Лечение глазных болезней типа дегенерации желтого пятна, глаукомы и диабетической ретинопатии с помощью лекарственных средств, устраняющих стареющие клетки Российский патент 2024 года по МПК A61K31/496 A61K31/5377 A61P27/02 

Родственные заявки

Для настоящего изобретения испрашивается приоритет от патентной заявки США № 15/675,171, поданной 11 августа 2017 г. (на рассмотрении), и патентной заявки США № 62/579,793, поданной 31 октября 2017 г. (на рассмотрении). В тех юрисдикциях, где допускается включение посредством ссылки, эти приоритетные заявки настоящим включены в данное описание посредством ссылки во всей полноте для всех целей.

Область техники, к которой относится изобретение

Технология, раскрытая и заявленная ниже, в целом относится к области глазных болезней, приводящих к ухудшению зрения. В частности, данным изобретением предусмотрено семейство соединений и методики, которые могут применяться для лечения глазных болезней путем устранения вовлеченных в их патофизиологию и симптоматику стареющих клеток.

Уровень техники

Распространенность нарушений зрения и слепоты у взрослых вследствие возрастных заболеваний глаз является одной из самых больших проблем, стоящих перед современной медициной.

По данным Всемирной организации здравоохранения, три заболевания глаз представляют потенциальную угрозу состоянию зрения у людей в странах со средним уровнем дохода и в промышленно развитых странах по всему миру. Увеличение распространенности диабета II-го типа привело к тому, что диабетическая ретинопатия заняла первое место в списке приоритетов ВОЗ. Глаукома, вызывающая инвалидность глазная болезнь, известная на протяжении веков, остается на повестке дня общественного здравоохранения из-за трудностей её ранней диагностики и частой необходимости пожизненного лечения. Возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) занимает третье место среди глобальных причин нарушения зрения с уровнем слепоты 8,7%. Это главная причина нарушений зрения в промышленно развитых странах.

По данным Национального института глаз (NEI), в США возрастная дегенерация желтого пятна имеется у 2,1 миллионов человек, диабетическая ретинопатия – у 7,7 миллионов, глаукома – у 2,7 миллионов, а катаракта – у 24,4 миллионов. Это составляет поразительные 26% американского населения старше 40 лет.

Несмотря на распространенность нарушений зрения и все внимание, которое им уделяет медицинское исследовательское сообщество, эти заболевания в большой степени так и остаются трудноизлечимыми. Многие заболевания не имеют доступных или модифицирующих заболевание терапевтических альтернатив. За некоторыми исключениями, большинство лекарств, одобренных в настоящее время для лечения этих заболеваний, направлены на позднюю стадию патофизиологии или на облегчение симптомов, а не на факторы, которые инициируют и/или поддерживают заболевание.

Доступные в настоящее время способы терапии включают средства типа ингибиторов фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) для лечения связанных с VEGF заболеваний глаз (к примеру, влажной AMD, диабетических заболеваний глаз), витамины и антиоксиданты при сухой AMD и средства, снижающие внутриглазное давление при глаукоме. Для лечения некоторых заболеваний доступна лазерная терапия: к примеру, фотокоагуляция сетчатки при отеке сетчатки или неоваскуляризации вследствие диабета, окклюзии вен и хориоидальной неоваскуляризации; и лазерная трабекулопластика для лечения повышенного внутриглазного давления, устойчивого к лекарственной терапии. Для многих заболеваний глаз, включая сухую AMD, сейчас нет утвержденных терапевтических средств. Фаза 3 клинических испытаний гуманизованного антитела, разработанного для лечения географической атрофии при сухой AMD (лампализумаб), недавно не смогла достичь своей главной конечной цели – предотвращения прогрессирования атрофии. Даже для тех глазных болезней, где имеются терапевтические средства, схемы лечения зачастую являются обременительными и обладают ограниченной долгосрочной эффективностью.

Представленное здесь изобретение создает новую парадигму для лечения глазных болезней посредством устранения стареющих клеток, вовлеченных в патофизиологию нарушений зрительной системы. В нижеследующем описании изложена его реализация и применение, а также описаны многие вытекающие из этого преимущества.

Cущность изобретения

Настоящее изобретение основывается на том обнаруженном факте, что многие заболевания глаз, связанные со старением, опосредованы, по крайней мере частично, клетками с фенотипом старения. Стареющие клетки накапливаются с возрастом и экспрессируют факторы, способствующие патофизиологии возрастных заболеваний. Данные показывают, что у сопоставимых по возрасту пациентов тяжесть возрастных заболеваний коррелирует с обилием стареющих клеток, а удаление стареющих клеток может помочь устранению таких заболеваний.

В настоящем изобретении предусмотрены низкомолекулярные препараты, удаляющие стареющие клетки из пораженной ткани глаз, которые обладают особой эффективностью при лечении заболеваний глаз. Они не только тормозят прогрессирование заболеваний, но также могут обратить некоторые патофизиологические процессы типа неоваскуляризации и облитерации сосудов, которые приводят к потере зрения. Эти сенолитические средства обладают соответствующим дозовым профилем и специфичностью, будучи эффективными при клиническом ведении ранее трудноизлечимых заболеваний глаз.

В общем смысле настоящим изобретением предусмотрены технологии для профилактики или лечения заболеваний глаз у субъектов путем удаления стареющих клеток из или вокруг глаз у субъекта, при этом замедляется прогрессирование заболевания или уменьшается тяжесть по меньшей мере одного признака или симптома заболевания.

В целях настоящего изобретения заболевания глаз классифицируют по шести основным типам патофизиологии: ишемические или сосудистые заболевания; дегенеративные заболевания; генетические заболевания; бактериальные, грибковые или вирусные инфекции; воспалительные заболевания; или ятрогенные заболевания. Их патофизиология информативна при реализации сенолитической стратегии лечения каждого заболевания. Классификация заболеваний глаз в пределах этих типов приводится далее в описании.

В изобретение входят способы лечения, единичные дозы и предполагаемое применение определенных ингибиторов и сенолитических средств. Эффективные средства, которые могут применяться в контексте данного изобретения для удаления стареющих клеток и лечения заболеваний глаз, включают соединения следующей формулы либо их фосфорилированные формы:

где: R₁ и R₂ независимо означают C₁–C₄-алкил;

R₃, R₄ и R₅ независимо означают -H или -CH₃;

R₈ означает -OH или -N(R₆)(R₇), где R₆ и R₇ независимо означают алкил или гетероалкил, который необязательно циклизирован;

X₁ означает -F, -Cl, -Br или -OCH₃;

X₂ означает -SO₂R′ или -CO₂R′, где R′ означает -H, -CH₃ или -CH₂CH₃;

X₃ означает -SO₂CF₃, -SO₂CH₃ или -NO₂; и

X₅ означает -F, -Br, -Cl, -H или -OCH₃.

В некоторых воплощениях X₃ означает -SO₂CF₃ или -NO₂, а R₈ означает -N(R₆)(R₇), где R₆ и R₇ независимо означают алкил или гетероалкил, который необязательно циклизирован.

В зависимости от того, как реализуется технология, помимо общего улучшения симптоматики или предотвращения прогрессирования определенного глазного заболевания, технология может оказывать один или несколько из следующих эффектов в любой комбинации:

• уменьшение количества p16-положительных стареющих клеток в или вокруг глаз у субъекта;

• торможение или регрессия неоваскуляризации в глазах у субъекта;

• торможение или регрессия облитерации сосудов в глазах у субъекта; и

• торможение или регрессия повышенного внутриглазного давления (ВГД) в глазах у субъекта.

Изобретением также предусмотрены новые способы скрининга. Один из таких способов включает выбор тестируемого соединения в качестве возможного фармацевтического средства для лечения глаукомы путем контактирования с клетками трабекулярной сети (TM) в культуре или в ткани нечеловеческих испытуемых субъектов и определения того, будет ли тестируемый агент снижать количество стареющих клеток в культуре или ткани. Другой такой способ скрининга включает введение тестируемого агента в глаза нечеловеческих испытуемых субъектов и определение того, будет ли тестируемый агент ингибировать или обращать неоваскуляризацию или облитерацию сосудов, возникающую на модели заболевания у животных.

Другие особенности технологии по изобретению представлены в дальнейших разделах и в прилагаемой формуле изобретения.

Краткое описание фигур

На фиг. 1A представлена блок-схема, которая показывает патофизиологические взаимодействия в глазах, которые возникают при ишемии. На фиг. 1B представлена блок-схема, которая показывает многофакторную патофизиологию глаукомы, приводящую к гибели ганглиозных клеток сетчатки (RGC). На фиг. 1C представлена блок-схема, которая показывает патофизиологический каскад при возрастной дегенерации желтого пятна. На фиг. 1D представлена блок-схема, которая показывает события, ведущие к дегенерации клеток и гибели клеток при наследственной оптической невропатии Лебера.

На фиг. 2A представлены снимки гистопатологии, которые показывают потерю клеток сетчатки на стадиях пигментного ретинита. На фиг. 2B, 2C, 2D и 2E представлены флуоресцеиновые ангиограммы нормальной сетчатки и при неперфузии и неоваскуляризации сетчатки при диабете, серповидноклеточной анемии и воспалительном васкулите, соответственно.

На фиг. 3A и 3B представлено 9 конкретных соединений, выбранных из библиотеки на основании связывания с Bcl-2 или Bcl-xL.

На фиг. 4A, 4B и 4C представлено количественное сродство связывания 9 соединений с изоформами Bcl: Bcl-xL, Bcl-2 и Bcl-w, соответственно. Каждое из соединений, для которых приведены данные, идентифицированы по назначенным им номерам BM.

На фиг. 5A, 5B и 5C представлено сравнение структуры соединений по эффективности для определения того, какие субструктуры вносят вклад в требуемые свойства соединений.

На фиг. 6 представлено сродство связывания с изоформами Bcl и эффективная концентрация (EC₅₀) для уничтожения стареющих фибробластов (SnCs) в культуре.

На фиг. 7 представлена кривая типа концентрация-ответ для стареющих клеток микрососудистого эндотелия сетчатки человека HRMEC и контрольных клеток при обработке in vivo сенолитическим средством.

На фиг. 8 представлена кривая типа концентрация-ответ для стареющих клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) и контрольных клеток при обработке in vivo сенолитическим средством. Средство обладает гораздо большей активностью (более низкой LD₅₀) на стареющих клетках, чем на нормальных пролиферирующих клетках RPE. Его индекс селективности для стареющих клеток RPE по сравнению с нестареющими клетками RPE составляет от 10 до 100.

На фиг. 9A и 9B представлена регрессия неоваскуляризации и облитерации сосудов на мышиной модели индуцированной кислородом ретинопатии (OIR) при интравитреальном введении сенолитического средства UBX1967.

На фиг. 10A, 10B, 10C и 10D представлено снижение уровня экспрессии связанных со старением маркеров на уровне РНК-транскриптов после обработки UBX1967.

На фиг. 11A и 11B представлена стрептозотоциновая (STZ) модель диабетической ретинопатии. Индуцированная STZ сосудистая утечка ослабляется при интравитреальном введении UBX1967.

На фиг. 12A и 12B представлено иммуногистохимическое окрашивание на p16 (маркер стареющих клеток) в ткани, взятой у пациента с первичной открытоугольной глаукомой (POAG). В трабекулярной сети (TM) хорошо видны p16-положительные клетки.

На фиг. 13A и 13B представлена экспрессия p16 в глазной ткани человека, полученной от доноров с диагнозом первичной открытоугольной глаукомы (POAG).

На фиг. 14A и 14B представлено иммуногистохимическое окрашивание на p16 в ткани сетчатки человека у пациента с возрастной дегенерацией желтого пятна (AMD).

Раскрытие сущности изобретения

Обзор

Предпосылкой настоящего изобретения является то, что многие или большинство тех заболеваний глаз, которые связаны с возрастом или связаны с клеточными дефектами, ведущими к фенотипу ускоренного старения, вызваны или опосредованы, по крайней мере частично, стареющими клетками, которые накапливаются с возрастом и оказывают вредное влияние на глазные ткани. Стареющие клетки обычно представляют собой такие клетки, которые больше не обладают способностью к репликации, но остаются в исходной ткани, вызывая связанный со старением секреторный фенотип (SASP). Считается, что стареющие клетки происходят из пролиферативных клеток различных типов тканей, в том числе клеток, находящихся внутри и вокруг глаз. Факторы SASP включают различные ангиогенные, воспалительные, фиброзные и модифицирующие внеклеточный матрикс молекулы (Acosta et al., 2013). Некоторые факторы, вовлеченные в глазные патологии, являются частью совокупности факторов, вырабатываемых стареющими клетками. По этой причине устранение или контроль стареющих клеток обеспечивает средство для лечения глазных болезней, не только путем устранения стареющих клеток, но также посредством снижения связанных с ними факторов SASP и влияния на окружающие клетки.

Различные заболевания глаз предстают в клинике с различными признаками и симптомами и имеют разные типы патофизиологических механизмов. Гетерогенность заболеваний глаз согласуется с предполагаемой ролью стареющих клеток в патологии заболеваний, так как стареющие клетки могут происходить из разных поколений клеток, индуцироваться разными стрессорами, находиться в различных тканях глаз и по-разному взаимодействовать с окружающими клетками. Тем не менее, стареющие клетки в различных тканях глаз имеют связанный с ними секреторный фенотип, который способствует расстройствам всей зрительной системы. Специфический клиренс стареющих клеток из ткани в настоящем изобретении именуется сенолизом. Низкомолекулярные соединения, способные вызывать сенолиз, именуются сенолитическими средствами, которые удаляют стареющие клетки независимо от вызывающего старение механизма, профиля SASP или происхождения клеток.

В качестве разъяснения: авторы обнаружили, что ингибиторы семейства белков Bcl запускают апоптоз в стареющих клетках, происходящих из того типа клеток, которые известны как находящиеся в задней части глаза и представлены клетками, вовлеченными в заболевания сетчатки типа AMD, а также запускают апоптоз в стареющих клетках, происходящих из того типа клеток, которые известны как находящиеся в переднем отделе глаза и представлены клетками, вовлеченными в заболевания типа глаукомы.

Обнаруженные факты, меняющие нынешнюю парадигму разработки лекарств

Помимо нового понимания общей роли стареющих клеток в возникновении заболеваний глаз, в настоящем изобретении описаны и другие обнаруженные факты, которые открывают новые возможности для разработки лекарств.

Один из таких обнаруженных фактов заключается в том, что стареющие клетки в изобилии присутствуют в трабекулярной сети пациентов с глаукомой и в соответствующих моделях на животных. Повышение внутриглазного давления вызывается либо перепроизводством водянистой влаги, главным образом в цилиарном теле, либо уменьшением оттока водной жидкости, главным образом через трабекулярную сеть. Представленные здесь данные согласуются с тем, что по крайней мере часть патофизиологии, лежащей в основе заболевания, состоит в нарушении дренажа внутриглазной жидкости через трабекулярную сеть и вниз по каналу Шлемма и эписклеральным венам в венозную систему глазниц. Нацеливание сенолитических лекарств на клетки трабекулярной сети является важным новым направлением для разработки лекарств, как в виде монотерапии, так и в сочетании с препаратами, действующими посредством регуляции продукции жидкости.

Другой обнаруженный факт заключается состоит в том, что удаление стареющих клеток из задней части глаз при заболеваниях типа диабетической ретинопатии не просто тормозит прогрессирование заболевания, но фактически обращает вспять часть патофизиологии, ведущей к потере зрения, включая неоваскуляризацию и облитерацию сосудов. Насколько известно авторам, сейчас еще нет терапии (ни в клинике, ни в разработке), которая была бы способна обратить течение ретинопатии вспять в такой степени. Теперь же цель терапии заболеваний глаз может быть более амбициозной, давая новую надежду пациентам с такими заболеваниями на улучшение качества жизни.

Преимущества лечения заболеваний глаз путем удаления стареющих клеток

Роль стареющих клеток в провоцировании или возникновении различных заболеваний глаз обеспечивает подход к лечению с рядом преимуществ для лечащего врача.

• Поскольку стареющие клетки не являются пролиферативными, то устранение стареющих клеток дает возможность получить клинически полезный эффект, который сохраняется продолжительное время между эпизодами лечения. Особенности состояния, опосредованного стареющими клетками, проходят по крайней мере до тех пор, пока опять не накопятся стареющие клетки. Поскольку стареющие клетки могут накапливаться медленно (учитывая, что возрастные заболевания обычно развиваются в течение многих лет), то эффекты от одного лечения или цикла лечения могут длиться неделями, месяцами или годами.

• В той степени, в которой стареющие клетки усугубляют другие виды патологии типа воспаления или разрушения ткани, продолжительный эффект сенолиза обеспечивает окно, в котором такая патология сдерживается, потенциально давая ткани возможность для восстановления. Это значит, что лекарство для стареющих клеток дает возможность не только остановить прогрессирование заболеваний глаз, но и в какой-то степени вызвать регрессию заболевания и его симптомов на благо пациента.

• Поскольку стареющие клетки в разных частях глаза реагируют на одни и те же сенолитические средства, то у одного и того же пациента можно лечить несколько разных заболеваний глаз одновременно. Например, пациент может обратиться к врачу с несколькими протекающими процессами таких заболеваний, как глаукома и дегенерация желтого пятна. Это дает возможность вводить одно сенолитическое средство по схеме лечения, которая учитывает заболевание и его симптомы у каждого из нескольких заболеваний. Помимо удобства этого подхода, он обладает дополнительным преимуществом снижения риска побочных эффектов, которые могут возникать при введении нескольких препаратов в комбинации для лечения каждого заболевания по отдельности. Кроме того, возможно, что факторы, вызванные клетками в одной части глаза, могут воздействовать на другие части глаза, так что лечение старения в двух локализациях может оказывать благоприятное действие на оба заболевания.

• Воздействуя на раннюю патологию при заболевании, сенолитическая медицина может быть важным дополнением к другим типам терапии, применяемым для лечения поздних стадий патологии или для облегчения симптомов, возникающих при заболевании. Два режима терапии могут работать синергически или аддитивно, уменьшая нагрузку, частоту и побочные эффекты каждого режима при введении по отдельности.

Классификация глазных болезней в соответствии с их патофизиологией

В качестве руководства для лечения заболеваний глаз по настоящему изобретению, соответствующие заболевания можно классифицировать в соответствии с их первичной патофизиологией. Заболевания, которые подпадают под одну и ту же классификацию, подходят для применения сенолитической медицины по одним и тем же принципам и с аналогичными целями.

Заболевания глаз, подходящие для лечения, обсуждаются более подробно ниже в рамках следующей классификации.

• 1-й тип. Ишемические или сосудистые заболевания: возникают при ограничении кровоснабжения тканей, что вызывает дефицит кислорода и/или основных питательных веществ, необходимых для клеточного метаболизма для поддержания работоспособности тканей.

• 2-й тип. Дегенеративные заболевания: характеризуются прогрессирующим ухудшением качества, функции или структуры ткани или органа, что ведет к прогрессирующему нарушению зрения.

• 3-й тип. Генетические заболевания: вызываются мутациями, делециями или вставками в последовательность ДНК индивида.

• 4-й тип. Инфекционные заболевания, вызванные патогенными микроорганизмами типа бактерий, вирусов, паразитов или грибков; заболевания могут передаваться, прямо или косвенно, от одного лица другому.

• 5-й тип. Воспалительные заболевания, характеризующиеся локализованной реакцией на травмы, посторонние предметы или разрушение тканей, которая служит для разрушения, разбавления или ограждения и вредоносного агента, и поврежденной ткани путем вырабатывания провоспалительных медиаторов и привлечения клеток иммунной системы.

• 6-й тип. Ятрогенные заболевания, определяемые как заболевания, которые возникают в результате диагностических и терапевтических процедур, проводимых на пациентах.

Эта классификация приводится для того, чтобы помочь читателю в понимании и применении изобретения к конкретному пациенту, и не должна ограничивать применение этой технологии. Некоторые заболевания могут вызывать несколько из таких категорий: например воспалительный процесс может способствовать патологическим процессам, имеющим другие основные причины. Точно так же SASP может запускать дополнительные патологические процессы независимо от первичного повреждения.

Схема лечения

Стареющие клетки накапливаются с возрастом, поэтому заболевания, опосредованные стареющими клетками, чаще встречаются у пожилых людей. Кроме того, различные виды стресса на глазные ткани могут способствовать появлению стареющих клеток и фенотипа, который они экспрессируют. Клеточные стрессоры включают окислительный стресс, метаболический стресс, повреждение ДНК (к примеру, в результате воздействия ультрафиолетового света или генетического расстройства), активацию онкогенов и укорачивание теломеров (к примеру, в результате гиперпролиферации). Глазная ткань, подверженная таким стрессорам, может иметь большее содержание стареющих клеток, что, в свою очередь, может привести к появлению определенных заболеваний глаз в более раннем возрасте или в более тяжелой форме. Наследственная восприимчивость к некоторым глазным болезням предполагает, что на накопление болезнетворных стареющих клеток могут прямо или косвенно влиять генетические компоненты, что может привести к более раннему проявлению.

При лечении конкретных офтальмологических заболеваний с помощью сенолитического средства по настоящему изобретению режим лечения будет зависеть от местонахождения стареющих клеток и патофизиологии заболевания.

Касательно местоположения: заболевания зрительной системы в широком смысле классифицируются как передние и задние. Передние заболевания глаз поражают или затрагивают переднюю часть глаз типа периокулярных мышц, век либо глазных тканей или жидкостей, расположенных перед задней стенкой капсулы хрусталика или ресничными мышцами. Задние заболевания глаз в основном поражают или затрагивают заднюю часть глаз типа сосудистой оболочки, ресничного тела, стекловидного тела, стекловидной камеры, сетчатки, пигментного эпителия сетчатки, мембраны Бруха, зрительного нерва (т.е. диска зрительного нерва), зрительного пути и тех кровеносных сосудов и нервов, которые снабжают сосудами либо иннервируют заднюю часть глаз.

Касательно патофизиологии: стареющие клетки и появление SASP могут способствовать продолжающейся дисфункции и дегенерации/гибели клеток. Стареющие клетки и связанные с ними факторы SASP могут вносить вклад в текущую дисфункцию клеток, потерю клеток и прогрессирование заболевания путем блокирования ангиогенных, воспалительных, фиброзных и модифицирующих внеклеточный матрикс белков, присутствующих при патофизиологии.

Таким образом, устранение или уменьшение количества стареющих клеток в или вокруг участка патологии устраняет по крайней мере одну из причин или медиаторов заболевания, которое проявляется в клинике. Сенолитические средства составляются и вводятся таким образом, чтобы они связывались со стареющими клетками в или вокруг участка патологии, удаляя их и/или подавляя их активность в такой степени, чтобы остановилось прогрессирование заболевания и/или ослаблялись признаки и симптомы заболевания.

Различные заболевания, опосредованные стареющими клетками примерно в одном и том же месте и/или с похожей базовой патологией, зачастую подвергают лечению одинаковым образом. Например, сенолитическое средство можно вводить путем местного топического нанесения на участок, пораженный при заболеваниях переднего сегмента, напр., на конъюнктиву и/или роговицу, к примеру, с помощью глазных капель, мази или при помощи контактной линзы. Может применяться и внутриглазное введение, интракамерально либо интравитреально, при заболеваниях как переднего, так и заднего сегмента.

Диагностика и мониторинг нарушений зрительной системы

Подход к диагностике и мониторингу всех заболеваний глаз и к оценке терапевтических эффектов облегчается широкой доступностью стандартной “батареи” тестов на структуры и функции глаз. Этими тестами можно оценивать отдельные слои глаз, простирающиеся от век и переднего сегмента до стекловидного тела и всех клеточных слоев сетчатки, зрительного нерва и зрительной коры.

Стандартное офтальмологическое обследование включает подробную биомикроскопическую оценку с помощью щелевой лампы, которая позволяет оценивать веки, придатки глаз, ресницы, поверхность роговицы, переднюю камеру, зрачки, хрусталик, стекловидное тело и анатомию центральной сетчатки, включая зрительный нерв и желтое пятно. Гониоскопия позволяет детально обследовать угол передней камеры, что важно при диагностике и мониторинге всех форм глаукомы. Непрямая офтальмоскопия позволяет оценить периферию сетчатки, что важно при мониторинге заболеваний стекловидного тела и периферической сетчатки.

Также при диагностике и мониторинге терапевтических реакций широко применяется вспомогательное тестирование при всех нарушениях зрительной системы, причем эти тесты включают следующие.

Функциональные тесты на остроту зрения (включая остроту зрения с коррекцией, контрастную остроту и остроту при низкой яркости), цветовое зрение (включая тесты Ishihara и Farnsworth-Munsell) и оценку поля зрения (включая автоматическую периметрию и микропериметрию Хамфри), продуцирование слезной жидкости (тест Ширмера) и тонометрию для измерения внутриглазного давления (ВГД). Они применяются в сочетании со структурными тестами, включая фотографии переднего и заднего сегментов, пахиметрию роговицы, ультразвук, ультразвуковую биомикроскопию, оптическую когерентную томографию (OCT), внутривенную флуоресцеиновую ангиографию (IVFA) и аутофлуоресценцию глазного дна (FAF). Для оценки глазных, периокулярных и орбитальных структур, а также внутричерепной части зрительного нерва, зрительного пути и зрительной коры головного мозга применяется визуализация типа компьютерной томографии (CT) или магнитно-резонансной томографии (MRI). Эти тесты позволяют визуализировать структурную целостность и толщину слоев глаза и окружающих структур, а также оценить кровоток и кровообращение.

Также применяется расширенное функциональное тестирование сетчатки, зрительного нерва и зрительного тракта/коры, включая такие электрофизиологические тесты, как полнопольная и мультифокальная электроретинография, зрительные вызванные потенциалы и микропериметрия, для диагностики и мониторинга течения заболеваний и влияния терапии (Mengini and Duncan, 2014). Хотя сейчас они доступны только в условиях исследовательских лабораторий, другие технологии визуализации могут стать важным дополнением при диагностике и лечении заболеваний глаз, в том числе вызванных старением, как-то методы адаптивной оптики и оптической когерентной ангиографии.

Клиническое обследование, структурные и функциональные измерения и корреляции могут быть получены как на животных моделях, так и в клинических условиях, и применимы к условиям и заболеваниям зрительной системы, описанным в настоящей заявке. Набор тестов, приведенных выше, является частью диагностики, оценки и реакции на лечение при этих заболеваниях.

