) δ 30,93 (t; J=26,9 Гц; 1 P) -0,59 (br. s; 1 P) -11,94 (d; J=26,9 Гц; 1 P) -12,08 (d; J=26,9 Гц; 1 P);

(D2): ¹H ЯМР (400 MГц; D₂O) δ 9,08 (s; 1H); 8,16 (s; 1H); 8,10 (s; 1H); 5,89 (d; J = 2,49 Гц; 1H); 5,87 (d; J = 5,98 Гц; 1H); 5,82 (d; J = 5,98 Гц; 1H); 4,97 (m; 1H); 4,58 – 4,55 (~t; 1H) 4,85 -4,73 (m; 2H; перекрывается с сигналом HDO); 4,54 - 4,47 (m; 2H); 4,13 - 4,46 (m; 9H); 4,07 (s; 3H); 3,57 (s; 3H); 3,44 (s; 3H); ³¹P ЯМР (162 MГц; D₂O) δ 30,40 (dt; J=26,9 Гц; 1 P) -0,60 (br. s; 1 P) -11,98 (d; J=26,9 Гц; 1 P) -12,43 - 12,06 (d; J=26,9 Гц; 1 P)

МСВР расч., m/z для C₃₃H₄₄N₁₅O₂₄P₄S^- [M-H]^- 1190,1360; зарегистрировано, 1190,13936.

Пример 2 - Синтез кэпированной мРНК in vitro путем транскрипции in vitro с использованием аналогов кэпа

Для включения различных аналогов кэпа во время транскрипции in vitro можно использовать тот же протокол, что и для включения обычных динуклеотидных кэпов бета-S-ARCA. В приведенном здесь примере к реакции транскрипции добавляли 3 мМ аналога кэпа и 7,5 мМ NTP. Выход (в мг РНК на мл реакционного объема) и целостность РНК, продуцированной одним из диастереомеров (D1/D2) Соединения 1 или одним из диастереомеров (D1/D2) бета-S-ARCA, были сопоставимы с данными, приведенными в следующей таблице.

Выход реакции
(мг РНК/мл объема реакции) Целостность РНК
(BIOANALYZER) бета-S-ARCA (D1) 6,54 82% Соединение 1 (D1) 6,39 87% бета-S-ARCA (D2) 6,42 82% Соединение 1 (D2) 5,81 80%

Пример 3 - Экспрессия белка из мРНК с различными кэпами в культуре клеток

В качестве функционального анализа включения аналога кэпа и в качестве теста на транслируемость полученной структуры кэпа в незрелые дендритные клетки человека (hiDC) трансфицировали мРНК с различным кэпом, кодирующую репортер люциферазы. Для этого 700 нг кэпированной РНК на лунку готовили с липосомами, как описано в Kranz et al., Nature 534, 396-401 (2016), и добавляли в 96-луночный планшет, содержащий 5E04 hiDC. Затем активность репортера регистрировали в течение 72 часов. Результаты представлены на Фиг. 3.

мРНК, ко-транскрипционно кэпированная с диастереомером D1 или D2 Соединения 1, были функциональными и транслировались в hiDC на сопоставимых уровнях с мРНК, кэпированной соответствующим диастереомером D1 или D2 бета-S-ARCA, что указывает на то, что с соединениями формулы (I) в соответствии с настоящим изобретением преимущества модификации бета-S-ARCA все также были активными (Фиг. 3).

Пример 4 - мРНК, модифицированная 5’-кэп соединением формулы (I), сочетает улучшенную стабильность и эффективность трансляции мРНК с уклонением от иммунного ответа через IFIT1

мРНК люциферазы были ко-транскрипционно кэпированы диастереомером D1 или D2 Соединения 1 или соответствующим диастереомером D1 или D2 бета-S-ARCA, как описано выше. Кроме того, трифосфат Luc мРНК (т.е. транскрибируемая при отсутствии какого-либо аналога кэпа) была ферментативно кэпирована с использованием набора ферментов кэпирования осповакцины NEB (ферментативная Кэп-0/Кэп-1 РНК). Для получения ферментативных кэп-0 структур кэппинг-фермент осповакцины применяли как таковой, для ферментативных кэп-1 структур также добавляли метилтрансферазу осповакцины. Затем полученные препараты кэпированной мРНК очищали для уменьшения количества или устранения двухцепочечной РНК. Кроме того, небольшое количество не кэпированной РНК, присутствующей в препаратах ко-транскрипционно кэпированной мРНК, которая, как было показано в предыдущих экспериментах, мешает анализу, ферментативно преобразовывали в структуры кэп-0 (для мРНК, кэпированных динуклеотидами) или в структуры кэп-1 (для мРНК, кэпированных тринуклеотидами). Затем полученные препараты мРНК готовили с F12 и вводили мышам Balb/c внутривенно. В каждой группе тестировали по пять мышей с дозой 10 мкг РНК на мышь. Силу и кинетику экспрессии люциферазы контролировали с помощью визуализации биолюминесценции in vivo через 6, 24 и 48 часов после применения.

