Штамм "Ямал" вируса гриппа птиц рода Alphainfluenzavirus вида Influenza A virus подтипа H5N1 для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н5 Российский патент 2023 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к получению нового штамма вируса гриппа птиц подтипа Н5 и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики гриппа птиц подтипа Н5.

Грипп птиц - контагиозное вирусное заболевание, которое вызывает сезонные эпизоотии и панзоотии с различным уровнем смертности в зависимости от степени патогенности возбудителей [1].

Возбудитель - РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Orthomyxoviridae (по классификации International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) - 00.046), роду Alphainfluenzavirus (ID: 197911 no классификации The National Center for Biotechnology Information (NCBI), к виду Influenza A virus (ID 00.046.0.01.001).

Вирус гриппа А широко распространен в природе, поражает многие виды млекопитающих и птиц, в основном водного и околоводного экологических комплексов. От диких птиц выделены вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков, при этом инфекция у диких птиц протекает в виде энтерита, без видимых признаков заболевания. Это указывает на высокую степень адаптации вирусов гриппа А к диким птицам, которые являются естественными хозяевами вирусов гриппа. Вирус сохраняется в воде в течении длительного времени (6-8 месяцев), инфицирование происходит водно-фекальным путем [2].

Вирус гриппа А отличается высокой степенью вариабельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: НА и NA.

Установлено, что антитела хозяина к НА и NA обеспечивают основу гуморального иммунитета, при этом ведущую роль играют протективные антитела к НА. Известно 18 антигенных подтипов НА (H1-H18) и 11 подтипов NA (N1-N11). Вирус гриппа обладает сегментированным геномом, состоящим их 8 сегментов, которые обладают высокой способностью к реассортации [2, 3].

Различные комбинации НА и NA способны привести к появлению высоковирулентных штаммов вируса, вызывающих высокий процент смертности. В настоящее время наблюдается распространение высокопатогенного гриппа птиц (ВГП) вызванного вирусом типа А, подтипа Н5, на территории Евразии. Считается, что этот подтип является одним из наиболее опасных в плане возникновения пандемий [4].

Вирусы низкопатогенного гриппа птиц (НПГ) подтипа Н5 показывают практически одинаково низкую патогенность в экспериментальных условиях при тестировании с помощью IVPI, однако в полевых условиях они часто демонстрируют заболеваемость и смертность от средней до высокой степени [6].

При сравнении выделенных изолятов вируса гриппа птиц обнаруживается чрезвычайно высокая их генетическая и антигенная вариабельность. Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых изолятов вируса гриппа птиц, пригодных для изготовления диагностических и вакцинных препаратов [5, 7].

Известны штаммы вируса гриппа птиц, выделенные на территории Российской Федерации, используемые для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Известен штамм вируса гриппа птиц A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 субтип H5N1 для изучения активности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа. Данное изобретение относится в медицинской вирусологии. Штамм используется для изучения биологии вируса гриппа, а также эффективности лечебных и профилактических препаратов против гриппа [8].

Известен штамм А/БАК/РОССИЯ/05 субтип H5N1 вируса птичьего гриппа подтипа H5N1. Однако указанный штамм может быть использован только для получения антигена и создания вакцинных и диагностических препаратов. Данных о патогенных свойствах штамма для лабораторных животных, в т.ч. мышей, нет [9].

Известен штамм вируса гриппа птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005 субтип H5N1 для моделирования инфекции, вызываемой вирусом гриппа птиц субтипа H5N1, на мышах в экспериментах по изучению активности противовирусных препаратов и эффективности вакцин [10].

Известен штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса гриппа птиц Influenza virus avicum типа А подтипа Н5 для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н5 [12].

Известен штамм A/chiken/Kostroma/3175/17 H5N2 вируса гриппа птиц подтипа H5N2 Infuenza A virus рода Alphainfluenzavirus для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления антигенсодержащих диагностикумов [13].

Известен штамм вируса гриппа птиц A/common gull/Chany/2006 H5N1 субтипа, используемый для приготовления антигенсодержащего диагностического или вакцинного препарата [14].

Известен штамм вируса гриппа A /H5N2/ ГВК №2340 птиц для моделирования гриппозной инфекции. Предложенный штамм является непатогенным для птиц и людей. Полученный штамм предназначен для изучения генетических основ преодоления межвидового барьера, выявления филогенетических и экологических связей вирусов, выделенных в разное время, в различных географических регионах [15].

Известен штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1 вируса гриппа птиц, выделенный на территории Западной Сибири, который используется для моделирования вирусной инфекции в научных экспериментах при изучении эффективности противовирусных препаратов на культурах клеток. Однако указанный штамм имеет следующие недостатки: штамм имеет пониженную продуктивность при культивировании на клетках МДСК - максимальная концентрация вируса 6,5 lg ТЦД5 0/мл. Штамм предназначен для производства профилактических и диагностических препаратов и, исходя из представленных данных о патогенности для культур клеток и отсутствия данных о патогенности для животных, в т.ч. мышей, может быть использован для оценки противовирусной активности различных соединений только на культуре клеток [16].