В качестве примера, для диагностики и мониторинга реакции на сенолитики может проводиться структурная оценка неперфузии и неоваскуляризации сетчатки после ишемии сетчатки, вызванной целым рядом различных этиологических факторов (напр., диабетической ретинопатии, окклюзионных сосудистых заболеваний вследствие атеросклеротических или воспалительных причин, ретинопатии недоношенных и генетических сосудистых заболеваний типа серповидноклеточной ретинопатии) методами IVFA и OCT. Может проводиться диагностика и мониторинг глаукоматозной невропатии зрительного нерва с потерей ганглиозных клеток сетчатки и функции поля зрения в результате подверженности зрительного нерва повышению ВГД, вызванному множеством причин (к примеру, ремоделированием трабекулярной сети, первичной открытоугольной глаукомой (POAG), псевдоэксфолиацией, пигментной дисперсией, лечением стероидами, травмой) методами OCT и тестирования поля зрения. Роль стареющих клеток по данным молекулярных маркеров типа p16 в ткани трабекулярной сети больных глаукомой (пример 5) и в ткани сетчатки глаз донора с AMD (пример 6) и наличию факторов SASP, которые вовлечены в различные стадии этих заболеваний, подчеркивает потенциальное влияние сенолитической медицины на эти заболевания.

Следствием настоящего изобретения является то, что независимо от того, каким точно образом стареющие клетки накапливаются и впоследствии экспрессируют SASP, сенолитическая терапия может оказывать благотворное влияние на свойства заболеваний глаз путем восстановления гомеостаза в клеточной среде. Это приводит к модификации заболевания через изменение течения и исхода заболевания.

Сравнение сенолитической медицины с существующей терапией

Виды терапии, которые сейчас применяются в клинике, ограничены в их способности модифицировать течение болезни или потенциальный регресс патологии. Стандартом лечения наиболее распространенных глазных болезней (глаукомы и сосудистых заболеваний сетчатки и хориоида) являются глазные капли для снижения внутриглазного давления (ВГД) при глаукоме, внутриглазное введение препаратов против VEGF при неоваскуляризации сетчатки и хориоида, и лазерная фотокоагуляция для контроля как ВГД (Stein и Challa, 2007), так и витреоретинальных заболеваний (AAO Retina/Vitreous Panel, 2014).

Топические средства, снижающие внутриглазное давление (ВГД), и препараты, направленные на связанные с VEGF глазные болезни, обременены частым режимом введения, которого нужно придерживаться для максимальной эффективности. Даже при оптимальном введении препараты против VEGF связаны со значительной частотой неполного отклика, рецидивами заболевания и продолжающимся прогрессированием не опосредованных VEGF аспектов глазного заболевания (к примеру, атрофии желтого пятна при лечении влажной AMD (Bhisitkhul, 2015). Эти же проблемы возникают при использовании снижающих ВГД средств при глаукоме, которые нужно вводить по меньшей мере раз в день для снижения ВГД, а также связаны с продолжающимся прогрессированием глаукомной болезни, даже при правильном применении и в связи со снижением ВГД (Levin, 2005).

Лазерная фотокоагуляция была еще одним столпом глазной терапии при широком спектре глазных болезней, по сравнению с которыми сенолитическое введение может иметь много преимуществ. Несмотря на клиническую эффективность, лазерная фотокоагуляция сетчатки ведет к коллатеральным повреждениям и побочным эффектам, включая ухудшение ночного зрения, макулярные и периферические скотомы со снижением центрального и периферического зрения, обострение отека желтого пятна и нарушение анатомии сетчатки вследствие рубцевания (Kozak and Luttrul, 2015). В применении к трабекулярной сети для снижения ВГД лазерная терапия связана с пиками ВГД, образованием периферических передних спаек, необходимостью в дополнительных лазерных или хирургических процедурах и отсутствием снижения потребности в снижающих ВГД каплях после процедуры (Damji et al., 2006).

Удаление стареющих клеток и связанных с ними факторов SASP при сенолитической терапии может положительно влиять на течение заболеваний посредством модуляции многих вызывающих заболевания факторов, включая воспалительные, ангиогенные и модифицирующие внеклеточный матрикс аспекты заболевания. Почти или совсем без повреждения или разрушения здоровых клеток, необходимых для поддержания зрительной функции, и с редким режимом дозирования при продолжительном терапевтическом эффекте, данное изобретение представляет собой большой прогресс по сравнению с существующими методами лечения, которые не нацелены специально на стареющие клетки или множественные факторы, связанные с SASP, что ограничивает их способность модифицировать многие аспекты патофизиологии заболеваний.

В качестве примера: удаление стареющих клеток на фоне ишемии может оказать влияние на зрительную функцию, способствуя процветанию функционирующих ганглиозных клеток сетчатки в более здоровом окружении, свободном от связанных с SASP вредных воспалительных, ангиогенных и модифицирующих внеклеточный матрикс факторов. Это можно отслеживать структурно по измерению толщины сетчатки методом оптической когерентной томографии (OCT) и функционально по электрофизиологическим тестам (VEP и ERG), которые могут вычленять функцию слоя ганглиозных клеток сетчатки. Также для оценки функции периферического поля зрения у пациентов может применяться автоматическая периметрия.

Точно так же на фоне вазооблитерирующих заболеваний и неоваскуляризации удаление стареющих клеток и SASP может потенциально улучшить происходящее при этом повреждение клеток и способствовать реперфузии пораженных сосудистых русел и уменьшению неоваскуляризации. Можно оценивать сходство ишемического фенотипа (облитерация сосудов и неоваскуляризация) независимо от этиологии и отслеживать структурную и функциональную реакцию на терапию методами IVFA, OCT и ERG. На фиг. 2B (снимок с веб-сайта Carver College of Medicine, University of Iowa, поступил 30 октября 2017 г.), фиг. 2C (снимок веб-сайта Retina Gallery, поступил 30 октября 2017 г.), фиг. 2D (снимок веб-сайта Retina Vitreous Associates of Florida, поступил 30 октября 2017 г.) и фиг. 2E (снимок веб-сайта Retina Gallery, поступил 30 октября 2017 г.) представлены примеры флуоресцеиновой ангиографии нормальной сетчатки (фиг. 2B) и неперфузии и неоваскуляризации сетчатки при диабете (фиг. 2C), серповидноклеточной анемии (фиг. 2D) и воспалительном васкулите (фиг. 2E). Реакцию на сенолитическую терапию можно отслеживать с помощью внутривенной флуоресцеиновой ангиографии (IVFA) и OCT. Факторы, которые задействованы при SASP стареющих клеток, можно измерять прямо в глазной жидкости, включая слезы, водянистую влагу и стекловидное тело.

Влияние сенолитической медицины на лечение глазных болезней включает три основных концепции. Во-первых, после удаления стареющих клеток ожидается, что также сильно уменьшатся связанные с этим факторы SASP, происходящие из стареющих клеток. Постулируется, что в отсутствие этих воспалительных, ангиогенных и фиброзных белков и модифицирующих внеклеточный матрикс ферментов могут сильно подавляться многие или большинство из описанных здесь симптомов заболеваний глаз. Важно то, что после удаления стареющих клеток по возможности окружающие клетки могут восстанавливать некоторые функциональные возможности. Это представляет собой большой патофизиологический прогресс по сравнению с существующими способами лечения глазных болезней. Влияние сенолитических средств и восстановление функции можно отслеживать клинически с помощью структурных и функциональных тестов, как описано выше.

Во-вторых, в зависимости от обстоятельств сенолитические средства можно вводить однократно. Если необходимо повторное введение, то значительно возрастает время между дозами. Поскольку дегенерация желтого пятна, глаукома, сосудистая и наследственная ретинопатия характеризуются медленной деградацией сетчатки на протяжении многих лет, то повторное накопление стареющих клеток занимает значительный период времени. Дальнейшая терапия может не потребоваться в течение нескольких лет. Это представляет собой большое улучшение по сравнению, к примеру, со схемой дозирования существующих препаратов против VEGF, которые требуют введения от одного раза в месяц до каждого второго месяца и связаны с субоптимальными визуальными и анатомическими результатами при введении по менее частой схеме (Maguire et al., 2016; Holz et al., 2014). Топические средства, снижающие ВГД, требуют ежедневного введения, а значительный процент пациентов демонстрирует прогрессирование глаукомы, несмотря на снижение ВГД (Levin, 2005).

Наконец, сенолитическая терапия глазных болезней может устранять основную общую механистическую причину заболеваний глаз, а не воздействовать только на симптомы, возникающие на нижележащих сигнальных путях. Сенолитические средства, к примеру, могут воздействовать на несколько связанных с патологией цитокинов (воспалительных, цитотоксических, ангиогенных, фиброзных), а не на специфическое ингибирование одного фактора, задействованного в одном аспекте заболевания (к примеру, терапию против VEGF для связанного с VEGF аспекта неоваскуляризации).

В качестве примера, сенолитическая терапия может понизить целый ряд факторов роста, вовлеченных в различные стадии AMD. Из фиг. 1C (Kumar and Fu, 2014) видно, что ранние отложения в RPE вызывают дегенерацию внеклеточного матрикса, в том числе эластина и фибронектина. Усиление окислительного стресса вызывает повреждение митохондриальной ДНК, известного сильного индуктора старения. Затем следует дополнительная активация провоспалительных цитокинов и хемокинов (IL-1, IL-6) с возможной индукцией VEGF и металлопротеазы (MMPs) и активацией воспаления. Сенолитическая терапия, нацеленная на этот ряд факторов (все они определены как компоненты SASP), может оказывать многостороннее воздействие на патофизиологическое течение AMD со способностью модулировать и потенциально обратить течение болезни. Настоящая модификация течения заболевания пока еще не была продемонстрирована при существующей терапии глазных заболеваний, что подчеркивается необходимостью частого введения для контроля заболевания. Возможность редкого дозирования и модификация течения заболевания при сенолитической терапии представляют собой большой прогресс в лечении глазных болезней.

Удаление сенесцентных клеток может быть модифицирующим течение заболевания способом лечения глазных болезней, возникающих по причине ишемии, дегенерации или генетических первопричин, путем остановки прогрессирования или потенциально позволяя эндогенным репаративным системам или улучшению клеточной функции модифицировать исход.

Подходящие сенолитические средства

Соединения, которые могут быть полезными для удаления стареющих клеток в или около глаз в целях лечения заболеваний глаз по настоящему изобретению, включают ингибиторы Bcl-2, ингибиторы Bcl-xL, ингибиторы MDM2 и ингибиторы Akt. См. Патенты США №№ 8,691,184, 9,096,625 и 9,403,856; опубликованные заявки WO 2015/17159, WO 2015/116740, WO 2016/127135 и WO 2017/008060; и неопубликованную заявку PCT/CN2016/110309.

Сенолитические средства-кандидаты, действующие в качестве ингибиторов Bcl-2, Bcl-w и Bcl-xL, можно охарактеризовать как бензотиазолгидразоновые, аминопиридиновые, бензимидазоловые, тетрагидрохинолиновые или феноксильные соединения. Примеры соединений, ингибирующих изоформы Bcl, включают WEHI 539, A 1155463, ABT 737 и ABT 263 (Navitoclax).

Сенолитические средства-кандидаты, действующие в качестве ингибиторов MDM2, можно охарактеризовать как цис-имидазолины, дигидроимидазотиазолы, спиро-оксиндолы, бензодиазепины или пиперидиноны. Кандидаты-ингибиторы MDM2 включают Nutlin-1, Nutlin-2, Nutlin-3a, RG-7112, RG7388, R05503781, DS-3032b, MI-63, MI-126, MI-122, MI-142, MI-147, MI-18, MI-219, MI-220, MI-221, MI-773, 3-(4-хлорфенил)-3-((1-(гидроксиметил)циклопропил)метокси)-2-(4-нитробензил)изоиндолин-1-он, Serdemetan, AM-8553, CGM097, R0-2443 и R0-5963.

Сенолитические средства-кандидаты, действующие в качестве ингибиторов Akt (протеинкиназы B), представлены конкурентными ингибиторами Akt: CCT128930, GDC-0068, GSK2110183 (афуресертиб), GSK690693 и AT7867; липидными ингибиторами Akt: Ингибиторы Akt Calbiochem I, II и III, PX-866 и перифозин (KRX-0401); псевдосубстратными ингибиторами vKTide-2T и FOXO3-гибрид; аллостерическими ингибиторами киназного домена Akt, в частности MK-2206 (8-[4-(1-аминоциклобутил)фенил]-9-фенил-2H-[1,2,4]триазоло[3,4-f][1,6]нафтиридин-3-он дигидрохлорид); антителом GST против Akt1-MTS; соединениями, взаимодействующими с доменом PH Akt: трицирибин и PX-316; и другими соединениями типа GSK-2141795, VQD-002, милтефозина, AZD5363, GDC-0068 и API-1.

Типичные ингибиторы Bcl для применения при лечении заболеваний глаз по настоящему изобретению содержат структуру формулы I, представленной ниже, либо её фосфорилированную форму.

где: R₁ и R₂ независимо означают C₁–C₄-алкил;

R₃, R₄ и R₅ независимо означают -H или -CH₃;

R₈ означает -OH или -N(R₆)(R₇), где R₆ и R₇ независимо означают алкил или гетероалкил, который необязательно циклизирован;

X₁ означает -F, -Cl, -Br или -OCH₃;

X₂ означает -SO₂R′ или -CO₂R′, где R′ означает -H, -CH₃ или -CH₂CH₃;

X₃ означает -SO₂CF₃, -SO₂CH₃ или -NO₂;

X₅ означает -F, -Br, -Cl, -H или -OCH₃.

Необязательно R₈ означает -N(R₆)(R₇), где R₆ и R₇ независимо означают алкил или гетероалкил, который необязательно циклизирован.

Необязательно R₁ и R₂ независимо означают C₁–C₄-алкил;

R₃ и R₄ оба означают -H;

R₅ означает -H или -CH₃;

R₆ и R₇ независимо означают алкил или гетероалкил, который необязательно циклизирован;

X₁ означает -F или -Cl;

X₂ означает -SO₂R′ или -CO₂R′, где R′ означает -H, -CH₃ или -CH₂CH₃;

X₃ означает -SO₂CF₃, -SO₂CH₃ или -NO₂; и

X₅ означает -F или -H.

Другие типичные ингибиторы Bcl для применения при лечении заболеваний глаз по настоящему изобретению содержат структуру формулы II, представленной ниже, или её фосфорилированную форму.

где: R₁ и R₂ независимо означают C₁–C₄-алкил;

R₃ и R₄ независимо означают -H или -CH₃;

R₈ означает -OH или ;

X₁ означает -F, -Cl, -Br или -OCH₃;

X₂ означает -SO₂R′ или -CO₂R′, где R′ означает -H, -CH₃ или -CH₂CH₃;

X₃ означает -SO₂CF₃, -SO₂CH₃ или -NO₂;

X₄ означает -OH, -COOH или -CH₂OH;

X₅ означает -F, -Cl или -H; а

n₁ и n₂ независимо равны 1, 2, или 3.

Необязательно X₃ означает -SO₂CF₃ или -NO₂, а R₈ означает , где X₄ означает -OH или -COOH.

Необязательно соединение может иметь один, два, три, более трех или все из следующих признаков в любой комбинации:

R₁ означает изопропил;

R₂ означает метил;

R₃ означает -H;

R₄ означает -H;

X₁ означает -Cl;

X₂ означает -SO₂CH₃;

X₃ означает -SO₂CF₃;

X₄ означает -OH;

n₁ равно 2; и

n₂ равно 2.

Другие типичные ингибиторы Bcl для применения при лечении заболеваний глаз по настоящему изобретению содержат структуру формулы III, представленной ниже, либо её фосфорилированную форму.

где: R₁ и R₂ независимо означают C₁–C₄-алкил;

R₃, R₄ и R₅ независимо означают -H или -CH₃;

R₆ и R₇ независимо означают алкил или гетероалкил, который необязательно циклизирован;

X₁ означает -F, -Cl, -Br или -OCH₃;

X₂ означает -SO₂R′ или -CO₂R′, где R′ означает -H, -CH₃ или -CH₂CH₃;

X₃ означает -SO₂CF₃ или -NO₂; и

X₅ означает -F, -Br, -Cl, -H или -OCH₃;

или же:

R₁ и R₂ независимо означают C₁–C₄-алкил;

R₃ и R₄ оба означают -H;

R₅ означает -H или -CH₃;

R₆ и R₇ независимо означают алкил или гетероалкил, который необязательно циклизирован так, как показано в формуле VII;

X₁ означает -F или -Cl;

X₂ означает -SO₂R′ или -CO₂R′, где R′ означает -H, -CH₃ или -CH₂CH₃;

X₃ означает -SO₂CF₃ или -NO₂; и

X₅ означает -F или -H.

Другие типичные ингибиторы Bcl для применения при лечении заболеваний глаз по настоящему изобретению содержат структуру формулы IV, представленной ниже, или её фосфорилированную форму.

где: R₁ и R₂ независимо означают C₁–C₄-алкил;

R₃ и R₄ независимо означают -H или -CH₃;

X₁ означает -F, -Cl, -Br или -OCH₃;

X₂ означает -SO₂R′ или -CO₂R′, где R′ означает -H, -CH₃ или -CH₂CH₃;

X₃ означает -SO₂CF₃ или -NO₂;

X₄ означает -OH или -COOH;

X₅ означает -F, -Cl или -H; а

n₁ и n₂ независимо равны 1, 2, или 3.

Скрининг соединений на сенолитическую активность

Эти и другие соединения могут быть подвергнуты скринингу на молекулярном уровне по их способности действовать таким образом, который указывает на то, что они являются средствами-кандидатами для применения по настоящему изобретению.

Например, если терапия включает запуск апоптоза стареющих клеток посредством Bcl-2, Bcl-xL или Bcl-w, то соединения можно протестировать на их способность ингибировать связывание между Bcl-2, Bcl-xL или Bcl-w и соответствующим лигандом. В примере 1 представлена иллюстрация гомогенного анализа (анализа, который не требует стадии разделения) с целью определения связывания с изоформами Bcl. Соединения могут быть подвергнуты скринингу на молекулярном уровне по их способности действовать в качестве агонистов MDM2, при этом стимулируя активность р53 и вызывая сенолиз. В примере 2 представлена иллюстрация анализа для этой цели.

Системы клеточных культур для тестирования сенолитических средств

Соединения могут быть подвергнуты скринингу на биологическую активность при анализе на стареющих клетках. Культивируемые клетки приводят в контакт с соединением и определяют степень цитотоксичности или ингибирования клеток. Способность соединения к уничтожению или ингибированию стареющих клеток можно сравнить с воздействием соединения на нормальные клетки, которые свободно делятся при низкой плотности, и нормальные клетки, которые находятся в состоянии покоя при высокой плотности.

В примере 3 представлена иллюстрация на клетках линии IMR90 фибробластов из легких человека. Вследствие легкости их размножения клетки IMR90 эффективны в качестве инструмента для раннего скрининга. Поскольку в настоящем описании представлены типы клеток в глазах, которые генерируют стареющие клетки, вовлеченные в глазные болезни, то выбранные при раннем скрининге соединения могут быть подвергнуты повторному скринингу на первичных культурах целевых клеток глаз: в частности, клеток трабекулярной сети, как показано в примере 4, и клеток RPE, как показано в примере 5.

При технической возможности можно получить эксплантаты тканей из глаз пациентов-доноров и измерять снижение маркеров стареющих клеток и соответствующих заболеваний после инкубации с исследуемыми соединениями. В этом формате можно измерять сенолиз и его дальнейшее воздействие в неповрежденной ткани, где присутствуют соответствующие типы клеток и старение обусловлено патогенезом заболевания. Эксплантаты тканей также могут являться средством для оценки таких связанных с заболеванием типов клеток, которые с трудом поддаются стандартным методам культивирования клеток in vitro по отдельности (к примеру, фоторецепторов и нейронов).

Модели на животных для тестирования сенолитических средств

Исследуемые соединения можно оценивать на доклинических животных моделях, чтобы удостовериться в задействовании соответствующих типов клеток и последующих эффектах типа уменьшения SASP или эффективности по функциональным показателям на моделях механизмов/заболеваний.

Свидетельства связывания с мишенью можно исследовать in vivo на моделях индуцированного старения. Для того, чтобы понять, имеют ли исследуемые соединения доступ к связанным с заболеванием типам клеток в глазах, можно использовать несколько методов индукции старения. Повреждающие ДНК агенты, как-то доксорубицин, блеомицин и облучение, могут вызывать клеточное старение и их можно вводить непосредственно (к примеру, интравитреально, интракамерально, субретинально и т.д.) в глаза мышей (или же воздействовать локально или на все тело в случае облучения), чтобы вызвать старение в трабекулярной сети или сетчатке. Затем можно вводить исследуемые соединения для определения доступа соединений к соответствующим слоям клеток (что измеряется по потере маркеров старения). Кроме того, можно измерить многие факторы SASP в этих тканях, чтобы понять последующее влияние индукции старения и влияние сенолиза на такие медиаторы.

В качестве иллюстрации: введение блеомицина, повреждающего ДНК агента, в переднюю камеру глаз мышей приводит к клеточному старению в трабекулярной сети (TM), что определяется по индукции транскрипта p16 в TM (пример 8). Через 14 дней после внутрикамерного (IC) введения блеомицина наблюдалось повышение относительной экспрессии мРНК p16 в правом глазу по сравнению с контрольным левым глазом. Внутрикамерное введение сенолитика (UBX1967) на 7-й день после блеомицина приводило к снижению мРНК p16 на 14-й день, свидетельствуя о клиренсе стареющих клеток под действием UBX1967 в ТМ мышей.

Модель индуцированной кислородом ретинопатии (OIR) (Scott and Fruttiger, Eye (2010) 24, 416-421; Oubaha et al., 2016) имитирует элементы ишемической ретинопатии у людей типа диабетической ретинопатии (DR), ретинопатии недоношенных (ROP) и диабетического отека желтого пятна (DME). Воздействие на молодых мышей гипероксической среды приводит к облитерации сосудистой сети сетчатки с последующим патологическим ангиогенезом (неоваскуляризацией) после перехода на обычный воздух.

Приведенные ниже примеры показывают эффективность модельного соединения UBX1967 на модели индуцированной кислородом ретинопатии (OIR) у мышей. Интравитреальное (IVT) введение UBX1967 показало статистически значимое улучшение степени неоваскуляризации и вазооблитерации при всех уровнях дозы (пример 6A). Кроме того, измеряли относительное содержание нескольких транскриптов, связанных со старением (p16, pai1) и заболеванием у человека (VEGF), и обнаружили, что обработка UBX1967 приводила к снижению этих транскриптов. Также после введения UBX1967 снижалась активность связанной со старением β-галактозидазы (SA-βGal).

Стрептозотоциновая (STZ) модель на грызунах (Feit-Leichman et al., IOVS 46: 4281-87, 2005) воспроизводит признаки диабетической ретинопатии и диабетического отека желтого пятна при индукции гипергликемии посредством прямого цитотоксического действия STZ на β-клетки поджелудочной железы. Гипергликемия возникает в пределах нескольких дней после введения STZ, а фенотипические аспекты диабетической ретинопатии возникают в пределах нескольких недель, при этом у грызунов отмечается сосудистая утечка и снижение остроты зрения и контрастной чувствительности. Данная модель широко применялась для оценки терапевтических средств при диабетических заболеваниях глаз. Приведенные ниже данные показывают, что UBX1967 исправляет сосудистую утечку в сетчатке и сосудистой оболочке.

При тестировании также можно использовать модели повреждения ганглиозных клеток сетчатки, которые имеют отношение к глаукоме, при которой повышение внутриглазного давления (ВГД) вызывает потерю ганглиозных клеток сетчатки и повреждение зрительного нерва. В доклинических исследованиях повышение давления в передней камере может приводить к потере нейронов сетчатки, что отмечалось на нескольких известных моделях, включая окклюзию магнитными микрошариками (Ito et al., Vis Exp. 2016 (109): 53731), и на других моделях глаукомы (Almasieh and Levin, Annu Rev Vis Sci. 2017). Кроме того, было показано, что ишемия-реперфузия вызывает повреждение сетчатки, которое может приводить к старению клеток. Наличие старения сетчатки в таких моделях может использоваться для мониторинга влияния сенолиза после интравитреального введения исследуемых соединений.

Способы введения

Как правило, сенолитики по настоящему изобретению вводятся непосредственно во внешнюю или внутреннюю часть глаза субъекта или в окружающую ткань. Местное введение включает топическое введение, введение шприцем и/или введение через имплантируемое устройство. Оно охватывает лечение передних заболеваний глаз (передней части глаза) и задних заболеваний глаз (задней части глаза).

Передние заболевания глаз – такие заболевания, которые поражают или затрагивают переднюю часть или участок глаз типа периокулярных мышц, век либо глазных тканей или жидкостей, расположенных перед задней стенкой капсулы хрусталика или ресничными мышцами. Передние заболевания глаз поражают или затрагивают в первую очередь конъюнктиву, роговицу, переднюю камеру, радужную оболочку, заднюю камеру (позади радужной оболочки, но перед задней стенкой капсулы хрусталика), хрусталик или капсулу хрусталика и кровеносные сосуды и нервы, которые снабжают сосудами или иннервируют переднюю часть глаза. Примеры включают синдром сухости глаз, заболевания конъюнктивы, конъюнктивит, заболевания роговицы, пресбиопию, катаракту и рефракционные нарушения. Глаукома также может рассматриваться как переднее заболевание глаз, так как клинической целью лечения глаукомы может быть снижение гипертензии водной жидкости в передней камере глаз (т.е. снижение внутриглазного давления).

Задние заболевания глаз – такие заболевания, которые, прежде всего, поражают или затрагивают заднюю часть или участок глаз типа склеры, цилиарного тела, сосудистой оболочки (позади от плоскости, проходящей через заднюю стенку капсулы хрусталика), стекловидного тела, задней камеры, сетчатки, пигментного эпителия сетчатки, мембраны Бруха, зрительного нерва (т. е. диска зрительного нерва), а также кровеносные сосуды и нервы, которые снабжают сосудами или иннервируют заднюю часть или участок глаза. Примеры включают острую нейроретинопатию желтого пятна; хориоидальную неоваскуляризацию; гистоплазмоз; инфекции типа вирусных инфекций; неэкссудативную возрастную дегенерацию желтого пятна и экссудативную возрастную дегенерацию желтого пятна; отеки типа отека желтого пятна, цистоидного отека желтого пятна и диабетического отека желтого пятна; мультифокальный хориоидит; травмы глаз, которые затрагивают заднюю часть или участок глаза; заболевания сетчатки типа окклюзии центральной вены сетчатки, диабетической ретинопатии, пролиферативной витреоретинопатии (PVR), окклюзии артерий сетчатки, отслоения сетчатки, воспалительных хориоретинальных заболеваний; симпатическую офтальмию; пигментный ретинит и глаукому. Глаукома может рассматриваться как заднее заболевание глаз, так как целью лечения является предотвращение потери или снижение степени потери зрения из-за повреждения или потери ганглиозных клеток сетчатки или клеток зрительного нерва (т.е. нейропротекция).

В некоторых случаях эффективное количество сенолитика вводится в переднюю камеру глаза путем топического введения. Сенолитик можно закапывать в переднюю часть глаза с помощью глазных капель, мази или геля (напр., в конъюнктиву и/или роговицу) по мере необходимости для лечения, ослабления и/или профилактики конкретного заболевания глаз. Сенолитическое средство может представлять собой офтальмологический препарат в виде глазных капель, содержащих достаточное количество активного средства для обеспечения терапевтически эффективной концентрации в месте действия внутри глаза.