Хотя в этом случае бета-S-замена оказывает лишь незначительный эффект (если вообще оказывает), что наблюдается по аналогичным профилям экспрессии ферментативно кэпированной РНК кэп-0 по сравнению с бета-S-ARCA (D1) и (D2) кэп-0 РНК, основным фактором, управляющим экспрессией in vivo, является 2'-O-метилирование структуры кэп-1. Соответственно, ферментативно кэпированные препараты кэп-1 мРНК дают наивысшую экспрессию белка в любой измеренный момент времени. Однако РНК, кэпированные Соединением 1, демонстрируют аналогичные уровни белка через 20 часов после применения и лишь немного более низкие уровни в другие моменты времени (и всегда более высокие уровни по сравнению со всеми кэп-0 РНК). Таким образом, 5’-кэп соединения по настоящему изобретению позволяют включать в РНК кэп-1 структуры бета-S-ARCA, которые сочетают положительный эффект тиозамещения с определяющим кэп-1 2’-O-метилированием.

Пример 5 - Экспрессия белка из мРНК с различными кэпами in vivo

мРНК мышиного эритропоэтина (mEPO), содержащие 1-метилпсевдоуридин (m1Ψ), были ко-транскрипционно кэпированы с помощью ARCA G или диастереомера D1 бета-S-ARCA (обозначенного как D1), как описано выше. Кроме того, трифосфат EPO мРНК (т.е. транскрибируемая в отсутствие какого-либо аналога кэпа) была ферментативно кэпирована с использованием набора ферментов кэпирования осповакцины NEB (ферментативная Кэп-0/Кэп-1 РНК). Для получения ферментативных структур кэп-0 (обозначенных как Есар-0) фермент кэпирования осповакцины с активностью РНК-трифосфатазы и гуанилилтрансферазы использовали как таковой, для ферментативных структур кэп-1 (обозначенных как Есар-1) также добавляли метилтрансферазу осповакцины с активностью 2'-O-метилтрансферазы. Затем полученные препараты мРНК с различными кэпами очищали, чтобы уменьшить количество или исключить двухцепочечную РНК. Кроме того, небольшое количество не-кэпированной РНК, присутствующей в препаратах мРНК с ко-транскрипцией, которая, как было показано в предыдущих экспериментах, мешает анализу, ферментативно превращали в структуры кэп-0, а затем в структуры кэп-1. В препарате мРНК с использованием структур D1 полученный продукт после обработки ферментами был обозначен как D1+Есар-1, тогда как в случае ARCA G полученный продукт после обработки ферментами был обозначен как ARCA G+Есар-1. Затем готовили препараты мРНК с TransIT® и интраперитонеально вводили мышам Balb/c. В каждой группе тестировали по пять мышей с дозой 3 мкг РНК на мышь. Трансляцию мРНК mEPO контролировали с помощью ИФА в плазме, собранной через 6, 24, 48 и 72 часа после применения.

Как видно на Фиг. 5, присутствие структуры кэп-1 по изобретению в РНК приводит к гораздо более высоким уровням экспрессии mEPO по сравнению с РНК, имеющей структуру кэп-0, в частности через 24 часа после инъекции. Кроме того, на Фиг. 5 показано, что при использовании РНК, содержащей структуру кэп-1 по настоящему изобретению, можно поддерживать высокие уровни mEPO в плазме в течение по меньшей мере 72 часов. Таким образом, этот пример демонстрирует, что нет необходимости вводить РНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид или белок, по меньшей мере два раза в сутки, чтобы поддерживать высокие уровни экспрессии пептида или белка. Скорее, используя настоящее изобретение, можно вводить РНК не более одного раза в сутки, предпочтительно не более одного раза в два дня, предпочтительно не более одного раза в три дня или не более одного раза в четыре дня при сохранении высоких уровней экспрессии пептида или белка. Это дает пациенту то преимущество, что количество введений (например, инъекций) может быть значительно уменьшено, что особенно полезно для пациентов, которые получают лечение (например, фармацевтическую композицию) в течение длительного периода времени, таких как хронические или длительно болеющие пациенты.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение раскрывает новые 5'-кэп соединения и может быть использовано для стабилизации РНК такими 5'-кэп соединениями, а также для повышения их экспрессии в клетках. 12 н. и 21 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 5 пр.

