Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации Российский патент 2024 года по МПК C12N1/00 G01N33/48 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к созданию диагностического набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации при разработке и производстве средств диагностики.

Грипп птиц - высококонтагиозное вирусное заболевание, которое вызывает сезонные эпизоотии и панзоотии с различным уровнем смертности в зависимости от степени патогенности возбудителей. Вирусы гриппа птиц (ВГП) типа А циркулируют среди диких водоплавающих птиц, преимущественно из отряда гусеобразных, которые являются природным резервуаром данного патогена [1].

Возбудитель гриппа птиц - РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Ортомиксовирусов (Orthomyxoviridae) роду Alphainfluenzavirus, к виду Influenza A virus (International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). По внешнему виду вирион представляет из себя спиральный нуклеокапсид, заключенный в липопротеидную оболочку. Вирусная РНК имеет сегментированное строение, что способствует высокой степени реассортации данного вируса. Такой процесс называется антигенный сдвиг (antigenic shift) и является основной причиной появления новых подтипов данного вируса [2, 3].

Классификация вирусов гриппа основана на антигенных свойствах поверхностных гликопротеинов, гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). На данный момент у диких и домашних птиц выделено шестнадцать подтипов НА (Н1-Н16) и девять подтипов NA (N1-N9). Репликация вируса в основном происходит в желудочно-кишечном тракте, что приводит к выделению фекалий, содержащих вирионы, поэтому фекально-оральный способ считается основным путем передачи инфекции среди диких птиц [2].

Инфекционный процесс у диких водоплавающих птиц в основном протекает в бессимптомной форме, это объясняется тем, что данная форма течения заболевания вызвана низкопатогенными вирусами гриппа птиц. Однако вирусы гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 могут эволюционировать в высокопатогенные формы данного вируса, который, при попадании в частные или коммерческие птицеводческие хозяйства, может привести к 100% смертности всего поголовья. Случаи выявления данных подтипов подлежат обязательному уведомлению во Всемирную организацию здравоохранения животных (ВОЗЖ) [4].

В настоящее время на территории Евразии наблюдается распространение высокопатогенного гриппа птиц, вызванного вирусом типа А, подтипа H5N8, предком которого принято считать штамм A/Goose/Guangdong/1/96, выделенный в Китае в 1996 году. Впоследствии, распространившись по всей территории Евразии, этот штамм положил начало «Азиатской генетической линии вирусов высокопатогенного гриппа птиц». Считается, что этот подтип является одним из наиболее опасных, так как вызывает огромные экономические потери в птицеводческих хозяйств [1, 3, 6, 7].

За последние 15 лет в странах Азии, Европы и Северной Америке было зафиксировано более 100 вспышек высокопатогенного гриппа птиц, вызванного вирусом гриппа птиц подтипа Н7. Несмотря на то, что большая часть из них была зафиксирована в Северной Америке, вирусы H7N9 и H7N7 стали причиной гибели более 2,5 млн. птиц в странах Европы и Азии. Эти факты указывают на то, что вирусы Н7 активно циркулируют в природе и продолжают представлять угрозу для мировой птицеводческой отрасли [5].

Способность данных вирусов обмениваться генетическим материалом повышает вероятность эволюции и появления вирусов с неизвестными свойствами, возможно, с высоким пандемическим потенциалом.

В связи с высокими экономическими потерями, а также возможностью инфицирования людей вирусом гриппа птиц подтипа Н5 и Н7, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) уделяет этому пристальное внимание, проводит работу по антигенной и генетической характеристике вируса для разработки новых средств специфической лабораторной диагностики [8].

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) является «золотым стандартом» серологической диагностики гриппа птиц. Данный метод обладает высокой чувствительностью и позволяет как определить уровень антител в сыворотке крови, так и идентифицировать подтип гемагглютинирующего вирусного агента. Кроме того, реакция требует минимального количества оборудования и может быть проведена в полевых условиях [5].

В Российской Федерации в настоящее время известны наборы для серологической диагностики гриппа птиц.

Известен набор для выявления антител к вирусу гриппа типа А иммуноферментным методом «ГРИПП А СЕРОТЕСТ» [9]. Способ заключается в связывании специфических антител к вирусу гриппа с вирусным антигеном, сорбированным на дне лунок полистиролового планшета, последующим выявлением количества связавшихся антител с использованием конъюгата - антивидовых антител и ферментной метки. Данный метод характеризуется очень высокой чувствительность, что негативно сказывается на специфичности.

Известен способ выявления антител к гемагглютинину вируса гриппа А, позволяет обеспечить возможность детекции антител к гемагглютинину вируса гриппа птиц у разных видов птиц и животных с использованием методов инструментального учета реакции [10].

Известна диагностическая тест-система для выявления вируса гриппа птиц A/H5N1 при проведении иммуноферментного анализа (ИФА), на твердофазном носителе с использованием пероксидазного конъюгата [11].

К недостаткам можно отнести необходимость наличия дорогостоящего оборудования (ИФА-анализатор) и строгую специфичность используемого конъюгата, из за чего в реакции тестируются только сыворотки от определенных видов птиц.

Известен набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации, производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов», с помощью которого можно исследовать сыворотки крови птиц на 15 подтипов по гемагглютинину. В его состав входят:

- инактивированные референтные штаммы вируса гриппа птиц с подтипами гемагглютинина HI-HI 5;

- моноспецифические гипериммунные сыворотки к 15 серологическим вариантам вируса гриппа птиц (HI-HI5);

- нормальная сыворотка, не содержащая антител к вирусу гриппа птиц [12].

Несмотря на большое разнообразия подтипов гемагглютинина и нейраминидазы, представленных в данном наборе, для производства используются штаммы ВГП полученные до 2010 года.

Известен набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации (организация-производитель: ФГБУ «ВНИИЗЖ»), который содержит иммуноспецифические и неспецифические компоненты [13].

Известен Набор диагностический «РТГА-ВПГ-СтавБио», для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации, производства ФКП «Ставропольская биофабрика». Набор предназначен для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации при осуществлении серологического мониторинга распространения вируса в популяциях, для оценки эффективности иммунизации поголовья, с целью ретроспективной диагностики гриппа птиц у всех видов птиц [14].

Недостатком наборов является возможность выявлять антитела к вирусу гриппа птиц только подтипа Н5, а также использование неактуального штамма при производстве набора.

Известен Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в реакции торможения гемагглютинации. Недостаток данного набора в том, что он выявляет антитела только к вирусу гриппу птиц подтипа Н9 [15].