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм «Новосибирский» вируса гриппа птиц Influenza virus avicum для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц [11]. Это производственный высокопатогенный штамм вируса гриппа птиц типа А подтипа H5N1.

Техническая проблема заключается в расширении арсенала актуальных производственных штаммов низкопатогенного вируса гриппа птиц типа А подтипа Н5 и обладающих антигенной и иммуногенной активностью при введении птице, сохраняющих иммуногенные свойства после инактивации, обеспечивая тем самым получение вакцинных препаратов, создающих эффективную защиту домашней птицы против высокопатогенного вируса гриппа А подтипа Н5.

Указанная проблема решена путем получения штамма «Ямал» низкопатогенного вируса гриппа А подтипа Н5, который может использоваться для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики гриппа птиц подтипа Н5.

Вирусный изолят A/wildduck/YaNAO/956-12, послуживший источником для получения штамма «Ямал», был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2021 г. из проб патологического материала от дикой утки, отобранного на территории Ямало-Ненецкого АО Российской Федерации.

Для получения штамма «Ямал» вируса гриппа птиц, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали метод предельных разведений на СПФ-эмбрионах кур. Из ранее выделенного изолята был получен штамм «Ямал» низкопатогенного вируса гриппа птиц А подтипа H5N1, имеющий стабильные биотехнологические свойства и пригодный для использования при проведении лабораторных исследований и изготовления диагностических препаратов и препаратов специфической профилактики данного заболевания. Штамм адаптирован к репродукции в 9-11-суточных эмбрионах кур. Вирус способен вызывать гибель эмбрионов кур в течение 48-96 ч инкубации при температуре 37±0,5°С и влажности 60±10%.

Идентификация и филогенетическое родство штамма «Ямал».

Подтип H5N1 штамма «Ямал» идентифицирован методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и нуклеотидного секвенирования, в РТГА (реакция торможения гемагглютинации) и РИНА (реакция ингибиции нейраминидазной активности).

При проведении филогенетического анализа нуклеотидной последовательности фрагмента гена НА участка 837-1097 н.о. было установлено, что она идентична последовательности вируса гриппа птиц A/wildduck/YaNAO/956-12, а сайт разрезания - RETR - характерен для низкопатогенного вируса гриппа птиц.

Штамм «Ямал» вируса гриппа птиц типа А подтипа H5N1, депонирован 24 сентября 2021 г. во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №366 - деп/21-28- ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «Ямал» вируса гриппа птиц для приготовления биопрепаратов для специфической профилактики гриппа птиц А подтипа Н5.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении (фиг.1). На фиг.1 представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма «Ямал» подтипа Н5 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса гриппа птиц подтипа Н5. Дендрограмма основана на сравнении нуклеотидных последовательностей участка гена гемагглютинина.

Показано, что исследуемый штамм «Ямал» относится к ветви низкопатогенных вирусов гриппа птиц подтипа Н5.

Сущность изобретения пояснена следующим перечнем последовательностей:

SEQ ID №1: представляет последовательность нуклеотидов фрагмента гена гемагглютинина штамма «Ямал» подтипа H5N1;

SEQ ID №2: представляет последовательность аминокислот фрагмента гемагглютинина штамма «Ямал» подтипа H5N1.

Штамм «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологическая характеристика

Штамм «Ямал» вируса гриппа птиц относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Influenza A virus, подтипу H5N1 и обладает морфологическими признаками, характерными для низкопатогенного вируса гриппа типа А.

Вирионы вируса гриппа - оболочечные, плеоморфные. Диаметр сфероподобных частиц около 80-120 нм; нитевидные частицы около 17 нм в диаметре, длиной 250 нм и более. На поверхности вириона находятся шипообразные выступы (до 14 нм), образованные гомотримерами НА. В промежутках между кластерами НА у вирусов типа А размещаются молекулы NA.

Липидная мембрана окружает петлеобразные филаменты нуклеокапсидов с восемью фрагментами вирусного генома, каждый из которых представлен линейной одноцепочечной антисмысловой РНК.

Общая длина генома составляет около 13600 нуклеотидов (нт). Наиболее крупный фрагмент (№1) содержит около 2350 н.о.; №2 - чуть менее 2350 н.о.; №3, как правило, - 2250 н.о.; №4 - 1780 н.о.; №5 - 1575 н.о.; №6 - 1420 н.о.; №7 - 1050 н.о.; №8 - 900 н.о.