Местное введение в переднюю часть глаз (напр., в конъюнктиву и/или роговицу) также может осуществляться с помощью контактной линзы, несущей сенолитическое средство. Это может улучшить биодоступность и продлить время пребывания активного средства.

Для повышения степени нагруженности препаратом и контроля высвобождения препарата контактная линза или гидрогель может включать: (i) полимерные гидрогели с контролируемым соотношением гидрофильного/гидрофобного сополимера; (ii) гидрогели для включения препарата в коллоидную структуру, диспергированную в контактных линзах; (iii) лиганд-содержащие гидрогели; (iv) молекулярно отпечатанные полимерные гидрогели; (v) гидрогели с поверхностью, содержащей многослойную структуру для нагрузки и высвобождения препарата. Гидрогели являются предпочтительным материалом мягких контактных линз из-за их биосовместимости и прозрачности. Контактная линза из гидрогеля может использоваться для высвобождения активного агента на переднюю часть глаза контролируемым образом при контакте с тонкой пленкой слез, покрывающей глаз. Контактные линзы можно носить ежедневно в соответствии с графиком дозирования, чтобы обеспечить местное введение эффективного количества сенолитика для лечения глазных болезней (напр., описанных здесь). Устройства с контактными линзами включают устройства, описанные в патенте США № 6,827,996 и в патентных публикациях США №№ 2010/0330146 и 2006/0251696.

Местное введение на переднюю часть глаза также может осуществляться путем субконъюнктивальной инъекции. Субконъюнктивальная инъекция может применяться для введения сенолитика в субконъюнктивальное пространство или в субтеноново пространство. Поскольку субконъюнктивальное пространство находится спереди от субтенонова пространства, то субконъюнктивальное введение может оказывать более выраженное действие на доставку препарата в передний сегмент, тогда как субтеноново введение может оказывать большее влияние на задний сегмент.

Местное введение в передние и задние сегменты глаз также может осуществляться путем внутриглазной инъекции, напр. интракамерально или интравитреально. Внутрикамерная инъекция представляет собой инъекцию, которая обычно вводится в камеру в передней части глаза (напр., перед хрусталиком). Интравитреальная инъекция представляет собой инъекцию, которая вводится в стекловидную камеру в задней части глаза (напр., за хрусталиком). Вследствие риска повреждения слоев сетчатки и зрительного нерва при повышении внутриглазного давления следует вводить объем не более 0,1 мл при внутрикамерном или интравитреальном введении. В некоторых случаях внутрикамерная инъекция может обеспечить введение без повышения внутриглазного давления, которое связано с интравитреальным введением. Внезапное повышение внутриглазного давления может вызывать у пациента дискомфорт и приводить к риску повреждения зрительного нерва. Введение путем инъекции обычно проводится таким образом, чтобы свести к минимуму воздействие патогенов на глаза.

Местное введение также может осуществляться через имплантируемое глазное устройство, помещенное в глаз, к примеру, через разрез роговицы. Глазные устройства включают стенты (напр., трабекулярные стенты), органогелевые имплантаты и композиции и устройства, описанные в патентах США №№ 5,501,856, 5,869,079, 5,824,072, 4,997,652, 5,164,188, 5,443,505 и 5,766,242.

В патенте США № 5,501,856 раскрыты фармацевтические препараты с контролируемым высвобождением для внутриглазных имплантатов при введении внутрь глаз после хирургической операции при заболеваниях сетчатки/стекловидного тела или при глаукоме. В патенте США № 5869079 раскрыты комбинации гидрофильных и гидрофобных элементов в биоразлагаемых имплантатах с замедленным высвобождением и описан имплантат из сополимера полимолочной кислоты с полигликолевой кислотой (PLGA), содержащий дексаметазон. В патенте США № 5824072 раскрыты имплантаты для введения в супрахориоидальное пространство или бессосудистую область глаз и описан имплантат из метилцеллюлозы, содержащий дексаметазон. В патенте США № 4997652 и 5164188 раскрыты биоразлагаемые глазные имплантаты, содержащие микроинкапсулированные препараты, и описана имплантация микрокапсул, содержащих гидрокортизон сукцинат, в задний сегмент глаза. В патенте США № 5164188 раскрыты инкапсулированные средства для введения в супрахориоиды глаз и описана установка микрокапсул и бляшек, содержащих гидрокортизон, в pars plana. В патентах США №№ 5443505 и 5766242 раскрыты имплантаты, содержащие активные средства для введения в супрахориоидальное пространство или в бессосудистую область глаз, и описана установка микрокапсул и бляшек, содержащих гидрокортизон, в pars plana.

Для получения имплантата или депо для доставки лекарств с замедленным высвобождением субъекту можно ввести инъецируемый состав, содержащий активное средство субъекта, что приводит к образованию органогелевого имплантата in situ. При контакте с биологической жидкостью сшивающие агенты начинают перекрестную сшивку органогеля с образованием более стабильного матрикса, который модулирует выделение активного средства в глаз субъекта. В некоторых случаях этот способ введения может обеспечить длительный период высвобождения активного агента. В некоторых случаях образуется биоразлагаемый сшитый матрикс in vivo, который включает систему неводных апротонных биосовместимых растворителей, которая не смешивается с водой (Zhou T. et al., Journal of Controlled Release 55: 281-295, 1998).

Лекарственные формы

Офтальмологические препараты могут быть получены путем смешивания сенолитического средства с фармацевтически приемлемым основанием или носителем и, при необходимости, одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями. Ингредиенты, приемлемые в офтальмологических формах, представляют собой такие эксципиенты или носители, которые почти или совсем не вызывают раздражения глаз, обеспечивают подходящую консервацию, если это нужно, и доставляют одно или несколько средств в подходящем объеме. Примеры основ или носителей включают воду; водные растворители типа полярных растворителей; полиспирты; растительные масла; и маслянистые основы. Примеры основ или носителей для внутриглазного введения включают воду для инъекций и физиологический раствор.

Для офтальмологической доставки сенолитические средства можно комбинировать с приемлемыми эксципиентами для применения в глазах или вокруг них, такими как поверхностно-активные вещества, консерванты, сорастворители, ароматизаторы или освежающие вещества, антисептики, бактерицидные или антибактериальные средства, вещества для доведения рН, вещества для изотоничности, хелатирующие вещества, буферные вещества, стабилизаторы, антиоксиданты, усилители вязкости, усилители проникновения, хлорид натрия и загустители. В некоторых случаях композиция для внутриглазного введения может содержать одно или несколько из числа солюбилизирующих веществ, суспендирующих веществ, веществ для изотоничности, буферных веществ, смягчающих веществ, стабилизаторов и антисептиков. Носители и наполнители для офтальмологических композиций могут объединяться с образованием водной стерильной офтальмологической суспензии, раствора либо вязких или полувязких гелей или других типов твердых или полутвердых композиций типа мазей.

Типичные эксципиенты и добавки, которые можно использовать, включают следующие. Поверхностно-активные вещества: например, неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как блок-сополимеры полиоксиэтилена (в дальнейшем иногда именуется “POE”) и полиоксипропилена (в дальнейшем иногда именуется “POP”) (напр., полоксамер 407, полоксамер 235, полоксамер 188), аддукты блок-сополимера POE-POP с этилендиамином (напр., полоксамин), сложные эфиры POE-сорбитана и жирных кислот (напр., полисорбат 20, полисорбат 60, полисорбат 80 (TO-10 и др.)), гидрогенизированные POE-касторовые масла (напр., гидрогенизированное касторовое масло с POE (60) (HCO-60 и др.)), POE-касторовые масла, алкиловые эфиры POE (напр., лауриловый эфир полиоксиэтилена (9), цетиловый эфир полиоксиэтилена (20) и полиоксипропилена (4)) и полиоксилстеараты; амфотерные ПАВ типа амфотерных ПАВ глицинового типа (напр., алкил-диаминоэтилглицин, алкил-полиаминоэтилглицин), амфотерные ПАВ бетаинового типа (напр., лаурилдиметиламиноуксусный бетаин, имидазолиний-бетаин); катионные ПАВ типа солей четвертичного алкиламмония (напр., бензалкония хлорид, бензетония хлорид); и др.

Ароматизаторы или освежающие вещества: например, камфора, борнеол, терпены (они могут быть в d-форме, l-форме или dl-форме); эфирные масла, такие как мятная вода, эвкалиптовое масло, бергамотовое масло, анетол, эвгенол, гераниол, ментол, лимонен, мятное масло, масло мяты перечной, розовое масло и др.

Антисептики, бактерицидные или антибактериальные средства: например, полидрония хлорид, алкилдиаминоэтилглицин гидрохлорид, бензоат натрия, этанол, бензалкония хлорид, бензетония хлорид, хлоргексидин глюконат, хлорбутанол, сорбиновая кислота, сорбат калия, дегидроацетат натрия, метил-параоксибензоат, этил-параоксибензоат, пропил-параоксибензоат, бутил-параоксибензоат, оксихинолин сульфат, фенетиловый спирт, бензиловый спирт, бигуанидные соединения (в частности, полигексаметилен-бигуанид или его гидрохлорид и др.), Glokill (Rhodia Ltd.) и др.

Вещества для доведения рН: например, соляная кислота, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция, гидроксид магния, триэтаноламин, моноэтаноламин, диизопропаноламин, серная кислота, фосфорная кислота.

Вещества для изотоничности: например, бисульфит натрия, сульфит натрия, хлорид калия, хлорид кальция, хлорид натрия, хлорид магния, ацетат калия, ацетат натрия, бикарбонат натрия, карбонат натрия, тиосульфат натрия, сульфат магния, динатрийгидрофосфат, натрий-дигидрофосфат, калий-дигидрофосфат, глицерин, пропиленгликоль.

Хелатирующие вещества: например, аскорбиновая кислота, тетранатрий-ЭДТА, натрий-ЭДТА, лимонная кислота. Буферные вещества: например, фосфатные буферные вещества; цитратные буферные вещества, такие как лимонная кислота и цитрат натрия; ацетатные буферные вещества, такие как уксусная кислота, ацетат калия и ацетат натрия; карбонатные буферные вещества, такие как бикарбонат натрия и карбонат натрия; боратные буферные вещества, такие как борная кислота и бура; такие буферные вещества, как таурин, аспарагиновая кислота и их соли (напр., калиевые соли и т.д.) и ε-аминокапроновая кислота.

Офтальмологические формы в виде растворов могут быть получены путем растворения агента в физиологически приемлемом изотоническом водном буфере. Кроме того, офтальмологические растворы могут включать и офтальмологически приемлемые ПАВ для содействия растворению агента. Для лучшего удерживания соединений можно добавлять вещества, повышающие вязкость, такие как гидроксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, метилцеллюлоза, поливинилпирролидон.

Стерильные офтальмологические формы в виде геля могут быть получены путем суспендирования агента в гидрофильной основе, приготовленной, к примеру, из комбинации с Carbopol^®-940. Для внутриглазных инъекций можно использовать Viscoat^® (Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, Tex.). Другие композиции по настоящему изобретению могут содержать материалы, улучшающие проникновение, типа Cremophor^® (Sigma Aldrich, St. Louis, Mo.) и Tween^® 80 (полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат, Sigma Aldrich), в случае, если средства по настоящему изобретению мало проникают в глаза.

Настоящим изобретением предусмотрены коммерческие продукты – наборы, содержащие единичные дозы одного или нескольких средств или композиций, описанных в данном описании. Такие наборы обычно содержат фармацевтический препарат в одном или нескольких контейнерах. Препараты могут быть представлены в виде одной или нескольких единичных доз (комбинированных или раздельных). Набор может содержать устройство типа шприца для введения средства или композиции в глаз или вокруг глаз нуждающегося в этом субъекта. Продукт также может содержать или сопровождаться информационным вкладышем с описанием применения и сопутствующих преимуществ препаратов при лечении связанных со стареющими клетками глазных болезней, а также, необязательно, прибора или устройства для введения композиции.

Заболевания глаз, подходящие для лечения

В нижеследующих разделах приведено обсуждение конкретных заболеваний глаз, сгруппированных по широким этиологическим категориям (см. выше), которые являются кандидатами для лечения сенолитическими средствами по настоящему изобретению. Степень, в которой конкретное глазное заболевание поддается лечению сенолитическим средством, будет зависеть от степени и размера того, какую роль играют стареющие клетки в патологии или симптоматике заболевания. Протоколы лечения и ведения пациентов находятся на усмотрении лечащего врача. Эффективность терапии можно определить эмпирически.

ТИП 1. Ишемические или сосудистые заболевания

Эти заболевания характеризуются ограничением кровоснабжения тканей, что вызывает дефицит кислорода и/или основных питательных веществ, необходимых для клеточного метаболизма, чтобы поддерживать функционирование тканей. Ишемия обычно вызывается заболеваниями, связанными с кровеносными сосудами, с последующим повреждением или дисфункцией тканей. Она также включает локальные дефициты, которые возникают в данной части тела в результате проблем, затрагивающих кровоток, но не сами сосуды (типа вазоконстрикции, тромбоза или эмболии).

Примеры ишемических или сосудистых заболеваний глаз включают диабетическую ретинопатию, глаукоматозную ретинопатию, ишемическую артериально-оптическую невропатию и сосудистые заболевания, характеризующиеся артериальной и венозной окклюзией, ретинопатию недоношенных и/или серповидноклеточную ретинопатию.

Общий подход и цели сенолитической терапии при ишемических или сосудистых заболеваниях основываются на следующем.

Ишемия вызывает хорошо известную серию патофизиологических взаимодействий в глазах. Сенолитическая терапия воздействует на эту патофизиологию путем улучшения множества известных индукторов старения, которые заполняют ишемический путь. Первичное воздействие ишемического события запускает каскад, который подвергает клетки пораженной ткани индукторам старения, которые включают повреждение митохондрий и ДНК, окислительный стресс, воспаление и перекисное окисление липидов.

Накопление стареющих клеток и высвобождение связанных с ними факторов SASP оказывает негативное влияние на микроокружение ткани, как для клеток с прямым, так и косвенным воздействием. Целью сенолитической терапии при ишемических заболеваниях глаз является уменьшение популяции стареющих клеток, присутствующих в пораженной области, и уменьшение влияния связанных с ними факторов SASP на окружающие клетки. Это ограничивает продолжающееся повреждение в ткани после ишемического события и потенциально восстанавливает функцию за счет улучшения свойств клеточного микроокружения.

В качестве примера: устранение стареющих клеток в условиях ишемии влияет на зрительную функцию, способствуя процветанию функционирующих ганглиозных клеток сетчатки в более здоровом окружении, свободном от связанных с SASP вредных воспалительных, ангиогенных и модифицирующих внеклеточный матрикс факторов. Ишемические события в зрительной системе обычно влияют на задние структуры глаз. При некоторых заболеваниях на ишемию могут влиять особенности переднего сегмента. Таким образом, сенолитические средства можно вводить в передний отсек или же в передний и задний отсек.

Базовая патофизиология

Ишемия сетчатки способствует множественным глазным заболеваниям и возникает вторично по отношению к множественным основным этиологиям. Ишемия вовлечена в глаукому, диабетическую ретинопатию, окклюзию сосудов сетчатки и сосудистой оболочки, ретинопатию недоношенных и ишемические и травматические зрительные невропатии. Отек сетчатки и желтого пятна, связанный с этими состояниями, также является вторичным по отношению к последствиям ишемического каскада.

На фиг. 1A представлены патофизиологические взаимодействия в глазу, возникающие в результате ишемии. Все известные ишемические парадигмы сетчатки приводят к потере ганглиозных клеток, которые имеют решающее значение для поддержания функционального зрения (Osborne N et al., 2004). Кроме того, неоваскуляризация, опосредованная множественными факторами роста, такими как фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), TNFα, TGFβ, FGF, PKC, ангиопоэтины, PDGF, среди прочего (Ucuzian et al., 2010), является еще одним эффектом конечной стадии ишемии и связана с угрожающими зрению осложнениями при неоваскуляризации как сетчатки, так и сосудистой оболочки (Campochiaro, 2015).

Ишемия вследствие прерывания кровоснабжения сетчатки любой этиологии запускает каскад, который в конечном итоге может привести к гибели клеток, и, как известно, включает избирательную гибель нейронов, отек клеток и неоваскуляризацию. Это подробно описано на фиг. 1A, где показаны основные стадии каскада, которые включают выход из строя натрий-калиевого АТФазного насоса, деполяризацию мембраны и накопление ионов натрия и кальция в цитоплазме с последующим образованием деструктивных свободных радикалов. Этот процесс в конечном итоге приводит к гибели клеток от некроза или апоптоза (Osborne N. et al., 2004). Таким образом, ишемический путь заполнен известными индукторами старения и подтверждает гипотезу о том, что сенолитические средства могут влиять на эффекты многих вызванных ишемией реакций старения.

Глаукома является еще одним примером заболевания глаз, которое иллюстрирует такое прогрессирование к гибели ганглиозных клеток сетчатки под влиянием целого ряда факторов, включая ишемию (Choi and Kook, 2015), повышенное ВГД, генетическую восприимчивость и окислительный стресс (Wang et al., 2014), каждый из которых может вызывать старение и вносить свой вклад в изменения в окружении, создаваемом стареющими клетками и связанными с ними факторами SASP.

На фиг. 1B показана многофакторная патофизиология глаукомы, приводящая к гибели ганглиозных клеток сетчатки (RGC) (Wang et al., 2014).

Глаукома

Глаукома имеет значительные связи с возрастом как по распространенности, так и по патофизиологическим характеристикам. Распространенность глаукомы заметно возрастает в возрасте старше 60 лет у европеоидов и старше 40 лет у афроамериканцев и латиноамериканцев. Возраст является наиболее надежным и наименее изменчивым фактором риска развития глаукомы, включая ВГД. Возраст также связан с уменьшением оттока из глаза и увеличением ВГД, усилением склеры с последующим воздействием на биомеханические свойства зрительного нерва и уменьшением популяции ганглиозных клеток сетчатки (Caprioli, 2013).

Глаукома является формой невропатии зрительного нерва (заболевания зрительного нерва), которая связана с повышением внутриглазного давления в результате неспособности сбросить давление в передней камере глаз, вызванного ненормальным скоплением прозрачной жидкости, известной как “водянистая влага”. Существует два основных типа глаукомы: открытоугольная глаукома и закрытоугольная глаукома. Глаукому можно классифицировать на основании патогенеза как первичную глаукому: первичную открытоугольную глаукому или первичную закрытоугольную глаукому; и вторичную глаукому, вызванную другими нарушениями, включая стероидную глаукому, псевдоэксфолиацию или пигментную дисперсионную глаукому. При открытоугольной глаукоме (также называемой широкоугольной глаукомой) дренажная структура трабекулярной сети или канал глаза не отводит жидкость, выделяемую цилиарным телом, как это должно быть, что приводит к повышению внутриглазного давления. При закрытоугольной (или узкоугольной) глаукоме глаз неправильно дренируется из-за слишком узкого угла между радужкой и роговицей, что может вызвать внезапное повышение внутриглазного давления. Проявление закрытоугольной глаукомы может быть острым или хроническим. Закрытоугольная глаукома может быть связана с дальнозоркостью и катарактой.

Водянистая влага, которая образуется в цилиарном теле в задней камере глаза со скоростью около 2,5 мкл в минуту, проникает в переднюю камеру через щель между передней частью хрусталика и задней частью радужной оболочки через отверстие зрачка в радужной оболочке. Когда глаз функционирует нормально, водянистая влага вытекает из передней камеры с той же или практически той же скоростью, с которой она поступает, в результате чего давление в глазу остается в пределах нормального диапазона от 12 до 22 мм рт. ст. Жидкости сравнительно несжимаемы, поэтому внутриглазное давление относительно равномерно распределяется по всему глазу. Повышение внутриглазного давления происходит, когда возникает дисбаланс между образованием водной жидкости цилиарного тела и оттоком этой жидкости.

Отток водянистой влаги из передней камеры происходит двумя путями. Небольшое количество (около 10%) выходит через “увеосклеральный дренаж” между мышечными волокнами в цилиарном теле. Этот отток не зависит от внутриглазного давления. Однако главный путь оттока идет через трабекулярную сеть (TM) в канал Шлемма и зависит от давления. Когда этот путь становится затрудненным, внутриглазное давление может повышаться, потому что приток водянистой влаги не уравновешивается, пока давление в глазу не поднимется в достаточной степени, чтобы преодолеть сопротивление для оттока. Обнаружения авторами стареющих клеток в ТМ у пациентов с глаукомой подтверждает дисфункцию ТМ в патофизиологии этого заболевания. Со временем это может привести к потере зрения, как периферического, так и центрального, и в конечном итоге привести к полной слепоте через потерю ганглиозных клеток сетчатки и функции зрительного нерва.

Субъекты с открытоугольной глаукомой и хронической закрытоугольной глаукомой могут не иметь явно выраженных симптомов на ранних стадиях заболевания. Потеря поля зрения может произойти на более поздних стадиях глаукомы. У субъекта, нуждающегося в лечении глаукомы, могут проявляться один или несколько симптомов, включая, без ограничения, повышенное внутриглазное давление, аномалии зрительного нерва с соответствующей потерей поля зрения, снижение остроты зрения, отек роговицы и закрытый угол дренажа. В определенных случаях субъект с колебаниями уровня внутриглазного давления может испытывать ухудшение зрения и видеть ореолы вокруг источников света. В некоторых случаях симптомы острой закрытоугольной глаукомы включают быстрое начало боли в глазах, головную боль, тошноту, рвоту и визуальное размывание. Глаза пациентов с острой закрытоугольной глаукомой могут выглядеть красными, а зрачок глаза может быть большим и не реагировать на свет. В некоторых случаях роговица может выглядеть мутной для невооруженного глаза.

Субъекты, подлежащие лечению по настоящему изобретению, могут быть выбраны на основании клинической картины или офтальмологического обследования, которое предполагает наличие глаукомы, с использованием методов диагностики, описанных ранее. К ним относятся щелевая лампа и гониоскопия, тонометрия, визуализация и исследование зрительного нерва, фотография глазного дна и методы ОКТ.

Сенолитические средства по изобретению могут обеспечивать снижение внутриглазного давления в глазах у субъекта, нуждающегося в лечении, например снижение от повышенного внутриглазного до нормального внутриглазного давления посредством устранения стареющих клеток и связанного с ними SASP в ТМ и передней камере. Повреждение зрительного нерва может быть облегчено и подавлено путем значительного снижения внутриглазного давления, а в некоторых случаях можно обеспечить восстановление или улучшение зрительной способности сетчатки.

В некоторых случаях сенолитик вводят путем интракамеральной инъекции в переднюю камеру глаза или интравитреальной инъекции в задний сегмент, стекловидное тело или стекловидную камеру глаза. Сенолитические средства по изобретению могут быть эффективными для улучшения оттока водянистой влаги, тем самым снижая внутриглазное давление. При интравитреальном введении может использоваться естественный поток жидкости в глазу: стекловидное тело доставляет активный агент в трабекулярную сеть и увеосклеральный путь, когда он течет в переднюю камеру. Это может обеспечить доставку активного агента к месту действия в переднем сегменте глаза. Интравитреальная доставка также может непосредственно воздействовать на ганглиозные клетки сетчатки, пораженные глаукомой.

Необязательно сенолитические средства можно вводить в сочетании с хирургическим методом снятия внутриглазного давления, например каналопластикой, лазерной трабекулопластикой, трабекулэктомией и вставкой шунтов или других имплантируемых устройств. Как правило, хирургическое вмешательство обеспечивает временное облегчение при повышенном внутриглазном давлении. Имплантируемые дренажные устройства включают устройства, описанные в патенте США № 9,468,558, которые могут вводиться в глаз через разрез и располагаться, к примеру, на склере позади лимба для облегчения дренажа.

Диабетическая ретинопатия

Распространенность диабета и диабетической ретинопатии возрастает с возрастом и является наиболее частой причиной слепоты у людей старше 50 лет. Это многофакторное заболевание с гипергликемией, оказывающей токсическое воздействие на клетки, и воспалительными цитокинами, вовлеченными во многие аспекты диабетической болезни глаз (Lutty, 2013).

Диабетическая болезнь глаз развивается у пациентов с диабетом из-за изменений в клетках, выстилающих кровеносные сосуды, и охватывает как сосудистую, так и нервную дисфункцию. У больных диабетом часто развиваются офтальмологические осложнения типа аномалий роговицы, глаукомы, неоваскуляризации радужки, катаракты и невропатии. Диабетическая ретинопатия является распространенным и потенциально серьезным осложнением диабета.

Продолжительность и тяжесть гипергликемии является фактором, связанным с развитием диабетической ретинопатии. Когда уровни глюкозы высоки, как при диабете, глюкоза может вызывать повреждения различными способами. Например, глюкоза или метаболит глюкозы связывается с аминогруппами белков, что приводит к повреждению тканей. Кроме того, избыток глюкозы попадает в полиольный путь, что приводит к накоплению сорбита. Сорбит не может метаболизироваться клетками сетчатки и может способствовать высокому внутриклеточному осмотическому давлению, внутриклеточному отеку, нарушению диффузии, гипоксии тканей, повреждению капиллярных клеток и ослаблению капилляров. Диабетическая ретинопатия включает утолщение базальных мембран капилляров и предотвращает контакт перицитов с эндотелиальными клетками капилляров. Потеря перицитов увеличивает капиллярную утечку и может привести к разрушению гематоэнцефалического барьера. Ослабленные капилляры могут привести к образованию аневризмы и дальнейшей утечке. Эти эффекты гипергликемии также могут нарушать функции нейронов в сетчатке. Это ранняя стадия диабетической ретинопатии, называемая непролиферативной диабетической ретинопатией.

Диабетическая ретинопатия – это также и дегенеративное заболевание нервной сетчатки, связанное с изменениями в функции нейронов еще до начала клинического сосудистого заболевания. Капилляры сетчатки могут закупориваться при диабете, вызывая зоны ишемии в сетчатке. Неперфузируемая ткань реагирует, вызывая рост новых кровеносных сосудов из существующих сосудов (т.е. ангиогенез). Эти новые кровеносные сосуды также могут вызвать потерю зрения – заболевание, которое называется пролиферативной диабетической ретинопатией, поскольку новые кровеносные сосуды хрупкие и имеют тенденцию пропускать кровь в глаза. При прогрессирующей пролиферативной диабетической ретинопатии возникает опосредованный VEGF ангиогенный ответ с неоваскуляризацией сетчатки, что подвергает глаза дополнительному риску серьезной потери зрения из-за развития кровоизлияния в стекловидном теле или вытяжения сетчатки. Без лечения возможно необратимое повреждение сосудов или нейронов, что подчеркивает необходимость раннего вмешательства.

