СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛОГА ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО НЕРВА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2024 года по МПК G09B23/28 A61F2/02 A61L27/36 A61P25/02 

Предлагаемое изобретение относится к регенеративной медицине, а именно к нейрохирургии, и может быть использовано при создании аналога периферического нерва для замещения дефектов в реконструктивной хирургии.

Повреждения нервов верхних и нижних конечностей являются одним из частых и тяжелых видов травм, которые могут кардинально изменить качество и образ жизни человека как в повседневной бытовой, так и в профессиональной среде.

На сегодняшний день при дефектах периферического нерва в восстановительной хирургии чаще используют аутотрансплантаты, но ограниченная доступность подходящих донорских участков у пациента и необратимые последствия эксплантации нерва, такие как онемение и болевые синдромы донорского участка, ограничивают возможность применения данного способа. Поэтому разрабатываются различные нервные кондуиты и конструкции на основе биологических и синтетических материалов, которые позволяют восстанавливать серьезные повреждения.

В настоящий момент проводится разработка все более сложных биоматериалов, которые тестируются на моделях in vivo в качестве альтернативы аутотрансплантата (Vleggeert-Lankamp С. L. А. М. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: a systematic review // Journal of neurosurgery. - 2007. - Vol. 107. - №. 6. - P. 1168-1189). В идеале эти биоматериалы должны имитировать структуру нормальной ткани периферического нерва, включая структуру внеклеточного матрикса, а также клеточные и молекулярные сигналы. В этом контексте нервные трубки на основе коллагена были признаны перспективными за их биосовместимость, отсутствие токсических продуктов распада, структурное и молекулярное сходство с естественными соединительными тканями (Van Neerven S. G. A. et al. Two-component collagen nerve guides support axonal regeneration in the rat peripheral nerve injury model // Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. - 2017. - Vol. 11. - №. 12. - P. 3349-3361).

Известен способ восстановления нерва, характеризующийся тем, что участок поврежденного нерва размещают в нейротрубочке из биологического полимера с продольным разрезом, нейротрубочку подшивают к эпиневрию на расстоянии от 0,5 до 5 см от места повреждения так, чтобы максимальное натяжение нерва приходилось на неповрежденный участок нерва, затем соединяют поврежденные участки нерва.

Недостатком данного способа является то, что способ нельзя применить для дефектов более 1 см [Маргасов А.В. Патент РФ на изобретение №2585421 С1 от 24.12.2014 г. «Способ восстановления поврежденного нерва»].

Известны также способы применения синтетических биосовместимых трубок в качестве самостоятельных или заполненных кондуитов для замещения дефектов периферичесского нерва:

1. Способ применения биосовместимой синтетической трубки из химически инертного нерассасывающегося полимера, отличающийся тем, что в трубчатом имплантате располагают дополнительный элемент в виде сплошного стержня [Соломицкий Д.Н. и соавт. Патент РФ на изобретение №2697775 С1 от 23.03.2018 г. «Трубчатый имплантат в качестве направляющей оболочки нерва и способ регенерации нерва»].

2. В качестве ближайшего аналога принят способ применения биосовместимой синтетической трубки, которую имплантируют в место разрыва периферического нерва, фиксируют в ней один конец разорванного нерва, заполняют ее водным раствором, включающим экзогенный белок теплового шока Hsp70 с концентрацией 500-900 нм/мл и коллаген I и/или III типа, и фиксируют в ней другой конец разорванного нерва [Демьяненко С.В. и соавт. Патент РФ на изобретение №2775886 С1 от 07.11.2021 г. «Способ стимулирования регенерации нерва»].

Недостатками всех указанных выше способов лечения дефектов периферических нервов является использование синтетических материалов, которые могут вызывать воспалительную реакцию в организме реципиента, а также невозможность передачи нервного импульса к дистальной части отростка нерва, лишенного питания и электрических импульсов.

Задачами предлагаемого изобретения являются создание композитной биологической конструкции для замещения дефектов периферического нерва, устранение риска отторжения и воспалительного процесса, улучшение репаративных свойств поврежденной нервной ткани.

Сущностью предлагаемого изобретения является получение биологического аналога периферического нерва в эксперименте, включающий использование кондуита для замещения дефекта периферического нерва, отличающийся тем, что осуществляют забор образцов дермы с поверхности кожи свиньи, затем замораживают образцы дермы при температуре -70÷-80°С с последующей разморозкой, образцы обрабатывают 3,2-5,0% щелочным раствором гидроксида натрия при комнатной температуре при гидромодуле 1:5 в течение 20-24 часов, после чего отмывают в 0,05% уксусной кислоты до нейтрального значения рН в течение 35-40 часов и заполняют полученным гидрогелем коллагеновую трубку NeuraGen (INTEGRA, США).

