Область применения изобретения
В настоящем изобретении предложен способ получения комплексов белков с высокой изоэлектрической точкой с казеином, включающий определенную последовательность стадий нагревания, охлаждения и выдерживания. Кроме того, предложены комплексы, полученные таким способом, и их применение, в частности их применение в методах терапии.
Предпосылки создания изобретения
Некоторые биоактивные белки, такие как лактоферрин, лизоцим или лактадгерин, были идентифицированы как оказывающие благоприятное воздействие на здоровье, и поэтому были предприняты попытки использовать такие белки в питательных продуктах или фармацевтических продуктах. Вместе с тем такие белки очень чувствительны к агрессивным видам обработки, таким как воздействие высокой температуры, и включение таких белков в промышленные продукты оказалось затруднительным. Следовательно, существует потребность в разработке стабилизированных форм таких белков.
Например, лактоферрин представляет собой компонент человеческого грудного молока. Он также присутствует в продуктах, таких как детская смесь, но в значительно более низких концентрациях, чем в человеческом грудном молоке. В связи с этим ранее было описано дополнение детской смеси лактоферрином, полученным от крупного рогатого скота. Лактоферрин крупного рогатого скота (bLf) представляет собой связывающий железо гликопротеин массой приблизительно 77 кДа и состоит из единой полипептидной цепи примерно из 700 аминокислот. Человеческий лактоферрин представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 80 кДа, который проявляет высокую аффинность к железу. Гомология последовательности между человеческим Lf и Lf крупного рогатого скота составляет около 70%, а их трехмерная (3D) структура очень сходна, но не идентична.
Lf представляет собой сильнокатионный белок с высокой изоэлектрической точкой (pI), приблизительно 8,9. Известно, что при нейтральном рН (~pH 7) Lf связывается с другими анионными белками, такими как β-лактоглобулин, казеин и альбумин. По этой причине при добавлении лактоферрина в процессе влажного смешивания детской смеси белки под действием температуры и pH будут подвергаться денатурации в результате развертывания и рефолдингу, что приводит к нестабильности белка и увеличению вязкости. Это явление очень осложняет добавление лактоферрина во влажном состоянии (т.е. до сушки) в продукт, такой как детская смесь.
Таким образом, было описано добавление лактоферрина в продукты, такие как детская смесь, в твердой форме путем сухого смешивания после получения порошковой основы продукта. Тем не менее такой способ проблематичен, поскольку лактоферрин, добавляемый в твердой форме, должен быть стерильным. Для достижения требуемого уровня стерильности лактоферрин необходимо подвергать методикам стерилизации. Большинство методик стерилизации предусматривает использование высокой температуры, что может приводить к денатурации лактоферрина. Доступны и другие методики стерилизации, такие как мембранная фильтрация, но они могут быть дорогостоящими и требовать специального оборудования. Кроме того, для добавления стерильного лактоферрина в конечный продукт требуется специальное и точное оборудование для асептического дозирования.
Таким образом, для решения этих проблем было бы крайне желательно разработать альтернативные формы лактоферрина, что позволит добавлять лактоферрин вместе с другими ингредиентами детской смеси во влажную смесь и подвергать композицию детской смеси асептической обработке или распылительной сушке.
В качестве альтернативы добавлению в нативной форме было описано добавление лактоферрина в пищевые продукты в форме комплексов. В WO2012/045801 описаны коацерваты комплексов, содержащие лактоферрин и по меньшей мере один другой белок с изоэлектрической точкой ниже pH 7,0, которые можно использовать для замедления ферментативного расщепления белка и для улучшения метаболических реакций, воспалительной реакции кишечника, чувства насыщения и потребления пищи у человека. Тем не менее в этом документе не рассмотрена проблема стабилизации лактоферрина в процессе обработки продукта, подобного детской смеси, и, в частности, не указано, что описанные коацерваты будут достаточно стабильными для добавления во влажную смесь при производстве детской смеси.
Противоположно заряженные белки в растворе (которые являются коллоидами) при определенных значениях pH, ионной силы и стехиометрии самопроизвольно взаимодействуют с образованием комплексов. Такие комплексы могут оставаться растворимыми или вызывать разделение жидких фаз в растворе. В последнем случае образуются коацерваты комплексов. «Более концентрированная фаза в коллоидном компоненте представляет собой коацерват, а другая фаза представляет собой равновесный раствор» (IUPAC, 1997). Обе фазы остаются в равновесии, а следовательно, считаются несовместимыми. И растворимые комплексы, и коацерваты очень чувствительны к свойствам среды и по существу обратимы под действием изменения pH, ионной силы или температуры, а следовательно, во время обработки пищевого продукта могут разрушаться. Такая обратимость белковых комплексов описана в литературе. Например, в публикации Anema et al. Coacervates of lysozyme and β-casein; Journal of Colloid and Interface Science 398 (2013): 255–261, сообщают, что комплексы лактоферрина или лизоцима и β-казеина являются обратимыми, а именно под действием изменения pH и ионной силы (например, добавления NaCl).
Было описано, как увеличить устойчивость коацерватов комплексов путем использования поперечносшивающих агентов. Однако поперечносшивающие агенты было бы нежелательно добавлять в продукты для чувствительных потребителей, таких как младенцы и дети младшего возраста, где ингредиенты, которые можно использовать, ограничены очень строгими нормативами.
В WO2012/045801 коацерваты комплексов лактоферрина и белка, имеющего изоэлектрическую точку ниже 7, индуцируют воздействием pH. Однако комплексы, такие как описано в этом документе, недостаточно стабильны, чтобы выдерживать агрессивные условия обработки, такие как высокая температура, что делает их непригодными для обработки с другими ингредиентами продукта, такого как детская смесь.
Кроме того, в работе Anema et al. Co-acervates of lactoferrin and caseins; Soft Matter 8 (2012): 4471–4478, было исследовано образование коацерватов лактоферрина и казеинов, а именно β-казеина, индуцированное путем доведения рН до 6,55 при различных температурах. Тем не менее в этом документе вообще не затрагивается вопрос обратимости полученных коацерватов, которые могут быть повреждены, когда их подвергают агрессивной обработке, такой как стерилизация или сушка.