Симптомы диабетической ретинопатии включают потерю центрального зрения, неспособность видеть цвета, расплывчатое зрение, плавающие предметы, искажения, дыры или черные пятна в зрении. На начальных стадиях диабетической ретинопатии в некоторых случаях субъект может быть бессимптомным. Однако микроаневризмы в глазу могут быть ранним клиническим признаком диабетической ретинопатии. В некоторых случаях микроаневризма возникает вторично по сравнению с выпадением капиллярной стенки вследствие потери перицитов и может появляться в виде маленьких красных точек в поверхностном слое сетчатки.

Методы диагностики включают полное офтальмологическое обследование, как описано ранее, с флюоресцеиновой ангиографией, оптической когерентной томографией (ОКТ) и УЗИ-сканированием B-типа, которые обычно используют вспомогательные тесты для определения стадии и мониторинга ответа на терапию. Тяжесть непролиферативной диабетической ретинопатии можно оценить по наличию, количеству и локализации микроаневризм и кровоизлияний. Микроаневризмы могут проявляться как точечные, гиперфлуоресцентные поражения на ранних стадиях ангиограммы и обычно дают течь на более поздних фазах флюоресцеинового ангиографического теста. Пролиферативная диабетическая ретинопатия может быть оценена частично по наличию неоваскуляризации, преретинальных кровоизлияний, кровоизлияний в стекловидное тело, пролиферации фиброваскулярных тканей и тяговых отслоений сетчатки. Для определения толщины сетчатки и наличия отека внутри сетчатки, а также связанной с ней витреомакулярной тракции можно использовать ОКТ.

Другие признаки и симптомы диабетической ретинопатии включают в себя: 1) точечные кровотечения, которые могут казаться похожими на микроаневризмы, если они небольшие, и могут возникать в результате разрыва микроаневризмы в более глубоких слоях сетчатки (внутренние ядерные и наружные плексиформные слои); 2) кровоизлияния в форме язычков пламени, которые представляют собой осколочные кровоизлияния, возникающие в более поверхностном слое нервных волокон; 3) отек сетчатки и твердые экссудаты, вызванные разрушением гематоэнцефалического барьера, что способствует вытеканию сывороточных белков, липидов и белка из сосудов; 4) ватные пятна, которые являются инфарктами слоя нервных волокон от окклюзии прекапиллярных артериол; они часто ограничены микроаневризмами и гиперпроницаемостью сосудов; 5) венозные петли и венозные отростки, которые могут возникать рядом с зонами неперфузии; они отражают усиление ишемии сетчатки и их появление может быть предиктором прогрессирования пролиферативной диабетической ретинопатии (ПДР); 6) внутриретинальные микрососудистые нарушения, которые включают реконструированные капиллярные ложи без пролиферативных изменений; обычно они встречаются на границах не перфузируемой сетчатки; и 7) отек желтого пятна, вызывающий ухудшение зрения.

Другие сосудистые заболевания глаз

Другие сосудистые заболеваниями глаз: артериальная и/или венозная окклюзия сетчатки и/или зрительного нерва и ретинопатия (например, ретинопатия недоношенных и/или серповидноклеточная ретинопатия).

Окклюзия вен сетчатки (RVO) – это закупорка мелких вен, которые уносят кровь от сетчатки. Блокировка более мелких вен (напр., разветвленных вен) в сетчатке может происходить в местах, где артерии сетчатки, которые были утолщены или укреплены атеросклерозом, пересекают и оказывают давление на вену сетчатки. При закупорке в капиллярах повышается давление, что приводит к кровоизлиянию, утечке жидкости и крови. Это может привести к макулярному отеку с утечкой возле желтого пятна. Макулярная ишемия возникает, когда эти капилляры, которые поставляют кислород в сетчатку, проявляют утечку и неперфузию. Затем происходит неоваскуляризация, новый аномальный рост кровеносных сосудов, который может привести к неоваскулярной глаукоме, кровоизлиянию в стекловидное тело и, в поздних или тяжелых случаях, отслоению сетчатки. Визуальные нарушения и слепота, возникающие при RVO, могут возникать в результате отека желтого пятна, кровоизлияния в сетчатку, ишемии желтого пятна и/или неоваскулярной глаукомы.

Родственным событием является окклюзия центральной или ветвистой артерии сетчатки (RAO), которая может возникать, когда бляшка (напр., сгусток крови или жировые отложения) закупоривает кровеносный сосуд или артерию в глазу. Это может привести к внезапной и постоянной потере зрения, обычно только на один глаз. В некоторых случаях центральной RAO при фундоскопическом исследовании пораженного глаза может выявляться бледная сетчатка с вишнево-красной макулой (то есть вишнево-красным пятном), которая возникает в результате обструкции кровотока в сетчатке из артерии сетчатки, вызывая бледность, и продолжающаяся подача крови к сосудистой оболочке из цилиарной артерии, что приводит к ярко-красной окраске в самой тонкой части сетчатки (т.е. в макуле). Как правило, это развивается только после эмболии и может разрешиться в течение нескольких дней после острого события. В некоторых случаях к этому времени потеря зрения уже носит постоянный характер и развивается первичная атрофия зрительного нерва. В некоторых случаях, когда ресничная артерия снабжает макулу, вишнево-красное пятно не наблюдается. Ветви RAO могут возникать, когда бляшки ложатся в более дистальную ветвь артерии сетчатки и могут вовлекать временные сосуды сетчатки. В некоторых случаях субъект, подверженный риску закупорки артерии сетчатки, идентифицируется и лечится с помощью сенолитического средства еще до появления серьезной закупорки.

Ретинопатия недоношенных (ROP) (также называемая ретролентальной фиброплазией (RLF)) представляет собой сосудистое заболевание глаз, вызванное фиброваскулярной пролиферацией, напр. дезорганизованным ростом кровеносных сосудов сетчатки, которое может привести к образованию рубцов и отслоению сетчатки. Кислородная токсичность и относительная гипоксия могут способствовать развитию ROP. Были определены различные стадии заболевания ROP (Committee for the Classification of Retinopathy of Prematurity, Arch. Ophthalmol. 102(8): 1130-1134, 1984).

Серповидноклеточная ретинопатия (SCR) может развиться у субъектов, страдающих серповидноклеточной анемией, в некоторых случаях в течение второго десятилетия жизни. Глазные проявления серповидноклеточной анемии (SCD) возникают в результате закупорки сосудов, которая может возникнуть в конъюнктиве, радужной оболочке, сетчатке и сосудистой оболочке. SCR вызывается закупоркой сосудов микроциркуляторного русла глаз, в отличие от диабетической ретинопатии, которая может быть связана с чрезмерным воздействием сосудистых тканей на гипергликемию. SCR может привести к ухудшению зрения в зависимости от его локализации и пораженной ткани. SCR можно классифицировать как непролиферативную или пролиферативную в зависимости от наличия или отсутствия неоваскуляризации в глазах.

При непролиферативной форме SCR клинические данные могут включать кровоизлияния в “лососевые” пятна, радужные пятна и черные “солнечные лучи”, которые могут наблюдаться в периферической сетчатке. В центральной части сетчатки также может наблюдаться венозная извилистость, расширение фовеальной аваскулярной зоны, обструкция центральной артерии сетчатки и закупорка перипапиллярной и перимакулярной артериол.

Пролиферативные осложнения SCR могут привести к ухудшению или потере зрения в 10-20% пораженных глаз. В некоторых случаях субъект может быть диагностирован по истории спонтанной регрессии после начального развития пролиферативной SCR. Неоваскуляризация периферической сетчатки может развиться после вазоокклюзии периферической сетчатки, которая может расти вперед от перфузированной до неперфузированной сетчатки. Изначально эти новые сосуды были плоскими и напоминали морские лопасти. Неоваскуляризация способна вызвать кровоизлияние в стекловидное тело из-за постоянного проникновения компонентов крови в стекловидное тело через хрупкую неоваскулярную ткань. Повторение этого геморрагического явления ведет к ухудшению витреоретинальной тракции, что может привести к возникновению регматогенного или тракционного отслоения сетчатки.

Сенолитическая терапия может применяться к ряду фенотипов ишемических заболеваний глаз, которые включают потерю RGC при глаукоме, диабетическую и сосудистую окклюзионную ретинопатию (напр., артериальная и венозная окклюзия, ретинопатия недоношенных, серповидноклеточная ретинопатия, воспалительная и инфекционная ретинопатия, радиационная ретинопатия и т.д.) и неоваскулярную AMD (известно, что она опосредована VEGF и другими известными факторами SASP типа IL-6). Эти фенотипы имеют четко определенные клинические признаки, которые можно диагностировать и отслеживать с помощью различных процедур клинического тестирования, включая исследование и тесты на структуру сетчатки (напр., флуоресцеиновую ангиографию для областей неперфузии, оптическую когерентную томографию для структуры клеточного слоя сетчатки, наличие жидкости, толщина) и функцию (проверка поля зрения, электрофизиология, которая может конкретно измерять функцию ганглиозных клеток сетчатки).

В подтверждение этого изобретения на снимках фиг. 12А и 12В видно наличие стареющих клеток в ткани трабекулярной сети пациентов с глаукомой. Существует связь стареющих клеток с потерей ганглиозных клеток сетчатки при глаукоме (Skowronska-Krawcyzyk, 2015; Li et al., 2017).

ТИП 2. Дегенеративные заболевания

Эти заболевания характеризуются прогрессирующим ухудшением качества, функции или структуры глаз, что приводит к прогрессирующему снижению остроты зрения.

Примеры дегенеративных заболеваний глаз включают халазодермию, птоз, сухой кератит, дистрофию роговицы Фукса, пресбиопию, катаракту, влажную возрастную дегенерацию желтого пятна (влажную AMD), сухую возрастную дегенерацию желтого пятна (сухую AMD); дегенеративные заболевания стекловидного тела, включая синдром витреомакулярной тракции (VMT), макулярный разрыв, эпиретинальную мембрану (ERM), разрывы сетчатки, отслоение сетчатки и пролиферативную витреоретинопатию (PVR).

Общий подход и цели сенолитической терапии дегенеративных заболеваний основываются на следующем.

Дегенеративные заболевания глаз влияют на все анатомические расположения зрительной системы и связаны с патофизиологическим каскадом, который включает признаки старения и факторы, связанные с SASP, которые вызваны множеством клеточных стрессоров. К ним относятся такие факторы окружающей среды, как воздействие ультрафиолета и курение, окислительный стресс и воспалительные факторы, повреждение митохондрий и ДНК и деградация внеклеточного матрикса. Эти стрессоры также связаны с секрецией и накоплением SASP-подобных факторов, которые продолжают разрушать локальное микроокружение ткани и вызывают продолжающиеся дегенеративные изменения.

Целью сенолитической терапии является нарушение этого цикла путем устранения стареющих клеток и связанных с ними SASP. Это могло бы ограничить продолжающееся повреждение в ткани и потенциально восстановить функцию за счет улучшения свойств клеточного микроокружения. Например, сенолитическая терапия может уменьшить диапазон факторов роста, которые, как известно, вовлечены в различные стадии AMD. Сенолитические средства, которые блокируют выработку факторов SASP, могут оказывать многогранное влияние на патофизиологическое течение AMD и могут модулировать и потенциально полностью изменить течение болезни.

Дегенеративные заболевания зрительной системы влияют на передние и задние структуры, поэтому подход к сенолитической доставке при этих заболеваниях будет включать как передние, так и задние механизмы доставки, в зависимости от места первичной патологии.

Халазодермия

Халазодермия – возрастное изменение верхних и нижних век, характеризующееся рыхлой, избыточной кожей и орбикулярной мышцей часто с выпуклыми орбитальными жировыми карманами. Это может быть связано с опущением бровей и расслаблением лба. При сильном поражении верхних век это может ограничивать периферическое зрение и заслонять центральную зрительную ось. Локализация, тяжесть и частота визуально значимого птоза увеличивается с возрастом.

Системные заболевания, такие как связанная с щитовидной железой орбитопатия, почечная недостаточность, травма, вялость кожи, синдром Элерса-Данлоса, амилоидоз, наследственный ангионевротический отек и ксантелазма, могут предрасполагать субъекта к халазодермии. В некоторых случаях халазодермия связана с наследственным заболеванием. Халазодермия вызывается потерей эластичности соединительной ткани, поддерживающей структуру передней части века. Патофизиология халазодермии согласуется с нормальными возрастными изменениями кожи. Это включает в себя потерю эластичных волокон, истончение эпидермиса, избыточность кожи и лимфатическую дилатацию. У субъектов с халазодермией также может быть блефарит, заболевание, вызванное закупоркой желез в глазах, вырабатывающих смазывающую жидкость (мейбомиевые железы).

Халазодермия может быть настолько тяжелой, что она вдавливает ресницы в глаза, вызывая энтропион (заворот). Деформации век, такие как заворот верхнего века и эктропион или ретракция нижнего века, могут наблюдаться при избыточной коже верхнего или нижнего века. Избыточная кожа верхнего века нависает над ресницами, вызывая опущение ресниц и энтропион с последующим кератитом. У пациентов с тяжелой халазодермией нижнего века развивается слабость нижнего века с результирующей ретракцией век или эктропионом.

Халазодермия может привести к потере поля зрения. В тяжелых случаях халазодермии пациент может потерять 50% и более своего верхнего поля зрения. Пациенты с чисто эстетической деформацией могут не испытывать никаких дефектов поля зрения. В некоторых случаях у пациентов с умеренной и тяжелой халазодермией наблюдается блефарит. Блефарит характеризуется отеком кожи век и эритемой; перхотью; воспалением и закупоркой мейбомиевых желез; а иногда ячменем.

Местное введение (напр., посредством инъекции или местного введения в кожу и/или веко) сенолитического средства может доставлять субъекту эффективную дозу для лечения халазодермии. Сенолитические средства по изобретению могут остановить прогрессирование халазодермии у субъекта. В некоторых случаях это изобретение может остановить или обратить вспять по крайней мере часть повреждений, возникших еще до лечения.

Птоз

Птоз означает аномальное положение краев век, наиболее частой причиной которого является старение. Приобретенный птоз – это заболевание, при котором у пациентов появляются нормальные веки при рождении и развивается опущение век в зрелом возрасте. Заболевание может поражать один глаз или оба глаза и чаще встречается у пожилых людей, так как мышцы век могут начать ухудшаться. В некоторых случаях человек может родиться с врожденным птозом и испытывать раннее возникновение заболевания, включая опущение любого из обоих век.

Птоз возникает из-за дисфункции мышц, поднимающих веко, либо их иннервации. В зависимости от причины птоз можно классифицировать на несколько типов: нейрогенный птоз, который включает паралич глазодвигательного нерва, синдром Хорнера, синдром подмигивания Маркуса-Ганна, неправильное направление третьего черепного нерва; миогенный птоз, который включает мышечно-гнойную дистрофию, миастению, миотоническую дистрофию, миопатию глаз, простой врожденный птоз, синдром блефарофимоза; апоневротический птоз, который может быть инволюционным или послеоперационным; механический птоз, возникающий из-за отеков или опухолей верхнего века; нейротоксический птоз; и псевдоптоз.

Основным симптомом птоза является видимое опущение или провисание верхнего века на одном или обоих глазах. Птоз обычно придает лицу усталый или серьезный вид. Птоз также может привести к сухости глаз или слезотечению, поскольку веки перестают эффективно функционировать, чтобы сохранять глаза влажными. Тяжелый птоз может привести к потере поля зрения. В некоторых случаях субъект испытывает усталость и боль вокруг глаз, так как брови постоянно поднимаются, чтобы правильно видеть.

Местное введение может осуществляться путем инъекции или местного введения на кожу и/или веки. В некоторых случаях сенолитическое средство может обратить вспять или остановить по крайней мере часть повреждений, вызванных заболеванием.

Сухой кератоидный конъюнктивит

Сухой кератоидный конъюнктивит (keratitis sicca) представляет собой заболевание, характеризующееся сухостью конъюнктивы и/или роговицы. Сухой кератоидный конъюнктивит также именуется как сухой кератоконъюнктивит, сухость глаз, синдром сухости глаз, болезнь сухих глаз (DED) или синдром дисфункциональных слез. Конкретные подтипы, которые входят в рамки keratitis sicca, включают DED с водным дефицитом, испарительную DED, синдром Шёгрена, недостаточность слезных желез и болезнь мейбомиевых желез.

В некоторых случаях сухой кератоконъюнктивит возникает из-за неадекватного слезоотделения и может упоминаться как сухость глаз с дефицитом воды в слезах или DED с водным дефицитом. Сухость глаз с дефицитом воды в слезах может встречаться у женщин в постменопаузе или у пациентов, страдающих аутоиммунным расстройством или таким заболеванием, как ревматоидный артрит, системная красная волчанка (lupus) или синдром Шёгрена. В некоторых случаях keratitis sicca возникает из-за аномалии состава слез, которая приводит к быстрому испарению слез и поэтому может называться испарительной сухостью глаз. Сухость глаз также может быть результатом частичного открытия глаз в течение какого-то времени ночью (напр., у субъектов, страдающих ночным лагофтальмом) или из-за недостаточной скорости моргания (напр., как это может происходить у пациентов с болезнью Паркинсона). Повреждение поверхности глаз, которое может возникать при заболевании keratitis sicca, может включать повышенный дискомфорт и чувствительность к яркому свету.

Симптомы кератита могут включать раздражение глаз, покалывание, жжение, боль или болезненность, зуд, ощущение натяжения, давление за глазом; ощущение сухости, царапин, ощущение шероховатости или песка в глазу; ощущение инородного тела, чувствительность к яркому свету, помутнение зрения, усиление моргания, усталость глаз, фотофобию, покраснение, выделение слизи, непереносимость контактных линз и чрезмерное рефлекторное слезоотделение. Ощущение инородного тела означает такое ощущение или чувство, будто что-то попало в глаз. В определенных случаях субъект может испытывать помутнение зрения или раздражение глаз, которое является серьезным, частым и/или длительным по продолжительности. У некоторых пациентов с сильным ощущением сухости глаз поверхность роговицы может утолщаться и/или могут возникать язвы и рубцы. В некоторых случаях кровеносные сосуды могут расти по всей роговице и ухудшать зрение.

Не все субъекты, страдающие keratitis sicca, проявляют все симптомы. Субъект может жаловаться на неприятные ощущения или жжение в глазах. Светобоязнь или помутнение зрения могут присутствовать даже в тяжелых случаях. История болезни пациента также может свидетельствовать о сухости глаз, например, у пациента с ранее существовавшим диагнозом: розовые угри, лучевая терапия, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, склеродермия или другие аутоиммунные нарушения. Можно провести биомикроскопическое исследование с помощью щелевой лампы для выявления мейбомита, расширения конъюнктивы, уменьшения слезного мениска, увеличения количества слезных остатков, слизистых нитей или профиля окрашивания, согласующегося с keratitis sicca. Можно также установить время отрыва слез менее 10 секунд и провести тест Ширмера для выявления субъектов, которым будет полезно лечение.

Сенолитики можно вводить путем топического введения в место, пораженное keratitis sicca, напр. в конъюнктиву и/или роговицу: к примеру, через глазные капли, мазь, гель или посредством контролируемого продолжительного высвобождения из контактной линзы, установленной на внешней поверхности глаза. Также может рассматриваться доставка через систему точечных пробок или прямые инъекции в мейбомиевые или слезные железы для доставки сенолитического средства. Улучшение состояния может включать уменьшение окрашивания флуоресцеином в роговице, улучшение теста Ширмера или улучшение признаков и/или симптомов синдрома сухости глаз. Улучшения можно измерить с помощью индекса поверхности заболевания глаз или индекса глазного комфорта.

Дистрофия роговицы по Фуксу (FCD)

Дистрофия роговицы по Фуксу является основной причиной трансплантации роговицы и поражает 5% населения США в возрасте старше 40 лет. Она характеризуется прогрессирующей потерей эндотелиальных клеток и отложением в роговице аномального клеточного матрикса. Роговица постепенно набухает и мутнеет, так как оставшихся эндотелиальных клеток недостаточно для обезвоживания роговицы и поддержания ее чистоты. Была продемонстрирована повышенная экспрессия белков известных генов, связанных со старением: CDKN1A и CDKN2A (Matthaei et al., 2014). Симптомы FCD включают помутнение зрения и нечеткость и могут быть связаны с болью и волдырями роговицы. Диагноз ставится с помощью стандартных офтальмологических тестов, как указано выше, а толщина роговицы измеряется посредством пахиметрии роговицы. Доступные в настоящее время методы лечения включают топические капли и хирургическое вмешательство с частичной или полной сквозной кератопластикой. Введение сенолитического средства может осуществляться путем локальной доставки в роговицу или в переднюю камеру, прилегающую к роговице в глазу, к примеру, посредством внутрикамерной инъекции или через глазное имплантируемое устройство. Это может остановить прогрессирование или обратить вспять хотя бы часть повреждений, возникших до лечения.

Пресбиопия

Пресбиопия – заболевание, непосредственно связанное со старением, причем оно практически универсально по достижении среднего возраста. Пресбиопия связана со старением глаз и приводит к постепенному ухудшению способности четко фокусироваться на близких объектах. Это происходит из-за затвердевания и потери гибкости хрусталика глаза, заставляя глаз фокусировать свет позади сетчатки, а не на сетчатке при взгляде на близкие объекты. Затвердение хрусталика может быть результатом снижения уровня α-кристаллина в хрусталике. Ослабление мышечных волокон цилиарного тела также может способствовать неспособности цилиарной мышцы деформировать хрусталик и вызывать пресбиопию. Введение сенолитика может укрепить цилиарную мышцу за счет устранения стареющих клеток и последующего уменьшения мышечного фиброза, который происходит с возрастом.

Симптомы включают в себя ошибки рефракции, затруднения при чтении мелким шрифтом (напр., в условиях низкой освещенности), необходимость держать материал для чтения подальше, размывание близких объектов, напряженность глаз, головную боль и усталость при выполнении задач, требующих ближнего зрения. Диагностика может проводиться путем осмотра глаз офтальмологом, включая тесты для оценки зрения и способности фокусироваться на и различать объекты.

Введение может осуществляться путем локальной доставки в хрусталик или в камеру, прилегающую к хрусталику в глазу, к примеру, посредством внутрикамерной инъекции, интравитреальной инъекции или с помощью имплантируемого в глаз устройства. Это может остановить прогрессирование или обратить вспять по крайней мере часть возникших повреждений.

Катаракта

Катаракта остается крупнейшей причиной полной слепоты, на которую приходится 18 из 39 миллионов слепых людей во всем мире. Известно, что заболеваемость повышается с возрастом и в мире нет региона, который был бы невосприимчив к возрастному началу или воздействию непрозрачности хрусталика, угрожающей зрению.

Катаракта – это помутнение хрусталика глаз, которое вызывает прогрессирующую безболезненную потерю зрения. Катаракты можно классифицировать по их местоположению. Субкапсулярная катаракта возникает в задней части хрусталика. Люди с диабетом или принимающие высокие дозы стероидных препаратов могут иметь больший риск развития субкапсулярной катаракты. Ядерная катаракта образуется глубоко в ядре (напр., в центральной зоне) хрусталика и может быть связана со старением. Кортикальная катаракта характеризуется белыми клиновидными помутнениями, которые начинаются на периферии хрусталика и продвигаются к центру в виде спиц. Корковая катаракта может возникать в коре хрусталика, которая окружает центральное ядро.

Обычный хрусталик внутри глаза работает во многом как линза камеры, получая и фокусируя свет на сетчатку для четкого зрения. Объектив также регулирует фокусировку глаза, позволяя нам видеть вещи как близко, так и далеко. Хрусталик состоит в основном из воды и белка, которые собраны в высокоупорядоченную интерактивную макроструктуру, необходимую для прозрачности хрусталика и показателя преломления. Нарушение внутри- или межбелковых взаимодействий может изменить эту структуру, обнажая гидрофобные поверхности и вызывая агрегацию белка, связанную с образованием катаракты. Со временем катаракта может увеличиться и затуманить большую часть хрусталика, блокируя прохождение части света через хрусталик и рассеивая его, не давая четко сфокусироваться на сетчатке.

С формированием катаракты связан ряд факторов риска, включая, без ограничения, воздействие ультрафиолетового излучения, диабет, гипертонию, ожирение, курение, длительное применение кортикостероидных препаратов, статинов, применяемых для снижения уровня холестерина, предыдущее повреждение глаз или воспаление, предыдущая хирургия глаз, гормонозаместительная терапия, значительное употребление алкоголя, сильная близорукость, семейный анамнез. В некоторых случаях катаракта связана с окислительными нарушениями. Старческая катаракта – это возрастное заболевание с нарушением зрения, которое характеризуется постепенным прогрессирующим утолщением хрусталика глаз. Как изложено в настоящей заявке, все эти факторы риска могут быть связаны с индукцией старения и факторами SASP, способствующими развитию заболеваний зрительной системы.

Симптомы, которые могут быть связаны с катарактой, включают снижение остроты зрения, блики (напр., видится ореол и вспышки звезд вокруг огней), миопический сдвиг и монокулярную диплопию. В некоторых случаях симптомы проявляются одним или несколькими из следующих факторов: затруднения при чтении из-за ухудшения способности различать контраст между светлыми и темными печатными буквами на странице, когда требуется больше света, чтобы хорошо видеть, проблемы с отличением темно-синего цвета от черного, затуманенность зрения, цвета кажутся более желтыми и менее яркими, и небольшое двоение в глазах (также называемое фантомным изображением). В некоторых случаях катаракта может набухать и увеличивать давление в глазах, вызывая глаукому.

Катаракта выявляется при осмотре глаз, как изложено ранее. Методы диагностики, специфичные для выявления катаракты, включают: 1) исследование придатков глаз и внутриглазных структур, которые могут дать представление об этиологии катаракты у пациента, сопутствующем заболевании и возможном зрительном прогнозе; 2) тест с качающимся фонариком для выявления зрачка Маркуса-Ганна или относительного афферентного дефекта зрачка (RAPD), свидетельствующего о поражении зрительного нерва или диффузном повреждении желтого пятна, что может быть альтернативной причиной снижения зрения; 3) исследование размера ядра и брунесценции (после дилатации, размер ядра и брунесценция как показатели плотности катаракты можно определять до операции факоэмульсификации); 4) прямая и непрямая офтальмоскопия – для оценки целостности заднего сегмента; или 5) генетическое тестирование на заболевание, которое предрасполагает субъекта к развитию катаракты.

Сенолитические средства могут быть эффективными в предотвращении развития катаракты, регрессии катаракты у пациента, снижении тяжести катаракты или повышении прозрачности хрусталика. Введение может включать местную доставку в хрусталик или в глазную камеру, прилегающую к хрусталику, посредством внутриглазной или внутрикамерной инъекции или через имплантируемое в глаз устройство. Это может устранить потребность в стандартной операции по удалению катаракты в глазах. Как правило, способ выполняется без хирургического удаления хрусталика или его части.