Известна Тест-система для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом полимеразной цепной реакции (ПНР), производства ООО «Ветбиохим». Тест-система предназначена для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в образцах сывороток крови и патологического материала от птиц и млекопитающих и в инфицированных культурах клеток [16].

Известен Набор для выявления вируса гриппа птиц А с типированием «Н5 - Н7 - Н9 - ИДС» (Influenza virus а), производства компании IDS™. Позволяет выявлять и дифференцировать РНК вируса гриппа птиц А субтипов Н5, Н7, Н9 в биологических пробах методом ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентной схемой детекции в присутствии внутреннего контрольного образца этапа выделения [17].

Известна Тест-система ПЦР РВ Грипп А-Н5/Н7/Н9 - ЩБК, для выявления РНК вируса гриппа А субтипов Н5/Н7/Н9 в биологическом материале методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени [18].

Известен набор реагентов, предназначенный для качественного определения и дифференциации подтипов Н5, Н7 и Н9 вируса гриппа А (Influenza virus А) методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» - «АмплиПрайм® Грипп Н5 / Н7 / Н9», производства «НекстБио». Набор предназначен для качественного определения и дифференциации подтипов Н5, Н7 и Н9 вируса гриппа A (Influenza virus А) в биологическом материале, полученном от птиц (помет, мазки из клоаки, ротоглотки, носоглотки и трахеи, тканевой (аутопсийный) материал трахеи и легких, селезенки, головного мозга, воздухоносных мешков, кишечника, сердца, почек, яйца, аллантоисная жидкость эмбрионов кур), в пробах мяса, продуктах переработки, субпродуктах, мазках с поверхности мяса и субпродуктов, кормах методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» [19].

Недостатком является необходимость наличия дорогостоящего оборудования и высокая квалификация специалистов при постановке ПЦР.

Наиболее близким по технической сущности и по совокупности существенных признаков к заявляемому и взятым за прототип является набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипов Н5 и Н7, который разработан в ФГБУ «ВНИИЗЖ». Недостаток данного набора заключается в том, что в прилагаемых документах не прописаны наименования штаммов, на которые получены специфические компоненты [20].

Как представлено выше, существует множество наборов для выявления антител к вирусу гриппа птиц, для типирования изолятов, выделенных при вспышках заболевания гриппа птиц. Учитывая высокую генетическую изменчивость вирусов гриппа птиц, для диагностики данного заболевания необходимо использовать более актуальные штаммы.

Целью изобретения является разработка диагностического набора на основе актуальных штаммов вируса гриппа птиц, позволяющего выявлять антитела к НА вируса гриппа птиц подтипа Н5 и Н7 и идентифицировать подтип гемагглютинина выделенного вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации.

Поставленная цель достигается тем, что используемые в диагностическом наборе специфические антигены вируса гриппа птиц получены из штаммов «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и «A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7. Специфические гомологичные сыворотки получены на штаммы вируса гриппа птиц «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и «A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7. Реакция торможения гемагглютинации основана на том, что при контакте иммунной сыворотки с гомологичным вирусом и специфической гипериммунной сыворотки с антигеном выделенного вируса образуется комплекс антиген-антитело, в результате чего, вирус теряет способность гемагглютинировать эритроциты крови.

Технический результат от изобретения заключается в разработке современного, высокоспецифичного диагностического набора, предназначенного для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации с применением штаммов вируса гриппа птиц «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и «A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7.

В состав предлагаемого набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации входят:

1. Инактивированный антиген штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц подтипа Н5, лиофилизированный, объем 2,0 см³ - 8 флаконов;

2. Инактивированный антиген штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц подтипа Н7, лиофилизированный, объем 2,0 см³ - 8 флаконов;

3. Гипериммунная сыворотка крови кур к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 (положительный контроль Н5), лиофилизированная, объем 1,0 см³ - 2 флакона;

4. Гипериммунная сыворотка крови кур к вирусу гриппа птиц подтипа Н7 (положительный контроль Н7), лиофилизированная, объем 1,0 см³ - 2 флакона;

5. Сыворотка крови кур нормальная (отрицательный контроль), не содержащая антител к вирусу гриппа птиц, лиофилизированная, объем 1,0 см³ - 4 флакона.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях.

Фиг. 1 - Схема РТГА.

Фиг. 2 - Интерпретация результатов реакции.

Фиг. 3 - Дендрограмма, видовая принадлежность штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» методом секвенирования.

Фиг. 4 - Дендрограмма, видовая принадлежность штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» методом секвенирования.

Разработанный диагностический набор на основе актуальных штаммов вируса гриппа птиц («А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2») подтипа Н5 и («А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2») подтипа Н7, позволяющего выявлять и определять титр антител к гемагглютинину вируса гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 и идентифицировать изоляты вируса гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации основан на специфическом взаимодействии антител, содержащихся в исследуемой сыворотке крови птиц, с антигеном вируса гриппа птиц подтипов Н5 и Н7, что приводит к потере его агглютинирующих свойств и визуально проявляется оседанием или склеиванием эритроцитов. Схема РТГА представлена на фиг. 1.

РТГА для выявления антител проводят в три этапа:

- определение гемагглютинирующих титров антигенов в реакции гемагглютинации;

- подготовка рабочей дозы антигенов;

- выявление специфических антител в пробах сыворотки крови.

РТГА для идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента проводят аналогичным образом, за исключением того, что в качестве антигена выступает выделенный изолят вируса, чьи поверхностные белки обладают гемагглютинирующими свойствами.

Сущность реакции гемагглютинации заключается в специфических свойствах гемагглютинина склеивать эритроциты чувствительного животного. Реакцию оценивают положительно при оседании эритроцитов в виде «зонтика», отрицательно - в виде «пуговки» при отсутствии спонтанной агглютинации в контроле. За титр антигена принимают его наибольшее разведение, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов в виде «зонтика», что соответствует 1 гемагглютинирующей единице (1 ГАЕ). Гемагглютинирующая активность представленных антигенов должна быть не ниже 1:128. Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в отрицательном контроле.

Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке (лунке) смешивают равные объемы сыворотки крови и рабочей дозы вируса (антигена) и после экспозиции (30-60 мин) добавляют эритроциты соответствующего вида животного. Рабочую дозу антигена (4 ГАЕ) готовят из гемагглютинирующего титра, установленного в реакции гемагглютинации. Если рабочая доза подготовлена правильно, то при постановки реакции гемагглютинации, как для выявления антител, так и для типирования изолятов вируса гриппа птиц, результаты должны быть следующими:

1) В первой и второй лунках должна быть полная агглютинация («зонтик»);

2) В третьей лунке, содержащей 1/2 ГАЕ - частичная («несформировавшаяся пуговка»);

3) В четвертой - отсутствие агглютинации («пуговка») (Фиг. 2).