В работе Li Quanyang et al. Formation of lactoferrin/sodium caseinate complexes and their adsorption behaviour at the air/water interface; Food Chemistry, 232 (2017); 697–703, описан способ, включающий нагревание с последующим мгновенным охлаждением раствора казеината натрия и лактоферрина. Недостаток описанного в этом документе способа состоит в том, что он не подходит для образования комплексов с мицеллярным казеином. Желательно обеспечить способ, позволяющий также образовывать комплексы с мицеллярным казеином.
В работе Pan et al. Self-assembly of β-casein and lysozyme; Journal of Colloid and Interface Science, 316(2) (2007), 405–412, описан способ образования комплексов β-казеина и лизоцима, включающий регулирование pH в подходящем диапазоне от 4,0 до 6,0 или от 9,0 до 12,0 с последующей обработкой нагреванием при 80 °C в течение 30 минут и охлаждением. Этот способ приводит к образованию наночастиц, нестабильных при pH 3,0 и 12,0 и агрегированных в присутствии 0,15 М NaCl. Только прививание декстрана на β-казеин посредством реакции Майяра позволило стабилизировать наночастицы при нейтральном рН и солевом растворе. Желательно обеспечить способ получения более стабильных комплексов, способных выдерживать такие условия без добавления в комплекс дополнительного компонента, такого как декстран. Это особенно важно в детской смеси, причем желательно, чтобы перечень ингредиентов был как можно короче, и нормативные ограничения при этом очень строги.
Лактоферрин и/или другие чувствительные белки, такие как лизоцимы, желательно обеспечить в форме, которая придает им достаточную устойчивость к агрессивным условиям обработки, таким как тепловая стерилизация или сушка, что позволяет избежать необходимости в альтернативных способах стерилизации и асептического дозирования, осложняющих производство продуктов с чувствительными белками, подобными лактоферрину, и увеличивающих его стоимость. Дополнительно желательно иметь возможность образовывать комплексы со всеми типами казеина, включая мицеллярный казеин.
Преимуществом настоящего изобретения является то, что оно решает вышеупомянутые проблемы.
Изложение сущности изобретения
В первом аспекте в изобретении предложен способ получения комплексов белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, с казеином, включающий стадии:
a. обеспечения раствора белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, и казеина при pH в диапазоне от 6,5 до 7,5;
b. линейного повышения температуры от температуры денатурации белка, имеющего изоэлектрическую точку 7 или более, до температуры в диапазоне от 85 до 95 °C;
c. выдерживания раствора при температуре от 85 до 95 °C в течение по меньшей мере 30 секунд; и
d. линейного снижения температуры с 85–95 °C до температуры ниже 5 °C в течение периода по меньшей мере 30 минут;
e. выдерживания раствора при температуре ниже 5 °C в течение по меньшей мере 15 минут.
Во втором аспекте в изобретении предложены комплексы белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, с казеином, получаемые или полученные способом изобретения.
В третьем аспекте в изобретении предложен продукт, содержащий комплексы изобретения.
В четвертом аспекте в изобретении предложен способ получения продукта изобретения.
В пятом аспекте в изобретении предложены комплексы изобретения для применения в терапии.
В пятом аспекте изобретение относится к комплексам изобретения для применения в способе
a) предотвращения, уменьшения и/или лечения инфекций;
b) модулирования, стимуляции и/или поддержания иммунного ответа;
c) стимуляции и/или поддержания роста полезной кишечной флоры;
d) стимуляции и/или поддержания когнитивной функции;
е) стимуляции и/или поддержания здорового роста младенца или ребенка младшего возраста; или
f) стимуляции более мягкого стула у младенца.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Изображение коацерватов, полученных в примере 1, с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ). Фотографическое изображение получено посредством карты срезов образца по оси Z с использованием 63 линз объектива. Коацерваты имеют вид однородных сферических частиц с пористой структурой.
Фиг. 2. A: КЛСМ-изображение коацерватов, полученных в примере 1, после центрифугирования. Изображение гранулы после центрифугирования, полученное с использованием 20 линз объектива. B: снимок раствора коацерватов после центрифугирования. Осадок коацерватов четко виден.
Фиг. 3. КЛСМ-изображение коацерватов, полученных в примере 1 до (A) и после (B) охлаждения в течение 24 часов, с использованием 20 линз объектива. Коацерваты четко видны на обоих изображениях, хотя коацерваты после охлаждения в течение одной ночи имеют меньший размер.
Фиг. 4. КЛСМ-изображение композиции, полученной в примере 2 (сравнительном), с использованием 20 линз объектива. В надосадочной жидкости (A) и в осадке (B) коацерваты не видны.
Фиг. 5. КЛСМ-изображение композиции, полученной в примере 3 (сравнительном), с использованием 20 линз объектива. В надосадочной жидкости (A) и в осадке (B) коацерваты не видны.
Фиг. 6. КЛСМ-изображение композиции, полученной в примере 4 (сравнительном), с использованием 20 линз объектива. В надосадочной жидкости (A) и в осадке (B) коацерваты не видны.
Фиг. 7. Изображение коацерватов из примера 5 с помощью световой микроскопии после разведения коацерватов в додецилсульфате натрия (ДСН). Коацерваты все еще видны как однородные сферические частицы. Коацерваты увеличены в 10 раз.
Фиг. 8. Изображение коацерватов из примера 5 с помощью световой микроскопии после того, как они были подвергнуты высокоскоростному центрифугированию. Коацерваты все еще видны как однородные сферические частицы. Коацерваты увеличены в 10 раз.
Фиг. 9. Изображение коацерватов из примера 5 с помощью световой микроскопии после разведения водой и доведения pH до 3,5. Коацерваты все еще видны как однородные сферические частицы. Коацерваты увеличены в 10 раз.
Фиг. 10. Изображение коацерватов из примера 5 с помощью световой микроскопии после разведения водой и доведения pH до 3,5 и последующего нагревания при 70 °C в течение 15 минут. Коацерваты все еще видны как однородные сферические частицы. Коацерваты увеличены в 10 раз.
Фиг. 11. Изображение коацерватов из примера 5 с помощью световой микроскопии после разведения водой и доведения pH до 11. Коацерваты все еще видны как однородные сферические частицы. Коацерваты увеличены в 10 раз.
Фиг. 12. Изображение коацерватов из примера 5 с помощью световой микроскопии после разведения водой и доведения pH до 10 и последующего нагревания при 70 °C в течение 15 минут. Коацерваты все еще видны как однородные сферические частицы. Коацерваты увеличены в 10 раз.