Возрастная дегенерация желтого пятна (AMD)

Дегенерация желтого пятна относится к семейству заболеваний, которые характеризуются прогрессирующей потерей центрального зрения, связанной с аномалиями мембраны Бруха, сосудистой оболочки, нервной сетчатки и/или пигментного эпителия сетчатки. AMD подразделяется на два типа: сухая дегенерация желтого пятна и влажная дегенерация желтого пятна. Сухая AMD определяется постепенной потерей пигментных эпителиальных (RPE) и фоторецепторных клеток сетчатки в желтом пятне. Влажная AMD характеризуется ростом аномальных кровеносных сосудов под макулярным эпителием. Возрастные изменения в развитии морфологии сетчатки и энергетическом обмене, а также кумулятивные эффекты воздействия окружающей среды могут сделать невральную и сосудистую сетчатку и пигментный эпителий сетчатки более восприимчивыми к повреждениям в поздней взрослой жизни. Патогенез возрастной дегенерации желтого пятна может быть связан с различными процессами, связанными со старением, включая окислительный стресс, дисфункцию митохондрий и воспалительные процессы.

Сухая AMD (также называемая неэкссудативной AMD) – широкое обозначение, охватывающее все формы AMD, которые не являются неоваскулярными, включая ранние и промежуточные формы AMD и развитую форму сухой AMD, известную как географическая атрофия или атрофическая AMD. При географической атрофии прогрессирующая и необратимая потеря клеток сетчатки приводит к потере зрительной функции. AMD-подобная патология характеризуется прогрессирующим накоплением характерных желтых отложений, называемых друзами (напр., накоплением внеклеточных белков и липидов), в желтом пятне между пигментным эпителием сетчатки и нижележащей сосудистой оболочкой, которые, как полагают, и повреждают сетчатку со временем.

Пациенты с сухой AMD могут иметь минимальные симптомы на ранних стадиях заболевания. Примерно у 10-20% пациентов сухая AMD прогрессирует до влажного типа AMD. Пациенты, которые болеют сухой AMD, имеют постепенную потерю центрального зрения из-за гибели фоторецепторных клеток и их близких партнеров, клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) с отложением друз. Фоторецепторы, то есть клетки сетчатки, которые фактически и “видят” свет, необходимы для зрения. Клетки RPE необходимы для выживания, функции и обновления фоторецепторов. Клетки RPE в глазах действуют как макрофаги, которые фагоцитируют и рециркулируют компоненты мембранных наружных сегментов фоторецепторов. Если митохондрии в клетках RPE повреждаются, то рециркуляция фоторецепторов блокируется, что приводит к накоплению друз. Накопление друз вызывает физическое смещение RPE от его непосредственного сосудистого снабжения, хориокапилляров. Это смещение создает физический барьер, который может помешать нормальной диффузии метаболитов и клеточных отходов между хориокапиллярами и сетчаткой.

Симптомы сухой AMD включают друзы, зрительные искажения, напр., прямые линии кажутся согнутыми, снижение центрального зрения в одном или в обоих глазах, потребность в более ярком свете при чтении, потерю контрастной чувствительности, повышенную размытость печатных слов, снижение интенсивности или яркости цвета, трудность в распознавании лиц.

“Влажная” форма прогрессирующей AMD (влажная AMD), также называемая неоваскулярной или экссудативной AMD, приводит к потере зрения из-за аномального роста кровеносных сосудов (напр., хориоидальной неоваскуляризации) в хориокапилляре через мембрану Бруха. Влажной AMD предшествует сухая форма AMD, и обе формы обычно сосуществуют у одного и того же человека – таким образом, на оба процесса можно повлиять путем одновременного лечения сенолитическим средством. Поскольку фоторецепторы и клетки RPE в мембране Бруха медленно дегенерируют и разрушаются, то наблюдается тенденция к росту кровеносных сосудов из их нормального расположения в сосудистой оболочке в ненормальное положение под сетчаткой. Хориоидальная неоваскуляризация (CNV) стимулируется фактором роста сосудистого эндотелия (VEGF). Аномальные кровеносные сосуды могут быть хрупкими, что в конечном итоге приводит к утечке крови и белка под макулой. Кровотечение, протекание и образование рубцов из этих кровеносных сосудов в конечном счете приводит к необратимым повреждениям (напр., кровоизлиянию, опуханию и рубцовой ткани) и сильной потере центрального зрения фоторецепторов и быстрой потере зрения. Без лечения влажная AMD ответственна примерно за 90% всех случаев слепоты, вызванной AMD.

Симптомы влажной AMD включают в себя снижение центрального зрения в одном или обоих глазах, напр., темное пятно (или пятна) в центре их зрения, нормальное боковое или периферическое зрение, прямые линии кажутся согнутыми, снижение интенсивности или яркости цветов, общее помутнение всего зрения, четко выраженное размытое или кровоточащее пятно в поле зрения, аномальная неоваскуляризация, утечка крови в глаз, напр., позади макулы, внезапное начало или быстрое ухудшение симптомов.

Подходящих субъектов можно идентифицировать при визуальном осмотре глаз у субъекта или по критериям факторов риска. Тестирование может включать фотографию глазного дна, тест на темновую адаптацию, тест Пелли-Робсона, тесты на качество зрения (напр., диаграмма Снеллена, сетка Амслера, тест на 100 оттенков Фарнсворта и тест на максимальную чувствительность к контрасту цвета), периметрический тест на преимущественную гиперостроту, электроретинографию, оптическую когерентную томографию (OCT) и ангиографию (напр., флуоресцеиновую ангиографию) в любых комбинациях.

AMD подразделяется на три стадии: раннюю, среднюю и позднюю, частично
на основании степени (размера и количества) друз. Ранняя AMD диагностируется на основании наличия друз среднего размера и может протекать бессимптомно. Промежуточная AMD диагностируется по большим друзам и/или любым нарушениям пигмента сетчатки. В некоторых случаях промежуточная AMD может вызвать некоторую потерю зрения, однако она также обычно бессимптомна. В конце AMD происходит достаточно повреждений сетчатки, что приводит к симптоматической потере центрального зрения в дополнение к друзам. Риск развития симптомов выше, когда друзы большие и многочисленные и связаны с нарушением слоя пигментированных клеток под макулой. Считается, что большие и мягкие друзы связаны с повышенным уровнем холестерина.

Диагностика дегенерации желтого пятна опирается на признаки в самом желтом пятне, независимо от остроты зрения. В диагностике AMD могут применяться различные методы и тесты, как описано ранее.

Соответствующие особенности друз включают количество, площадь и объем выявленных друз; форму выявленных друз; плотность друз; и отражательную способность друз. Можно проанализировать данные по снимкам сетчатки, полученным с помощью оптической когерентной томографии в спектральной области (SD-OCT). Данные по снимкам содержат поперечное сечение сетчатки и изображение сетчатки анфас. Данные по изображениям обрабатываются для получения точной структуры, показывающей расположение, форму, размер и другие данные о друзах. Эта структурная информация может предоставить количественные признаки друз, которые указывают на риск развития AMD от сухой формы до влажной формы заболевания у данного субъекта и в определенный период времени (патент США № 9,737,205).

При диагностике и последующей оценке реакции на лечение также может применяться оптическая когерентная томография. При влажной AMD ангиография (напр., флуоресцеиновая ангиография) позволяет идентифицировать и локализовать аномальные сосудистые процессы и может применяться для визуализации утечки крови за макулой.

Сенолитическая терапия может применяться при дегенеративных заболеваниях сетчатки типа возрастной дегенерации желтого пятна (AMD) следующим образом. Отложения аномальных соединений типа липофусцина в пигментном эпителии сетчатки (RPE) приводят к постоянному накоплению обломков, которые затрудняют поддержку фоторецепторов в наружной сетчатке. При AMD это происходит вследствие возрастных изменений мембраны Бруха, хориокапилляров и пигментного эпителия сетчатки (RPE). Как и в случае ишемических заболеваний глаз, запускается сложный патофизиологический каскад, опять же с множеством путей сенолитической терапии для воздействия на стабилизацию заболевания и потенциальную регрессию на основании способности устранять стареющие клетки и связанные с ними SASP.

На фиг. 1C (адаптировано из Kumar and Fu, 2014) представлены факторы, которые влияют на многие точки вдоль патофизиологического каскада AMD. На фиг. 14А и 14В показано наличие стареющих клеток при AMD. На фиг. 8 показано влияние сенолитического средства на стареющие клетки RPE в соответствии с изобретением. Потенциал влияния сенолитической терапии на многие признаки как влажной, так и сухой AMD является новым и беспрецедентным.

Дегенеративные заболевания стекловидного тела

Стекловидное тело представляет собой прозрачное гелеобразное вещество, которое заполняет полость задней части глаза за хрусталиком. Оно состоит из сети коллагеновых волокон и помогает стабилизировать различные слои сетчатки и сосудистую сеть сетчатки. Со временем гель стекловидного тела разрушается вследствие деградации сети коллагеновых волокон, и это подвергает пациентов риску возникновения тяговых сил на нижележащей сетчатке. Эти силы связаны со многими витреоретинальными заболеваниями, которые усиливаются с возрастом, и синерезисом стекловидного тела, который встречается у 70% пациентов в возрасте до 70 лет. Эти витреоретинальные заболевания описаны ниже.

Витреомакулярный тракционный синдром

Витреомакулярной тракционный синдром (VMT) представляет собой нарушение витреоретинального интерфейса, характеризующееся: (i) неполным задним отслоением стекловидного тела (PVD), (ii) анормально сильным сцеплением задней грани гиалоида с желтым пятном; и/или (iii) передне-задним вытяжением под действием синеретического растяжения стекловидного тела в местах прикрепления на желтом пятне, что вызывает морфологические и зачастую функциональные эффекты. С возрастом стекловидный гель подвергается разжижению, образуя очаги жидкости в стекловидном теле, что приводит к сокращению или конденсации (синерезису) стекловидного тела. При потере объема стекловидного тела возникает тяговое напряжение в местах витреоретинального и витреопапиллярного прикрепления под действием уплотняющейся плотной коры стекловидного тела. В то же время может происходить ослабление этих прикреплений между стекловидным телом и внутренней ограничительной мембраной (ILM), приводящее к отслоению заднего гиалоида. Симптомы включают затуманенность или снижение зрения, метаморфопсию, микропсию, скотомы и трудности выполнением ежедневных задач, связанных со зрением типа чтения.

Макулярный разрыв

Макулярный разрыв (отверстие) – это разрыв сетчатки, который обычно затрагивает область fovea. Макулярные разрывы связаны со старением и обычно встречаются у людей старше 60 лет. Макулярные разрывы могут быть вызваны тангенциальным вытяжением, а также передне-задним растяжением заднего гиалоида на parafovea. Макулярные разрывы могут возникать как осложнения при отслоении задней части стекловидного тела на самых ранних стадиях. Факторы риска для макулярного разрыва включают возраст, близорукость, травмы и воспаление глаз.

Макулярные разрывы могут начинаться постепенно и развиваться в три стадии: отслоение fovea (стадия I), которое может прогрессировать в отсутствие лечения; разрывы на часть толщины (стадия II), которые могут прогрессировать в отсутствие лечения; и полные разрывы (стадия III). Размер разрыва и его расположение на сетчатке может определять, насколько это повлияет на зрение. При появлении макулярного разрыва III стадии может быть потеряно наиболее центральное и детальное зрение. При отсутствии лечения макулярные разрывы могут привести к угрожающему зрению отслоению сетчатки.

На ранней стадии макулярного разрыва субъект может заметить небольшое искажение или размытость своего центрального зрения. Прямые линии или объекты могут выглядеть изогнутыми или волнистыми. Чтение и выполнение других рутинных заданий с пораженным глазом становится затруднительным. Симптомы макулярных разрывов включают затуманенное зрение, искаженное центральное зрение.

Эпиретинальная мембрана

Эпиретинальная мембрана (ERM, также называемая целлофановой макулопатией или макулярной складкой) представляет собой бессосудистую фиброклеточную ткань, которая может развиваться на внутренней поверхности сетчатки. Существует множество цитокинов, связанных с развитием и пролиферацией ERM, усилением этого состояния с возрастом и синерезисом стекловидного тела.

Ткань является полупрозрачной и пролиферирует на поверхности внутренней ограничительной мембраны. При возникновении ERM остаточное корковое стекловидное тело вследствие отслоения задней части стекловидного тела или частичного отделения заднего гиалоида может способствовать пролиферации глиальных клеток на сетчатке. В некоторых случаях ERM является идиопатическим состоянием. В некоторых случаях медиаторы воспаления способствуют фиброцеллюлярному росту на фоне образования вторичной ERM. Вторичные ERM могут возникать в связи с сосудистыми заболеваниями сетчатки, воспалительными заболеваниями глаз, травмами, внутриглазной хирургией, внутриглазными опухолями и разрывом или отслоением сетчатки. Другие факторы риска включают возраст, отслоение заднего стекловидного тела и историю ERM в парном глазу. Симптомы включают безболезненную потерю зрения, метаморфопсию (визуальное искажение, напр., при котором формы могут выглядеть волнистыми или кривыми), двойное зрение, светочувствительность и то, что изображения кажутся большими или меньшими, чем обычно.

В некоторых случаях субъекты с ERM имеют немного симптомов и ERM у них диагностируется случайно при дилатационном исследовании сетчатки или при визуализации сетчатки глаз типа когерентной томографии глаз (OCT). Метод визуализации OCT может применяться для оценки тяжести ERM. Также можно использовать флуоресцеиновую ангиографию для определения того, вызваны ли ERM другие базовые проблемы сетчатки.

Разрыв и отслоение сетчатки

Разрывы сетчатки могут возникать в результате вытяжения стекловидного тела до участка существующей витреоретинальной адгезии, чаще всего связанной с возрастным синерезисом стекловидного тела. В некоторых случаях сетчатка зачастую выглядит совершенно нормальной перед острым случаем разрыва. Разрыв сетчатки может происходить с последующим отслоением сетчатки или без него. Стекловидное тело заполняет пространство в глазу между хрусталиком и сетчаткой. Обычно стекловидное тело перемещается от сетчатки, не вызывая проблем, но в некоторых случаях перемещение бывает настолько сильным, что разрывает сетчатку в одном или нескольких местах. Жидкость может проходить через разрыв в сетчатке, приподнимая или отрывая сетчатку от задней части глаза.

Отслоение сетчатки происходит, когда субретинальная жидкость накапливается между нейросенсорной сетчаткой и пигментным эпителием сетчатки. Этот процесс может происходить тремя способами. Один из механизмов заключается в возникновении разрыва в сетчатке, который позволяет стекловидному телу напрямую проникать в субретинальное пространство и известен как регматогенное отслоение сетчатки. Регматогенное отслоение сетчатки часто связано с разрывами сетчатки, связанными с отслоением заднего стекловидного тела или травмой. Второй механизм включает пролиферативные мембраны на поверхности сетчатки или стекловидного тела. Эти мембраны могут оттягивать нейросенсорную сетчатку, вызывая физическое разделение между нейросенсорной сетчаткой и пигментным эпителием сетчатки, называемое тракционным отслоением сетчатки.

Тракционное отслоение сетчатки может наблюдаться при пролиферативной ретинопатии, вызванной диабетом, серповидноклеточной анемией и другими патологическими процессами, приводящими к неоваскуляризации сетчатки. Тракционные отслоения сетчатки также могут быть вызваны пролиферативной витреоретинопатией после травмы или операции. Третий механизм отслоения сетчатки основан на накоплении жидкости под сетчаткой из-за медиаторов воспаления или экссудации жидкости из массы поражения. Этот механизм известен как экссудативное или серозное отслоение сетчатки и может быть вызван рядом воспалительных или экссудативных процессов таких заболеваний сетчатки, как саркоидоз или новообразования хориоидеи. Регматогенное отслоение сетчатки имеет характерный вид, отличающий её от тракционного или серозного отслоения. Регматогенное отслоение сетчатки имеет волнистый вид и изгибается волнообразно при движении глаз. Тракционное отслоение имеет гладкую вогнутую поверхность с минимальным смещением при движениях глаз. Серозные отслоения проявляют гладкую поверхность сетчатки и перемещение жидкости в зависимости от положения пациента.

Разрывы сетчатки и регматогенные и тракционные отслоения требуют исправления любыми или всеми из числа лазерной терапии, криотерапии, пневматической ретинопексии, вдавливания склеры и/или витрэктомии.

Пролиферативная витреоретинопатия

Пролиферативная витреоретинопатия (PVR) возникает, когда образуется рубец под или на сетчатке после отслоения сетчатки, препятствуя заживлению сетчатки и возвращению ее на место. PVR связана с неудачным исправлением отслоения сетчатки. Когда в сетчатке имеется отверстие, клетки, которые обычно находятся под сетчаткой, попадают в глазное яблоко и оседают на внутреннем слое глаза поверх сетчатки. Эти клетки размножаются и образуют рубец на поверхности (а в некоторых случаях под) сетчатки. Эта рубцовая ткань затем сжимается и отделяет сетчатку от самых внутренних стенок глаза, что приводит ко второму отслоению сетчатки.

Сенолитические средства по настоящему изобретению можно вводить путем интравитреальной инъекции в стекловидное тело глаза или путем местного введения.

ТИП 3. Генетические заболевания

Генетические заболевания глаз характеризуются как заболевания, которые вызваны мутацией, делецией или вставкой в последовательность ДНК человека.

Генетические заболевания можно разделить на три основные категории. 1. Заболевания, связанные с одним геном: заболевания, вызванные дефектами одного конкретного гена, часто с простым и предсказуемым типом наследования типа доминантного, рецессивного и сцепленного с Х-хромосомой. 2. Хромосомные заболевания: заболевания, возникающие в результате изменения количества или структуры хромосом. 3. Многофакторные заболевания (комплексные заболевания): заболевания, вызванные изменением множества генов, часто в сложном взаимодействии с факторами окружающей среды и образа жизни, типа питания или сигаретного дыма.

Примеры генетических заболеваний глаз включают пигментный ретинит, болезнь Старгардта, болезнь Беста и наследственную оптическую невропатию Лебера (LHON).

Общий подход и цели сенолитической терапии генетических состояний основаны на следующем.

Генетические заболевания зрительной системы могут затрагивать все анатомические слои глаз и связаны с клеточными дефектами, которые могут привести к фенотипу ускоренного старения, вызванному или опосредованному, по крайней мере частично, стареющими клетками. Наследственная восприимчивость к определенным заболеваниям глаз позволяет предположить, что на накопление болезнетворных стареющих клеток могут прямо или косвенно влиять генетические компоненты, что опять же может привести к более раннему проявлению. Генетические нарушения демонстрируют многофакторный каскад со стареющими клетками и продуцированием SASP, способствующим продолжающейся дисфункции и дегенерации/гибели клеток.

Эти заболевания могут извлечь пользу от сенолитической терапии, потому что стареющие клетки и связанные с ними факторы SASP опосредуют связанный с этим вклад в текущую дисфункцию клеток, потерю клеток и прогрессирование заболевания путем блокирования ангиогенных, воспалительных, фиброзных и модифицирующих внеклеточный матрикс белков, присутствующих в патофизиологии. Генетические нарушения зрительной системы затрагивают передние и задние структуры. Сенолитические средства вводятся либо в переднюю или заднюю область глаз, либо в их комбинацию, в зависимости от места первичной патологии.

Базовая патофизиология

Сложные моногенные заболевания сетчатки, такие как пигментный ретинит, болезнь Старгардта или нарушения митохондриальной ДНК, такие как наследственная оптическая нейропатия Лебера, представляют собой заболевания с известной генетической основой, которые могут ускорять накопление стареющих клеток. Диагностика, клинический мониторинг и ответ на терапию контролируются при таких заболеваниях, как ишемические или дегенеративные заболевания, путем сочетания функциональных и структурных тестов, включая остроту зрения, поле зрения, внутривенную флуоресцеиновую ангиографию (IVFA), ОКТ-сканирование и электрофизиологию, включая электроретинографию (ERG) и зрительный вызванный потенциал (VEP).

На фигуре 1D показаны события, приводящие к дегенерации и гибели клеток при наследственной оптической невропатии Лебера (Mann et al., 2002). На фиг. 2А показана потеря клеток сетчатки на клинических стадиях пигментного ретинита (Dryja, 1986). При этих заболеваниях может быть полезным применение сенолитического средства вследствие устранения стареющих клеток и устранения SASP.

При болезни Старгардта происходит накопление липофусцина вследствие мутации в гене ABCA4. Диагностика, клинический мониторинг и реакция на терапию отслеживаются при этих заболеваниях, как и при ишемических заболеваниях, путем сочетания функциональных и структурных тестов, включая остроту зрения, поле зрения, внутривенную флуоресцеиновую ангиографию (IVFA), ОКТ-сканирование и электрофизиологию, включая электроретинографию (ERG) и зрительные вызванные потенциалы (VEP).

Пигментный ретинит

Пигментный ретинит представляет собой группу наследственных заболеваний, возникающих в результате вредных изменений любого из более чем 200 генов и приводящих к дегенерации сетчатки, что приводит к разрушению и потере клеток в сетчатке. Пигментный ретинит характеризуется прогрессирующей потерей периферического зрения и трудностями ночного видения (никталопия), которые могут привести к потере центрального зрения. В целом, результатом унаследованного гена является повреждение фоторецепторных клеток в сетчатке. Симптомы пигментного ретинита включают никталопию, потерю зрения, напр., потерю периферического зрения, туннельное зрение и фотопсию (световые вспышки).

Существует изменчивость в физических симптомах в зависимости от конкретной формы пигментного ретинита, и не все субъекты проявляют все симптомы одновременно. Методы диагностики включают тестирование поля зрения, фундоскопическое обследование, электроретинографию (ЭРГ) (измерение электрической активности фоторецепторных клеток) и генетическое тестирование. Обследование глаз может включать оценку остроты зрения и реакции зрачков, а также оценку переднего сегмента, сетчатки глаз и фундоскопическую оценку. Субъекты с пигментным ретинитом могут иметь пониженную электрическую активность, отражающую снижение функции фоторецепторов. Для исключения возможности диагноза других заболеваний могут применяться дополнительные методы, которые применяются при диагностике родственных заболеваний.

В некоторых случаях можно использовать образцы ДНК от субъекта для генетической диагностики пигментного ретинита. Можно провести генетическое типирование конкретных форм заболевания. Генетическое тестирование доступно через Национальную сеть генотипирования и фенотипирования глазных заболеваний (eyeGENE).

Болезнь Старгардта

Болезнь Старгардта (также называемая макулярной дистрофией Старгардта, ювенильной макулярной дегенерацией и fundus flavimaculatus) является наследственным заболеванием сетчатки. Болезнь Старгардта является одним из нескольких генетических заболеваний, вызывающих дегенерацию желтого пятна. Болезнь Старгардта характеризуется чрезмерным накоплением липофусцина в сетчатке, которое вызывает прогрессирующее повреждение или дегенерацию желтого пятна, небольшой центральной области сетчатки, ответственной за остроту центрального зрения.

Для создания светочувствительных молекул внутри фоторецепторов используется витамин A. Мутации в гене, называемом ABCA4, являются наиболее частой причиной болезни Старгардта. Этот ген производит белок, который обычно удаляет потенциально вредные побочные продукты витамина A внутри фоторецепторов. Пораженные клетки накапливают скопления липофусцина, жирового вещества, которое образует желтоватые пятна. По мере увеличения скоплений липофусцина в области вокруг макулы и вокруг нее может ухудшиться центральное зрение. В конечном счете, эти жировые отложения приводят к гибели фоторецепторов, и зрение становится еще хуже.

Симптомы болезни Старгардта включают серые, черные или мутные пятна в центре зрения; отложения липофусцина; дальтонизм, чувствительность к яркому свету, длительное время регулировки при переходе от светлого к темному. Прогрессирование симптомов при болезни Старгардта может варьироваться для каждого субъекта. У субъектов с более ранним началом заболевания обычно наблюдается более быстрая потеря зрения. Вначале потеря зрения может медленно уменьшаться, а затем быстро ухудшаться, пока не выровняется. Субъекты с болезнью Старгардта могут иметь зрение 20/200 или хуже. Люди с болезнью Старгардта также могут начать терять часть своего периферического зрения по мере старения.

Методы диагностики, которые можно использовать для оценки симптомов потери зрения при болезни Старгардта, включают обследование и вспомогательные тесты, как описано выше, и включают тестирование поля зрения, цветовое тестирование, исследование глазного дна, электроретинографию (ERG), оптическую когерентную томографию (OCT) и генетическое тестирование. Количество, размер, цвет и внешний вид отложений липофусцина могут варьироваться от субъекта к субъекту. Отложения липофусцина могут наблюдаться в виде желтоватых пятен в макуле. Пятна, как правило, имеют неправильную форму и вытянуты наружу от макулы в форме кольца.

Накопление липофусцина может быть прямой причиной гибели RPE и фоторецепторов в сетчатке. Сенолитические средства по изобретению могут сохранить зрение у пациентов с болезнью Старгардта, страдающих чрезмерным накоплением липофусцина.

Болезнь Беста

Болезнь Беста (также называемая вителлиформной макулярной дистрофией) представляет собой форму ранней дегенерации желтого пятна, которая характеризуется появлением отложений липофусцина, напр. в слое пигментного эпителия сетчатки макулы. Отложения липофусцина могут проявляться в виде желтых или оранжевых желтковидных или яйцевидных очагов. Нарушения в глазах возникают в результате нарушения пигментного эпителия сетчатки (RPE). Дисфункция белка бестрофина приводит к аномальному транспорту жидкости и ионов через RPE. Липофусцин может накапливаться в клетках RPE и в субпространстве RPE, особенно в области fovea. RPE у субъекта может со временем дегенерировать и в некоторых случаях вызывать вторичную потерю фоторецепторных клеток. В некоторых случаях разрушение RPE/мембраны Брукса может привести к развитию хориоидальной неоваскуляризации.

Симптомы болезни Беста включают двусторонние крупные желтые пятна макулы яйцевидной формы, умеренную потерю зрения на ранних стадиях, умеренную потерю зрения на поздних стадиях, хориоидальную неоваскулярную мембрану (CNVM) и субретинальные кровоизлияния, которые происходят при легких травмах глаза.

Методы диагностики включают методы, описанные ранее, такие как электроокулография (EOG), электроретинография (ERG), оптическая когерентная томография (OCT), ангиография (напр., флуоресцеиновая ангиография) и аутофлуоресцентная визуализация глазного дна. Аутофлуоресценция глазного дна (FAF) может применяться для того, чтобы выявить гипераутофлуоресценцию на ранних вителлиформных стадиях заболевания. Такая гиперфлуоресценция может наблюдаться на стадии псевдогипопиона, становиться пятнистой с участками гипоаутофлуоресценции во время вителлеруптивной стадии, и в конечном итоге становиться гипофлуоресцентной на атрофической стадии заболевания. Изменения, наблюдаемые при FAF, могут предшествовать или казаться более сильными, чем при офтальмоскопии.

Применение сенолитических средств может остановить или обратить вспять эффект повреждения, связанного с липофусцином.