Рабочую дозу антигенов готовят непосредственно в день постановки реакции с обязательным контролем 4 ГАЕ. Корректирование рабочей дозы (увеличение или уменьшение) проводят путем добавления антигена или фосфатно-буферного раствора (ФБР) с обязательным повторным контролем 4 ГАЕ.

Для выявления специфических антител в пробах сыворотки крови от птиц во все лунки планшета полимерного для иммунологических реакций (круглодонного) вносят ФБР в объеме 0,025 см³ или 0,050 см³. Затем в первую лунку горизонтального ряда добавляют равный объем испытуемой сыворотки, трижды пипетируют и готовят ряд последовательных двукратных разведений с 1:2 до 1:4096.

После этого во все лунки вносят рабочее разведение антигена в объеме 0,025 см³ или 0,050 см³, осторожно встряхивают и после 30 минут контакта при температуре 18-25°С в каждую лунку добавляют 0,025 см³ или 0,050 см³ 1% суспензии эритроцитов. Планшеты аккуратно встряхивают и оставляют при температуре 18-25°С на 30-60 минут.

Одновременно ставят контроли реакции:

- на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов и определение времени учета реакции. В две-три лунки планшета с объемом ФБР 0,025 см³ или 0,050 см³ добавить по 0,025 см³ или 0,050 см³ 1% суспензии эритроцитов. Спонтанная агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.

- на отсутствие изоагглютинации сыворотки. В лунку планшета вносят 0,025 см³ или 0,050 см³ ФБР, добавляют равный объем сыворотки и 1% суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов должна отсутствовать. В случае проявления изоагглютинации к 0,050 см³ сыворотки добавить 0,025 см³ осадка отмытых эритроцитов, тщательно встряхивают и выдерживают не менее 30 минут при 18-25°С. Затем эритроциты осаждают центрифугированием при 1500 об/мин (800 g) в течение 3-5 минут. При данном исходе реакции необходимо отобрать сыворотку и использовать для повторной постановки реакции.

- контроль активности положительной и отрицательной сывороток крови. В лунки одного ряда планшета вносят по 0,025 см³ или 0,050 см³ ФБР. Затем в первые лунки добавляют равные объемы специфической и нормальной сыворотки, трижды пипетируют и готовят последовательные двукратные разведения с 1:2 до 1:4096. После этого в лунки вносят рабочую дозу антигена в выбранном объеме для постановки реакции, осторожно встряхивают и оставляют для контакта в течение 30 минут при температуре 18-25°С, после чего в каждую лунку добавляют по 0,025 см³ или 0,050 см³ 1%-ной суспензии эритроцитов. Контрольная положительная сыворотка должна тормозить гемагглютинирующую активность 4 ГАЕ антигена в титре 1:128 плюс или минус одно разведение. Нормальная сыворотка должна тормозить гемагглютинирующую активность 4 ГАЕ антигена в титре, меньшем, чем 1:4.

Учет результатов реакции проводят визуально после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (в виде «пуговки»). Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, в котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов антигеном вируса гриппа птиц.

Исследуемая сыворотка оценивается положительно, если она содержит специфические к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 или Н7 антитела в титре 1:16 (4,0 log₂) и выше.

При идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в РТГА реакция считается качественной и не учитывает титры антител. Изолят вируса гриппа птиц относят к подтипу Н5 или Н7 при визуальной оценке результатов - полная агглютинация, эритроциты выпадают на дно лунки в виде «пуговки».

Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации предназначен для:

- контроля за распространением гриппа птиц в популяциях сельскохозяйственных, синантропных, диких и экзотических птиц;

- оценки эффективности иммунизации поголовья птиц против данного заболевания;

- ретроспективной диагностики гриппа птиц по приросту уровня специфических антител;

- типирования изолятов вируса гриппа птиц.

С использованием данного диагностического набора проведены исследования референтных и испытуемых полевых сывороток крови, отобранных от диких и домашних сельскохозяйственных птиц; проведено типирование полевых изолятов вируса гриппа птиц, выделенных из патологического материала от больной птицы: A/chicken/Ryazan/1245-1/22, A/chicken/Krasnodar/208/22, A/shelduck/Kalmykia/1814/21.

Исследование активности и специфичности компонентов набора с сыворотками крови кур, содержащими антитела к вирусу гриппа птиц типа А, подтипов Н5 и Н7, и антиген вируса гриппа птиц типа А, подтипов Н5 и Н7 показало положительный результат. Исследовании с гетерологичными и нормальными сыворотками показали отрицательные результаты.

Проверка стабильности компонентов набора (по воспроизводимости результатов исследований, проведенных в двух повторностях) показала воспроизводимость полученных результатов.

Диагностический набор рассчитан на проведение 1600 исследований сывороток крови и изолятов вируса гриппа птиц. Срок годности набора 12 месяцев от даты производства при хранении и транспортировании в защищенном от света месте при температуре от 2°С до 8°С.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «А/duck/Vladimir/l 121/21 H5N2» подтипа Н5 вируса гриппа птиц, был выделен от дикой утки, убитой в окрестностях коммуны Леньяро, Италия. Депонирован в 2021 году во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №343 - деп / 21-4 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7 вируса гриппа птиц, был выделен от курицы, убитой в окрестностях коммуны Леньяро, Италия. Депонирован в 2021 г. во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №345 - деп /21-6 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Морфологические признаки

Штаммы «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7 являются возбудителями гриппа птиц Influenza A virus, относящиеся к роду Alphainfluenzavirus, семейству Orthomyxoviridae. Принадлежность штаммов вируса гриппа к роду определяется консервативными элементами генома, задающими антигенные характеристики нуклеокапсидов.

Вирионы вируса гриппа - оболочечные, плеоморфные. Диаметр сфероподобных частиц около 80-120 нм; нитевидные частицы около 17 нм в диаметре, длиной 250 нм и более. На поверхности вириона находятся шипообразные выступы (до 14 нм), образованные гомотримерами НА. В промежутках между кластерами НА у вирусов типа А размещаются молекулы NA.

Вирусная РНК состоит из 8 сегментов и кодирует 11 белков вируса. Вирусная РНК упакована белком нуклеопротеином (NP) в нуклеокапсид.