Фиг. 13. Изображение коацерватов из примера 5 с помощью световой микроскопии после разведения 100 мМ NaCl. Коацерваты все еще видны как однородные сферические частицы. Коацерваты увеличены в 10 раз (A) и 20 раз (B) соответственно.
Фиг. 14. Изображение коацерватов из примера 6 с помощью световой микроскопии. Коацерваты видны как однородные сферические частицы. На более крупном снимке коацерваты увеличены в 10 раз, а на более мелком снимке представлены в 4-кратном увеличении.
Подробное описание изобретения
Определения
В настоящем документе следующие термины имеют приведенные ниже определения.
Термин «младенец» означает ребенка в возрасте до 12 месяцев.
Выражение «ребенок младшего возраста» означает ребенка в возрасте от одного года до семи лет.
Выражение «питательная композиция» означает композицию, которой питается субъект. Данная питательная композиция обычно предназначена для перорального или внутривенного применения и обычно включает в себя источник липидов или жира и источник белка.
В конкретном варианте осуществления композиция настоящего изобретения представляет собой гипоаллергенную питательную композицию. Выражение «гипоаллергенная питательная композиция» означает питательную композицию, которая с низкой вероятностью вызовет аллергические реакции.
В конкретном варианте осуществления композиция настоящего изобретения представляет собой «искусственную питательную композицию». Выражение «искусственная питательная композиция» означает смесь, полученную с помощью химических и/или биологических средств, которые могут быть химически идентичны смеси природного происхождения, присутствующей в молоке млекопитающих (т.е. искусственная композиция не является грудным молоком).
Выражение «детская смесь» при использовании в настоящем документе относится к продукту питания, который специально предназначен для употребления в пищу младенцами в течение первых месяцев жизни и сам по себе удовлетворяет потребности в питании этой категории лиц (статья 2(c) Директивы Европейской комиссии 91/321/EEC 2006/141/EC от 22 декабря 2006 г. о детских смесях и смесях для прикармливаемых детей). Оно также относится к питательной композиции, предназначенной для младенцев, как определено в Codex Alimentarius (Codex STAN 72-1981) и Infant Specialities (включая статью Food for Special Medical Purpose). Выражение «детская смесь» охватывает как «начальную детскую смесь», так и «смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей».
«Смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей» дают, начиная с 6-го месяца. Она составляет главный жидкий элемент в постепенно увеличивающемся разнообразии рациона для данной категории лиц.
Выражение «детское питание» означает продукт питания, специально предназначенный для употребления в пищу младенцами или детьми младшего возраста в течение первых лет жизни.
Выражение «детская композиция на зерновой основе» означает продукт питания, специально предназначенный для употребления в пищу младенцами или детьми младшего возраста в течение первых лет жизни.
Термин «обогатитель» относится к жидким или твердым питательным композициям, подходящим для смешивания с грудным молоком или детской смесью.
Выражения «в возрасте дней/недель/месяцев/лет» и «дней/недель/месяцев/лет после рождения» могут использоваться как взаимозаменяемые.
Под «материнским молоком» следует понимать грудное молоко или молозиво матери.
«Олигосахарид» представляет собой сахаридный полимер, содержащий небольшое число (как правило, от трех до десяти) простых сахаров (моносахаридов).
Термин «пребиотик» означает субстрат, селективно утилизируемый микроорганизмами-хозяевами, придающими полезный для здоровья эффект (Согласованное экспертное заключение: совместное заключение Международной научной ассоциации по пробиотикам и пребиотикам (ISAPP) по определению и сфере применения пребиотиков, Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2017, 14, 491–502).
Термин «пробиотик» означает живые микроорганизмы, которые при введении в соответствующих количествах обеспечивают организму-хозяину полезный для здоровья эффект (Всемирная организация по продовольствию (FAO) / Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), 2002). Клетки микроорганизмов по существу представляют собой бактерии или дрожжи.
Если не указано иное, все процентные содержания даны по массе.
Способ получения комплексов
В настоящем изобретении предложен конкретный способ получения комплексов казеина и белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7. Полученные комплексы могут представлять собой растворимые комплексы или коацерваты. Предпочтительно комплексы представляют собой коацерваты.
Способ включает в себя определенную последовательность стадий нагревания, выдерживания и охлаждения. Комплексы, полученные данным конкретным способом, являются особенно устойчивыми, и могут сохраняться, несмотря на изменения в окружающей среде, и могут быть подвергнуты жестким условиям, таким как изменение pH, нагревание, приложение механического напряжения, изменение ионной силы и добавление поверхностно-активных веществ, как будет показано в примерах.
Любой белок, имеющий изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, может образовывать комплексы с казеином при использовании способа настоящего изобретения. В предпочтительном аспекте изобретения белок имеет изоэлектрическую точку по меньшей мере 8, предпочтительно по меньшей мере 8,5, наиболее предпочтительно изоэлектрическую точку 8,9. Такие белки являются предпочтительными, поскольку чем выше изоэлектрическая точка, тем более сильной катионностью они будут обладать при нейтральном рН, а следовательно, тем проще они будут взаимодействовать с казеинами при естественном pH.
В частности, преимущественные белки, имеющие изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, включают лактоферрин, лактадгерин и лизоцим. Такие белки особенно предпочтительны благодаря полезным для здоровья эффектам, связанным с их потреблением. Например, лактоферрин был описан как играющий полезную роль в предотвращении, уменьшении и/или лечении инфекций, модулировании, стимуляции и/или поддержании иммунного ответа, стимуляции и/или поддержании роста полезной кишечной флоры, стимуляции и/или поддержании когнитивной функции, стимуляции и/или поддержании здорового роста младенца или ребенка младшего возраста; или стимуляции мягкого стула у младенца.
Для цели настоящего изобретения подходят все типы казеинов. Тем не менее β-казеин, κ-казеин и α-s1-казеин предпочтительны для добавления в продукты для младенцев и детей младшего возраста, такие как детская смесь, смесь для прикармливаемых детей, детские каши, детское питание и молочная смесь для детей от 1 до 3 лет, поскольку они естественным образом присутствуют в человеческом грудном молоке. тогда как α-s2-казеин обнаруживается в коровьем молоке, но не в грудном молоке.
