СПОСОБ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО НЕРВА ДЛЯ РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ХИРУРГИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2024 года по МПК A61L27/14 A61L27/22 A61L27/38 

Предлагаемое изобретение относится к регенеративной медицине, а именно к нейрохирургии, и может быть использовано при создании аналога периферического нерва для применения в реконструктивной хирургии.

В отличие от других тканей тела, регенерация периферических нервов происходит медленно и обычно не полностью. Тяжелое повреждение периферического нерва оказывает разрушительное воздействие на качество жизни пациентов. Типичными симптомами являются сенсорная и двигательная дисфункция, которая может привести к полному параличу пораженной конечности или развитию нейропатической боли (Siemionow М, Brzezicki G, 2009). Нервные волокна перерезанного нерва регенерируют спонтанно в пределах, ограниченных размером нервной щели, невриномы и образованием рубцовой ткани (Thomson J.G., 2005). Основная цель восстановления нерва - позволить реиннервацию органов-мишеней путем направления регенерирующих сенсорных, моторных и вегетативных аксонов в среду дистального нерва с минимальной потерей волокон на линии шва (Brushart Т., 1991). При повреждении нерва целью хирургического вмешательства, как правило, является повторная аппроксимация концов поврежденного нерва. Иногда во время восстановления после повреждения нерва необходимо элиминировать часть поврежденного нерва, называемую невромой, оставляя разрыв. Обычно нервные окончания удается свести вместе, если натяжение будет в пределах физиологической нормы. Исследования на животных показали, что при сшивании нервов с натяжением в 17% случаев происходит расхождение шва. Поэтому при невозможности наложения шва на место разрыва может потребоваться трансплантат нерва. В клинической практике используется два метода лечения с помощью трансплантатов: соединение нервных проводников с помощью фрагмента аутологичного нерва и применение полых кондуитов из различных биодеградируемых материалов, обеспечивающих направленный рост аксонов к периферическому отрезку нерва (Масгутов Р.Ф. и др., 2020).

До сих пор «золотым стандартом» микрохирургического лечения являлось использование аутологичных нервных трансплантатов (АНТ) (Shapira Y. et al., 2016). Помимо отсутствия гарантии полного функционального восстановления, например, в результате неправильной реиннервации мишени, использование АНТ сопровождается рядом других недостатков, таких как болезненность и ограниченная доступность донорской ткани. Чтобы обойти эти недостатки для клинического использования необходимо разработать биологические нервные трансплантаты, которые лучше всего имитируют естественную среду исходной нервной структуры, чтобы обеспечить поддерживающие регенерацию сигналы (Dietzmeyer N. et al., 2020).

Известен способ разработки трехмерных нанотопографических скаффолдов, обеспечивающих ускоренный направленный рост отростков нервных клеток. Для этого используют подложки на основе нейлона-4,6. Данные скаффолды показывают высокую биосовместимость с нервными клетками (нейробластомы человека IMR-32) и независимо от ультраструктуры повышают пролиферацию клеток по сравнению с контролем. Полученные скаффолды способствовали значительной элонгации отростков и поляризованности клеток в целом, что позволяет их использовать в качестве тканеинженерной конструкции при замещении дефектов периферических нервов [Антонова О.Ю., Кочеткова О.Ю., Михеев А.Ю. Наноструктурированные скаффолды для направленного роста нейрональных клеток // Гены и Клетки. - 2019. - Т. 14. - №. S. - С. 25-25].

Недостатком данного способа является отсутствие исследований in vivo в качестве проводника для замещений дефектов периферического нерва.

В качестве ближайшего аналога принят способ применения нерва, взятого от трупа человека и предварительно помещенного в консервирующую среду ТС-199 [Мухамадеев И.С. и соавт. Патент РФ на изобретение №2308241 С1 от 29.05.2006 г. «Способ лечения повреждений периферических нервов»].

Недостатком применения данного способа является возможность отторжения пересаженного нерва ввиду присутствия клеточных компонентов, которые не были удалены при предварительной обработке нерва.

Задачи:

- получить децеллюляризированный периферический нерв, характеризующийся максимальным сохранением гистологической структуры и полной элиминацией клеточных компонентов;

- сократить время регенерации нервной ткани при больших дефектах;

- исключить забор нерва с донорского участка;

- предотвратить образование невромы;

- обеспечить жизнеспособность дистальной части травмированного нерва.

Сущностью предложенного изобретения является создание протокола децеллюляризации нерва крысы, включающий забор нерва, отличающийся тем, что у крысы забирают седалищный нерв, замораживают его при температуре -70-80°С с последующей разморозкой; обрабатывают раствором Трипсин-Версена при температуре +37°С на шейкер-инкубаторе при 100-150 оборотах в минуту в течение 6 часов, с периодической сменой растворов через каждые 2 часа; последовательно двукратно воздействуют на шейкере при 100-150 оборотах в минуту растворами 1% Тритона X-100 в течение 3 часов и 4% дезоксихолатом натрия в течение 3 часов, с условием промывки дистиллированной водой образцов после циклов в течение 5-20 минут и последующей обработки свиной панкреатической ДНКазой в течение 4 часов при температуре +37°С на шейкер-инкубаторе при 100-150 оборотах в минуту, при этом нерв обрабатывают в указанных растворах в соотношении массы образца в граммах к объему растворов в миллилитрах - 1:10 в течение 22-23 часов, затем осуществляют контроль качества децеллюляризации и при условии содержания ДНК не более 50 нг/мг ткани, образцы соответствуют заданным требованиям, а в случае несоответствия образца указанному требованию, его вторично обрабатывают в тех же режимах растворами Тритона Х-100 и дезоксихолата натрия.