Наследственная оптическая невропатия Лебера (LHON)

Наследственная оптическая невропатия Лебера (LHON) – митохондриальное генетическое заболевание, характеризующееся двусторонней потерей центрального зрения вследствие очаговой дегенерации зрительного нерва. Начало потери зрения колеблется в возрасте от 8 до 60 лет, но происходит в основном в возрасте от 15 до 30 лет. Однако ухудшение зрения может произойти уже в пределах первых семи лет жизни. Болезнь преимущественно поражает мужчин.

Симптомы у субъектов, страдающих LHON, включают затуманенное или замутненное зрение, потерю остроты зрения, потерю центрального зрения, нарушение цветового зрения, центроцекальные скотомы, временную бледность диска зрительного нерва, циркумпапиллярную телеангиэктатическую микроангиопатию, слабые реакции зрачка на свет, отек слоя нервных волокон сетчатки вокруг диска (псевдоэдема) и атрофию зрительного нерва. Субъекты с LHON могут оставаться бессимптомными до тех пор, пока не испытают затуманенное или помутнение зрения в одном глазу, в некоторых случаях поражается и второй глаз с задержкой около шести-восьми недель. Пациенты с LHON могут испытывать быструю и безболезненную потерю центрального зрения, сопровождающуюся угасанием цветов, особенно в зеленом/красном поле. Острота зрения может достигать уровня 20/400, напр., через несколько месяцев. Атрофия зрительного нерва является характеристикой заболевания и может возникнуть примерно через 6 месяцев.

Методы диагностики включают фундоскопическое исследование, флуоресцеиновую ангиографию и оптическую когерентную томографию (OCT). При осмотре глазного дна характерными признаками заболевания являются извилистость центральных сосудов сетчатки, циркумпапиллярная телеангиэктатическая микроангиопатия и набухание слоя нервных волокон сетчатки вокруг диска. Для исключения истинного отека зрительного нерва может проводиться флуоресцеиновая ангиография. В некоторых случаях не наблюдается утечки красителя вдоль границ опухшего зрительного нерва. OCT зрительного нерва может проявлять подъем в начальных фазах заболевания или атрофию на более поздних стадиях заболевания.

ТИП 4: Инфекционные заболевания глаз

Эти заболевания вызываются патогенными микроорганизмами, такими как бактерии, вирусы, паразиты или грибки; заболевания могут передаваться прямо или косвенно от одного человека другому.

Инфекционные глазные болезни могут быть вызваны бактериальными агентами, грибковыми агентами или вирусами. Этиологические агенты включают вирус ветряной оспы - опоясывающего герпеса (HZV), вирус простого герпеса, цитомегаловирус и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).

Общий подход и цели сенолитической терапии при инфекционных заболеваниях могут основываться на следующем.

Инфекционные заболевания зрительной системы влияют на все анатомические локации глаз и тесно связаны с возрастом и старением. Инфекционные агенты могут способствовать индукции старения и многофакторного каскада со стареющими клетками и продукцией SASP, способствующей продолжающейся дисфункции клеток. Оказавшись в стареющих клетках, они, в свою очередь, могут повлиять на способность бороться с инфекцией.

У стареющих клеток нарушена способность контролировать репликацию вируса (Kim et al., 2016), что соответствует известной повышенной восприимчивости к инфекции, возникающей с возрастом. Старение и способность реагировать на инфекционные агенты – та категория глазных болезней, на которые может значительно повлиять сенолитическая терапия. Устранение стареющих клеток и связанных с ними факторов SASP может уменьшить повреждение клеточной микросреды. Инфекционные заболевания зрительной системы поражают передние и задние структуры. При этом сенолитические средства вводят в передний или задний компартмент либо их комбинацию, в зависимости от места первичной патологии.

Заболевания глаз, связанные с простым герпесом

Сенолитические средства могут применяться при лечении субъектов от вирусных возрастных заболеваний глаз, связанных с простым герпесом. Вирусы простого герпеса (напр., простого герпеса 1) присутствуют у большинства взрослых. Вирусы из семейства герпеса обычно располагаются вокруг нервных волокон у людей. Вирусы герпеса могут заразить глаза, вызывая воспаление и рубцевание роговицы. Герпес глаз может передаваться при тесном контакте с инфицированным человеком, у которого вирус активен. Начиная от простой инфекции до состояния, которое может вызвать слепоту, существует несколько форм глазной герпетической инфекции. Герпетический кератит – вирусная инфекция роговицы, которая обычно поражает эпителий роговицы. Стромальный кератит возникает, когда инфекция проникает глубже в слои роговицы и может привести к образованию рубцов и/или потере зрения. Стромальный кератит может быть связан с поздним иммунным ответом на исходную инфекцию. Иридоциклит является серьезной формой инфекции, при которой радужная оболочка и окружающие ткани внутри глаза воспаляются, вызывая сильную чувствительность к свету, помутнение зрения, боль и покраснение глаз. Когда инфекция возникает в сетчатке или внутренней оболочке задней части глаза, её можно именовать герпетическим ретинитом.

Симптомы включают боль только в одном глазу и вокруг него, головную боль и лихорадку, покраснение, сыпь или язвы на веках и вокруг глаз, особенно в области лба или кончика носа, покраснение глаз, помутнение зрения, воспаление или отек и/или мутность роговицы, ощущение грязи или песка в глазу, слезоточивость, боль при взгляде на яркий свет. Методы диагностики включают изложенные ранее. В некоторых случаях для определения наличия очагов, содержащих вирус типа герпеса, можно использовать мазок Цанка или пятно Райта. Для подтверждения диагноза заражения конкретным вирусом также можно применять методы культивирования вируса, прямого иммунофлуоресцентного анализа и/или ПЦР.

Сенолитические средства можно вводить путем топического введения в место, пораженное инфекцией, напр., в конъюнктиву и/или роговицу, для лечения, улучшения и/или предотвращения заболевания глаз. Это может осуществляться путем применения контактной линзы, которая доставляет сенолитик в глаз (глаза) пациента в месте действия; или путем внутриглазной инъекции в конкретный участок инфекции в глазу. Необязательно сенолитические средства можно вводить в комбинации с противовирусным средством, которое может включать пероральные средства типа ацикловира, фамцикловира или валацикловира.

Глазной опоясывающий герпес

Вирус ветряной оспы - опоясывающего герпеса (HZV) или вирус varicella zoster (VZV) – это латентный вирус семейства герпеса, который обычно располагается вокруг нервных волокон у человека. Он сильно связан со старением. Реактивация вируса в глазном отделе тройничного нерва вызывает заболевание глаз – глазной опоясывающий герпес (herpes zoster ophthalmicus (ZHOU)).

Симптомы включают сильную хроническую боль, потерю зрения, кожную сыпь на лбу, болезненное воспаление всех тканей передней, а в некоторых случаях и задней структуры глаза, боль только в одном глазу и вокруг него, головную боль и лихорадку, покраснение глаза, затуманенное зрение, воспаление или отек и/или помутнение роговицы, ощущение грязи или песка в глазу, слезоточивость, боль при взгляде на яркий свет.

Субъекты, подлежащие лечению по настоящему изобретению, могут быть выбраны на основании клинической картины или офтальмологического исследования, свидетельствующего о наличии HZO. Методы диагностики включают внешний осмотр, остроту зрения, поле зрения, другие движения глаз, реакцию зрачков, фундоскопию, внутриглазное давление, исследование с помощью щелевой лампы в передней камере и исследование роговицы с окрашиванием и без него. В некоторых случаях можно использовать мазок Цанка или пятно Райта, чтобы определить, содержат ли очаги вирус типа герпеса. Для подтверждения диагноза заражения конкретным вирусом также можно применять методы культивирования вируса, прямого иммунофлуоресцентного анализа и/или ПЦР.

Сенолитические средства можно вводить путем топического введения в место, пораженное инфекцией, напр. в конъюнктиву и/или роговицу, к примеру, с помощью глазных капель, при помощи контактной линзы или посредством внутриглазной инъекции в конкретный участок инфекции в глазу. Сенолитические средства можно вводить в комбинации со вторым средством типа кортикостероида или противовирусного средства, напр., действующего против вируса ветряной оспы - опоясывающего герпеса типа ацикловира, фамцикловира или валацикловира. В некоторых случаях противовирусное средство вводится перорально.

Цитомегаловирусный ретинит

Связанные с цитомегаловирусом (CMV) заболевания глаз включают цитомегаловирусный ретинит. CMV-ретинит – распространенная оппортунистическая инфекция глаз, которая чаще всего встречается у лиц с ослабленным иммунитетом (ВИЧ, трансплантация органов), что ведет к воспалению сетчатки и может поражать светочувствительные клетки сетчатки, приводя к потере зрения, а в некоторых случаях к слепоте. После первичной инфекции CMV устанавливает латентную инфекцию в миелоидных клетках-предшественниках и перемежающуюся реактивацию вируса из активированных макрофагов или дендритных клеток, которая контролируется сильными вирус-специфичными ответами T-клеток CD4⁺ и T-клеток CD8⁺. В некоторых случаях пациенты с ВИЧ становятся более восприимчивыми к заболеваниям глаз, связанным с CMV, когда содержание CD4 падает ниже 50 клеток/мкл. Субъекты, которые являются ВИЧ-положительными или проходят иммуносупрессивную химиотерапию, могут быть восприимчивы к цитомегаловирусным заболеваниям глаз.

Симптомы цитомегаловирусного ретинита включают инфекцию в одном или обоих глазах, плавающие пятна, вспышки, слепые пятна, помутнение зрения, потерю периферического зрения и отслоение сетчатки. Диагноз цитомегаловирусного ретинита может быть подтвержден с помощью ПЦР-амплификации вирусной ДНК из образца субъекта. Подсчет Т-лимфоцитов CD4⁺ в образце субъекта может быть использован для прогнозирования или диагностики начала глазной инфекции. Пациенты с низким числом Т-лимфоцитов CD4⁺ должны регулярно проходить офтальмологические обследования на наличие симптомов заболевания сетчатки.

Сенолитические средства можно вводить в переднюю часть глаза с помощью глазных капель, через контактную линзу или посредством внутриглазной инъекции в конкретный участок инфекции в глазу. В некоторых случаях сенолитическое средство вводится в комбинации с противовирусным средством типа ганцикловира, валганцикловира, фоскарнета или цидофовира.

Заболевания глаз, связанные с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) может воздействовать на глаза прямо или косвенно посредством неинфекционных микрососудистых нарушений или различных оппортунистических инфекций. Офтальмологические проявления ВИЧ-инфекции могут затрагивать передний или задний сегмент глаза. В переднем сегменте могут развиваться опухоли периокулярных тканей и различные внешние инфекции, а в задних сегментах может возникать связанная с ВИЧ ретинопатия или оппортунистическая инфекция сетчатки и/или сосудистой оболочки. Офтальмологические проявления ВИЧ-инфекции включают контагиозный моллюск, глазной опоясывающий герпес, саркому Капоши, плоскоклеточный рак конъюнктивы, трихомегалию, сухость глаз, передний увеит, микроваскулопатию сетчатки, цитомегаловирусный ретинит, острый некроз сетчатки, прогрессирующий некроз наружной сетчатки, токсоплазмозный ретинохориоидит, сифилический ретинит и эндофтальмит, вызванный Candida albicans.

Симптомы могут включать потерю остроты зрения, повреждение сетчатки и ряд других симптомов, связанных с данными оппортунистическими инфекциями. Методы диагностики включают изложенные ранее.

В некоторых случаях для прогнозирования и/или диагностики начала глазной инфекции у ВИЧ-положительных пациентов применяется подсчет Т-лимфоцитов CD4⁺ в образце субъекта. В некоторых случаях у пациентов с ранней стадией ВИЧ-инфекции (число CD4 >300 клеток/мкл) редко встречаются глазные синдромы, связанные с иммуносупрессией.

Сенолитические средства можно вводить посредством интравитреальной инъекции в конкретный участок инфекции в глазу, необязательно в комбинации с антиретровирусным средством против ВИЧ или специальными противовирусными средствами типа валганцикловира при системном введении посредством инъекции или перорально.

ТИП 5. Воспалительные заболевания

Они характеризуются локализованным ответом, вызванным повреждением, посторонним предметом или разрушением тканей, который служит для разрушения, разбавления или ограждения как вредного агента, так и поврежденной ткани посредством производства провоспалительных медиаторов и набора клеток иммунной системы. Воспалительный ответ может провоцироваться физическими, химическими и биологическими агентами, включая механическую травму, воздействие чрезмерного количества солнечного света, рентгеновских лучей и радиоактивных материалов, агрессивных химических веществ, экстремальных температур и холода, или инфекционными агентами, такими как бактерии, вирусы и другие патогенные микроорганизмы. Воспаление может быть острым или хроническим и связанным с известным триггером либо идиопатическим (т.е. не связанным с явным провоцирующим агентом). Встречаются аутоиммунные заболевания глаз, которые могут быть связаны со значительным нарушением зрения.

Примеры идиопатических задних воспалительных заболеваний глаз включают точечный хориоидит (PIC), многоочаговый хориоидит (MIC) и серпигинозную хориоидопатию. Воспаление также может играть роль при заболеваниях глаз, связанных с другими этиологиями.

Общий подход и цели сенолитической терапии воспалительных заболеваний основываются на следующем.

Первичные и вторичные воспалительные заболевания глаз затрагивают все анатомические зоны зрительной системы, от век и роговицы до зрительного нерва и зрительного пути, и могут быть острыми или хроническими. Они связаны с патофизиологическим каскадом, который густо заполнен признаками старения и факторами, связанными с SASP. Целью сенолитической терапии является нарушение цикла воспаления путем устранения стареющих клеток и связанных с ними SASP. Это ограничивает продолжающееся повреждение в ткани и потенциально восстанавливает функцию за счет улучшения свойств клеточного микроокружения.

Хроническое воспаление является особенностью возраста и старения и многочисленных заболеваний, связанных со старением. Поэтому оно играет роль во всех категориях заболеваний, представленных до сих пор. Воспалительные заболевания зрительной системы поражают передние и задние структуры и лечатся соответственно, в зависимости от места первичной патологии.

Точечный хориоидит (PIC)

PIC – идиопатическое воспалительное заболевание сосудистой оболочки, которое характеризуется многоочаговыми, хорошо очерченными, небольшими поражениями сосудистой оболочки, если была исключена инфекционная причина. Патогенезу PIC могут способствовать изменения в кровоснабжении сосудистой оболочки, связанные с воспалением. Симптомы PIC включают помутнение зрения, фотопсию, центральные и/или периферические скотомы и метаморфопсии.

Методы диагностики включают изложенные ранее. При фундоскопии могут быть множественные, маленькие, круглые, желтовато-белые точечные очаги, при отсутствии признаков внутриглазного воспаления. SD-OCT может дать структурные характеристики очагов PIC. Аутофлуоресцентные снимки могут показывать гипофлуоресценцию в рубцовых очагах и аутофлуоресценцию в активных очагах.

Сенолитические средства можно вводить посредством интравитреальной инъекции или при помощи интравитреального имплантата в стекловидном теле глаза субъекта (напр., биоразрушаемый имплантат). Сенолитические средства можно вводить в комбинации с такими кортикостероидами, как кортизон, дексаметазон, флуоцинолон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон и триамцинолон; такими иммунодепрессантами, как рапамицин; такими антагонистами VEGF-A, как бевацизумаб и ранибизумаб; и антибиотиками.

Многоочаговый хориоидит (MFC)

Многоочаговый хориоидит (MFC) – хроническое воспалительное заболевание, которое характеризуется увеитом (воспалением среднего слоя глаза) и множественными поражениями в сосудистой оболочке. MFC чаще всего встречается у пациентов женского пола в возрасте от 6 до 69 лет.

Симптомы MFC включают снижение остроты зрения, ухудшение зрения, всплывающие ощущения, светочувствительность, слепые пятна, дискомфорт в глазах, фотопсию, видимые вспышки света, фотофобию, воспаление в переднем, среднем и/или заднем слое глаза, задний увеит, множественные рассеянные желтые/серо-белые пятна в сосудистой оболочке и/или сетчатке. Поражения могут иметь размеры от 50 до 1000 мкм и иметь распределение в перипапиллярной области, в аркадах и в средней периферии глаза. В некоторых случаях у субъекта может развиваться макулярная и перипапиллярная неоваскуляризация сосудистой оболочки или хориоидальные неоваскулярные мембраны (CNVM), новые кровеносные сосуды, которые могут вызвать более серьезную потерю зрения.

Методы диагностики включают ранее описанные методы, а также анализы крови, чтобы исключить возможность конкретного заболевания, связанного с вирусом.

Сенолитические средства можно вводить посредством интравитреальной инъекции или при помощи интравитреального имплантата. Сенолитические средства можно вводить в комбинации со вторым активным средством, которое вводится местно или с помощью внутриглазного имплантата или внутриглазной инъекции. Подходящие вторые средства включают такие кортикостероиды, как кортизон, дексаметазон, флуоцинолон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон и триамцинолон; такие иммунодепрессанты, как рапамицин; такие антагонисты VEGF-A, как бевацизумаб и ранибизумаб; и антибиотики.

Серпигинозная хориоидопатия

Серпигинозная хориоидопатия (также именуется географическим хориоидитом или геликоидной перипапиллярной хориоидопатией) – воспалительное заболевание глаз, которое характеризуется прогрессирующим разрушением пигментного эпителия сетчатки (RPE) и хориокапилляриса со вторичным поражением наружной сетчатки. В глазах могут образовываться очаги, которые длятся неделями или месяцами, обычно повторяются и могут включать рубцвыевание тканей глаз. Если центробежно расширяющиеся очаги обходят область fovea, то острота центрального зрения у субъекта может сохраниться. При макулярном варианте серпигинозной хориоидопатии у пациентов сначала может развиться географическое поражение макулы, вызывающее раннюю и глубокую потерю зрения без предшествующей перипапиллярной активности. Заболевание возникает, как правило, у субъектов в возрасте от 30 до 70 лет, у больных может наблюдаться повышенная частота ассоциации HLA-B7 и S-антигена сетчатки.

Симптомы серпигинозной хориоидопатии включают безболезненную одностороннюю потерю зрения, затуманенность зрения, метаморфопсию, фотопсию, скотомы, центральные скотомы или желтовато-белые хориоретинальные поражения змеевидного или псевдоподального вида, центробежно расходящиеся от диска зрительного нерва.

Методы диагностики включают методы визуализации, как описано выше.

Сенолитические средства необязательно можно вводить в комбинации с другими средствами, такими как кортизон, дексаметазон, флуоцинолон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон и триамцинолон; такими иммунодепрессантами, как рапамицин; такими антагонистами VEGF-A, как бевацизумаб и ранибизумаб, если они показаны при связанной с этим хориоидальной неоваскуляризации; и антибиотиками.

ТИП 6. Ятрогенные заболевания

Ятрогенные заболевания глаз характеризуются как заболевания, которые являются следствием диагностических и терапевтических процедур, проводимых на пациенте. Примеры ятрогенных заболеваний глаз включают возникающую после витрэктомии катаракту или радиационную ретинопатию после обработки новообразований.

Общий подход и цели сенолитической терапии ятрогенных заболеваний основываются на следующем.

Процесс старения под воздействием стрессоров, связанных с процедурой или терапевтическим средством, вызывает патофизиологический каскад, сходный с тем, что наблюдается при других формах процесса старения. Подвергаясь таким стрессорам, глазные ткани могут иметь большее распространение стареющих клеток, что, в свою очередь, может привести к появлению некоторых глазных болезней на более ранней стадии или в более тяжелой форме. Целью сенолитической терапии является разрушение воздействия стареющих клеток на ткани путем устранения стареющих клеток и связанных с ними SASP. Это предотвращает или ограничивает продолжающееся повреждение в ткани и потенциально восстанавливает функцию за счет улучшения свойств клеточного микроокружения. Учитывая, что в некоторых случаях ятрогенный эффект может быть предсказан, может осуществляться профилактическая терапия.

Ятрогенные заболевания зрительной системы влияют на передние и задние структуры. При этом сенолитическое средство вводится в передний или задний отсек или же в оба, в зависимости от места первичной патологии, характера процедуры и сенолитического средства, выбранного для применения.

Катаракта после витрэктомии

После внутриглазной хирургии может происходить образование катаракты или ускорение её образования. Витрэктомия – это микрохирургический метод, используемый для получения доступа к полости стекловидного тела и сетчатке, который применяется для лечения заболеваний, затрагивающих задний сегмент глаза. Витрэктомия связана с сопутствующими заболеваниями, которые могут нарушать остроту зрения, такими как отслоение сетчатки, декомпенсация роговицы, образование катаракты или её прогрессирование. В некоторых случаях тип катаракты, которая формируется или ускоряется после витрэктомии, представляет собой ядерную склеротическую катаракту. В некоторых случаях, когда глаза подвергаются витрэктомии, хрусталик также удаляется. Катаракта, которая развивается после витрэктомии, может ограничивать остроту зрения до такой степени, что это приведет к хирургическому удалению хрусталика в нормальном глазу. Образование или ускорение катаракты после витрэктомии может быть связано с токсичностью света, окислением белков хрусталика, воздействием внутриглазного газа, продолжительностью самой операции и повышением ретролентального уровня кислорода.

Симптомы катаракты после витрэктомии включают снижение остроты зрения, несмотря на анатомический и/или функциональный успех предшествующей операции витрэктомии, блики, ореолы и т.д. У лиц, перенесших витрэктомию, может быть более низкий уровень базовой (до катаракты) остроты зрения из-за скрытого характера патологии сетчатки у них; поэтому у пациентов с катарактой после витрэктомии чаще бывает худшее зрение, чем у пациентов с типичными старческими катарактами.

Радиационная ретинопатия

Радиационная ретинопатия – это зависимое от дозы радиации осложнение при воздействии облучения типа наружной лучевой терапии или капсульной брахитерапии. Наружная лучевая терапия применяется для лечения опухолей носоглотки, околоносовых пазух или глазниц, где возможности защиты глаз ограничены, и может приводить к клинически значимой радиационной ретинопатии. Капсульная брахитерапия для лечения внутриглазных опухолей также может приводить к повреждению ближайшей сетчатки и сосудистой оболочки. Воздействие радиации может вызвать преимущественную потерю клеток сосудистого эндотелия с относительным сохранением перицитов. Различия в чувствительности между эндотелиальными клетками и перицитами может быть результатом прямого воздействия на эндотелиальные клетки высокого содержания кислорода и железа в крови, при котором образуются свободные радикалы и происходит повреждение клеточных мембран, закупорка капиллярного русла и образование микроаневризм. Ишемия сетчатки в зонах неперфузии сетчатки в конечном итоге приводит к отеку желтого пятна, неоваскуляризации микроаневризмов, отеку желтого пятна, кровоизлиянию в стекловидное тело и тракционному отслоению сетчатки.

Симптомы радиационной ретинопатии включают ухудшение зрения, летающие “мушки”, телеангиэктазию, неоваскуляризацию, кровоизлияния в стекловидное тело, твердые экссудаты, ватоподобные пятна и/или отек желтого пятна.

Методы диагностики включают офтальмологическое исследование глаз субъекта, например, при помощи ангиографии и оптической когерентной томографии (OCT). Для выявления и вычленения микрососудистых особенностей радиационной ретинопатии может применяться флуоресцеиновая ангиография. Зеленая индоцианиновая ангиография может выявить прекапиллярную окклюзию артериол и участки хориоидальной гипоперфузии. Оптическая когерентная томография (OCT) может найти применение при оценке макулярного отека.

Комбинирование сенолитических средств с другими стандартными методами лечения

Сенолитические средства для лечения заболеваний глаз можно комбинировать с другими фармацевтическими средствами, которые одобрены для клинического применения. Поскольку удаление стареющих клеток работает по другому механизму, чем современные методы лечения, то эти два средства могут действовать синергически или аддитивно, минимизируя график введения и улучшая результаты. Сенолитические средства удаляют стареющие клетки в глазах, которые способствуют сохранности и прогрессированию связанной с заболеванием патофизиологии.

В настоящее время стандартом лечения многих сосудистых заболеваний глаз является средство, которое ингибирует фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), а именно: афлиберцепт (продается как Eylea^® фирмой Regeneron Pharmaceuticals). Афлиберцепт представляет собой рекомбинантный слитый белок, состоящий из связывающих VEGF участков из внеклеточных доменов рецепторов VEGF-1 и -2 человека, слитых с Fc-фрагментом иммуноглобулина IgG1 человека.

Для неоваскулярной (влажной) возрастной дегенерации желтого пятна (AMD) рекомендуемая доза для EYLEA составляет 2 мг (0,05 мл или 50 мкл) и вводится путем интравитреальной инъекции каждые 4 недели (ежемесячно) в течение первых 12 недель (3 месяца), с последующим введением 2 мг (0,05 мл) путем интравитреальной инъекции один раз каждые 8 недель (2 месяца). Для отека желтого пятна после венозной окклюзии сетчатки (RVO) рекомендуемая доза для EYLEA составляет 2 мг (0,05 мл или 50 микролитров), вводимой путем интравитреальной инъекции один раз каждые 4 недели (ежемесячно). Для диабетического макулярного отека (DME) рекомендуемая доза для EYLEA составляет 2 мг (0,05 мл или 50 микролитров), вводимой путем интравитреальной инъекции каждые 4 недели (ежемесячно) для первых 5 инъекций, а затем 2 мг (0,05 мл) посредством интравитреальной инъекции один раз каждые 8 недель (2 месяца). Хотя EYLEA можно вводить и так часто, как по 2 мг раз в 4 недели (ежемесячно), у большинства пациентов не была продемонстрирована дополнительная эффективность при введении EYLEA раз в 4 недели по сравнению с 8 неделями. Некоторые пациенты могут нуждаться в дозировке раз в 4 недели (ежемесячно) после первых 20 недель (5 месяцев). Для диабетической ретинопатии (DR) у пациентов с DME рекомендуемая доза EYLEA составляет 2 мг (0,05 мл или 50 микролитров), которые вводятся путем интравитреальной инъекции каждые 4 недели (ежемесячно) для первых 5 инъекций, а затем 2 мг (0,05 мл) путем интравитреального введения один раз каждые 8 недель (2 месяца).

Использование сенолитического средства в сочетании с терапией против VEGF является новой парадигмой, которая может влиять на особенности заболевания существенным образом. Терапия против VEGF, назначаемая отдельно, требует частого введения для предотвращения прогрессирования заболевания. Комбинирование терапии против VEGF с сенолитическим средством может уменьшить скорость прогрессирования или частоту рецидивов активного заболевания. Вполне возможно, что анти-VEGF может резко блокировать потенциальную утечку и кровотечение, а сенолитическое средство может воздействовать на CNV подострым, а затем хроническим образом – с возможностью того, что потребность в комбинированной терапии уменьшится или будет устранена, или что это используется с большей степенью эффективности в более широкой группе пациентов. Это, в свою очередь, может позволить ведущему врачу назначать терапию против VEGF реже, с лучшими результатами по зрению.