На обоих концах каждой геномной цепи РНК содержатся

повторяющиеся отрезки, причем повторы 5' -концевого участка (у вирусов типа А они имеют вид 5' -AGUAGAAACAAGG) комплементарны инвертированным повторам, расположенным на 3' -конце. Кроме того, 3' -концевые участки некоторых фрагментов генома содержат консервативные отрезки, типичные для вирусных штаммов, поражающих субъектов определенного биологического вида [ICTV-International Committee on Taxonomy of Viruses].

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «Ямал» низкопатогенного вируса гриппа птиц относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Influenza A virus, типу А, подтипу H5N1.

У переболевшей птицы в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РТГА. Гемагглютинирующая активность штамма «Ямал» подавляется специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц подтипа H5N1 («IZSVe», Италия), что подтверждает принадлежность штамма «Ямал» низкопатогенного вируса гриппа птиц к подтипу Н5. Активность сыворотки подтипа Н5 в РГТА составила 8 log₂, активность других сывороток была ниже 4 log₂ (таблица 1). Нейраминидазная активность штамма подавляется специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц (ВГП) подтипа H5N1 («IZSVe», Италия) (таблица 2).

Согласно результатам серологических исследований штамм «Ямал» отнесен к вирусу гриппа птиц подтипа H5N1.

Биотехнологические свойства

Оптимальными условиями культивирования штамма «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А являются следующие:

- система культивирования - развивающиеся эмбрионы кур в возрасте 9-11 суток;

- метод заражения - инокуляция при помощи шприца в аллантоисную полость;

- продолжительность культивирования вируса составляет 48-96 ч.

При культивировании вирус штамма «Ямал» накапливается в титре не менее 8,2 lg ТЦД₅₀/см³ и сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение не менее 5 пассажей (срок наблюдения).

Инактивированный вирус индуцирует антитела, выявляемые методами реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА) (таблица 4). Так, через 28 суток после однократной иммунизации цыплят инактивированной цельной вакциной из штамма «Ямал» вируса гриппа птиц А подтипа H5N1 в прививном объеме 0,5 см³/гол средний титр антител по группе к НА, обеспечивающим реакцию торможения гемагглютинации, составил 11,2±0,3 log₂.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «Ямал» низкопатогенного вируса гриппа птиц типа А подтипа Н5 является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 250 МД.

Геном вируса гриппа представлен однонитевой РНК негативной полярности в виде 8 нитей (сегментов) в комплексе с белком нуклеопротеина (NP).

Вирионы вируса гриппа имеют наружную липопротеиновую оболочку, чаще сферической формы. Диаметр сферических форм около 80-120 нм. Вирусные частицы содержат РНК - 1%, белки - 70%, жиры - 20%, углеводы -до 8%.

Антигенная вариабельность и таксономическая классификация вируса основана на идентификации двух основных поверхностных белков - гемагглютинина и нейраминидазы.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «Ямал» низкопатогенного вируса ГП чувствителен к детергентам, формальдегиду, этанолу, миродез базик, хлорамину Б быстро инактивируется при прогревании (56°С), ультрафиолетовом облучении и при рН ниже 5,0.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами в составе инактивированной вакцины не обладает. Иммунизация цыплят в дозе, в два раза превышающей прививную, не вызывает видимых клинических изменений в общем состоянии птицы, а также локальных поражений ткани в месте введения.

Патогенные свойства

Вирулентность - низкая. Вызывает гибель одного из 10 зараженных цыплят в дозе 7,9 lg ЭИД₅₀. Интравенозный индекс патогенности 0,29, что характерно для низкопатогенных штаммов вируса гриппа А.

Контагиозность - контагиозен. Не иммунные цыплята заражаются при совместном содержании с зараженными.

Стабильность фенотипа штамма при пассажах в системе культивирования. Штамм ««Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А обладает стабильным фенотипом при культивировании в куриных эмбрионах в течение 5 пассажей.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Стабильность фенотипа и генотипа штамма «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А

Для исследований использовали исходный посевной материал штамма «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А, пассаж №2 в СПФ-эмбрионах кур, объем фасовки 2 см³ и вирусную суспензию, прошедшую 5 последовательных пассажей от исходного материла штамма.

Стабильность фенотипа вируса оценивали в сравнительном аспекте по титрам инфекционной и гемагглютинирующей активности вируссодержащих суспензий не пассированного (исходный посевной материал) и пассированного (5 пассажей) в куриных эмбрионах (КЭ). Результаты определения активности вируссодержащего материала не пассированного и пассированного в КЭ материалов представлены в таблице 3.

Показатели инфекционной и гемагглютинирующей активности сравниваемых суспензий были очень близки, и статистически не отличались, при Р>0,05.