1. 5'-кэп соединение, имеющее структуру в соответствии с формулой (I):

формула (I)

где R¹ выбран из группы, состоящей из С_1-4 алкила, С_2-4 алкенила и арила;

R² и R³ независимо выбраны из группы, состоящей из H, F, OH, метокси, этокси, пропокси и 2-метоксиэтокси;

R⁴ и R⁶ представляют собой O;

R⁵ представляет собой S;

R⁷ представляет собой мононуклеотид или ди- или триолигонуклеотид, причем нуклеотид, ближайший к кольцу, к которому присоединен R⁷, представляет собой нуклеозидный гуанозин;

R⁸ выбран из группы, состоящей из метокси, этокси, пропокси и 2-метоксиэтокси;

n равен 1, 2 или 3; и

B представляет собой фрагмент пуринового или пиримидинового основания.

2. 5'-кэп соединение по п. 1, где R² выбран из группы, состоящей из H, F, метокси, этокси, пропокси и 2-метоксиэтокси.

3. 5'-кэп соединение по п. 1 или 2, где B представляет собой фрагмент природного пуринового или пиримидинового основания, или его модифицированную форму.

4. 5'-кэп соединение по любому из пп. 1-3, где B выбран из группы, состоящей из гуанина, аденина, цитозина, тимина, урацила и их модифицированных форм, предпочтительно из группы, состоящей из гуанина, аденина, цитозина, урацила и их модифицированных форм, более предпочтительно из группы, состоящей из гуанина, аденина, цитозина и их модифицированных форм, более предпочтительно из группы, состоящей из гуанина, аденина и их модифицированных форм.

5. 5'-кэп соединение по п. 4, где фрагмент модифицированного пуринового или пиримидинового основания модифицирован одной или несколькими алкильными группами, предпочтительно одной или несколькими C_1-4 алкильными группами, более предпочтительно одной или несколькими метильными группами.

6. 5'-кэп соединение по п. 4 или 5, где фрагмент модифицированного пуринового или пиримидинового основания выбран из группы, состоящей из N⁷-алкил-гуанина, N⁶-алкил-аденина, 5-алкил-цитозина, 5-алкил-урацила и N(1)-алкил-урацила, предпочтительно из группы, состоящей из N⁷-C_1-4 алкил-гуанина, N⁶-C_1-4 алкил-аденина, 5-C_1-4 алкил-цитозина, 5-C_1-4 алкил-урацила и N(1)-C_1-4 алкил-урацила, более предпочтительно из группы, состоящей из N⁷-метил-гуанина, N⁶-метил-аденина, 5-метил-цитозина, 5-метил-урацила и N(1)-метил-урацила.

7. 5'-кэп соединение по любому из пп. 3-6, где фрагмент природного пуринового или пиримидинового основания представляет собой G или A, предпочтительно G.

8. 5'-кэп соединение по любому из пп. 1-4, где B представляет собой G или A, предпочтительно G.

9. 5'-кэп соединение по любому из пп. 1-8, где R⁷ связан своим 5'-концом с кольцом, к которому присоединен R⁸.

10. 5'-кэп соединение по любому из пп. 1-9, где R⁷ представляет собой рибомононуклеотид или рибоолигонуклеотид, имеющие 2 или 3 основания.

11. 5'-кэп соединение по п. 10, где R⁷ представляет собой рибонуклеотид, имеющий свободную группу ОН в положении 2'.

12. 5'-кэп соединение по п. 10, где R⁷ представляет собой рибоолигонуклеотид, причем как рибозный фрагмент на 3'-конце рибоолигонуклеотида, так и рибозный фрагмент на 5'-конце рибоолигонуклеотида имеют свободную группу ОН в положении 2'.

13. 5'-кэп соединение по п. 10, где R⁷ представляет собой рибоолигонуклеотид, где ОН группа в положении 2' по меньшей мере рибозы на 5'-конце рибоолигонуклеотида замещена заместителем, выбранным из группы, состоящей из Н, галогена и необязательно замещенного алкокси, а рибоза на 3'-конце рибоолигонуклеотида имеет свободную ОН группу в положении 2'.

14. 5'-кэп соединение по любому из пп. 1-13, где межнуклеотидная связь между мононуклеотидом или олигонуклеотидом и кольцом, к которому присоединен R⁷, выбрана из группы, состоящей из фосфата, фосфотиоата, боранофосфата, имидофосфата, алкиленфосфата, фосфодитиоата, алкилфосфоната, фосфотриэфира, фосфоамидита и ненуклеотидного линкера.

15. 5'-кэп соединение по любому из пп. 1-14, где межнуклеотидная связь (связи) между нуклеотидами в олигонуклеотиде выбрана (выбраны) из группы, состоящей из фосфата, фосфотиоата, боранофосфата, имидофосфата, алкиленфосфата, фосфодитиоата, алкилфосфоната, фосфотриэфира, фосфоамидита и ненуклеотидного линкера.