Видовая принадлежность штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 и штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» к вирусу гриппа птиц подтипа Н7 была подтверждена методами серологической (реакцией торможения гемагглютинации (РТГА) и реакцией торможения нейраминидазной активности (РТНА)) и молекулярно-биологической диагностики (ОТ-ПЦР-РВ, ОТ-ПЦР и секвенирование).

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Influenza A virus, типу А, подтипу H5N2, а «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» к подтипу H7N2.

Гемагглютинирующая активность штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подавляется специфическими сыворотками к вирусу гриппа птиц подтипов H5N1, H5N2, H5N3 («IZSVe», Италия), а также H5N2 («GD» Нидерланды), что подтверждает принадлежность штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц к подтипу Н5. Нейраминидазная активность штамма подавляется специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2 («IZSVe», Италия), что подтверждает принадлежность штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц к подтипу H5N2.

Гемагглютинирующая активность штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подавляется специфическими сыворотками к вирусу гриппа птиц подтипов H7N1, H7N7 («IZSVe», Италия), а также Н7 («GD» Нидерланды), что подтверждает принадлежность штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц к подтипу Н7. Нейраминидазная активность штамма подавляется специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2 («IZSVe», Италия), что подтверждает принадлежность штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц к подтипу H7N2.

В результате проведения филогенетического анализа полученной нуклеотидной последовательности (848-1096 н.о.) фрагмента гена НА методом секвенирования было определено, что исследуемый штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц типа А принадлежит к генетической линии низкопатогенных штаммов вируса гриппа птиц подтипа Н5 (Фиг. 3.). В результате проведения филогенетического анализа полученной нуклеотидной последовательности (960-1114 н.о.) фрагмента гена НА методом секвенирования было определено, что исследуемый штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц типа А принадлежит к генетической линии низкопатогенных штаммов ВГП подтипа Н7 (Фиг. 4).

В результате испытаний с применением методов ПЦР-РВ и ОТ-ПЦР-РВ было установлено, что штаммы «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа А не контаминированы вирусами ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, инфекционного ларинготрахеита птиц, инфекционной бурсальной болезни, реовирусом птиц и штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» содержит в своем составе только геном вируса гриппа А подтипа Н5, а штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» -только геном вируса гриппа А подтипа Н7. Подтверждение отсутствия контаминации бактериями и грибами проводили в соответствии с ГОСТ 28085 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности». Подтверждение отсутствия контаминации микоплазмами проводили в соответствии с требованиями ГФ XIV, том 1, с. 1201-1222.

В результате контроля было установлено, что штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» не контаминированы посторонними вирусами, бактериями, грибами и микоплазмами.

Биологические характеристики.

Штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц способен к размножению в куриных эмбрионах (КЭ) без предварительной адаптации и показывает высокую гемагглютинирующую (титр в РГА составил 1:128 (7,0 log₂)) и инфекционную активность при десятикратном титровании в СПФ-куриных эмбрионах (титр инфекционной активности при десятикратном титровании в СПФ куриных эмбрионах составил 8,88±0,27 lg ЭИД₅₀/см³).

Штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц способен к размножению в куриных эмбрионах без предварительной адаптации и показывает высокую гемагглютинирующую (титр в РГА составил 1:128 (7,0 log₂)) и инфекционную активность при десятикратном титровании в СПФ-куриных эмбрионах (титр инфекционный активности вируса составил более 8,13±0,36 lg ЭИД₅₀/см³).

Штамм «А/duck/Vladimir/l 121/21 H5N2» и штамм «А/chicken/Vladimir/113 8/2021 H7N2» вируса гриппа птиц сохраняют инфекционную и антигенную активность в лиофилизированном виде, репродуцируются в СПФ-КЭ в течение 4-5 суток инкубирования и накапливаются в титре 8,88±0,27 и 8,13±0,36 lg ЭИД₅₀/см³, соответственно. Данные титрования представлены в таблице 1 и 2.

Биотехнологические свойства.

Оба штамма вируса индуцируют антитела, выявляемые методами РТГА и иммуноферментным анализом.

Устойчивость к внешним факторам.

Штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц чувствительны к детергентам, формальдегиду, бета-пропиолактону, производным азиридина, быстро инактивируются при прогревании 56°С, ультрафиолетовом облучении и при рН ниже 5,0.

В результате проведения последовательных пассажей в 11 суточных СПФ-КЭ были получены штаммы «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц, имеющие стабильные биотехнологические и антигенные свойства и пригодные для изготовления и получения антигенов и сывороток для диагностики вируса гриппа птиц подтипа Н5 и Н7.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение антигенов вируса гриппа птиц подтипа Н5 и Н7.

Для изготовления антигенов вируса гриппа птиц подтипа Н5 использовали лиофилизированный штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2», и подтипа Н7 - лиофилизированный штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» и 10-11 суточные свободные от патогенной микрофлоры куриные эмбрионы. Перед проведением работ куриные эмбрионы овоскопировали, с целью отбора жизнеспособных подвижных эмбрионов с развитой сосудистой системой, а также отметки воздушной границы хориоаллантоисной полости. Посевной вирус разводили стерильным фосфатно-буферным раствором рН (7,2-7,4) в объеме, необходимым для заражения партии 11-суточных куриных эмбрионов, из расчета 0,1 см³ на эмбрион. К рабочему разведению вируса добавляли антибиотики (смесь: пенициллин 1000-2000 ед/см³, стрептомицин 50-100 мг/см³, амфотерицин В 1000-2000 ед/см³). Вирус инокулировали в аллантоисную полость эмбриона, используя стерильный одноразовый инсулиновый шприц. Далее, куриные эмбрионы инкубировали при температуре 37±1°С и относительной влажности 60-70% в течение 72 часов. Ежесуточно эмбрионы овоскопировали и проверяли их состояние. Все эмбрионы, погибшие в течение 24 ч после инокуляции браковали и утилизировали. Эмбрионы, погибшие через (48-72) ч, и оставшиеся живые эмбрионы выдерживали в течение 12 ч при температуре 4±2°С. Отбор экстраэмбриональной жидкости проводили с использованием пластиковой одноразовой стерильной пипетки и резиновой груши.

Инактивацию вируса проводили с использование рабочего разведения бета-пропиолактона с конечной концентрацией 0,1%. Инактивированную вируссодержащую суспензию центрифугировали при 5000 об/мин (4000 g) в течении 25 минут при температуре +4°С. Надосадочную жидкость аккуратно отбирали стерильной пипеткой с грушей в стерильный пластиковый флакон. Полученную надосадочную жидкость, содержащую очищенный антиген, хранили при температуре +4°С до лиофилизации.