Стабильность генотипа вируса оценивали, сравнивая нуклеотидные последовательности гена НА (837-1097 н.о.) в исходном посевной материале и пассированном (5 раз) в куриных эмбрионах материалах.

Нуклеотидная (соответственно и аминокислотная), последовательность фрагмента гена НА, выявленная в составе восстановленных суспензий не пассированного и пассированного в КЭ материалов была одинаковой.

Таким образом, штамм обладает фенотипической стабильностью при проведении 5 последовательных пассажей в СПФ-эмбрионах кур, сравниваемые материалы имели одинаковую генетическую последовательность фрагмента гена НА, которая была идентифицирована как штамм «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А. Пример 2. Определение патогенности

Патогенность штамма «Ямал» вируса гриппа А подтипа H5N1 определяли согласно требования МЭБ, двумя способами.

Первый способ. Восемь восприимчивых цыплят в возрасте 30 дн. заражали внутривенно вирусным материалом с инфекционной активностью 9,6 lg ЭИД₅₀/см³ из разведения 1/10 в объеме 0,2 см³. Через 6 дн. после заражения пал 1 цыпленок с признаками нарушения кровеносной системы (цианоз гребня, лап) и расстройства желудочно-кишечного тракта (диарея). Остальные цыплят не болели и через 10 дн. (период наблюдения) после заражения были живы.

Второй способ. Заключался в определении интравенного индекса патогенности (ИВИП) для 42 дневных восприимчивых цыплят.Результаты определения индекса патогенности представлены в таблице 5.

Было установлено, что ИВИП составляет 0,29, что свидетельствует о низкой патогенности исследуемого штамма.

Таким образом, штамм «Ямал» вируса гриппа А подтипа H5N1 был охарактеризован как низкопатогенный.

Пример 3. Определение отсутствия контаминации чужеродными вирусами, бактериями и грибами

Для приготовления биопрепаратов для специфической профилактики гриппа птиц подтипа Н5 необходимо использовать штамм, свободный от контаминации чужеродными вирусами, бактериями и грибами. Подтверждение отсутствия контаминации бактериальной и грибной микрофлорой проводили в соответствии с ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности» [17]. Отсутствие контаминации микоплазмами проводили в соответствии с требованиями ГФ XIV, том 1, с. 1201-1222 [18].

В результате исследований установлено, что штамм «Ямал» вируса гриппа птиц А не контаминирован бактериями, грибами и микоплазмами. В результате испытаний с применением методов полимеразной цепной реакции (ТП TP) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) было установлено, что штамм «Ямал» вируса гриппа птиц не контаминирован вирусами ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, инфекционного ларинготрахеита птиц, инфекционной бурсальной болезни, реовирусом птиц, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционного энцефаломиелита птиц, анемии цыплят, оспы птиц, лейкоза птиц подтипа J, болезни Марека и метапневмовирусной инфекции.

Пример 4. Получение антигена Н5 на основе штамма «Ямал» вируса гриппа птиц А подтипа H5N1

Для приготовления антигена ампулы с лиофилизированным штаммом «Ямал» вируса гриппа птиц А подтипа H5N1 вскрывали, и разводили содержимое каждой ампулы в 2 см³ забуференного физиологического раствора. Восстановленный таким образом материал разводили стерильным забуференным физраствором (рН 7,2-7,4) до рабочей концентрации 5,0-5,3 lg ЭИД₅₀/см³, добавляли антибиотики из расчета 400 мкг стрептомицина сульфата и 400 ЕД бензилпенициллина натриевой соли на 1 см³ восстановленной вируссодержащей суспензии. Приготовленный таким образом вируссодержащий материал использовали для заражения куриных эмбрионов. Контроль стерильности матрикса осуществляли высевом на бактериальные среды.

После процедуры подготовки рабочего разведения вируссодержащего материала, отобранные эмбрионы, размещенные в пластиковых решетках с ячейками воздушной камерой вверх обрабатывали 1%-ным раствором йода. В подготовленных эмбрионах стерильным стилетом прокалывали отверстия в области воздушной камеры для инокуляции вируса.

Рабочее разведение вируссодержащего материала вносили шприцом-автоматом (типа «Socorex») с иглой диаметром 0,5 мм и длиной 15 мм в аллантоисную полость в объеме 0,1 см³. После заражения отверстие в скорлупе заклеивали стерильной воск-парафиновой смесью.

Зараженные куриные эмбрионы вируссодержащим материалом вируса гриппа птиц штамм «Ямал» подтипа H5N1 инкубировали 96 ч при температуре (37,5±0,5)°С и относительной влажности 50-70%. Овоскопию зараженных эмбрионов проводили ежедневно. Сбор вируссодержащего материала проводили от куриных эмбрионов через 48-96 ч инкубации. По окончании инкубации эмбрионы помещали в холодильную камеру с температурой 2-8°С на 12-24 ч с целью исключения во время сбора материала минимального попадания эритроцитов в аллантоисную жидкость.