Казеин, и в частности β-казеин, обладает уникальными свойствами, позволяющими образовывать комплексы. В частности, сильно гидрофильный N-концевой домен и сильно гидрофобный C-концевой домен последовательности β-казеина позволяют ему образовывать агрегаты, подобные поверхностно-активным веществам. Данный конкретный контраст в последовательности β-казеина придает этому белку свойства, особенно полезные для цели настоящего изобретения. Поскольку одна десятая аминокислот на N-конце белка содержит одну треть общего заряда, и при pI 5, на N-конце при нейтральном pH образуется высокая плотность отрицательных зарядов, что дает этому белку возможность сильно связываться с белками, которые являются катионными при этом pH.
В предпочтительном аспекте казеин представлен в форме мицеллярного казеина. В питательных композициях, таких как детская смесь, молочные смеси для детей от 1 до 3 лет, мицеллярный казеин обладает особыми преимуществами перед казеинатом. Поведение мицеллярного казеина отличается по сравнению с казеинатом, таким как, например, казеинат натрия. Особым преимуществом способа настоящего изобретения является то, что он позволяет образовывать комплексы со всеми типами казеина, как определено выше, включая мицеллярный казеин.
В предпочтительном аспекте изобретения белок, имеющий изоэлектрическую точку выше 7, представляет собой лактоферрин, а казеин представляет собой β-казеин.
На первой стадии способа изобретения (стадия (a)) обеспечивают раствор белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, и казеина. Этот раствор получают способом, известным специалисту в данной области, путем растворения обоих белков в водной среде. В предпочтительном аспекте изобретения раствор, полученный на стадии a), содержит белок, имеющий изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, и казеин в массовом соотношении от более 1 : 10 до менее 10 : 1. В предпочтительном аспекте изобретения массовое отношение белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, к казеину составляет по меньшей мере 1 : 9, предпочтительно по меньшей мере 1 : 8, более предпочтительно по меньшей мере 1 : 7, еще более предпочтительно по меньшей мере 1 : 6 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 1 : 5. В другом предпочтительном аспекте изобретения массовое отношение белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, к казеину составляет максимум 9 : 1, предпочтительно максимум 8 : 1, более предпочтительно по меньшей мере 7 : 1, еще более предпочтительно по меньшей мере 6 : 1 и наиболее предпочтительно максимум 5 : 1. Например, массовое отношение белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, к казеину может преимущественно составлять от 1 : 9 до 9 : 1, предпочтительно от 1 : 8 до 8 : 1, более предпочтительно от 1 : 7 до 7 : 1, еще более предпочтительно от 1 : 5 до 5 : 1. В особенно предпочтительном варианте осуществления массовое отношение белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, к казеину составляет от 1 : 5 до 4 : 1, предпочтительно от 1 : 5 до 3 : 1, более предпочтительно от 1 : 5 до 2 : 1, наиболее предпочтительно от 1 : 5 до 1 : 1.
Предпочтительно pH раствора белков доводят до значения в диапазоне от 6,5 до 7,5. Предпочтительно pH составляет от 6,5 до 7,3, предпочтительно он составляет от 6,5 до 7,2, предпочтительно он составляет от 6,6 до 7,1, более предпочтительно он составляет от 6,7 до 7,0, более предпочтительно от 6,7 до 6,9, наиболее предпочтительно 6,8.
В предпочтительном аспекте изобретения раствор имеет общее содержание белка от 3 до 10% по массе в расчете на общую массу раствора.
На необязательной стадии перед дальнейшей обработкой раствора белки можно кондиционировать при температуре денатурации белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7. Такую необязательную стадию кондиционирования выполняют путем нагревания раствора белка при температуре денатурации белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, и путем выдерживания раствора при этой температуре в течение по меньшей мере 2 минут, предпочтительно по меньшей мере 3 минут. Несмотря на то что эта стадия не является обязательной для образования комплексов, их образование стимулирует частичная денатурация белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, достигаемая на данной фазе кондиционирования. В ходе этой стадии под действием развертывания структуры белка различные группы становятся доступными для взаимодействия с казеином. В предпочтительном аспекте такую стадию кондиционирования выполняют при температуре от 60 до 70°C. Такой температурный диапазон, в частности, подобран для лактоферрина. Наиболее предпочтительная температура для кондиционирования лактоферрина составляет 65°C.
На второй существенной стадии способа раствор нагревают до температуры в диапазоне от 85 до 95°C, предпочтительно в диапазоне от 86 до 94°C, более предпочтительно в диапазоне от 87 до 93°C, более предпочтительно в диапазоне от 88 до 92°C, еще более предпочтительно в диапазоне от 89 до 91°C и наиболее предпочтительно 90°C. Время, необходимое для нагревания раствора до такой температуры, не имеет решающего значения для успешного образования комплексов. В принципе, чем дольше время линейного повышения, тем лучше образование комплексов. Таким образом, максимальное время для стадии линейного повышения температуры определяется наилучшим коэффициентом экономической эффективности. Такая оптимальная продолжительность времени линейного повышения может изменяться, например, в зависимости от обрабатываемого объема и может быть определена специалистом в данной области базовым методом проб и ошибок. Тем не менее оптимальные результаты получают при линейном повышении температуры в течение периода от 1 минуты до 1 часа, предпочтительно от 1 до 30 минут.
Затем раствор выдерживают при такой температуре в течение периода по меньшей мере 30 секунд, предпочтительно по меньшей мере 1 минуты. Предпочтительно не выдерживать раствор при такой температуре в течение более чем 10 минут, более предпочтительно в течение более чем 5 минут.
После такого периода выдерживания температуру линейно снижают до температуры ниже 5°C. Чтобы обеспечить образование комплексов, важно линейно снижать температуру в течение достаточно длительного периода времени. Приемлемым является период по меньшей мере 30 минут. Предпочтительно температуру линейно снижают в течение периода 1 час. Предпочтительно температуру линейно снижают в течение периода максимум 10 часов, более предпочтительно в течение периода максимум 5 часов, еще более предпочтительно в течение периода максимум 3 часа. Такое ограничение продолжительности этой стадии линейного снижения в рамках способа нацелено на сохранение экономической жизнеспособности способа. Температуру линейно снижают до температуры 5°C или ниже, предпочтительно менее 5°C, более предпочтительно до температуры 4°C или ниже. Тем не менее на такой стадии выдерживания отрицательные температуры непригодны, поскольку водный раствор белков будет замерзать, и процесс образования комплексов прекратится. Кроме того, замораживание будет обеспечивать концентрацию ионной среды вокруг белков, приводя к нежелательной дополнительной денатурации или структурным изменениям белков. Таким образом, температуру предпочтительно линейно снижают до температуры от 5 до 1°C, предпочтительно от менее 5°C до 1°C, более предпочтительно от менее 5 °C до 2°C, наиболее предпочтительно от 4 до 2°C.