Техническим результатом является получение материала для замещения дефектов периферического нерва с максимально сохраненной гистологической структурой нативного нерва, не обладающий иммуногенными свойствами, который не травмирует донорский участок, предотвращает образование болезненной невромы, позволяет проводить нервные импульсы от одного конца нерва к другому, не позволяя отмирать дистальной части отростка.

Способ апробирован в течение года на 46 образцах биологического материала (нерв) экспериментальных животных (крысы линии Вистар). Получены образцы децеллюляризированных нервов с максимально сохранной гистологической структурой, отсутствием клеточных элементов и не являющиеся цитотоксичными в условиях in vitro.

Способ получения децеллюляризированного нерва осуществляют следующим образом: выполняют забор седалищного нерва массой 0,2-0,5 г, при этом хирургическую манипуляцию проводят под газовым наркозом «Изофлуран» (индукция 2-5%, поток 0,25-4%). После операции проводят инъекции антибиотика цефовецина 6,4 мг/кг (Zoetis, США) и кетопрофена 12,8 мг/кг (Вик-здоровье животных, Беларусь). Полученный образец нерва замораживают при температуре -70-80°С с последующей разморозкой; обрабатывают раствором Трипсин-Версена при температуре +37°С на шейкер-инкубаторе при 100-150 оборотах в минуту в течение 6 часов, с периодической сменой растворов через каждые 2 часа; затем последовательно двукратно воздействуют на шейкере при 100-150 оборотах в минуту растворами 1% Тритона Х-100 в течение 3 часов и 4% дезоксихолатом натрия в течение 3 часов, с условием промывки дистиллированной водой образца после циклов в течение 5-20 минут и последующей обработки свиной панкреатической ДНКазой в течение 4 часов при температуре +37°С на шейкер-инкубаторе при 100-150 оборотах в минуту, при этом нерв обрабатывают в указанных растворах в соотношении массы образца в граммах к объему растворов в мл - 1:10. Общее значение времени обработки нерва составляло 22-23 часа. Контроль качества децеллюляризации подтверждают путем определения остаточного содержания ДНК, которое не должно составлять более 50 нг на 1 мг сухой массы ткани (Bühler N.E. et al., 2015). Контроль остаточного содержания ДНК проводят с использованием набора реагентов (Dneasy Blood and Tissue Kit, Qiagen, Швеция) по протоколу фирмы-изготовителя. Отсутствие цитотоксического действия образцов нерва in vitro проводят методом Live/Dead (ThermoFisher Scientific Inc., США) по протоколу фирмы-производителя. Для проведения анализа используют линию человеческих дермальных фибробластов DF-1, полученную из Российской коллекции клеточных культур позвоночных ФГБУН Института цитологии РАН. При этом живые клетки приобретают зеленое, а мертвые - красное свечение за счет взаимодействия с кальцеином-АМ и гомодимером этидия соответственно.

Пример 1. В условиях операционной производили забор седалищного нерва массой 0,36 г у крысы линии Вистар, возрастом 6 месяцев. Полученный материал замораживали при температуре -80°С, затем образец размораживали. Далее образцы заливали раствором Трипсин-Версена (3,6 мл) и помещали в шейкер-инкубатор в режиме 100 оборотов в минуту при температуре +37°С на 6 часов, меняя раствор через каждые 2 часа. Затем образцы помещали на шейкер в режиме 100 оборотов в минуту и подвергали последовательному двукратному циклическому воздействию растворами детергентов: 1% раствора Тритона Х-100 (3,6 мл) в течение 3 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия (3,6 мл) в течение 3 часов, после воздействия каждого детергента образец промывали в деионизированной воде в течение 5 минут, далее обрабатывали образец раствором свиной панкреатической ДНКазы I (3,6 мл) в шейкере-инкубаторе в режиме 100 оборотов в минуту при температуре +37°С в течение 4 часов. Качество децеллюляризации подтверждали путем контроля остаточного содержания ДНК в трех повторностях. Исследование показало, что среднее значение количества ДНК в полученном образце составляло 48,35±1,65 нг/мг сухого вещества, что соответствовало критерию качества децеллюляризации. Анализ данных, полученных по методике Live/Dead, продемонстрировал, что 80±10% клеток DF-1 оставались жизнеспособными на полученном образце нерва. Данный результат свидетельствовал об отсутствии цитотоксического действия образцов исследуемых матриксов. Затем через 60 дней после имплантации проводили оценку динамики регенерации поврежденного нерва у крысы после моделирования дефекта. В результате проведенного эксперимента была выявлена положительная динамика репарационных процессов, отмечалось, что в имплантируемых образцах количество нервных волокон на мм² соответствовало значениям нативного нерва.