Перед вскрытием эмбрионы выдерживали 2-3 ч при комнатной температуре до испарения конденсата (влаги) на скорлупе.

Скорлупу над воздушной камерой дезинфицировали фламбированием и срезали глазными остроконечными стерильными ножницами по границе воздушной камеры. Затем, соблюдая правила асептики, стерильным пинцетом вскрывали подскорлупную и подлежащую хориоаллантоисную оболочки. Собирали экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ) эмбрионов в стерильные флаконы вместимостью 200-500 см³. При сборе экстраэмбриональной жидкости следует избегать попадания желтка и белка эмбриона. Собранный материал центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10-15 мин с целью осаждения эритроцитов. Из флакона отбирали пробу в количестве 1,0 см³ для определения титра гемагглютинина инфекционной активности вируса гриппа птиц. Заполненные бутыли с вируссодержащим материалом перекрывали стерильными резиновыми пробками и передавали на инактивацию.

Отходы эмбрионов собирали в пакеты, обеззараживали и передавали для уничтожения путем сжигания в кремационной печи.

Инактивацию вируссодержащего материала проводили рабочим раствором димера аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) в бутылях, с концентрацией инактиванта - 0,25%, рН инактиванта 8,2 - 8,3, при температуре (25,5±0,5)°С. Время инактивации составляло 36 ч.

Предварительно готовили навески тимеросала (мертиолята, тиомерсаля) из расчета 0,085 г на 1 л инактивируемого вируссодержащего материала (с учетом димера АЭЭИ).

В стерильном боксе приготовленные навески АЭЭИ и тимеросала вносили в бутыли с вируссодержащим материалом, емкости перекрывали стерильными пробками и тщательно перемешивали с периодичностью 1 ч. По окончании процесса инактивации из бутыли отбирали пробы на стерильность и контроль полноты инактивации.

Вируссодержащий материал с инфекционной активностью не ниже 9,6-9,8 lg ЭИД₅₀/см³ и гемагглютинирующей активностью 9,5-10,0 log₂ ТЦД₅₀/см³ хранили при температуре не выше минус 2-8°С и использовали для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.

Пример 5. Определение инфекционной и гемагглютинирующей активности антигена вируса гриппа птиц А штамма «Ямал» подтипа H5N1.

Оценку инфекционной активности материала проводили на развивающихся СПФ-эмбрионах кур. Лиофилизированный вирусный посевной материал в количестве трех флаконов ресуспендировали: в каждый флакон добавляли физиологический раствор до первоначального объема материала перед лиофилизацией, объединяли содержимое флаконов, получая среднюю пробу.

Готовили последовательные десятикратные разведения средней пробы вируссодержащего материала на физиологическом растворе до 10^-9 включительно.

Проводили заражение в аллантоисную полость 4 эмбрионам каждого разведения (с 10^-6 до 10^-9) вируссодержащего материала по 0,1 см³.

Инфицированные эмбрионы инкубировали в течение 96 ч при температуре (37,5±0,5)°С и относительной влажности 50-70%. Овоскопию зараженных эмбрионов проводили ежедневно.

Гибель эмбрионов в течение первых 24 ч считали неспецифической. Через 96 ч инкубации все эмбрионы охлаждали при температуре 4-8°С в течение 12-18 ч и вскрывали.

Индивидуально от каждого эмбриона отбирали аллантоисную жидкость и исследовали в реакции гемагглютинации (РГА) микрометодом для выявления гемагглютинирующей активности вируса по ниже описанной методике.

Для постановки РГА готовили двукратные разведения антигена от 1:2 до 1:4096. Для этого во все лунки планшета вносили физиологический раствор в объеме 0,05 см³. В первую лунку добавляли подготовленные пробы ЭЭЖ в объеме 0,05 см³, трехкратно пипетировали и переносили 0,05 см³ во вторую лунку и т.д. Из последней лунки после трехкратного пипетирования 0,05 см³ испытуемого материала удаляли в 2%-ый раствор едкого натрия или другой подобный дезинфектант.

Затем во все лунки вносили 1%-ную суспензию эритроцитов в объеме 0,05 см³.

Планшет аккуратно встряхивали и оставляли при температуре 18-22°С или 4-8°С на 40-60 минут.

Для контроля эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации и определения времени учета реакции в две-три лунки планшета с двойным объемом физраствора (0,1 см³) добавляли 0,05 см³ 1%-ной суспензии эритроцитов.

Реакцию учитывали при полном оседании эритроцитов в виде «пуговки» в отрицательных контрольных лунках.

РГА оценивали положительно при оседании эритроцитов в виде «зонтика», отрицательный результат - в виде «пуговки» при отсутствии спонтанной агглютинации в контроле.