Особым преимуществом линейного снижения температуры в течение продолжительного периода времени, как описано выше, является то, что оно позволяет создавать комплексы из казеина во всех формах, и в частности также с мицеллярным казеином. Медленное охлаждение существенно для разрушения мицелл и обеспечения доступности белков для взаимодействия с белком, имеющим изоэлектрическую точку по меньшей мере 7. Способ, предусматривающий внезапное охлаждение, обладает меньшими преимуществами, чем настоящий способ, поскольку он не подходит для образования комплексов из мицеллярного казеина и будет действенным только с казеинатом.
Затем после линейного снижения температуры до вышеуказанных значений раствор выдерживают при такой температуре, чтобы дать время для завершения образования комплексов. Раствор предпочтительно выдерживают при такой температуре в течение по меньшей мере 20 минут, предпочтительно в течение 30 минут. Такая минимальная продолжительность необходима для успешного образования комплексов. Время, в течение которого раствор выдерживают при таких температурах, не имеет конкретных ограничений. Как будет доказано в примерах, раствор можно хранить в холодильнике в течение нескольких дней. При этом на практике продолжительность времени выдерживания ограничена экономическими соображениями. Чрезмерная продолжительность стадии выдерживания сделает этот способ экономически нежизнеспособным. Таким образом, предпочтительно выдерживать раствор при такой температуре в течение максимум 1 дня, предпочтительно максимум 10 часов, более предпочтительно максимум 5 часов, наиболее предпочтительно максимум 3 часов.
Комплексы
Комплексы, предпочтительно коацерваты, полученные или получаемые способом настоящего изобретения, отличаются от комплексов, полученных стандартным способом, заключающимся только в регулировании pH раствора белка при определенной температуре, ионной силе и стехиометрическом соотношении. Последовательные стадии нагревания, охлаждения и выдерживания белковых композиций при определенных температурах в течение определенных периодов времени, как описано выше, приводят к значительным изменениям в структуре комплексов, что делает комплексы более устойчивыми по сравнению с комплексами предшествующего уровня техники, а именно к нагреванию, модификациям pH, механическому напряжению и присутствию поверхностно-активных веществ. Таким образом, комплексы, полученные или получаемые способом в соответствии с любым из вышеописанных вариантов осуществления, также являются предметом настоящего изобретения.
Предпочтительными комплексами в соответствии с настоящим изобретением являются комплексы, предпочтительно коацерваты, лактоферрина и казеина, еще более предпочтительно комплексы лактоферрина и β-казеина, наиболее предпочтительно коацерваты лактоферрина и β-казеина.
Продукты, содержащие комплексы
Комплексы настоящего изобретения могут преимущественно быть добавлены во все виды продуктов, в которые желательно добавлять казеин и/или белок, имеющий изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, такой как, например, лактоферрин, лактадгерин и/или лизоцим.
Продукт может представлять собой любой тип продукта, в который можно включать комплексы, такой как продукт в форме пищевого или питьевого продукта, продукт для кормления животных, питательная добавка для людей или животных, фармацевтическая композиция или косметическая композиция. Продукт может иметь твердую, жидкую или полужидкую форму.
Пищевые и питьевые продукты включают все продукты, предназначенные для употребления людьми перорально с целью получения питания и/или удовольствия. Это может, например, быть питательная композиция, такая как композиция для младенцев и/или детей младшего возраста, для беременных или кормящих женщин или для женщин, желающих забеременеть, для людей, которым необходимо специальное питание из-за неблагоприятного состояния здоровья, или для пожилых людей. Более предпочтительно питательную композицию выбирают из детской смеси, детских каш, смеси последующего уровня, молочных смесей для детей от 1 до 3 лет или молочных продуктов для беременных и кормящих женщин или для женщин, желающих забеременеть. Другие примеры пищевых и питьевых продуктов включают молочные продукты, такие как продукты на основе молока или йогурты, супы, соусы, сладкие и несладкие снэки, напитки в порошке и продукты из зерновых. Как правило, молочные продукты преимущественно содержат комплексы настоящего изобретения, поскольку казеин уже естественным образом присутствует в таких ингредиентах.
Продукт может также быть представлен в форме пищевого продукта для животных или питательной добавки для животных. Предпочтительно животное представляет собой млекопитающее. Примеры животных включают приматов (например, людей), коров, овец, коз, лошадей, собак, кошек, кроликов, крыс, мышей, рыб, птиц и т.п.
Питательные добавки, как правило, присутствуют в форме жидкости, геля, порошка либо таблетки или капсулы. Порошковые добавки, как правило, охватывают добавки, предназначенные для растворения в воде либо посыпания пищевого продукта или добавления в напиток. Такие добавки предназначены для обеспечения употребляющего их субъекта дополнительными питательными веществами и/или полезным для здоровья эффектом, а также другими полезными ингредиентами, такими как, например, лактоферрин, лактадгерин и/или лизоцим. Добавку в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для обеспечения питательными веществами и/или эффектом, полезным для здоровья людей, а также животных, как определено выше. Питательные добавки включают, например, порошковые добавки для добавления в грудное молоко, например для преждевременно родившихся младенцев или младенцев с низким весом при рождении. Они также включают добавки для беременных или кормящих женщин или для женщин, желающих забеременеть.
Фармацевтические продукты включают, например, продукты в форме капель, сиропов, порошка, таблетки или капсулы, предназначенные для лечения профилактики неблагоприятного медицинского состояния у нуждающегося в этом субъекта.
Косметические композиции, как правило, предназначены для эстетического воздействия на организм и могут быть для местного применения или введения пероральным путем.
Продукт настоящего изобретения предпочтительно содержит комплексы настоящего изобретения в терапевтически эффективном количестве.