16. 5'-кэп соединение по любому из пп. 1-15, где стереохимическая конфигурация атома P, содержащего заместитель R⁵, соответствует конфигурации атома P_β диастереомера D1 бета-S-ARCA.

17. 5'-кэп соединение, имеющее структуру в соответствии с формулой (I):

формула (I)

где R¹ является метилом или этилом;

один из R² и R³ представляет собой метокси, а другой - OH;

R⁴ и R⁶ представляют собой O;

R⁵ представляет собой S;

R⁷ представляет собой мононуклеотид или ди- или триолигонуклеотид, причем нуклеотид, ближайший к кольцу, к которому присоединен R⁷, представляет собой нуклеозидный гуанозин;

R⁸ является метокси;

n равен 1, а

B представляет собой фрагмент пуринового или пиримидинового основания.

18. Композиция для обеспечения РНК структурой 5'-кэп, содержащая эффективное количество 5'-кэп соединения по любому из пп. 1-17.

19. Набор для обеспечения РНК структурой 5'-кэп, содержащий 5'-кэп соединение по любому из пп. 1-17.

20. РНК, кодирующая представляющий интерес пептид или белок, модифицированная 5'-кэп соединением по любому из пп. 1-17.

21. РНК для экспрессии представляющего интерес пептида или белка, модифицированная 5'-кэп соединением по любому из пп. 1-17 и содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес пептид или белок, функционально связанную с последовательностями контроля экспрессии или регуляторными последовательностями.

22. Клетка для получения представляющего интерес пептида или белка, содержащая РНК по п. 21.

23. Способ получения представляющего интерес пептида или белка, включающий стадию переноса РНК по п. 21 в клетку.

24. Способ экспрессии представляющего интерес пептида или белка у индивидуума, включающий стадию введения указанному индивидууму РНК по п. 21 или клетки по п. 22.

25. Способ повышения стабильности РНК в клетках, включающий стадии, на которых:

- обеспечивают указанную РНК структурой согласно формуле (I), как определено в любом из пп. 1-17; и

- переносят указанную РНК, модифицированную структурой согласно формуле (I), в клетки.

26. Способ увеличения экспрессии РНК в клетках, включающий стадии, на которых:

- обеспечивают указанную РНК структурой согласно формуле (I), как определено в любом из пп. 1-17; и

- переносят указанную РНК, модифицированную структурой согласно формуле (I), в клетки, где указанная РНК содержит последовательности контроля экспрессии или регуляторные последовательности.

27. Способ по п. 25 или 26, где стадию обеспечения указанной РНК структурой согласно формуле (I) осуществляют в отсутствие 2'-O-рибозометилтрансферазы.

28. Способ для обеспечения РНК 5'-кэп-структурой, включающий:

проведение реакции транскрипции с использованием матричной нуклеиновой кислоты в присутствии 5'-кэп-соединения по любому из пп. 1-17, где матричная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК, комплементарную целевой РНК.

29. Способ по п. 28, где реакцию транскрипции проводят in vitro.

30. Способ по п. 28 или 29, где реакцию транскрипции проводят с использованием РНК-полимеразы, выбранной из группы, состоящей из РНК-полимераз Т3, Т7 и SP6.

31. Способ по любому из пп. 28-30, где РНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес пептид или белок.

32. Способ по любому из пп. 28-31, который осуществляют в отсутствие 2'-O-рибозометилтрансферазы.

33. РНК по п. 21, где представляющий интерес пептид или белок выбран из группы, состоящей из цитокинов, таких как эритропоэтин; молекул адгезии, таких как интегрин; иммуноглобулинов; иммунологически активных соединений, например антигенов, таких как антигены, ассоциированные с опухолью, антигены, ассоциированные с патогенами (такие как вирусные антигены, например один или несколько антигенов вируса гриппа (вируса гриппа A, B или C), цитомегаловируса (CMV) или респираторно-синцитиального вируса (RSV)), аллергенов или аутоантигенов; гормонов, таких как вазопрессин, инсулин или гормон роста; факторов роста, таких как VEGFA; ферментов, таких как тимидинкиназа вируса простого герпеса 1 типа (HSV1-TK), гексозаминидаза, фенилаланингидроксилаза, псевдохолинэстераза, ферменты поджелудочной железы и лактаза; рецепторов, таких как рецепторы фактора роста; ингибиторов протеаз, таких как альфа-1-антитрипсин; регуляторов апоптоза, таких как BAX; факторов транскрипции, таких как FOXP3; белков-супрессоров опухолей, таких как р53; структурных белков, таких как сурфактантные белки; факторов перепрограммирования, таких как OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, LIN28 или NANOG; геномно-инженерных белков, таких как ассоциированный с кластеризованными короткими палиндромными повторами с регулярными интервалами CRISPR белок 9 (CRISPR-Cas9); и белков крови, таких как фибриноген.