Инфекционная активность вирусного материала штамма «Ямал» составила 8,2 lg ЭИД₅₀/МЛ.

Оценку гемагглютинирующей активности вируса проводили в реакции гемагглютинации (РГА) микрометодом. Для проведения испытания лиофилизированный вирусный посевной материал в количестве трех флаконов ресуспендировали: в каждый флакон добавляли физиологический раствор до первоначального объема материала перед лиофилизацией, объединяли содержимое флаконов, получая среднюю пробу.

Методика постановки РГА описана выше.

Гемагглютинирующий титр посевного коллекционного материала штамма «Ямал» вируса гриппа А составил 1:1024 (10 log₂).

Пример 6. Получение экспериментальной модели вакцины, на основе антигена штамма «Ямал» низкопатогенного вируса гриппа А подтипа H5N1

В качестве вируссодержащего материала (антигена) при изготовлении вакцины против гриппа птиц Н5 используют экстраэмбриональную жидкость инфицированных эмбрионов кур. При этом к вируссодержащему материалу предъявляют следующие требования: инфекционный титр вируса должен составлять не ниже 7,0 lg ЭИД₅₀/см³, гемагглютинирующая активность должна быть не ниже 1:128. Антиген приготовленный по примеру 4 соответствует данным требованиям.

Антиген штамма «Ямал» низкопатогенного вируса гриппа А подтипа H5N1, используемый для составления вакцины имел следующие количественные характеристики: 9,6 lg ЭИД₅₀ инфекционная активность и гемагглютинирующая активность 1:1024.

Вакцину изготавливали из экстраэмбриональной жидкости эмбрионов кур, инфицированных низкопатогенным вирусом гриппа А подтипа H5N1 штамм «Ямал», инактивированной димером аминоэтилэтиленимина, с добавлением масляного адъюванта Montanide ISA 70 VG в соотношении 30÷70. Инфицированную экстраэмбриональную жидкость эмбрионов кур -антиген пригодный для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики гриппа А готовили как описано в примере 4.

Процедура получения готовой формы вакцины состояла в следующем: антиген смешивали с масляным адъювантом в соотношении 30÷70 (% по весу) и эмульгировали на высокоскоростном лабораторном смесителе Silverson (Англия) при скорости 6000 об/мин в течение 5 мин.

Пример 7. Протективная активность инактивированной вакцины из антигена штамма «Ямал» низкопатогенного гриппа птиц подтипа Н5 в отношении высокопатогенного гриппа птиц подтипа H5N1.

В качестве исследуемого лекарственного средства испытывали инактивированную вакцину против гриппа птиц Н5. Были приготовлены 3 экспериментальные модели вакцины с разной концентрацией антигена вируса низкопатогенного гриппа птиц А подтипа H5N1 штамма «Ямал», содержащие цельную, 1/25, 1/50 дозы. Приготовленные антигены были эмульгированы в масляном адъюванте Montanide ISA 70 VG в соотношении 30÷70 (по весу) посредством перекачки 25 раз через иглу 21G. В итоге были получены 3 эмульсии со следующими характеристиками: однородные белого цвета, стерильные, стабильные (высота верхней прозрачной фракции не более 10 мм), вязкость в пределах 40-50 мм²/с, антиген полностью инактивирован.

В эксперименте были использованы цыплята яичного направления продуктивности в возрасте 21-28 дн. из благополучного по острым инфекционным болезням птиц хозяйства в количестве 70 гол.

Для контроля иммуногенности использовали иммунологический метод - контрольное заражение вакцинированных животных.

Цыплят разделили на 4 опытные группы методом случайного отбора, при это было сформировано 3 группы по 20 гол. в каждой и одна группа (контрольная) в количестве 10 гол. Цыплят 3-ех опытных групп прививали экспериментальными вакцинами в объеме 0,5 мл внутримышечно, цыплята контрольной группы оставались не привиты. Через 21 дн. после вакцинации цыплят опытных группы заражали вирусом высокопатогенного гриппа птиц штамма A/chicken/Primorsky/85/08 H5N1 в дозе 10⁶ ЭИД₅₀. Срок наблюдения за цыплятами составил 14 суток.

Иммуногенность вакцины оценивали по результатам контрольного заражения с учетом количества павших и живых цыплят в группах, после чего стандартным статистическим методом подсчитывали 50% протективную дозу (ПД₅о).