В предпочтительном варианте осуществления продукт настоящего изобретения представляет собой детскую смесь, детскую композицию на зерновой основе, смесь последующего уровня или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет, содержащую комплексы, предпочтительно коацерваты, лактоферрина и казеина, более предпочтительно комплексы лактоферрина и β-казеина, наиболее предпочтительно коацерваты лактоферрина и β-казеина. В таких продуктах комплексы предпочтительно присутствуют в количестве, обеспечивающем от 0,5 до 10 г, предпочтительно от 1 до 10 г, более предпочтительно от 2 до 7 г лактоферрина на литр продукта.
Все типы продуктов в соответствии с изобретением можно готовить и производить согласно знаниям специалиста в данной области. Преимуществом комплексов настоящего изобретения является то, что они достаточно устойчивы для обработки вместе с другими ингредиентами продуктов.
Например, при производстве высушенного распылением продукта, такого как детская смесь, молочная смесь для детей от 1 до 3 лет или смесь последующего уровня в порошковой форме, комплексы достаточно устойчивы для добавления во влажную смесь и сушки распылением вместе с другими ингредиентами продукта. Это является преимуществом с точки зрения экономичности способа, поскольку устраняет необходимость в асептическом дозировании и сухом смешивании чувствительных белков, подобных лактоферрину, лактадгерину и/или лизоциму. Дополнительно введение комплексов во влажную смесь является преимуществом с точки зрения структуры продукта. В частности, комплексы будут однородно смешиваться с другими ингредиентами. Напротив, применение сухих смешанных порошков может приводить к получению неоднородных продуктов в связи с различием в свойствах смешанных порошков, таким как, например, различие в плотности или размере частиц. Неоднородность может приводить к неточному дозированию белков.
Таким образом, способ получения продукта, выбранного из детской смеси, смеси последующего уровня или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет в порошковой форме, включающий приготовление концентрата продукта, содержащего комплексы в соответствии с настоящим изобретением и указанный концентрат продукта, высушенный распылением, также является предметом настоящего изобретения. Приготовление влажной смеси и распылительную сушку осуществляют согласно общим знаниям специалиста в данной области.
В другом аспекте в изобретении предложен способ получения продукта, выбранного из жидкой детской смеси, смеси последующего уровня или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет, включающий смешивание комплексов настоящего изобретения с жидкой основой продукта и асептическую обработку основы продукта, содержащей комплексы. Приготовление жидкой основы продукта и асептическую обработку осуществляют согласно общим знаниям специалиста в данной области.
Первое медицинское применение
Преимуществом комплексов, предпочтительно коацерватов, или продукта, содержащего комплексы, предпочтительно содержащего коацерваты, как описано выше, является то, что их можно применять в терапии. Таким образом, в изобретении также предложены такие комплексы и такие продукты для применения в терапии. В особенно предпочтительном аспекте в изобретении предложены комплексы, предпочтительно коацерваты лактоферрина, лактадгерина или лизоцима и казеина, и продукты, содержащие такие комплексы или коацерваты, для применения в терапии. Еще более предпочтительно такие комплексы представляют собой комплексы, предпочтительно коацерваты лактоферрина и казеина, предпочтительно лактоферрина и β-казеина.
В настоящем документе под терапией подразумевают вылечивание или предотвращение заболевания или нарушения функции организма, и она также охватывает профилактическое лечение, т. е. предотвращение неблагоприятного медицинского состояния. В настоящем документе под терапией подразумевают также осуществление медицинской и ветеринарной терапии.
Иными словами, настоящее изобретение относится к методу лечения субъекта, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества комплекса или продукта в соответствии с настоящим изобретением.
В другом варианте осуществления изобретение относится к применению комплексов или продукта в соответствии с настоящим изобретением для производства лекарственного средства.
Дополнительные виды медицинского применения
В настоящем изобретении предложены комплексы, предпочтительно коацерваты, лактоферрина и казеина или продукт, содержащий такие комплексы, как описано выше, для применения в рамках следующих конкретных терапевтических способов:
a) предотвращение, уменьшение и/или лечение инфекций;
b) модулирование, стимуляция и/или поддержание иммунного ответа;
c) стимуляция и/или поддержание роста полезной кишечной флоры;
d) стимуляция и/или поддержание когнитивной функции;
е) стимуляция и/или поддержание здорового роста младенца или ребенка младшего возраста; или
f) стимуляция мягкого стула у младенца.
В предпочтительном варианте осуществления в изобретении предложены комплексы, предпочтительно коацерваты, лактоферрина и β-казеина или продукт, содержащий такие комплексы, как описано выше, для применения в рамках следующих конкретных терапевтических способов:
a) предотвращение, уменьшение и/или лечение инфекций;
b) модулирование, стимуляция и/или поддержание иммунного ответа;
c) стимуляция и/или поддержание роста полезной кишечной флоры;
d) стимуляция и/или поддержание когнитивной функции;
е) стимуляция и/или поддержание здорового роста младенца или ребенка младшего возраста; или
f) стимуляция мягкого стула у младенца.
В предпочтительном варианте осуществления в изобретении предложена детская смесь, смесь для прикармливаемых детей или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет, содержащая комплексы, предпочтительно коацерваты, лактоферрина и β-казеина, как описано выше, для применения в рамках следующих конкретных терапевтических способов:
a) предотвращение, уменьшение и/или лечение инфекций;
b) модулирование, стимуляция и/или поддержание иммунного ответа;
c) стимуляция и/или поддержание роста полезной кишечной флоры;
d) стимуляция и/или поддержание когнитивной функции;
е) стимуляция и/или поддержание здорового роста младенца или ребенка младшего возраста; или
f) стимуляция мягкого стула у младенца.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью следующих примеров.
Пример 1: приготовление и обнаружение комплексов в соответствии с настоящим изобретением
Маточные растворы лактоферрина (источник: Westland Milk Products (HY03; 98,9% белка; от Westand) и мицеллярного β-казеина (источник: Ultranor Beta (Y044; 75% белка; от Kerry) при концентрации белка 5,5% масс./масс. готовили и оставляли для солюбилизации на 2 часа при перемешивании с помощью магнитной мешалки Stuart Stirrer Multiposition SB 162-3 со скоростью 3. Затем, чтобы получить смесь в массовом соотношении 1 : 1 (β-cn : Lf), соответствующие объемы каждого маточного раствора взвешивали и смешивали вместе в течение 2 минут с помощью пастеровской пипетки. Затем pH доводили до 6,8 с использованием 0,1 М HCl / NaOH, и раствор непосредственно помещали в реометр (AR2000ex, от TA Instruments) для обработки нагреванием. В чашу для образцов реометра отвешивали 28 г (±0,05 г) смеси. Затем образец подвергали обработке с помощью устройства статистического контроля процесса (SPC) в режиме нагревания - охлаждения - выдерживания, как описано ниже в таблице 1.