Ожидается, что комбинация улучшит частоту ответов, улучшит результаты, снизит нагрузку на лечение и общую стоимость терапии. Это также может повлиять на аспекты основной сухой AMD, на которые не влияет терапия против VEGF. Это проявляется в отдаленных результатах у пациентов с влажной AMD, получавших терапию против VEGF, у которых со временем развивается потеря зрения в отсутствие активной неоваскуляризации, но скорее из-за атрофии или прогрессирования основной сухой AMD (Bhisitkul et al., 2015).

Сенолитические средства можно комбинировать с другими средствами, направленными на базовую патофизиологию или симптоматику заболевания.

Нефармацевтическое вмешательство, которое может проводиться в сочетании со введением сенолитиков, включает точечную окклюзию для уменьшения оттока слез из глаз. Другим примером является подбор субъекту склеральных или полусклеральных контактных линз, создающих заполненный жидкостью слой над роговицей. В некоторых случаях введение сенолитика проводится в сочетании с точечным устройством пробки, блокирующей слезный канал, дренирующий слезы из глаза.

В некоторых случаях заболевание глаз связано с другими воспалительными заболеваниями и сенолитическое средство вводится в комбинации с антигистаминовыми средствами (типа фенирамина, эмедастина или азеластина), противоотечными средствами (типа тетрагидрозолина гидрохлорида или нафазолина) или нестероидными противовоспалительными средствами (типа непафенака или кеторолака), кортикостероидами (типа фторметолона или лотепреднола), стабилизаторами тучных клеток (типа азеластии, кромала, эмедастина, кетотифена, йодоксамина, недокромила, олопатадина или пемироласта) или стероидами. В некоторых случаях фармацевтическая композиция вводится в сочетании со вторым активным средством, напр., таким макролидным иммунодепрессантом, как циклоспорин, такролимус, пимекролимус, эверолимус, сиролимус, дефоролимус, темсиролимус и зотаролимус, абетимус, гусперимус или микофеноловая кислота.

Если данное заболевание глаз связано с инфекционным бактериальным заболеванием (типа инфекции мейбомиевых желез или инфекции роговицы), то глазные капли или мазь можно вводить вместе с или в комбинированной композиции, содержащей такой антибиотик, как ципрофлоксацин, эритромицин, гентамицин, офлоксацин, сульфацетамин, тобрамицин или монофлоксацин. Если заболевание сухости глаз связано с вирусной инфекцией, то сенолитическое средство можно вводить вместе с или в комбинированной композиции с противовирусным средством типа трифлуридина или идоксуридина. В другом примере субъект приходит с предсуществующим аутоиммунным заболеванием. Субъекта тоже можно лечить с помощью системной (к примеру) пероральной терапии для ассоциированного заболевания.

В некоторых случаях сенолитическое средство вводят в сочетании с одним или несколькими различными биологически активными средствами, которые могут относиться к одному или к разным классам препаратов. Биологически активные средства или препараты выбирают из: анестетиков и анальгетиков, противоаллергических средств, антигистаминных средств, противовоспалительных средств, противораковых средств, антибиотиков, противоинфекционных средств, антибактериальных средств, противогрибковых средств, противовирусных средств, средств, затрудняющих транспорт/подвижность клеток, препаратов против глаукомы, антигипертензивных средств, противоотечных средств, модификаторов иммунологических реакций, иммуносупрессивных средств, пептидов и белков, стероидных соединений (стероидов), стероидов с низкой растворимостью, ингибиторов карбоангидризы, диагностических средств, антиапоптозных средств, средств генной терапии, секвестрирующих средств, восстановителей, антипермеабилизирующих средств, антисмысловых соединений, антипролиферативных средств, антител и конъюгатов антител, усилителей кровотока, антипаразитарных средств, нестероидных противовоспалительных средств, питательных веществ и витаминов, ингибиторов ферментов, антиоксидантов, препаратов против катаракты, ингибиторов альдозоредуктазы, цитопротекторов, цитокинов, ингибиторов цитокинов и цитокиновых протекторов, УФ-блокаторов, стабилизаторов тучных клеток и антинеоваскулярных средств типа антиангиогенных средств типа ингибиторов матриксной металлопротеазы и модуляторов фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), нейропротекторов, миотических средств и антихолинэстеразы, мидриатических средств, искусственных слез/терапии сухости глаз, анти-TNFα, антагонистов рецепторов IL-1, ингибиторов протеинкиназы С-13, аналогов соматостатина и симпатомиметиков.

Другие комбинации, включенные в изобретение, можно найти в других местах данного описания.

Определения

Обычно считается, что “стареющие клетки” происходят из такого типа клеток, которые обычно реплицируются, но в результате старения или другого события, вызывающего изменение состояния клетки, больше не могут реплицироваться. Они остаются метаболически активными и обычно принимают связанный со старением секреторный фенотип (SASP), который включает хемокины, цитокины, белки, модифицирующие внеклеточный матрикс и фиброз, и ферменты. Ядро стареющих клеток часто характеризуется связанными со старением очагами гетерохроматина и сегментами ДНК с изменениями хроматина, усиливающими старение. Не налагая каких-либо ограничений на практику того, что заявлено в настоящем изобретении, что не указано прямо или не требуется, изобретение основывается на гипотезе, что стареющие клетки вызывают или опосредуют определенные заболевания, связанные с повреждением или старением тканей. В целях практического применения аспектов настоящего изобретения, стареющие клетки можно идентифицировать как экспрессирующие хотя бы один маркер из числа p16, связанной со старением β-галактозидазы и липофусцина; иногда два или несколько таких маркеров и других маркеров SASP, таких, без ограничения, как интерлейкин-6 и воспалительные, ангиогенные и модифицирующие внеклеточный матрикс белки.

“Связанное со старением” заболевание, расстройство или состояние представляет собой физиологическое состояние, которое проявляется одним или несколькими симптомами или признаками, при этом субъекту с этим заболеванием требуется или же он мог бы получить пользу от ослабления таких симптомов или признаков. Заболевание связано со старением, если оно вызвано или опосредовано частично стареющими клетками, которые могут быть индуцированы многими этиологическими факторами, включая возраст, повреждение ДНК, окислительный стресс, генетические дефекты и т.п. Списки связанных со старением заболеваний, которые потенциально можно лечить или вести с помощью способов и продуктов, приведенных в данном описании, включают те, которые обсуждались в этом описании и предыдущих описаниях, по которым настоящая заявка претендует на приоритет.

Соединение обычно именуется “сенолитическим”, если оно устраняет стареющие клетки по сравнению с репликативными клетками того же типа ткани или покоящимися клетками без маркеров SASP. С другой стороны или же наряду с этим, соединение или комбинация может эффективно применяться в соответствии с настоящим изобретением, если оно снижает высвобождение патологических растворимых факторов или медиаторов как часть связанного со старением секреторного фенотипа, которые играют роль в первоначальном проявлении или текущей патологии заболевания либо ингибируют его разрешение. При этом термин “сенолитик” является иллюстративным в том понимании, что соединения, которые действуют главным образом путем ингибирования, а не устранения стареющих клеток (ингибиторы стареющих клеток), могут применяться таким же образом со всеми вытекающими преимуществами.

Успешное “лечение” глазной болезни по настоящему изобретению может означать любой эффект, полезный для проходящего лечение субъекта. Это включает уменьшение тяжести, продолжительности или прогрессирования заболевания или любых неблагоприятных признаков или симптомов, возникающих в результате этого. В некоторых случаях сенолитические средства также могут применяться для предотвращения или торможения проявления заболевания, которому субъект подвержен, к примеру, из-за наследственной предрасположенности или вследствие истории болезни.

“Терапевтически эффективное количество” означает такое количество соединения по настоящему изобретению, которое (i) лечит определенное заболевание, состояние или расстройство, (ii) ослабляет, улучшает или устраняет один или несколько симптомов определенного заболевания, состояния или расстройства, (iii) предотвращает или замедляет появление одного или нескольких симптомов определенного заболевания, состояния или расстройства, описанного здесь, (iv) предотвращает или замедляет прогрессирование определенного заболевания, состояния или расстройства, или (v) по крайней мере частично обращает повреждения, вызванные заболеванием до лечения.

Термины “инфекционное заболевание глаз” и “глазная инфекция” относятся к инфекциям, вызванным микроорганизмом или микроорганизмами в глазах или вокруг них либо в структурах глаз, которые включают веки и слезный аппарат, конъюнктиву, роговицу, увеальный тракт, стекловидное тело, сетчатку и зрительный нерв.

“Фосфорилированная” форма соединения означает такое соединение, в котором одна или несколько групп -OH или -COOH замещены фосфатной группой, которая представляет собой -OPO₃H₂, -OC_nH_2nPO₃H₂ или -OC(=O)C_nH_2nPO₃H₂ (где n равно от 1 до 4) с тем, что фосфатная группа или группы могут быть удалены in vivo (например, путем энзимолиза). Нефосфорилированная или дефосфорилированная форма не имеет таких фосфатных групп.

Если не указано или не требуется иначе, все структуры соединений, приведенные в изобретении, включают сопряженные кислоты и основания с такой же структурой, кристаллические и аморфные формы этих соединений, фармацевтически приемлемые соли и их растворенные и твердые формы, включая, к примеру, полиморфы, сольваты, гидраты, несольватированные полиморфы (в том числе безводные), конформационные полиморфы и аморфные формы соединений, а также их смеси.

Офтальмологические заболевания или заболевания глаз определяются для целей настоящего изобретения как заболевания зрительной системы. Передние заболевания глаз – такие заболевания, недомогания или состояния, которые затрагивают или вовлекают переднюю часть или участок глаза типа периокулярных мышц, глазного века либо глазной ткани или жидкости, расположенных перед задней стенкой капсулы хрусталика или ресничных мышц. Задние заболевания глаз – такие заболевания, недомогания или состояния, которые в первую очередь поражают или затрагивают заднюю часть или участок глаза типа сосудистой оболочки или склеры (позади от плоскости, проходящей через заднюю стенку капсулы хрусталика), стекловидного тела, задней камеры, сетчатки, пигментного эпителия сетчатки, мембраны Бруха, зрительного нерва (т. е. диска зрительного нерва), зрительного пути, а также кровеносные сосуды и нервы, которые снабжают сосудами или иннервируют заднюю часть или участок глаза.

Если не указано или не требуется иначе, другие термины, используемые в описании, имеют свои обычные значения.

Включение путем ссылки

Для всех целей в США и в других юрисдикциях, где это действительно, каждая отдельная публикация и патентные документы, процитированные в этом описании, настоящим включены сюда посредством ссылки во всей полноте для всех целей в той же степени, как если бы каждая такая публикация или документ был конкретно и индивидуально указан, как включенный сюда путем ссылки.

US 2016/0339019 A1 (Laberge et al.) и WO 2016127135 (David et al.) настоящим включены сюда путем ссылки для всех целей, включая, без ограничения, идентификацию, составление и применение соединений, способных устранять или уменьшать активность стареющих клеток и лечить заболевания глаз. Патенты США №№ 8,691,184, 9,096,625, и 9,403,856 (Wang et al.) настоящим включены сюда путем ссылки во всей полноте для всех целей, включая характеристики соединений в библиотеке Bcl, их получение и применение.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Измерение ингибирования Bcl

Способность соединений-кандидатов ингибировать активность Bcl-2 и Bcl-xL может быть измерена на молекулярном уровне путем прямого связывания. В этом методе применяется технология гомогенного анализа на основе каналирования кислорода, которая продается PerkinElmer Inc., Waltham, Massachusetts: см. Eglin et al., Current Chemical Genomics, 2008, 1, 2-10. Исследуемое соединение смешивают с целевым белком Bcl и пептидом, представляющим соответствующий когнатный лиганд, помеченный биотином. Затем смесь объединяют с содержащими стрептавидин люминесцентными донорными шариками и люминесцентными акцепторными шариками, у которых пропорционально снижается люминесценция, если соединение ингибирует связывание пептида с белком Bcl.

Bcl-2, Bcl-xL и Bcl-w получали от Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri. Биотинилированный пептид BIM (лиганд для Bcl-2) и пептид BAD (лиганд для Bcl-xL) описаны в US 2016/0038503 A1. Донорные шарики AlphaScreen^® Streptavidin со стрептавидином и акцепторные шарики AlphaLISA^® Anti-6XH получали от PerkinElmer.

Для проведения анализа готовили серию разведений соединения в ДМСО 1:4 и затем разбавляли 1:100 в буфере для анализа. В 96-луночном планшете для ПЦР смешивали в следующем порядке: 10 мкл пептида (120 нМ BIM или 60 нМ BIM), 10 мкл исследуемого соединения и 10 мкл белка Bcl (0,8 нМ Bcl-2/w или 0,4 нМ Bcl-xL). Планшет для анализа инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 24 часов. На следующий день донорные и акцепторные шарики объединяли и в каждую лунку добавляли по 5 мкл. После инкубации в темноте в течение 30 мин измеряли люминесценцию на считывающем устройстве и определяли сродство или степень ингибирования у каждого исследуемого соединения.

Пример 2. Измерение ингибирования MDM2

MDM2 (мышиный гомолог двойного мелкого-2, также известный как убиквитин-протеин-лигаза E3) является отрицательным регулятором супрессора опухолей p53. Ингибирование MDM2 стимулирует активность р53, тем самым придавая сенолитическую активность. Способность соединений действовать в качестве агонистов MDM2 в клетках можно измерить косвенно путем отслеживания их действия на p53.

Стабильную линию клеток RKO с люциферазным репортером р53 получали от Signosis Inc., Santa Clara, CA. В клетках с р53-люциферазой активность люциферазы специфически связана с активностью р53. Клеточная линия была установлена путем трансфекции вектора люциферазы-репортера р53 вместе с вектором, экспрессирующим G418, с последующим отбором по G418.

Анализ проводили следующим образом. Клетки репортерной клеточной линии обрабатывали 24 часа соединением-кандидатом. Затем удаляли среду, промывали клетки PBS и добавляли в лунки по 20 мкл буфера для лизиса. Клетки встряхивали 10 сек на качалке для планшетов. Готовили люциферазный буфер и добавляли в лунки. Затем считывали активность р53 на многометочном считывающем устройстве Victor™ (Perkin‌Elmer, San Jose, CA).

Пример 3. Измерение сенолитической активности на стареющих фибробластах

Клетки IMR90 фибробластов человека получали из Американской коллекции типовых культур (ATCC^®) с обозначением CCL-186. Клетки поддерживали на уровне конфлюэнтности <75% в среде DMEM, содержащей FBS и Pen/Strep, в атмосфере с 3% O₂, 10% CO₂ при влажности ~95%. Клетки разделяли на три группы: облученные клетки (культивировали после облучения в течение 14 дней перед использованием), пролиферирующие нормальные клетки (культивировали при низкой плотности в течение 1 дня перед использованием) и покоящиеся клетки (культивировали при высокой плотности в течение 4 дней перед использованием).

В день 0 готовили облученные клетки следующим образом. Клетки IMR90 промывали, вносили в колбы Т175 при плотности 50000 клеток на мл и облучали при 10-15 Гр. После облучения клетки высеивали по 100 мкл в 96-луночные планшеты. В дни 1, 3, 6, 10 и 13 среду в лунках отсасывали и заменяли свежей средой.

На 10-й день готовили покоящиеся здоровые клетки следующим образом. Клетки IMR90 промывали, смешивали с 3 мл содержащего трипсин реагента TrypLE (Thermo‌Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) и инкубировали в течение 5 мин, пока клетки не округлялись и начинали отделяться от планшета. Клетки диспергировали, подсчитывали и доводили средой до концентрации 50000 клеток на мл. По 100 мкл клеток высеивали в лунки 96-луночного планшета. На 13-й день меняли среду.

На 13-й день готовили популяцию пролиферирующих здоровых клеток следующим образом. Здоровые клетки IMR90 промывали, смешивали с 3 мл TrypLE и инкубировали в течение 5 мин, пока клетки не округлялись и начинали отделяться от планшета. Клетки диспергировали, подсчитывали и доводили средой до концентрации 25000 клеток на мл. По 100 мкл клеток высеивали в лунки 96-луночного планшета.

На 14-й день исследуемые ингибиторы Bcl-2 или ингибиторы MDM2 смешивали с клетками следующим образом. Готовили серию разведений в DMSO каждого исследуемого соединения в 200-кратной концентрации от требуемой конечной концентрации в 96-луночном планшете для ПЦР. Непосредственно перед использованием исходные растворы в DMSO разводили 1:200 подогретой полной средой. Из клеток в лунках отсасывали среду и добавляли по 100 мкл на лунку среды, содержащей соединение.

Для тестирования сенолитические средства-кандидаты культивировали с клетками в течение 6 дней, заменяя культуральную среду свежей средой с такой же концентрацией соединения на 17-й день. Ингибиторы Bcl-2 типа 001967 культивировали с клетками в течение 3 дней. В системе анализа используются свойства термостабильной люциферазы, обеспечивающие условия реакции, которые дают стабильный люминесцентный сигнал при одновременном ингибировании эндогенной АТФазы, высвобождаемой при лизисе клеток. По окончании культивирования в каждую лунку добавляли 100 мкл реагента CellTiter-Glo^® (Promega Corp., Madison, Wisconsin). Планшеты с клетками помещали на 30 сек на круговую качалку, а затем измеряли люминесценцию.

Пример 3A. Скрининг библиотеки соединений на антагонисты Bcl

Открытие сенолитических средств, применимых для реализации по настоящему изобретению, основывается на том, что стареющие клетки можно уничтожить путем ингибирования одного или нескольких регуляторных белков из семейства Bcl, которые являются антиапоптотическими. Предполагается, что молекулы с высоким сродством и избирательностью к изоформе Bcl будут эффективно индуцировать апоптоз в стареющих клетках, но не в пролиферирующих или не стареющих клетках одного и того же типа ткани. Соединения с такими свойствами были бы кандидатами для разработки в качестве терапевтических средств для клинической медицины.

Сначала была построена библиотека, содержащая несколько сотен соединений. Синтез и применение такой библиотеки изложены в Патентах США 8,691,184, 9,096,625 и 9,403,856. Библиотека сначала проходила скрининг в другом месте на предмет соединений, способных связывать или ингибировать Bcl-xL и/или Bcl-2. При первоначальном скрининге было отобрано 15 соединений для дальнейшего анализа. На фиг. 1A, 1B и 1C представлены 9 из пятнадцати соединений.

Выбранные соединения подвергали дальнейшему анализу для количественного определения фактического сродства к Bcl-xL, Bcl-2 и Bcl-w с целью идентификации потенциальных сенолитических средств для применения при лечении возрастных заболеваний. На фиг. 2A, 2B и 2C представлены результаты анализа связывания, причем соединения в левой части каждого графика обладают наибольшим сродством.

Индивидуальные соединения в библиотеке имели аналогичные базовые структуры. Как показано на фиг. 3A, 3B и 3C, сравнивали структуры каждого из наиболее перспективных соединений с целью выявления тех заместителей в молекулярной структуре, которые вносят вклад в требуемый эффект.

Пример 3B. Скрининг высокоаффинных антагонистов Bcl на сенолитическую активность и специфичность

Способность связывать регуляторные белки Bcl не обязательно означает, что соединение подходит для индукции апоптоза в клинической обстановке. Более того, даже если соединение является активным, оно может не подойти для применения в качестве терапевтического средства, если оно не уничтожает предпочтительно стареющие клетки с высокой степенью избирательности. Соответственно, соединения в библиотеке, проявляющие высокое сродство связывания с Bcl, подвергали дальнейшему скринингу на их способность уничтожать облученные фибробласты по сравнению с реплицирующимися фибробластами или покоящимися (вследствие конфлюэнтности), но не стареющими фибробластами.

На фиг. 4A, 4B и 4C представлены данные, полученные для девяти модельных соединений: сродство связывания с каждой изоформой Bcl и эффективные концентрации (EC₅₀) для уничтожения стареющих фибробластов (SnCs) в культуре. На фиг. 6 показано сродство связывания с изоформами Bcl и эффективные концентрации (EC₅₀) для уничтожения стареющих фибробластов (SnCs) в культуре. Данные приведены ниже в табл. 1.

ID Исходный ID Мол. масса Сродство связывания (K_i ± SD) EC₅₀ для SnCs (мкМ) SI Bcl-xL (пМ) Bcl-2 (пМ) Bcl-w (пМ) UM/APG-901 BM-501 639,1 н/п н/п н/п н/п н/п UM/APG-902 BM-983 967,5 3307 4037 >250000 5,000 1,0 UM/APG-903 BM-782 1274,4 885,55 10923 17694 11,000 1,3 UM/APG-904 BM-788 1148,2 5292 121045 23132,5 н/п н/п UM/APG-905 BM-792 1165,7 64,125 3324 1295,5 1,000 3,3 UM/APG-906 BM-957 1179,7 45,3 3333 659,95 0,300 11,7 UM/APG-907 BM-962 1193,7 57,41 3389,5 538,15 0,200 18,5 UM/APG-908 BM-1075 1113,7 5,7285 178,95 161,45 0,300 15,3 UM/APG-909 BM-1192 1215,3 н/п н/п н/п 0,050 60,0 UM/APG-910 BM-1195 1229,3 148,565 666,55 174,7 0,006 128,7 UM/APG-911 BM-1197 1245,8 295 447,95 291,6 0,005 366,7 UM/APG-912 BM-1244 1273,8 134,52 450,75 356,75 0,300 66,7 UM/APG-913 BM-1261 1409,9 106,89 274,45 239,45 27,000 н/п UM/APG-914 BM-1252 1395,9 81,085 5,85 123,95 6,000 н/п

Данные показывают, что высокое сродство связывания с любой изоформой Bcl не обязательно предсказывает эффективность сенолитического средства. У всех соединений, обозначенных BM-1075, BM-1195, BM-1197, BM-1244, BM-1261 и BM-1252, сродство связывания (K_i) для изоформ Bcl было в диапазоне от наномоль до пикомоль. Однако при анализе по определению эффективной концентрации для уничтожения клеток (EC₅₀) некоторые из этих молекул типа BM-1244, BM-1261 и BM-125 были в 60-5000 раз менее эффективными, чем соединения, выбранные в конечном счете для разработки.

Соединения с наилучшей сенолитической активностью, BM-1195 и BM-1197, были эффективными в наномолярном диапазоне. Был определен широкий диапазон специфичности для стареющих клеток (SI) у различных соединений, составляющий от 1,0 (неспецифично) до более 300. Лучшим соединением в смысле как эффективности, так и специфичности было BM-1197, а также представляют интерес BM-1195, BM-1244, BM-1105 и BM-1075.

В соответствии с этими данными были сделаны следующие выводы в отношении химической структуры. В основе эффективных соединений была эта субструктура:

причем группы R₃, R₄ и F необязательны. У BM-1197 важна группа -SO₂CF₃, но может быть заменена группами с близкими свойствами типа -NO₂ в BM-1075. Важна и группа -SO₂R′, хотя R′ может варьироваться от -CH₃ до других короткоцепочечных алкильных групп. Также важна группа арил-S-C₆H₅, хотя потенциально она может иметь нейтральные заместители. Что касается следующей части структуры:

то R₁ может означать некоторые короткоцепочечные алкильные группы, а X₁ может варьироваться (Cl у BM-1197; F у BM-1195). Следующая часть BM-1197:

,

как оказалось, оставляет определенную свободу в том, что касается формы, так что имеется ряд альтернативных подструктур, эффективных для многих целей настоящего изобретения.

На фиг. 5A, 5B и 5C представлено сравнение структур эффективных соединений для определения того, какие субструктуры вносят вклад в требуемые свойства соединений. Эти и другие соображения дают чертеж общей структуры, представленной ранее в виде формулы VI и формулы VII.

Пример 4. Влияние сенолитических средств на стареющие сосудистые клетки сетчатки

Способность веществ-кандидатов устранять стареющие клетки или похожие на стареющие эндотелиальные клетки сетчатки измеряли непосредственно следующим методом.

Микрососудистые эндотелиальные клетки сетчатки человека (HRMEC) получали от Neuromics с обозначением HEC09. Клетки сначала содержали и размножали до конфлюэнтности <75% в ростовой среде ENDO (Neuromics, Edina, MN) при 3% O₂, 10% CO₂ и влажности ~95%. Клетки разделяли на три группы: облученные клетки (культивировали после облучения в течение 7 дней перед использованием), пролиферирующие нормальные клетки (культивировали при низкой плотности в течение 1 дня перед использованием) и покоящиеся клетки (культивировали до конфлюэнтности более 4 дней).

В день 0 готовили облученные клетки следующим образом. Клетки HRMEC покрывали 3 мл содержащего трипсин реагента TrypLE (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts) и инкубировали в течение 5 мин, пока клетки не округлялись и начинали отделяться от планшета. Клетки диспергировали, подсчитывали и доводили средой до концентрации 100000 клеток на мл. Эту суспензию клеток вносили в колбы Т175 при плотности 100000 клеток на мл и облучали при 10-15 Гр. После облучения клетки высеивали по 100 мкл в 96-луночные планшеты. В дни 1, 3, 6 среду в лунках отсасывали и заменяли свежей средой.

На 3-й день готовили покоящиеся здоровые клетки следующим образом. Здоровые, не стареющие клетки HRMEC высвобождали из культуральной колбы путем инкубации с 3 мл содержащего трипсин реагента TrypLE (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts) и инкубировали в течение 5 мин, пока клетки не округлялись и начинали отделяться от планшета. Клетки диспергировали, подсчитывали и доводили средой до концентрации 80000 клеток на мл. По 100 мкл клеток высеивали в лунки 96-луночного планшета. В дни 1, 3, 6 и 10 меняли среду.

На 6-й день готовили популяцию пролиферирующих здоровых клеток следующим образом. Здоровые, не стареющие клетки HRMEC промывали, покрывали 3 мл TrypLE и инкубировали в течение 5 мин, пока клетки не округлялись и начинали отделяться от планшета. Клетки диспергировали, подсчитывали и доводили средой до концентрации 40000 клеток на мл. По 100 мкл клеток высеивали в лунки 96-луночного планшета.

На 7-й день сенолитические средства-кандидаты смешивали с клетками следующим образом. Готовили серию разведений в DMSO каждого исследуемого соединения в 200-кратной концентрации от требуемой конечной концентрации в 96-луночном планшете для ПЦР. Непосредственно перед использованием исходные растворы в DMSO разводили 1:200 подогретой полной средой. Из клеток в лунках отсасывали среду и добавляли по 100 мкл на лунку среды, содержащей соединение.

Сенолитические средства-кандидаты культивировали с клетками в течение 3 дней. В системе анализа используются свойства термостабильной люциферазы, обеспечивающие условия реакции, которые дают стабильный люминесцентный сигнал при одновременном ингибировании эндогенной АТФазы, высвобождаемой при лизисе клеток. По окончании культивирования в каждую лунку добавляли 100 мкл реагента CellTiter-Glo^® (Promega Corp., Madison, Wisconsin). Планшеты с клетками помещали на 30 сек на круговую качалку, а затем оставляли при комнатной температуре на 10 минут и измеряли люминесценцию. Значения люминесценции нормировали для определения % выживаемости/роста клеток и наносили на график зависимости от концентрации исследуемого соединения, а эффективность (значения IC₅₀) определяли путем построения нелинейных кривых в GraphPad Prism^®.