В таблице 6 представлены результаты клинического наблюдения за цыплятами после заражения в течение 14 суток. Из данных таблицы 6 видно, что только в группе цыплят, иммунизированных вакциной из цельного антигена все цыплята остались живы, при этом не наблюдалось признаков болезни. В группах, цыплят, иммунизированных вакцинами с разведением антигена наблюдали гибель цыплят в количестве 14 и 15 голов, соответственно. В дальнейшем на основании фактических данных по результатам контрольного заражения провели статистическую обработку результатов методом прямолинейной регрессии. Зависимость Y (защита от заражения) от X (степень разведения антигена) имеет вид

Y = (-1,528)X + 1,961,

на этом основании X_PD50=1,961/1,528=1,283, т.е. для получения концентрации соответствующей одной PD₅₀ в заданном объеме цельный материал необходимо развести в 19,20 раза (в цельном материале содержится 19,20 PD₅₀).

Таким образом, протективная активность экспериментальной вакцины против гриппа птиц подтипа Н5, изготовленной на основе низкопатогенного гриппа птиц вируса Н5 составила 19,2 ПД50 в отношении заражения высокопатогенным вирусом гриппа А шт. A/chicken/Primorsky/85/08 H5N1.

Пример 8. Иммуногенная активность инактивированной вакцины из антигена штамма «Ямал» низкопатогенного гриппа птиц А подтипа Н5 в отношении высокопатогенного гриппа птиц подтипа H5N8

В эксперименте использовали цыплят яичного направления продуктивности в возрасте 21-28 суток из благополучного по острым инфекционным болезням птиц хозяйства в количестве 40 гол.

Были приготовлены 3 образца экспериментальной модели вакцин, приготовленной по примеру 6, но с разной концентрацией антигена, содержащие 1/25, 1/50 и 1/100 дозы.

Цыплят разделили на 4 опытных групп методом случайного отбора по 10 гол. в каждой. Цыплята 3-х опытных групп были привиты экспериментальными вакцинами в объеме 0,5 см³ внутримышечно, цыплята контрольной группы остались не привиты. Через 21 сутки после вакцинации цыплятам опытных групп внутримышечно ввели вирус высокопатогенного гриппа птиц штамма A/duck/KChR/1590-20/20 подтипа H5N8 в дозе не менее 6,7 lg ЭИД₅₀/0,5 см³. Срок наблюдения за цыплятами составил 8 дней.

Иммуногенность вакцины оценивали в остром опыте, методом контрольного заражения по ПД50 (50% протективная доза), которую подсчитывали стандартным статистическим методом. Учитывали количество павших и живых цыплят в группах, после чего подсчитывали 50% протективную дозу (ПД50) с использованием формулы Кербера.

где: - доза, дающая максимальный эффект;

- отношение числа вакцинированных данной дозой животных, не погибших при заражении вирулентным вирусом, к общему числу вакцинированных данной дозой вакцины;

- знак суммирования;

- логарифм кратности разведения, для нашего случая d=log₂=0,301.

В таблице 7 представлены дынные об устойчивости цыплят, привитых вакциной, из штамма «Ямал» гриппа птиц А подтипа H5N1 к контрольному заражению высокопатогенным штаммом A7duck/KChR/l 590-20/20 вируса гриппа птиц подтипа H5N8.

Расчет ПД50 вакцины, из штамма «Ямал» гриппа птиц А подтипа H5N1 представлен уравнением:

Из данных представленных в таблице 7 видно, что цыплята привитые вакциной, приготовленной на основе штамма «Ямал» вируса гриппа птиц А подтипа H5N1, обладали высокой устойчивостью к заражению высокопатогенным вирусом гриппа А подтипа H5N8. С использованием статистических методов было установлено, что ПД50 данной вакцины составляет 79 усл.ед.

Таким образом, показатель иммуногенности вакцины, изготовленной из штамма «Ямал» вируса гриппа птиц А подтипа H5N1 выше минимального (79), равного 50 ПД50 в соответствии с требованиями МЭБ.

В результате анализа подтвердили эффективность изготовленного вакцинного препарата из штамма «Ямал» вируса гриппа птиц А подтипа H5N1 и возможность применения данного штамма для специфической профилактики птиц от данного заболевания.

Таким образом, заявляемый штамм «Ямал» вируса гриппа птиц рода Alphainfluenzavirus вида Influenza A virus подтипа H5N1 необходим для создания биопрепаратов, используемых для специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н5.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм «Ямал»» вируса гриппа птиц рода Alphainfluenzavirus вида Influenza A virus подтипа H5N1 для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н5»:

1. Ортомиксовирусы. Руководство по вирусологии. / Каверин Н.В., Львов Д.К., Щелканов М.Ю. - М.: МИА, 2013, С.307 - 313.

2. Анализ маркерных замен изолята вируса гриппа 132 A/chicken/Astrakhan/2171-1/2020 H5N8, выделенного на территории Астраханской области / Н. Г. Зиняков, А. В. Андриясов, Е. В. Овчинникова [и др.] // Ветеринария сегодня. - 2021. - №2(37). - С.132-137. - DOI 10.29326/2304-196Х-2021 -2-37-132-137.