Таблица 1. Журнал обработки с помощью SPC в режиме нагревания - охлаждения - выдерживания
Нормальное усилие: 0
Угловая скорость предварительного сдвига: 16,78 (рад/с) в течение 1 минуты
Равновесное состояние: 2 минуты
Продолжительность: 1 минута и 20 секунд
Угловая скорость: 16,78 (рад/с)
Продолжительность линейного изменения: 2 минуты и 4 секунды
Угловая скорость: 16,78 (рад/с)
Продолжительность линейного изменения: 1 минута и 20 секунд
Механическое воздействие (Па): 0,1080
Продолжительность: 1 минута
Угловая скорость: 16,78 (рад/с)
Продолжительность линейного изменения: 1 час
Угловая скорость: 16,78 (рад/с)
Продолжительность: 30 минут
Угловая скорость: 16,78 (рад/с)
Полученный раствор анализировали методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Heildelberg GmbH, Мангейм, Германия). Небольшое количество образца помещали на предметное стекло. Образцы окрашивали путем добавления пипеткой 10 мкл красителя «нильский зеленый» (0,001 г/100 мл) на поверхность образца. Сверху помещали покровное стекло. Получали 3D-изображения посредством карт срезов комплексов по оси z. Карты срезов по оси Z получают путем визуализации множества плоскостей образцов, в результате чего можно создать 3D-изображение.
В ходе КЛСМ-анализа было выявлено, что образовывались комплексы β-казеина и лактоферрина. На Фиг. 1 показано фотографическое изображение, полученное посредством карты срезов образца по оси Z с использованием 63 линз объектива. Коацерваты образуют сферические частицы равномерной формы. Коацерваты также характеризуются пористой структурой со множеством вакуолей, которые отмечены на фигуре белыми стрелками.
Затем образец центрифугировали при относительном ускорении центрифуги (RCF) 8000 в течение 5 минут при 20°C. Можно увидеть четкое разделение между слоем осадка (коацерват) и слоем надосадочной жидкости (фаза равновесного разведения), как показано на Фиг. 2B. И осадок (гранула), и надосадочная жидкость были подвергнуты КЛСМ-анализу, как описано выше. На Фиг. 2A представлено КЛСМ-изображение гранулы с 20 линзами объектива. Коацерваты вновь четко видны как сферические частицы.
Затем композицию подвергали 24-часовому охлаждению при 4°C. Слой осадка, содержащий коацерваты, анализировали посредством КЛСМ до (Фиг. 3A) и после (Фиг. 3B) дня охлаждения. Несмотря на то что на обоих изображениях представлены отдельные и имеющие четкую форму коацерваты, явно видно различие в размере, указывающее на то, что коацерваты уменьшаются в размере по мере увеличения времени выдерживания при низкой температуре. Такое уменьшение в размере связано со снижением частоты встречаемости вакуолей внутри структуры коацерватов.
Как будет показано в следующих сравнительных примерах, образование коацерватов представляет собой результат комбинации последовательных стадий нагревания, медленного охлаждения и выдерживания при низкой температуре. Воздействие на композицию β-казеина и лактоферрина только медленного охлаждения и выдерживания при 4°C, а также только обработки нагреванием не привело к успешному получению коацерватов.
Пример 2: композиция лактоферрина и β-казеина без обработки нагреванием или охлаждением (сравнительный)
Маточные растворы лактоферрина (источник: Westland Milk Products (HY03; 98,9% белка) и мицеллярного β-казеина (источник: Ultranor Beta (Y044; 75% белка) при концентрации белка 5,5% масс./масс. готовили путем растворения белка в воде. Раствор лактоферрина и β-казеина в массовом соотношении 1 : 1 готовили путем смешивания двух маточных растворов. Затем pH доводили до 6,8. Такой раствор кондиционировали при 65 °C в течение приблизительно 3 минут.
Полученный раствор анализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ). Небольшое количество образца помещали на предметное стекло. Образцы окрашивали путем добавления пипеткой 10 мкл красителя «нильский зеленый» (0,001 г/100 мл) на поверхность образца. Сверху помещали покровное стекло.
Комплексы лактоферрина и β-казеина не образовывались. В частности, как видно на Фиг. 4, в образце не было обнаружено коацерватов.
Пример 3: медленное охлаждение композиции лактоферрина и β-казеина (сравнительный)
Маточные растворы лактоферрина (источник: Westland Milk Products (HY03; 98,9% белка) и мицеллярного β-казеина (источник: Ultranor Beta (Y044; 75% белка) при концентрации белка 5,5% масс./масс. готовили путем растворения белка в воде. Раствор лактоферрина и β-казеина в массовом соотношении 1 : 1 готовили путем смешивания двух маточных растворов. Затем pH доводили до 6,8. Такой раствор кондиционировали при 65 °C в течение приблизительно 3 минут.
Затем температуру линейно снижали с 65 °C до 4 °C в течение 1 часа. Затем раствор выдерживали при 4 °C в течение 30 минут. Полученный раствор анализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ). Небольшое количество образца помещали на предметное стекло. Образцы окрашивали путем добавления пипеткой 10 мкл красителя «нильский зеленый» (0,001 г/100 мл) на поверхность образца. Сверху помещали покровное стекло.
Комплексы лактоферрина и β-казеина не образовывались. В частности, как видно на Фиг. 5, в образце не было обнаружено коацерватов.
Пример 4: обработка композиции лактоферрина и β-казеина нагреванием (сравнительный)
Маточные растворы лактоферрина (источник: Westland Milk Products (HY03; 98,9% белка) и мицеллярного β-казеина (источник: Ultranor Beta (Y044; 75% белка) при концентрации белка 5,5% масс./масс. готовили путем растворения белка в воде. Раствор лактоферрина и β-казеина в массовом соотношении 1 : 1 готовили путем смешивания двух маточных растворов. Затем pH доводили до 6,8. Такой раствор кондиционировали при 65°C в течение приблизительно 3 минут.