Для определения гемагглютинирующей активности полученных вирусных препаратов проводили реакцию гемагглютинации. Для дальнейших работ титр гемагглютинирующей активности должен быть не ниже 1:128 (7,0 log₂).

В очищенную инактивированную вируссодержащую суспензию добавляли стабилизаторы (20% гидролизат лактальбумина, 30% сахарозы и 5% желатина) и антибиотики (смесь: пенициллин 1000-2000 ед/см³, стрептомицин 50-100 мг/см³, амфотерицин В 1000-2000 ед/см³), а затем разливали в стеклянные флаконы по 2 см³ и замораживали при температуре минус 60-70°С не менее 6 часов. Высушивание проводили в аппаратах для лиофилизации фирмы Labconco (США). Титр антигенов вируса гриппа птиц подтипа Н5 и Н7 после лиофилизации должен быть не менее 1:128 (7,0 log₂).

Гемагглютинирующая активность антигенов для серии набора составила 1:128 (7,0 log₂). Специфичность препаратов антигена штаммов вируса гриппа птиц: штамма «А/duck/Vladimir/l 121/21 H5N2» и антигена штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» после лиофилизации проверяли в РТГА с референтными гомо- и гетерологичными сыворотками крови птиц. Результаты представлены в таблице 3. Лиофилизированный препарат антигена из штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» реагировал только со специфической сывороткой крови, содержащей антитела к ВГП подтипа Н5 (IZSVe, Италия), а лиофилизированный препарат антигена из штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» реагировал только со специфической сывороткой крови, содержащей антитела к ВГП подтипа Н7 (IZSVe, Италия). Эти результаты показывают специфичность приготовленных антигенов.

Пример 2. Получение гипериммунных положительной и отрицательной сывороток крови.

Для получения гипериммунных положительных и нормальных (отрицательных) сывороток крови кур использовали 40-60 суточных цыплят, у которых отсутствовали антитела к вирусу гриппа птиц.

Для иммунизации использовали очищенную инактивированную экстраэмбриональную жидкость, полученную от 11-суточных куриных эмбрионов, зараженных штаммом «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2», эмульгированную с равным объемом адъюванта ISA-70, производства SEPPIC (Франция). Иммунизацию проводили в область бедренной или грудных мышц в объеме 1,0 см³ методом двукратного введения препарата с интервалом 14 суток. Через 10 суток после второй иммунизации у цыплят отбирали образцы крови из подкрыльцовой вены для определения специфической активности в РТГА. Если активность полученной сыворотки была ниже 1:64 (6,0 log₂), проводили дополнительную иммунизацию.

Для приготовления гипериммунной сыворотки крови цыплят обескровливали, и выдерживали полученную кровь в пробирках при температуре 37±1°С в течение 30-60 минут, а затем при 4±2°С 24 часа. Спустя 24 часа образовавшуюся на поверхности пробирки сыворотку крови аккуратно отбирали в стерильные пробирки. Далее сыворотку инактивировали в термостате при температуре 57±1°С в течение 30 минут.

Аналогичным методом получена положительная гипериммунная сыворотка, содержащая антитела к вирусу гриппа птиц штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2».

Активность полученной гипериммунной положительной сыворотки в РТГА со специфическим антигеном вируса гриппа птиц штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» должна быть не ниже 1:64 (6,0 log₂) (положительный контроль). Результаты исследования гемагглютинирующей активности и специфичности контрольных сывороток крови в РТГА представлены в таблице 4. В результате реакции сыворотка против вируса гриппа птиц штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» сработала с гомологичным антигеном в титре 1:512, что указывает на высокую активность предлагаемых сывороток. Сыворотки прореагировали только с антигеном гомологичного подтипа, что говорит о их высокой специфичности.

Нормальную отрицательную сыворотку кур получали путем обескровливания здоровой птицы, не имеющей антител к вирусу гриппа птиц. Готовили методом, описанным выше. Проверку отрицательной сыворотки крови на активность и специфичность проводили в РТГА с использованием референтных антигенов и сывороток к вирусу гриппа птиц подтипов HI-HI6, к вирусу болезни Ньюкасла, синдрома снижения яйценоскости-76 и Mycoplasma gallisepticum (табл. 4). Для использования в наборе была необходима такая сыворотка крови, чтобы активность в РТГА с гетерологичными антигенами не превышала фоновый уровень 1:4 (2,0 log₂) (реакция с не иммунной сывороткой). Как представлено в таблице 4 активность отрицательной сыворотки крови не превышала фоновый уровень 1:4 и показана специфичность реакции взаимодействия антигенов с отрицательной сывороткой.

Для лиофилизации сывороток к ним добавляли стабилизирующую среду, состоящую из 20% гидролизат лактальбумина, 30% сахарозы и 5% желатина. Сушку проводили в сублимационном вакуумном аппарате фирмы LABCONCO (США).

Пример 3. Постановка реакции торможения гемагглютинации для выявления антител к вирусу гриппа птиц с применение диагностического набора (предлагаемое изобретение).

Для получения сывороток крови от птиц кровь берут из вены внутренней стороны крыла над локтевым сочленением путем прокола или путем скарификации гребня в объеме (1,0 - 2,0) см³ в стерильные пробирки. Через некоторое время в пробирке образуется сгусток, который отделяют от стенок тонким металлическим стержнем или пастеровской пипеткой и выдерживают при температуре 37°С в термостате в течение 60 минут. Затем пробирку с кровью помещают в холодильную камеру на 8-10 часов при температуре от 2 до 8°С. Отстоявшуюся сыворотку сливают в чистые пробирки. Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотку прогревают на водяной бане при температуре 56°С в течение 30 минут. Подготовленные сыворотки используют для постановки РТГА. При необходимости хранения сывороток более трех суток до начала исследований их замораживают при температуре не выше минус 15°С.

Определение гемагглютинирующего титра антигенов. Для постановки реакции гемагглютинации готовили двукратные разведения антигена используемых штаммов «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц, от 1:2 до 1:4096. Для этого во все лунки полимерного круглодонного планшета для серологических реакций вносили равное количество (0,025 см³ или 0,050 см³) фосфатно-буферного раствора. В две первые лунки горизонтального ряда добавляли равный объем подготовленного антигена вируса гриппа птиц, полученного из штаммов «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2», трехкратно пипетировали и переносили по 0,025 см³ или 0,050 см³ во вторые лунки и так далее. Из последних лунок вертикального ряда (1:4096) удаляли 0,025 см³ или 0,050 см³ антигена.