Технический результат, достигаемый заявленной совокупностью существенных признаков, заключается в разработке нового биологического кондуита с условием отсутствия риска натяжения в области соединения поврежденного участка нерва, что приводит к сокращению сроков восстановления нерва и к снижению количества послеоперационных осложнений, а также исключения использования синтетических материалов. Режим обработки образцов обеспечивает получение такой консистенции гидрогелевого материала, которую удобно применять при наполнении коллагеновой трубки с использованием инсулинового шприца, а также для увеличения скорости деградации после имплантации комплексного кондуита в область дефекта периферического нерва.

Способ апробирован в течение одного года на 32 образцах биологического материала (нерв) экспериментальных животных (крысы линии Вистар).

Способ получения биологического нервного кондуита для замещения дефекта периферического нерва осуществляют следующим образом: в условиях операционной животное возрастом 3-4 месяца в состоянии наркоза укладывают на бок, производят разметку донорского участка размером 20-30 × 40-50 см, при помощи шприца выполняют инъекционное пропитывание подкожной жировой клетчатки физиологическим раствором. Затем производят одномоментный разрез кожи по намеченному контуру и равномерными пилящими движениями скальпеля по плоскости получают полнослойный кожный лоскут на всей площади забора единым образцом, включающим эпидермис, дерму и жировую ткань. Далее забранный кожный лоскут помещают на валик, лоскут растягивают зажимами Кохера, создавая равномерное натяжение на всей площади, обрабатывают вазелиновым маслом и срезают с донорского участка дисковым электродерматомом эпидермис, подготавливая лоскут к забору дермы, далее электродерматомом с диметром дискового ножа 100 мм производят забор образца дермы толщиной 0,7-0,8 мм в направлении, перпендикулярном направлению лоскута, размером 8-10 × 6-10 см. После этого полученный образец замораживают при температуре -70÷-80°С с последующей разморозкой; далее образцы обрабатывают 3,2-5,0% щелочным раствором гидроксида натрия при комнатной температуре при гидромодуле 1:5 в течение 20-24 часов, после чего отмывают в 0,05% уксусной кислоте до нейтрального значения рН в течение 30-40 часов и с помощью инсулинового шприца заполняют коллагеновую трубку NeuraGen (INTEGRA, США).

Затем проводят хирургическое моделирование повреждений седалищного нерва (иссечение 2,8 см нерва) крысе линии Wistar с имплантацией разработанного комплексного кондуита, диаметром 5 мм, длиной - 3 см, заполненной 300 мкл гидрогеля. Для подшивания нервного кондуита использовали шовный материал Promilene 8/0, для закрытия операционной раны - Ethilon 3-0.

Пример 1. В условиях операционной животное возрастом 4 месяца в состоянии наркоза уложили на бок, произвели разметку донорского участка размером 30×50 см, при помощи шприца выполнили инъекционное пропитывание подкожной жировой клетчатки физиологическим раствором. Затем произвели одномоментный разрез кожи по намеченному контуру и равномерными пилящими движениями скальпеля по плоскости получили полнослойный кожный лоскут на всей площади забора единым образцом, включающим эпидермис, дерму, мозаичные участки жировой ткани. Далее забранный кожный лоскут поместили на валик, лоскут растянули зажимами Кохера, создавая равномерное натяжение на всей площади, обработали вазелиновым маслом и срезали с донорского участка дисковым электродерматомом эпидермис, подготавливая лоскут к забору дермы, далее электродерматомом с диметром дискового ножа 100 мм произвели забор образца дермы толщиной 0,8 мм в направлении, перпендикулярном направлению лоскута, размером 8×6 см. После этого полученный образец заморозили при температуре -70°С с последующей разморозкой; далее образцы обрабатывали 5% щелочным раствором гидроксида натрия при комнатной температуре при гидромодуле 1:5 в течение 20 часов, после чего отмывали в 0,05% уксусной кислоте до нейтрального значения рН в течение 40 часов.