3. Evolutionary dynamics of Н5 highly pathogenic avian influenza viruses (clade 2.3.4.4B) circulating in Bulgaria in 2019-2021/Zecchin B, Goujgoulova G, Monne I, Salviato A, Schivo A,Slavcheva I, et al. // Viruses. 2021; 13:2086.

4. Antigenic and genetic characteristics of zoonotic influenza A viruses and development of candidate vaccine viruses for pandemic preparedness. -URL:https://www.who.int/influenza/vaccines/viras/202103_zoonotic_vaccinevirus update.pdf (дата обращения 11.03.21).

5. Генетический анализ нуклеотидных последовательностей гена нейраминидазы изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N8, выделенных на территории Российской Федерации в 2020 году / П. Б. Акшалова, Н. Г. Зиняков, А. В. Андриясов [и др.] // Ветеринария сегодня. -2021. - №4(39). - С.301-307. - DOI 10.29326/2304-196Х-2021-10-4-301-307.

6. Н5 low pathogenic avian influenza viruses maintained in wild birds in China. / Tian J, Li M, Bai X, Li Y, Wang X, Wang F, Shi J, Zeng X, Tian G, Li Y. Vet Microbiol. 2021 Dec;263:109268. doi: 10.1016/j.vetmic.2021.109268. Epub 2021 Oct 29. PMID: 34781191.

7. Emergence and spread of novel H5N8, H5N5 and H5N1 clade 2.3.4.4 highly pathogenic avian influenza in 2020 / Lewis N.S, Banyard A.C, Whittard E., Karibayev Т., Al Kafagi Т., etc. // Emerg Microbes Infect. 2021 Dec; 10(1): P. 148-151.

8. Патент РФ №2366709, МПК C12N 7/00, 2008 г.

9. Патент РФ №2300564, МПК C12N 7/00, C12R 1/93, 2005 г.

10. Патент РФ №2361917, МПК C12N 7/00, А61К 39/145, 2008 г.

11. Патент РФ №2323 740, МПК C12N 7/00, 2008 г.

12. Патент РФ №2647566, МПК А61К 39/145, C12N 7/00, 2017 г.

13. Патент РФ №2736788, МПК C12N 7/00, 2020 г.

14. Патент РФ №2400536, МПК C12N 7/00, 2009 г.

15. Патент РФ №2163637, C12N 15/44, C12N 7/00, С07К 14/11, А61К 39/145, 2001 г.

16. Патент РФ №2309983, МПК C12N 7/00, 2007 г

17. ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».

18. ГФ XIV, т.2, с. 2997-3008 Испытания на присутствие микоплазм (ОФС.1.7.2.0031.15).

Перечень последовательностей

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="Influenza virus A .xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2022-09-19">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022121292</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-08-03</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>045016</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-08-03</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение &quot;Федеральный центр охраны здоровья

животных&quot; (ФГБУ ВНИИЗЖ)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI ARRIAH</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «Ямал»» вируса гриппа птиц

рода Alphainfluenzavirus вида Influenza А virus подтипа Н5N1 для

изготовления биопрепаратов для специфической профилактики гриппа птиц

типа А подтипа Н5</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>360</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..360</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Influenza virus </INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggagaaaatagtgcttcttcttgcaatggtcagtcttgttaaaagtg

accagatttgcattggttaccatgcaaacaactcgacagaacaggttgacacaataatggaaaagaatgt

tactgtcacacatgcccaagacatactagaaaaggcacacaacgggaagctctgcagcctaaatggagtg

aagcctctcattctgagggattgtagtgtagctggatggcttctaggaaaccccatgtgtgacgaattcc

tcaatgtgccagaatggtcttacatagtggagaaggacaacccagtcaatggcctctgctacccagggga

cttcaacgactatgaagaactaaaacaccta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>116</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..116</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Influenza virus </INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MEKIVLLLAMVSLVKSDQICIGYHANNSEQVDIMEKNVVHAQDILEKAH

NGKLCSLNGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKDNPVNGLCYPGDFNDYEELKHL</I

NSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма вируса гриппа типа А подтипа Н5 сем. Orthomyxoviridae рода Alphainfluenzavirus, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №366 - деп / 20-28- ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Предложенный штамм репродуцируется в 9-11-суточных куриных эмбрионах СПФ-кур, где достигает инфекционного титра не менее 8,2 lg ЭИД₅₀/см³. В составе инактивированной вакцины штамм обладает выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, вызывая выработку специфических антител, улавливаемых в РТГА. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н5. 1 ил., 7 табл., 8 пр.

Штамм «Ямал» вируса гриппа птиц семейства Orthomyxoviridae рода Alphainfluenzavirus вида Influenza A virus подтипа Н5, депонированный в Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №366 - деп/20-28-ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н5.