Результаты представлены на фиг. 7. На кривой типа концентрация-ответ для типичного исследуемого соединения представлена чувствительность выживания стареющих клеток HRMEC к инкубации с сенолитической молекулой. Эти данные показывают, что сенолитические средства способны устранять стареющие клетки HRMEC в культуре.

Пример 5. Влияние сенолитических средств на стареющие клетки глаз

Способность веществ-кандидатов устранять стареющие клетки или клетки типа стареющих клеток измеряли непосредственно следующим методом.

Клетки пигментного эпителия сетчатки (RPE) человека получали от Lonza с обозначением 194987. Клетки сначала содержали и размножали до конфлюэнтности <75% в среде для RPE, определенной в Sonoda et al., 2009, с 5% FBS и Pen/Strep в атмосфере с 3% O₂, 10% CO₂ и влажности ~95%. Клетки разделяли на три группы: облученные клетки (культивировали после облучения в течение 12 дней перед использованием), пролиферирующие нормальные клетки (культивировали при низкой плотности в течение 2 дней перед использованием) и покоящиеся клетки (культивировали до конфлюэнтности более 12 дней).

В день 0 готовили облученные клетки следующим образом. Клетки RPE покрывали 3 мл содержащего трипсин реагента TrypLE (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts) и инкубировали в течение 5 мин, пока клетки не округлялись и начинали отделяться от планшета. Клетки диспергировали, подсчитывали и доводили средой до концентрации 100000 клеток на мл. Эту суспензию клеток вносили в колбы Т175 при плотности 100000 клеток на мл и облучали при 10-15 Гр. После облучения клетки высеивали по 100 мкл в 96-луночные планшеты. В дни 1, 3, 6 и 10 среду в лунках отсасывали и заменяли свежей средой.

В день 0 готовили покоящиеся здоровые клетки следующим образом. Здоровые, не стареющие клетки RPE высвобождали из культуральной колбы с помощью трипсина, покрывали 3 мл содержащего трипсин реагента TrypLE (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts) и инкубировали в течение 5 мин, пока клетки не округлялись и начинали отделяться от планшета. Клетки диспергировали, подсчитывали и доводили средой до концентрации 100000 клеток на мл. По 100 мкл клеток высеивали в лунки 96-луночного планшета. В дни 1, 3, 6 и 10 меняли среду.

На 10-й день готовили популяцию пролиферирующих здоровых клеток следующим образом. Здоровые, не стареющие клетки RPE промывали, покрывали 3 мл TrypLE и инкубировали в течение 5 мин, пока клетки не округлялись и начинали отделяться от планшета. Клетки диспергировали, подсчитывали и доводили средой до концентрации 30000 клеток на мл. По 100 мкл клеток высеивали в лунки 96-луночного планшета.

На 12-й день сенолитические средства-кандидаты смешивали с клетками следующим образом. Готовили серию разведений в DMSO каждого исследуемого соединения в 200-кратной концентрации от требуемой конечной концентрации в 96-луночном планшете для ПЦР. Непосредственно перед использованием исходные растворы в DMSO разводили 1:200 подогретой полной средой. Из клеток в лунках отсасывали среду и добавляли по 100 мкл на лунку среды, содержащей соединение.

Сенолитические средства-кандидаты культивировали с клетками в течение 3 дней. В системе анализа используются свойства термостабильной люциферазы, обеспечивающие условия реакции, которые дают стабильный люминесцентный сигнал при одновременном ингибировании эндогенной АТФазы, высвобождаемой при лизисе клеток. По окончании культивирования планшеты вынимали из инкубатора и уравновешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, а затем в каждую лунку добавляли 100 мкл реагента CellTiter-Glo^® (Promega Corp., Madison, Wisconsin). Планшеты с клетками помещали на 30 сек на круговую качалку, а затем оставляли при комнатной температуре на 10 минут и измеряли люминесценцию. Значения люминесценции нормировали для определения % выживаемости/роста клеток и наносили на график зависимости от концентрации исследуемого соединения, а эффективность (значения IC₅₀) определяли путем построения нелинейных кривых в GraphPad Prism^®.

Результаты представлены на фиг. 8. На кривой типа концентрация-ответ для типичного исследуемого соединения представлена чувствительность выживания стареющих клеток RPE к инкубации с сенолитической молекулой. Напротив, значения IC₅₀ для пролиферирующих, не стареющих клеток были RPE выше, чем для стареющих клеток. Эти данные показывают, что сенолитические средства способны устранять стареющие клетки RPE в культуре.

Пример 6. Эффективность соединений на животной модели ишемической ретинопатии

Исследовали эффективность модельного соединения UBX1967 на мышиной модели индуцированной кислородом ретинопатии (OIR), которая является моделью in vivo ретинопатии недоношенных (ROP) и диабетической ретинопатии.

Мышат C57BL/6 и их приемных матерей CD1 подвергали воздействию среды с высоким содержанием кислорода (75% O₂) с постнатального дня 7 (P7) до P12. В день Р12 животным вводили интравитреально 1 мкл исследуемого соединения (200, 20 или 2 мкМ) в составе из 1% DMSO, 10% Tween-80, 20% PEG-400 и не возвращали их на комнатный воздух до дня Р17. Вылущивали глаза в P17 и препарировали сетчатку для окрашивания сосудов либо для кОТ-ПЦР. Для определения аваскулярных или неоваскулярных участков сетчатку распластывали и окрашивали изолектином B4 (IB4) в разведении 1:100 в 1 мМ CaCl₂. Для количественного измерения маркеров старения (напр., Cdkn2a, Cdkn1a, Il6, Vegfa) проводили кПЦР. Выделяли РНК и получали кДНК посредством обратной транскрипции, которую использовали для кОТ-ПЦР выбранных транскриптов.

Из фиг. 9A и 9B видно, что интравитреальное (IVT) введение UBX1967 приводило к статистически значимому улучшению по степени неоваскуляризации и облитерации сосудов при всех уровнях дозы.

На фиг. 10A и 10B представлено относительное содержание некоторых транскриптов, связанных со старением (p16, pai1) и заболеванием у человека (vegf). Обработка UBX1967 приводила к снижению p16, pai1 и vegf на 58, 35 и 24%, соответственно. Активность связанной со старением β-галактозидазы (SA-βGal) снижалась на 17% после введения UBX1967.

Эти результаты показывают, что однократная глазная инъекция UBX1967 может функционально ингибировать патогенный ангиогенез и способствовать восстановлению сосудов на этой ключевой модели заболевания OIR. Мы полагаем, что эффективность UBX1967 на модели OIR обусловлена устранением стареющих клеток и связанных с ними SASP, которые усиливают старение в клетках сетчатки и способствуют неоваскуляризации сосудов сетчатки.

Пример 7. Эффективность соединений на животной модели диабетической ретинопатии

Исследовали эффективность UBX1967 на мышиной модели диабетической ретинопатии при однократном введении стрептозотоцина (STZ).

6-7 недельных мышей C57BL/6J взвешивали и измеряли исходный уровень глюкозы в крови (Accu-Chek, Roche). Мышам внутрибрюшинно вводили STZ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) в течение 5 дней подряд по 55 мг/кг. Подобранным по возрасту контролям вводили только буфер. Уровень глюкозы в крови измеряли снова через неделю после последней инъекции STZ и мышей считали диабетиками, если уровень глюкозы не натощак был выше 17 мМ (300 мг/дл). Обработанным STZ диабетическим мышам C57BL/6J вводили интравитреально 1 мкл UBX1967 (2 мкМ или 20 мкМ в виде суспензии в 0,015% полисорбата-80, 0,2% фосфата натрия, 0,75% хлорида натрия, pH 7,2) через 8 и 9 недель после введения STZ. Через 10 недель после обработки STZ проводили анализ проникновения красителя Evans Blue в сетчатку.

На фиг. 11A и 11B представлены предварительные результаты для этой методики. Сосудистая утечка в сетчатке и сосудистой оболочке после интравитреального (IVT) введения UBX1967 улучшалась по проницаемости сосудов при обоих уровнях дозы.

Пример 8. Эффективность соединений на животной модели глаукомы

Введение блеомицина, повреждающего ДНК вещества, в переднюю камеру глаз мышей или кроликов приводит к старению клеток, которое определяется по индукции транскрипта p16 в трабекулярной сети.

Чтобы индуцировать стареющий фенотип в трабекулярной сети in vivo, мышам C57BL/6 (в возрасте 8-10 недель) интракамерально вводили 2 мкл блеомицина сульфата по 0,0075 ед. Белым кроликам породы New Zealand интракамерально вводили 30 мкл блеомицина сульфата по 0,0075 ед. Через 14 дней после повреждения блеомицином вылущивали глаза и микропрепарировали образцы, обогащенные TM. Для определения изменений в стареющих клетках выделяли РНК из TM и проводили анализ кПЦР для оценки влияния блеомицина на уровень мРНК p16.

На фиг. 12A и 12B показано повышение относительной экспрессии p16 через 14 дней после интракамерального (IC) введения блеомицина в правый (OD) глаз по сравнению с получавшим PBS левым (OS) глазом исследуемых животных. Эта модель также может применяться для оценки того, будет ли исследуемое соединение фармакологически способно снижать или ослаблять повышенное внутриглазное давление, которое является признаком первичной открытоугольной глаукомы (POAG).

Пример 9. Стареющие клетки в трабекулярной сети образцов ткани от людей с POAG

Чтобы получить доказательства присутствия стареющих клеток у больных людей с первичной открытоугольной глаукомой (POAG), проводили окрашивание образцов ткани, полученных от больных пациентов, на p16, маркер стареющих клеток.

Донорские глазные яблоки получали проспективно из глазных банков и сразу же помещали в реагент Дэвидсона для фиксации как минимум на 48 часов. После фиксации раствор заменяли на 70% этанол. Затем ткань помещали в гистологические кассеты и обрабатывали для пропитки и заливки парафином. Парафиновые блоки монтировали на микротоме и делали срезы толщиной 5-9 мкм. Срезы ткани помещали в водяную баню на 45°C и захватывали срезы на предметные стекла Superfrost Plus™ для микроскопа, отводя излишки воды салфеткой Kimwipe™. Затем предметные стекла ставили вертикально на 30 мин для сушки при комнатной температуре, после чего инкубировали в течение ночи в инкубаторе при 37°C. Стекла пропекали 15-20 мин при 60°C, а затем оставляли остывать до комнатной температуры.

Предметные стекла депарафинировали путем инкубации в растворе BOND для депарафинизации при 70°C в течение 30 сек. Затем стекла регидратировали путем серии инкубаций при снижающихся концентрациях этанола следующим образом: два раза в 100% этаноле по 5 мин, два раза в 90% этаноле по 2 мин, два раза в 75% этаноле по 2 мин, два раза в 50% этаноле по 2 мин, а затем промывали водой в течение 4 мин. Затем стекла дважды промывали трис-буферным солевым раствором с добавлением 0,1% Triton-X100 (TBST). Проводили восстановление антигена путем инкубации в растворе BOND ER1 (натрий-цитратный буфер, рН 6,0) при 95°C в течение 20 мин. Предметные стекла инкубировали в 3% H₂O₂ в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего дважды промывали в TBST.

Предметные стекла инкубировали 30 мин при комнатной температуре с первичным антителом к p16 (Roche, #9517), разведенным 1:2 в TBST. После инкубации с первичным антителом стекла дважды промывали TBST перед инкубацией со вторичным кроличьим антителом против мыши в течение 20 мин при комнатной температуре. Стекла дважды промывали TBST и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре с конъюгированным с HRP вторичным антителом. После инкубации с антителами стекла дважды промывали TBST, а для обнаружения использовали хромоген AEC, приготовленный по методике производителя, и проявляли окраску в течение примерно 20 мин. Затем стекла трижды промывали водой, после чего инкубировали в гематоксилине Харриса в течение 20 сек. Предметные стекла тщательно промывали водой, накладывали на них покровные стекла поверх заливочной среды Vectashield™ (Vector Labs, Burlingame, CA) и оставляли сушиться до получения снимков.

На фиг. 13A и 13B представлены репрезентативные снимки иммуногистохимии p16 на глазной ткани человека, полученной от доноров с диагнозом POAG. Клетки, положительные по экспрессии p16, появляются с темной окраской клеток в трабекулярной сети и вокруг неё (обведены кружками).

Пример 10. Стареющие клетки в ткани от людей с возрастной дегенерацией желтого пятна (AMD)

Чтобы получить доказательства присутствия стареющих клеток при AMD, проводили окрашивание образцов ткани от больных пациентов на p16.

Донорские глазные яблоки получали проспективно из глазных банков и сразу же помещали в реагент Дэвидсона для фиксации как минимум на 48 часов. После фиксации раствор заменяли на 70% этанол. Затем ткань помещали в гистологические кассеты и обрабатывали для пропитки и заливки парафином. Парафиновые блоки монтировали на микротоме и делали срезы толщиной 5-9 мкм. Срезы ткани помещали в водяную баню на 45°C и захватывали срезы на предметные стекла Superfrost Plus™ для микроскопа, отводя излишки воды салфеткой Kimwipe. Затем предметные стекла ставили вертикально на 30 мин для сушки при комнатной температуре, после чего инкубировали в течение ночи в инкубаторе при 37°C. Стекла пропекали 15-20 мин при 60°C, а затем давали остывать до комнатной температуры. Стекла депарафинировали с помощью ксилола или заменителя ксилола (напр., Histoclear™) в течение 4 мин, повторяя в общей сложности 3 инкубации. Затем стекла регидратировали путем серии инкубаций при снижающихся концентрациях этанола следующим образом: два раза в 100% этаноле по 5 мин, два раза в 90% этаноле по 2 мин, два раза в 75% этаноле по 2 мин, два раза в 50% этаноле по 2 мин, а затем промывали водой в течение 4 мин.

Проводили восстановление антигена путем инкубации в кислом натрий-цитратном буфере при 120°C в течение 3 мин (или при 95°C в течение 20 мин) в пароварке или скороварке. Предметные стекла охлаждали до комнатной температуры в течение 15 мин, а затем дважды промывали трис-буферным солевым раствором с добавлением 0,1% Triton-X100 (TBST) по 2 мин. Стекла дважды промывали TBST по 5 мин, а затем блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре в TBST, содержащем 5% нормальной сыворотки из того вида, из которого происходит вторичное антитело. После блокирования стекла осушали, а избыток раствора вытирали. Стекла инкубировали в течение ночи при 4°C (или в течение 2 ч при комнатной температуре) с первичным антителом к р16, разведенным 1:2 в TBST. После инкубации с первичным антителом стекла дважды промывали TBST по 5 мин, а затем обрабатывали 3% H₂O₂ в TBST в течение 15 мин. Затем стекла дважды промывали TBST по 5 мин перед инкубацией с вторичным антителом. Стекла инкубировали 1 час при комнатной температуре с конъюгированным с HRP вторичным антителом. После инкубации с антителами стекла трижды промывали TBST по 5 мин. Для обнаружения использовали хромоген AEC, приготовленный по методике производителя, и проявляли окраску в течение примерно 20 мин. Затем стекла промывали водой 5 мин, после чего проводили контрастное окрашивание гематоксилином. На предметные стекла накладывали покровные стекла поверх заливочной среды Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA) и оставляли сушиться до получения снимков.

На фиг. 14A и 14B представлены репрезентативные снимки иммуногистохимии p16 на глазной ткани человека, полученной от доноров с диагнозом AMD. Клетки, положительные по экспрессии p16, появляются с темной окраской в зонах с явной патологией заболевания (обведены кружками).

Пример 11. Клиническая оценка

В этом примере представлен план доклинических или клинических испытаний по оценке безопасности и эффективности сенолитических средств для лечения заболеваний глаз.

Испытуемым субъектам вводится сенолитик по стандартной методике интравитреального введения (ITV) с промыванием глаз и обкладыванием их салфетками обычным стерильным способом после измерения ВГД перед инъекцией. Применяется местная анестезия и ставится расширитель век для адекватной обработки. Лечащим врачом выбирается квадрант для инъекции и измеряется место для инъекции на расстоянии 3-4 мм позади от корнеосклерального лимба. Для введения от 0,05 до 0,1 мл соединения используется игла 28-32 калибра. По завершении процедуры инъекции удаляется расширитель век. В зависимости от характера заболевания, потенциально подходящие способы внутри- или пери-окулярного введения включают интравитреальные, интракамеральные, задние юкстасклеральные, субконъюнктивальные или супрахориоидальные инъекции.

После обработки проводится оценка субъектов для определения того, улучшаются ли симптомы или признаки глазного заболевания по сравнению с субъектами в контрольной группе с помощью общедоступных тестов структуры и функции глаз (см. выше).

Пример 12. Комбинированная терапия

Этот пример иллюстрирует клиническое применение сенолитического средства в комбинации со стандартной терапией против VEGF для лечения связанного с VEGF заболевания глаз.

В исследование вовлекаются субъекты с влажной AMD, которые уже проходят терапию против VEGF либо им нужно начинать терапию против VEGF. Первое введение сенолитического соединения проводится в тот же день, что и одно из регулярных введений препарата против VEGF. Не ожидается никаких противопоказаний к применению офтальмологической терапии в сочетании с сенолитическим соединением. Сначала вводят сенолитическое средство посредством стандартного интравитреального (ITV) введения. Через 15 и 30 мин после введения измеряют внутриглазное давление (ВГД). После того, как ВГД нормализуется до уровня перед инъекцией, вводится препарат против VEGF (к примеру, афлиберцепт 2,0 мг в 0,05 мл). Глаз промывают и обкладывают салфетками обычным стерильным способом, так как это совершенно другая стерильная процедура, чем первая инъекция. Проводится местная анестезия и ставится расширитель век для адекватной обработки. Лечащим врачом выбирается квадрант для инъекции и измеряется место для инъекции на расстоянии 3-4 мм позади от корнеосклерального лимба. Для введения 0,05 мл соединения используется игла 28-32 калибра. По завершении процедуры инъекции удаляется расширитель век. Через 5, 15 и 30 мин после второй ITV-инъекции измеряют ВГД.

Оценка безопасности и эффективности комбинированной терапии проводится следующим образом. Сразу же после инъекции обследуют глаз на предмет какой-либо острой потери зрения или повышения внутриглазного давления. Через 30 минут после инъекции, если зрение и ВГД стабильны, пациента выписывают из клиники со стандартными рекомендациями от лечащего врача после процедуры. Пациенту рекомендуется немедленно обратиться при возникновении любых изменений зрения либо появлении боли или покраснения в подвергавшемся инъекции глазу.

При данном конкретном заболевании влажной AMD назначается последующее наблюдение в пределах от 1 недели до 1 месяца от лечения. Последующее наблюдение включает оценку остроты зрения и ВГД, мониторинг любых улучшений или ухудшений после проведения терапии. Проводится обследование переднего и заднего сегмента глаза и стандартное вспомогательное тестирование, включая, без ограничения, фотографию, внутривенную флуоресцеиновую ангиографию и оптическую когерентную томографию (ОКТ).

Реакция на сенолитик документируется с использованием этой описанной выше комбинации клинического обследования, функционального и структурного тестирования. На основе реакции пациента планируется дальнейшее наблюдение. Если сенолитик вводился в сочетании со средством против VEGF, то врач продолжает следовать графику посещения и проведения лечения, связанному с этим средством.

Библиография

Acosta JC et al. 2013. A Complex Secretory Program Orchestrated by the Inflammasome Controls Paracrine Senescence. Nature Cell Biology 15 (8). Nature Publishing Group: 978-90.

Moreno Menghini, Jacque L. Duncan.2014. Diagnosis and Complementary Examinations in Cell-Based Therapy for Retinal Degenerative Disease. Casaroli-Marano RP, Zarbin MA (eds): Cell-Based Therapy for Retinal Degenerative Disease. Dev Ophthalmol. Basel, Karger, 2014, vol. 53, pp 53-69.

Stein JD, Challa P. 2007. Mechanisms of action and efficacy of argon laser trabeculoplasty and selective laser trabeculoplasty. Curr Opin Ophthalmol. Mar; 18(2):140-5.

American Academy of Ophthalmology Retina/Vitreous Panel. 2014. Preferred Practice Pattern Guidelines. Posterior Vitreous Detachment, Retinal Breaks and Lattice Degeneration. San Francisco, CA.

Bhisitkul RB et al. 2015. Macular atrophy progression and 7-year vision outcomes in subjects from the ANCHOR, MARINA, and HORIZON studies: the SEVEN-UP study. Am J Ophthalmol. May; 159(5): 915-24.e2.

Levin L. 2005. Pathophysiology of the progressive optic neuropathy of glaucoma. Ophth Clin N Am. 18: 355-364.

Kozak I, Luttrull JK. 2015. Modern retinal laser therapy. Saudi J Ophthalmol. Apr-Jun; 29(2): 137-146.

Damji KF et al. 2006. Selective laser trabeculoplasty versus argon laser trabeculoplasty: results from a 1 year randomized clinical trial. Br J Ophthalmol. 90:1490-94.

Maguire MG et al. 2016. Five-year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the comparison of age-related macular degeneration treatments trials. Ophthalmology. Aug; 123(8):1751-6.

Holz FG et al. 2015. Multi-country real-life experience of anti-vascular endothelial growth factor therapy for wet age-related macular degeneration. Br J Ophthalmol. 99:220-6.

Kumar S and Fu Y. 2014. Age-related macular Degeneration: A Complex Pathology. Austin J Genet Genomic Res. 1(1): 5.

Scott A and Fruttiger M. 2010. Oxygen-induced retinopathy: a model for vascular pathology in the retina. Eye. 24, 416-421.

Oubaha M, Sapieha P et al. 2016. Senescence-associated secretory phenotype contributes to pathological angiogenesis in retinopathy. Sci Transl Med. Oct 26; 8(362): 362ra144.

Ito YA et al. 2016. A magnetic microbead occlusion model to induce ocular hypertension-dependent glaucoma in mice. J Vis Exp. Mar 23;(109).

Almasieh M, Levin LA. 2017. Neuroprotection in Glaucoma: Animal Models and Clinical Trials. Annu Rev Vis Sci. Sep 15; 3:91-120. 061422. Epub 2017 Jul 21.

Zhou T, et al. 1998. Development of a multiple-drug delivery implant for intraocular management of proliferative vitreoretinopathy. Journal of Controlled Release 55: 281-295, 1998.

Osborne NN et al. Retinal ischemia: mechanisms of damage and potential therapeutic strategies. Prog Retin Eye Res. Jan; 23(1):91-147.

Ucuzian AA et al. 2010. Molecular Mediators of Angiogenesis. J Burn Care Res. 31(1):158.

Campochiaro PA. 2015. Molecular pathogenesis of retinal and choroidal vascular diseases. Prog Retin Eye Res. Nov; 49:67-81.

Choi J1, Kook MS. 2015. Systemic and Ocular Hemodynamic Risk Factors in Glaucoma. Biomed Res Int.:141905.

Wang H et al. The nerve growth factor signaling and its potential as therapeutic target for glaucoma. Biomed Res Int.:759473. Epub 2014 Aug 31.

Caprioli, J. 2013. Glaucoma: A Disease of Early Cellular Senescence. Invest Ophthalmol Vis Sci. Dec 13; 54(14): ORSF 60-7.

Lutty GA. 2013. Effects of Diabetes on the Eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. Dec 13; 54(14): ORSF 81-7.

Committee for the Classification of Retinopathy of Prematurity, 1984. Arch Ophthalmol. 102(8): 1130-1134.

Skowronska-Krawczyk D et al. Upregulation Mediated by SIX6 Defines Retinal Ganglion Cell Pathogenesis in Glaucoma. Mol Cell. Sep 17; 59(6):931-40.

Li Lu, Zhao Y, Zhang H. 2017. P16INK4a upregulation mediated by TBK1 induces retinal ganglion cell senescence in ischemic injury. Cell Death Dis. Apr 20; 8(4):e2752

Matthaei M et al. 2014. Transcript profile of cellular senescence-related genes in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Exp Eye Res. Dec;129:13-17.

Man PYW et al. 2002. Leber Hereditary Optic Neuropathy. J Med Genet. 39:162-169.

Dryja TP. 1986. 235: Retinitis Pigmentosa and Stationary Night Blindness. The Online Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. DOI: 10.1036/ommbid.275.

Kim JA et al. 2016. Enhanced Viral Replication by Cellular Replicative Senescence. Immune Netw. Oct; 16(5):286-295.

* * * * *

Несколько гипотез, представленных в данном описании, обеспечивают предпосылки, при помощи которых читатель может понять изобретение. Эти предпосылки предназначаются для сведения читателя и для понимания читателем. Практика изобретения не требует детального понимания или применения гипотез. Если не указано иначе, признаки гипотез, представленных в данном описании, не ограничивают применение или практику заявленного изобретения. Например, за исключением случаев, когда явным образом требуется устранение стареющих клеток, соединения по изобретению могут применяться для лечения описанных заболеваний независимо от их влияния на стареющие клетки. Хотя многие заболевания глаз, приведенные в данном описании, встречаются преимущественно у пожилых пациентов, изобретение может практиковаться на пациентах любого возраста с указанным заболеванием, если прямо не указано или не требуется иначе.

Хотя изобретение было описано со ссылкой на конкретные примеры и иллюстрации, можно вносить изменения и подставлять эквиваленты для адаптации к конкретному контексту или предназначению в качестве рутинного развития и оптимизации и в рамках компетенции рядовых специалистов в данной области, тем самым получая преимущества изобретения, не выходя за рамки формулы изобретения.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для ингибирования патологического ангиогенеза в глазу у нуждающегося в этом субъекта. Для ингибирования патологического ангиогенеза в глазу субъекта осуществляют введение терапевтически эффективной дозировки фармацевтической композиции, содержащей нижеследующие соединения или их фармацевтически приемлемые соли. Использование изобретения обеспечивает эффективное подавление патогенного ангиогенеза в глазу за счет подобранного дозового профиля и высокой специфичности. 6 з.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл., 12 пр.

1. Способ ингибирования патологического ангиогенеза в глазу у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение терапевтически эффективной дозировки фармацевтической композиции, содержащей соединение, выбранное из следующих:

его фосфорилированные формы и фармацевтически приемлемые соли; и

и его фармацевтически приемлемые соли.

2. Способ по п. 1, в котором соединение выбрано из следующих:

его фосфорилированные формы и фармацевтически приемлемые соли.

3. Способ по п. 1, в котором соединение выбрано из следующих:

и его фармацевтически приемлемые соли.

4. Способ по п. 2 или 3, в котором фармацевтическая композиция вводится интравитреально.

5. Способ по п. 4, в котором терапевтически эффективная дозировка вводится в виде однократной интравитреальной дозировки.

6. Способ по п. 1, в котором патологический ангиогенез в глазу у субъекта представляет собой неоваскуляризацию сетчатки.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором у субъекта имеет место диабетическая ретинопатия.