После титрования антигенов в лунки планшета с образцами вносили заранее подготовленную 1%-ю суспензию эритроцитов в объеме 0,025 см³ или 0,050 см³ (в зависимости от исходного объема внесенного фосфатно-буферного раствора). Планшет аккуратно встряхивали и оставляли при температуре 18-26°С на 30-40 минут.

Для контроля эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации и определения времени учета реакции в две-три лунки планшета с двойным объемом забуференного физиологического раствора (0,100 см³ или 0,050 см³) добавляли по 0,050 см³ или 0,025 см³ 1%-ной суспензии эритроцитов. Учет реакции проводили после оседания эритроцитов в виде «пуговицы» в контрольных лунках.

Реакция считается положительной, если при оседание эритроцитов в лунке планшета образовался ярко выраженный «зонтик», отрицательной образовалась «пуговка», при этом в отрицательном контроле должна отсутствовать спонтанная агглютинация.

Титр антигена должен соответствовать значению, указанному на этикетке флакона с антигеном плюс или минус одно разведение. За титр антигена принимали его наибольшее разведение, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов в виде «зонтика», что соответствует 1 гемагглютинирующей единице (1 ГАЕ).

Подготовка рабочей дозы инактивированных антигенов штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7. Для постановки РТГА необходимо приготовить рабочую дозу антигена (4 ГАЕ), исходя из его титра, установленного в реакции гемагглютинации. Необходимый объем высчитывали в зависимости от сывороток, которые необходимо исследовать. Также требуется учесть необходимые контроли реакции. Рабочую дозу антигена готовили непосредственно в день постановки реакции с обязательным контролем 4 ГАЕ.

Для этого в первую лунку планшета с выбранным объемом фосфатно-буферного раствора вносили равный объем антигенов и титровали до 4 лунки в ряде.

Для контроля времени реакции в две-три лунки планшета добавляли двойной объем фосфатно-буферного раствора (0,050 см³ или 0,100 см³), а затем - 0,025 см³ или 0,050 см³ 1%-ной суспензии эритроцитов.

Учет реакции проводили после оседания эритроцитов в контроле времени реакции. При правильном определении рабочей дозы антигенов в первой и второй лунках с титрованным антигеном должна быть полная агглютинация («зонтик»), в третьей лунке, содержащей 1/2 ГАЕ - частичная, в четвертой - отсутствие агглютинации («пуговка»). Если результат реакции не соответствует требуемым условиям, необходимо корректирование рабочей дозы путем добавления антигена или фосфатно-буферного раствора с обязательным контролем 4 ГАЕ.

Выявление специфических антител в исследуемых и контрольных пробах сыворотки крови от птиц. Во все лунки полимерного круглодонного планшета для серологических реакций вносили равное количество фосфатно-буферного раствора в объеме 0,025 см³ или 0,050 см³. Затем в первую лунку горизонтального ряда добавляли такой же объем исследуемой сыворотки, пипетировали и готовили ряд последовательных двукратных разведений с 1:2 до 1:4096.

Далее, во все лунки с титрованной сывороткой вносили подготовленную заранее рабочую дозу антигена, в объеме 0,025 см³ или 0,050 см³, аккуратно встряхивали и оставляли на 30 - 60 минут при температуре 18-26°С. После инкубации в лунки с исследуемыми образцами добавляли 0,025 см³ или 0,050 см³ 1%-ной суспензии эритроцитов. Планшеты осторожно встряхивали и оставляли при температуре 18-26°С до полного оседания контроля.

Одновременно ставили контроли реакции:

- На отсутствие изоагглютинации сывороток. В одну лунку планшета вносили 0,025 см³ или 0,050 см³ фосфатно-буферного раствора, добавляли равный объем испытуемой сыворотки и такой же объем 1%-ной суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов должна отсутствовать (в лунке образовалась «пуговка»).

- На спонтанную агглютинацию эритроцитов. В лунку планшета вносили двойной объем фосфатно-буферного раствора (0,050 см³ или 0,100 см³) и добавляли 0,025 см³ или 0,050 см³ 1%-ной суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов должна отсутствовать (в лунке образовалась «пуговка»).

- Контроль активности положительных и отрицательной сывороток крови. В лунки трех рядов планшета вносили по 0,025 см³ или 0,050 см³ фосфатно-буферного раствора. Затем в первые лунки каждого из двух рядов добавляли равные объемы специфической гипериммунной сыворотки против штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц (положительный контроль), а в первую лунку третьего ряда - равный объем отрицательной сыворотки (отрицательный контроль), пипетировали и готовили последовательные двукратные разведения с 1:2 до 1:4096. Далее, в лунки вносили заранее подготовленную рабочую дозу соответствующего антигена в аналогичном с предыдущими компонентами объеме (0,025 см³ или 0,050 см³), осторожно встряхивали и оставляли на 30-60 минут при температуре 18-26°С, после чего в лунки добавляли равный объем 1%-ной суспензии. эритроцитов. Контрольные гипериммунные положительные сыворотки (положительный контроль) должны тормозить гемагглютинирующую активность рабочего разведения антигена в титре, указанном на этикетке флакона (допускается погрешность±одно разведение). Отрицательная сыворотка должна тормозить гемагглютинирующую активность рабочего разведения антигена в титре, меньшем, чем 1:4.

Учет результатов реакции проводили визуально после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (образование «пуговки»). Результатом считали наибольшее разведение сыворотки, в котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов (сыворотка полностью подавила гемагглютинирующие свойства антигена вируса гриппа птиц).

Исследуемая сыворотка оценивается положительно, если она содержит специфические к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 или Н7 антитела в титре 1:16 (4,0 log₂) и выше.

Пример 4. Постановка реакции торможения гемагглютинации для определения подтипа гемагглютинирующего вирусного агента с применение диагностического набора (предлагаемое изобретение).

Для определении подтипа гемагглютинирующего вирусного агента, необходимо определить его гемагглютинирующую активность в РГА. Для этого готовили двукратные разведения исследуемого вируса гриппа птиц, от 1:2 до 1:4096, применяя метод, описанный в примере 2. Для повышении точности (достоверности) идентификации подтипа гемагглютинина вируса гриппа птиц, титр вируса в РГА должен быть не менее 1:16. Более низкие значения могут затруднить процесс приготовления рабочего разведения вируса.

Подготовка рабочей дозы исследуемого вируса. Для постановки РТГА требуется подготовить рабочую дозу исследуемого вируса, исходя из его титра, установленного в реакции гемагглютинации. Способ подготовки рабочей дозы вируса для идентификации гемагглютинина соответствует способу, описанному в примере 2.