Затем проводили хирургическое моделирование повреждений седалищного нерва (иссечение 2,8 см нерва) крысе линии Wistar с имплантацией разработанного комплексного кондуита, диаметром 5 мм, длиной - 3 см, заполненной 300 мкл гидрогеля. Для подшивания нервного кондуита использовали шовный материал Promilene 8/0, для закрытия операционной раны - Ethilon 3-0. Все хирургические манипуляции проводили под газовым наркозом «Изофлуран» (индукция 2-5%, поток 0,25-4,00%). Для контроля функционального восстановления использовали тест ходьбы на дорожке (Nasab S.Т. et al. Nanobioglass enhanced polyurethane/collagen conduit in sciatic nerve regeneration // Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. - 2022. - Vol. 110. - №. 5. - P. 1093-1102). Показатели индекса двигательной функции седалищного нерва (SFI) на 24-е, 36-е, 40-е, 56-е сутки эксперимента были: -98,52±2,35; -64,21±2,96; -47,22±7,23; -21,34±3,26 соответственно. Индекс, близкий к нулю, представляет собой нормальную функцию, тогда как -100 и выше демонстрирует полную потерю функции.

Пример 2. В условиях операционной животное возрастом 3,5 месяца в состоянии наркоза уложили на бок, произвели разметку донорского участка размером 25×60 см, при помощи шприца выполнили инъекционное пропитывание подкожной жировой клетчатки физиологическим раствором. Затем произвели одномоментный разрез кожи по намеченному контуру и равномерными пилящими движениями скальпеля по плоскости получили полнослойный кожный лоскут на всей площади забора единым образцом, включающим эпидермис, дерму, мозаичные участки жировой ткани. Далее забранный кожный лоскут поместили на валик, лоскут растянули зажимами Кохера, создавая равномерное натяжение на всей площади, обработали вазелиновым маслом и срезали с донорского участка дисковым электродерматомом эпидермис, подготавливая лоскут к забору дермы, далее электродерматомом с диметром дискового ножа 100 мм произвели забор образца дермы толщиной 0,7 мм в направлении, перпендикулярном направлению лоскута, размером 10×10 см. После этого полученный образец замораживали при температуре -80°С с последующей разморозкой; далее образцы обрабатывали 3,2% щелочным раствором гидроксида натрия при комнатной температуре при гидромодуле 1:5 в течение 24 часов, после чего отмывали в 0,05% уксусной кислоте до нейтрального значения рН в течение 35 часов.

Затем проводили хирургическое моделирование повреждений седалищного нерва (иссечение 1,5 см нерва) крысе линии Wistar с имплантацией разработанного комплексного кондуита, диаметром 1,5 мм, длиной - 1,5 см, заполненной 200 мкл гидрогеля. Для подшивания нервного кондуита использовали шовный материал Promilene 8/0, для закрытия операционной раны - Ethilon 3-0. Все хирургические манипуляции проводили под газовым наркозом «Изофлуран» (индукция 2-5%, поток 0,25-4,00%). Для контроля функционального восстановления использовали тест ходьбы на дорожке (Nasab S.T. et al. Nanobioglass enhanced polyurethane/collagen conduit in sciatic nerve regeneration // Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. - 2022. - Vol. 110. - №. 5. - P. 1093-1102). Показатели индекса двигательной функции седалищного нерва (SFI) на 24-е, 36-е, 40-е, 56-е сутки эксперимента были: -102,75±5,12; -76,35±6,14; -42,21±2,25; -13,69±2,66 соответственно. Индекс, близкий к нулю, представляет собой нормальную функцию, тогда как -100 и выше демонстрирует полную потерю функции.

Изобретение относится к области регенеративной медицины, а именно к способу получения биологического аналога периферического нерва в эксперименте. Способ получения биологического аналога периферического нерва в эксперименте, включающий забор образцов дермы с поверхности кожи свиньи, отличается тем, что образцы дермы замораживают при температуре -(70÷80)°С с последующей разморозкой, образцы обрабатывают 3,2-5,0% щелочным раствором гидроксида натрия при комнатной температуре при гидромодуле 1:5 в течение 20-24 часов, после чего отмывают в 0,05% уксусной кислоте до нейтрального значения рН в течение 35-40 часов и заполняют коллагеновую трубку NeuraGen (INTEGRA, США). Изобретение позволяет получить новый биологический кондуит, который исключает натяжение в области соединения поврежденного участка нерва, что приводит к сокращению сроков восстановления нерва, снижению количества послеоперационных осложнений, также изобретение позволяет исключить использование синтетических материалов. 2 пр.

Способ получения биологического аналога периферического нерва в эксперименте, включающий забор образцов дермы с поверхности кожи свиньи, отличающийся тем, что образцы дермы замораживают при температуре -(70÷80)°С с последующей разморозкой, образцы обрабатывают 3,2-5,0% щелочным раствором гидроксида натрия при комнатной температуре при гидромодуле 1:5 в течение 20-24 часов, после чего отмывают в 0,05% уксусной кислоте до нейтрального значения рН в течение 35-40 часов и заполняют коллагеновую трубку NeuraGen (INTEGRA, США).