Пример 2. В условиях операционной производили забор седалищного нерва массой 0,41 г у крысы линии Вистар, возрастом 6 месяцев. Полученный материал замораживали при температуре -80°С, затем образец размораживали. Далее образцы заливали раствором Трипсин-Версена (4,1 мл) и помещали в шейкер-инкубатор в режиме 150 оборотов в минуту при температуре +37°С на 6 часов, меняя раствор через каждые 2 часа. Затем образцы помещали на шейкер в режиме 150 оборотов в минуту и подвергали последовательному двукратному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона Х-100 (4,1 мл) в течение 3 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия (4,1 мл) в течение 3 часов, после воздействия каждого детергента образец промывали в деионизированной воде в течение 15 минут, далее обрабатывали образец раствором свиной панкреатической ДНКазы I (4,1 мл) в шейкере-инкубаторе в режиме 150 оборотов в минуту при температуре +37°С в течение 4 часов. Качество децеллюляризации подтверждали путем контроля остаточного содержания ДНК в трех повторностях. Исследование показало, что среднее значение количества ДНК в полученном образце составляло 34,02±1,85 нг/мг сухого вещества, что соответствовало критерию качества децеллюляризации. Анализ данных, полученных по методике Live/Dead, продемонстрировал, что 76±10% клеток DF-1 оставались жизнеспособными на полученном образце нерва. Данный результат свидетельствовал об отсутствии цитотоксического действия образцов исследуемых матриксов. Затем через 60 дней после имплантации проводили оценку динамики регенерации нерва у крысы после моделирования дефекта. В результате проведенного эксперимента наблюдали заметный рост нейронов в медиальных фрагментах, было отмечено увеличение мелких волокон (1-7 микрон) в медиальных участках замещенного нерва, что свидетельствовало о начале регенерации имплантируемого децеллюляризированного нерва.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу децеллюляризации периферического нерва. Способ децеллюляризации периферического нерва для реконструктивной хирургии в эксперименте, включающий забор нерва, характеризуемый тем, что у крысы забирают седалищный нерв, замораживают его при температуре -70-80°С с последующей разморозкой; обрабатывают раствором Трипсин-Версена при температуре +37°С на шейкер-инкубаторе при 100-150 оборотах в минуту в течение 6 часов, с периодической сменой растворов через каждые 2 часа; последовательно двукратно воздействуют на шейкере при 100-150 оборотах в минуту растворами 1% Тритона Х-100 в течение 3 часов и 4% дезоксихолатом натрия в течение 3 часов, с условием промывки дистиллированной водой образцов после циклов в течение 5-20 минут и последующей обработки свиной панкреатической ДНКазой в течение 4 часов при температуре +37°С на шейкер-инкубаторе при 100-150 оборотах в минуту, при этом нерв обрабатывают в указанных растворах в соотношении массы образца в граммах к объему растворов в миллилитрах - 1:10 в течение 22-23 часов, затем осуществляют контроль качества обесклечивания и при условии содержания ДНК не более 50 нг/мг ткани образцы соответствуют заданным требованиям, а в случае несоответствия образца указанному требованию его вторично обрабатывают в тех же режимах растворами Тритона Х-100 и дезоксихолата натрия. Использование изобретения обеспечивает получение материала для замещения дефектов периферического нерва с максимально сохраненной гистологической структурой нативного нерва, не обладающего иммуногенными свойствами, который не травмирует донорский участок, предотвращает образование болезненной невромы, позволяет проводить нервные импульсы от одного конца нерва к другому, не позволяя отмирать дистальной части отростка. 2 пр.

Способ децеллюляризации периферического нерва для реконструктивной хирургии в эксперименте, включающий забор нерва, отличающийся тем, что у крысы забирают седалищный нерв, замораживают его при температуре -70-80°С с последующей разморозкой; обрабатывают раствором Трипсин-Версена при температуре +37°С на шейкер-инкубаторе при 100-150 оборотах в минуту в течение 6 часов, с периодической сменой растворов через каждые 2 часа; последовательно двукратно воздействуют на шейкере при 100-150 оборотах в минуту растворами 1% Тритона Х-100 в течение 3 часов и 4% дезоксихолатом натрия в течение 3 часов, с условием промывки дистиллированной водой образцов после циклов в течение 5-20 минут и последующей обработки свиной панкреатической ДНКазой в течение 4 часов при температуре +37°С на шейкер-инкубаторе при 100-150 оборотах в минуту, при этом нерв обрабатывают в указанных растворах в соотношении массы образца в граммах к объему растворов в миллилитрах - 1:10 в течение 22-23 часов, затем осуществляют контроль качества обесклечивания и при условии содержания ДНК не более 50 нг/мг ткани образцы соответствуют заданным требованиям, а в случае несоответствия образца указанному требованию его вторично обрабатывают в тех же режимах растворами Тритона Х-100 и дезоксихолата натрия.