Определение подтипа гемагглютинирующего вирусного агента. Во все лунки полимерного круглодонного планшета для серологических реакций вносили равное количество фосфатно-буферного раствора в объеме 0,025 см³ или 0,050 см³. Затем в первые лунки горизонтального ряда добавляли такие же объемы сывороток крови против штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2», пипетировали и готовили ряд последовательных двукратных разведений с 1:2 до 1:4096. Затем, в каждую лунку с титрованными сыворотками добавляли равный объем рабочей дозы исследуемого вируса, осторожно встряхивали и оставляли на 30-60 минут при температуре 18-26°С, после чего в лунки добавляли равный объем 1%-ной суспензии эритроцитов. Параллельно ставили необходимые контроли, аналогично примеру 2.

Учет результатов реакции проводили визуально после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (образование «пуговки»). Подтип гемагглютинина исследуемого вируса соответствовал сыворотке, с которой реакция показала положительный результат.

Пример 5. Определение специфичности диагностического набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации

Для определения специфичности представленного набора (предлагаемое изобретение) исследовали сыворотки крови от нескольких свободных от патогенной микрофлоры цыплят 21-дневного возраста в РТГА, предварительно тестированные тем же методом с использованием референтных антигенов производства Голландской академии Девентера (GD, Нидерланды) и Итальянского Института Зоопрофилактики (IZSVe, Италия). Результаты представлены в таблице 5.

Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации (предлагаемое изобретение) показал 100% специфичность со всеми испытуемыми антигенами и сыворотками.

Для подтверждения специфичности данного набора также использовали специфические сыворотки крови к гемагглютинирующим вирусам болезни Ньюкасла, гриппа птиц подтипов HI-HI 6, и микоплазмам производства Голландской академии Девентера (GD, Нидерланды) и Итальянского института зоопрофилактики (IZSVe, Италия). Результаты представлены в таблице 6.

Активность используемого антигена штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц подтипа Н5, из разработанного набора с гомологичными сыворотками подтипа Н5, различных производителей (пробы 5-6) составила 1:256 (8 log₂) и 1:512 (9 log₂), соответственно. Активность используемого антигена штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц подтипа Н7, из разработанного набора с гомологичными сыворотками подтипа Н7, различных производителей (пробы 8-9) составила 1:1024 (10 log₂). Активность обоих антигенов (представленных в предлагаемом наборе) из используемых штаммов в РТГА с гетерологичными сыворотками не превышала фоновый уровень и составила менее 1:4, что соответствует результатам реакции с не иммунной (нормальной) сывороткой.

Для определения специфичности набора для идентификации гемагглютинирующего вирусного агента гриппа птиц при его выделении из патологического материала, применяли референтные антигены ВГП подтипов H1-H16 производства Итальянского института зоопрофилактики (IZSVe, Италия). Данные реакции представлены в таблице 7. Результат учитывается качественно - при выпадении «зонтика» на дне лунки. Так полученная гипериммунная сыворотка на штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц подтипа Н5 и на штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц подтипа Н7 показали четкую специфичность, реагируя только с антигенами H5N1, H5N3 и H7N1, H7N3, соответственно.

Пример 6. Определение диагностической чувствительности диагностического набора

Для сравнения результатов выявления антител к вирусу гриппа птиц в РТГА с помощью разработанного диагностического набора (предлагаемое изобретение) и наборов антигенов других производителей - IZSVe (Италия) и GD (Нидерланды), было исследовано 20 сывороток крови от цыплят, иммунизированных вакцинами с использованием различных изолятов вируса гриппа птиц подтипа Н5 и 20 проб сывороток иммунизированных изолятами подтипа Н7. Сыворотки были отобраны спустя 30 суток после иммунизации. Пробы предварительно были исследованы в иммуноферментном анализе с использованием набора производства ФГБУ «ВНИИЗЖ». Результаты представлены в таблицах 8 и 9.

Исходя из данных таблиц 8 и 9 можно сделать вывод, что при постановке реакции торможения гемагглютинации с применением антигенов, входящих в разработанный диагностический набор все сыворотки показали положительный результат.Реакция с использованием наборов IZSVe (Италия) и GD (Нидерланды), и при использовании тест-системы ИФА (производства ВНИИЗЖ) показала схожие результаты, из чего можно сделать вывод, что предлагаемый набор не уступает в диагностической чувствительности своим аналогам.

Выявили, что данные (n=20), полученные с помощью разработанного диагностического набора (предлагаемое изобретение), коррелировали с данными полученными при постановке РТГА наборов IZSVe (Италия) и GD (Нидерланды), и при использовании тест-системы ИФА (производства ВНИИЗЖ).

Чувствительность и специфичность РТГА для выявления антител к вирусу гриппа птиц в сыворотках крови кур при использовании антигенов разных производителей представлены в таблице 10.

Чувствительность и специфичность РТГА для идентификации подтипа гемагглютинирующего агента вируса гриппа птиц при использовании сывороток разных производителей представлены в таблице 11.

В результате проведенных испытаний разработанный диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации, показал 100%-ую специфичность и чувствительность; высокую воспроизводимость (коэффициент вариации не выше 10% между разными сериями анализа) и правильность. Высокая точность выявления антител (100%) позволяет использовать его как эффективный инструмент для ретроспективной диагностики гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 и контроля поствакцинального иммунитета поголовья птиц.

Аналогичные показатели чувствительности и специфичности разработанного диагностического набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации установлены при определения подтипа гемагглютинина выделенных изолятов вируса гриппа птиц.

Таким образом, предлагаемый «Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации» на основе актуальных штаммов «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7 вируса гриппа птиц, является чувствительной и специфичной диагностической системой. Диагностический набор отвечает современным требованиям серологической диагностики и может быть внедрен в практику ветеринарных лабораторий для контроля эпизоотической ситуации по гриппу птиц типа А подтипов Н5 и Н7 на территории Российской Федерации, для дифференциации выявляемых антител против гриппа птиц и выделенных изолятов вируса гриппа птиц.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации»:

1. Ducatez MF, dinger CM, Owoade AA, Tarnagda Z, Tahita MC, Sow A, et al. Molecular and antigenic evolution and geographical spread of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses in western Africa. J Gen Virol. 2007;88:2297-306. 10.1099/vir.0.82939-0

2. Smith GJD, Donis RO; World Health Organization/World Organisation for Animal Health/Food and Agriculture Organization (WHO/OIE/FAO) H5 Evolution Working Group.Nomenclature updates resulting from the evolution of avian influenza A(H5) virus clades 2.1.3.2a, 2.2.1, and 2.3.4 during 2013-2014. Influenza Other Respir Viruses. 2015; 9:271-6. 10.1111/irv. 12324.

3. Isoda N, Onuma M, Hiono T, Sobolev I, Lim HY, Nabeshima K, Honjyo H, Yokoyama M, Shestopalov A, Sakoda Y. Detection of New H5N1 High Pathogenicity Avian Influenza Viruses in Winter 2021-2022 in the Far East, Which Are Genetically Close to Those in Europe. Viruses. 2022 Sep 30; 14(10):2168. doi: 10.3390/V14102168.

4. https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.03.04_AI.pd (Дата запроса: 30.01.2023).

5. Molesti E, Milani A, Terregino C, Cattoli G, Temperton NJ. Comparative serological assays for the study of h5 and h7 avian influenza viruses. Influenza Res Treat. 2013; 2013:286158. doi: 10.1155/2013/286158. Epub 2013 Sep 15. PMID: 24163763; PMCID: PMC3791816.

6. Shi J, Zeng X, Cui P, Yan C, Chen H. Alarming situation of emerging H5 and H7 avian influenza and effective control strategies. Emerg Microbes Infect. 2023 Dec; 12(1):2155072. doi: 10.1080/22221751.2022.2155072. PMID: 36458831; PMCID: PMC9754034.

7. Gu W, Shi J, Cui P, et al.. Novel H5N6 reassortants bearing the clade 2.3.4.4b HA gene of H5N8 virus have been detected in poultry and caused multiple human infections in China. Emerg Microbes Infect. 2022; 11(1):1174-1185.

8. Dhingra MS, Artois J, Dellicour S, Lemey P, Dauphin G, Von Dobschuetz S, Van Boeckel TP, Castellan DM, Morzaria S, Gilbert M. Geographical and Historical Patterns in the Emergences of Novel Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5 and H7 Viruses in Poultry. Front Vet Sci. 2018 Jun 5; 5:84. doi: 10.3389/fvets.2018.00084. PMID: 29922681; PMCID: PMC5996087.

9. Инструкция по применению набора для выявления антител к вирусу гриппа типа А иммуноферментным методом «ГРИПП А СЕРОТЕСТ» https://vetbio.ru/upload/shop_3/2/9/9/item_299/shop_property_file_299_160.pdf (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 11.01.2022)

10. Патент РФ №2423145 от 12.08.2009 г.

11. Патент РФ №2339694 от 15.11.2006 г.

12. ИНСТРУКЦИЯ по применению набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

13. ИНСТРУКЦИЯ по применению набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации https://shop.amah.ru/upload/iblock/lee/leec3f9d0bf60a2673dd2b609ecc65fc.pdf (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 11.01.2022).

14. Инструкция по применению набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации «РТГА-ВГП-СтавБио», https://www.stavbio.ru/products/rtga-vpg-set/. (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 09.03.2023)

15. Патент РФ №2738900 от 27.04.2020 г.

16. Инструкция по применению Тест-системы для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), https://vetbio.ru/catalog/birds/test-sistems-PCR/gripp-a-H5-H7/?ysclid=lfflu7vg6dr142660245. (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 09.03.2023).

17. Набор для выявления вируса гриппа птиц А с типированием «Н5-Н7-Н9-ИДС» (Influenza virus а), для применения в ветеринарии и научно-исследовательских целях, производитель: ИДС™, https://ids-lab.ru/catalog/pcr-nabory/bolezni-ptits/test-sistema-pga-gen/?ysclid=lf0u7jygrr183226209. (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 09.03.2023).

18. Тест-система ПЦР РВ Грипп А-Н5/Н7/Н9 - ЩБК, https://biocombinat.ru/catalog/16/5733/?ysclid=lf0vfxytwc192642016. (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 09.03.2023).

19. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ Набор реагентов для выявления и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5, Н7, Н9 методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме «реального времени» «АмплиПрайм® Грипп Н5/Н7/Н9», https://nextbio.ru/include/DownloadFiles.php?file=/upload/iblock/6a6/6a61bc6ac33bb9d8881747dbfa8a9101.pdf&name=%D0%98%D0%BD%D1%81%D1%82%D1%80%D1%83%D0%BA%D1%86%D0%B8%D1%8F%D0%90%D0%BC%D0%BF%D0%BB%D0%B8%D0%9F%D1%80%D0%B0%D0%B9%D0%BC%C2%AE_H5_H7_H9_%D0%B2.15.12.21-4.pdf. (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 09.03.2023).

20. https://vetandlife.ru/sobytiya/uchenye-vniizzh-razrabotali-nabor-dlya-vyyavleniya-antitel-k-virusu-grippa-ptic/?ysclid=lcu5tc4w8h434442487.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации, содержащий инактивированные антигены вируса гриппа птиц подтипа Н5 и Н7, отрицательную нормальную сыворотку крови кур, положительные гипериммунные сыворотки крови кур к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 и Н7, согласно изобретению в качестве инактивированного антигена вируса гриппа птиц подтипа Н5 использован штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2», депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №343 - деп / 21-4 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» и в качестве инактивированного антигена вируса гриппа птиц подтипа Н7 использован штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2», депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №345 - деп / 21-6 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Набор расширяет арсенал средств для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации с применением штаммов вируса гриппа птиц «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и «A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл., 6 пр.

1. Набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации, содержащий инактивированные антигены вируса гриппа птиц подтипа Н5 и Н7, отрицательную нормальную сыворотку крови кур, положительные гипериммунные сыворотки крови кур к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 и Н7, отличающийся тем, что в качестве инактивированного антигена вируса гриппа птиц подтипа Н5 использован штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2», депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №343 - деп / 21-4 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» и в качестве инактивированного антигена вируса гриппа птиц подтипа Н7 использован штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2», депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №345 - деп / 21-6 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

2. Диагностический набор по п. 1, позволяющий обнаружить и определить количество специфических антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 и Н7 в сыворотках крови птиц в титре 1:16 (4,0 log₂) и выше.

3. Диагностический набор по п. 1, позволяющий идентифицировать выделенные изоляты вируса гриппа птиц в РТГА по подтипу Н5 или Н7.

4. Диагностический набор по п. 1, содержащий положительную гипериммунную сыворотку крови кур к вирусу гриппа птиц против штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5, положительную гипериммунную сыворотку крови кур к вирусу гриппа птиц против штамма «A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7.