Затем температуру линейно повышали с 65°C до 90°C. Впоследствии раствор выдерживали при 90 °C в течение 1 минуты, а затем температуру линейно снижали с 90 до 10°C в течение 5 минут. Затем его выдерживали при 10°C в течение 5 минут. Полученный раствор анализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ). Небольшое количество образца помещали на предметное стекло. Образцы окрашивали путем добавления пипеткой 10 мкл красителя «нильский зеленый» (0,001 г/100 мл) на поверхность образца. Сверху помещали покровное стекло.
Комплексы лактоферрина и β-казеина не образовывались. В частности, как видно на Фиг. 6, в образце не было обнаружено коацерватов.
Пример 5: оценка устойчивости комплексов
Устойчивость коацерватов, полученных, как описано в примере 1, оценивали путем воздействия на такие коацерваты различных видов обработки и последующей оценки того, присутствуют ли еще коацерваты на изображениях под световым микроскопом.
В первом опыте гранулу коацерватов, полученную в примере 1, разводили в 0,1%-м растворе додецилсульфата натрия (ДСН). На Фиг. 7 показано, что даже после контакта с этим ионным поверхностно-активным веществом коацерваты оставались стабильными.
Во втором эксперименте гранулу коацерватов, полученную в примере 1, разводили 0,02 н. раствором HCl, а затем центрифугировали при RCF 20 000 в течение 20 минут при 4°C. Несмотря на кислотную обработку и центрифугирование, коацерваты оставались стабильными, как можно увидеть на Фиг. 8, где показаны коацерваты, присутствующие в грануле.
В третьем эксперименте стабильность коацерватов в кислой среде оценивали путем разведения гранулы коацерватов, полученной в примере 1, в воде и доведения pH до 3,5. На Фиг. 9 показано, что коацерваты все еще присутствуют. На Фиг. 10 также показано, что коацерваты по-прежнему сохраняются после последующей обработки нагреванием при 70°C в течение 15 минут при pH 3,5.
В четвертом эксперименте исследовали влияние основного pH. Гранулу коацерватов, полученную в примере 1, разводили в воде и доводили pH до 10. На Фиг. 11 показано, что коацерваты остаются стабильными. На Фиг. 12 показано, что это также происходит в случае нагревания коацерватов до 70°C в течение 15 минут после регулирования pH.
В пятом эксперименте была проведена оценка влияния ионной силы на стабильность коацерватов путем разведения гранулы коацерватов, полученной в примере 1, в 100 мМ NaCl. В таких условиях коацерваты также оставались стабильными, как показано на Фиг. 13. На Фиг. 13A коацерваты увеличены в 10 раз, а на Фиг. 13B - в 20 раз.
Результаты этих экспериментов показывают, что коацерваты, полученные способом настоящего изобретения, по существу более стабильны, чем коацерваты, образованные, как описано в литературе предшествующего уровня техники. Действительно, было описано, что такие коацерваты предшествующего уровня техники, которые образуют путем регулирования рН раствора лактоферрина и β-казеина, нестабильны, в частности при нагревании или под действием изменения pH. В настоящем примере показано, что коацерваты настоящего изобретения неожиданно остаются стабильными в широком диапазоне pH и могут выдерживать нагревание, жесткое механическое напряжение, а также не растворяются в присутствии поверхностно-активных веществ.
Пример 6: влияние массового соотношения лактоферрина и β-казеина на образование комплексов
Пример 1 повторяли, используя в качестве исходного раствор лактоферрина и β-казеина в массовом соотношении 1 : 5 и раствор лактоферрина и β-казеина в массовом соотношении 1 : 10. За исключением изменения такого соотношения, способ был идентичен описанному в примере 1.
На Фиг. 14 видно, что коацерваты образуются при массовом отношении лактоферрина к β-казеину 1 : 5, даже несмотря на то что имеют меньший размер, чем полученные при массовом отношении 1 : 1. На Фиг. 14 на мелком снимке показано 4-кратное увеличение зоны, обозначенной черной стрелкой.
Напротив, при массовом отношении лактоферрина к β-казеину 1 : 10 коацерваты не образовывались.
Относится к биотехнологии и пищевой промышленности. Предложен способ получения комплексов белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7 и выбранного из лактоферрина, лактадгерина и лизоцима, с казеином. Способ включает стадии: a. обеспечения раствора белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, и казеина при pH в диапазоне от 6,5 до 7,5, в котором раствор, обеспеченный на стадии a), содержит белок, имеющий изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, и казеин в массовом соотношении более 1 : 10 и менее 10 : 1; b. линейного повышения температуры раствора, обеспеченного на стадии а) от температуры денатурации белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, до температуры в диапазоне от 85 до 95°C; c. выдерживания раствора стадии b) при температуре от 85 до 95°C в течение по меньшей мере 30 секунд; и d. линейного снижения температуры раствора стадии с) с 85–95°C до температуры ниже 5°C в течение периода по меньшей мере 30 минут; e. выдерживания раствора стадии d) при температуре ниже 5°C в течение по меньшей мере 15 минут. Предложен комплекс белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7 с β-казеином; пищевой продукт; применение комплекса для производства лекарственного средства; применение продукта для производства лекарственного средства. Изобретение позволяет получить комплексы более устойчивые по сравнению с комплексами предшествующего уровня техники, а именно к нагреванию, модификациям pH, механическому напряжению и присутствию поверхностно-активных веществ. 5 н. и 13 з.п. ф-лы, 1 табл., 14 ил., 6 пр.
1. Способ получения комплексов белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7 и выбранного из лактоферрина, лактадгерина и лизоцима, с казеином, включающий стадии:
a. обеспечения раствора белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, и казеина при pH в диапазоне от 6,5 до 7,5, в котором раствор, обеспеченный на стадии a), содержит белок, имеющий изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, и казеин в массовом соотношении более 1 : 10 и менее 10 : 1;
b. линейного повышения температуры раствора, обеспеченного на стадии а) от температуры денатурации белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, до температуры в диапазоне от 85 до 95°C;
c. выдерживания раствора стадии b) при температуре от 85 до 95°C в течение по меньшей мере 30 секунд; и
d. линейного снижения температуры раствора стадии с) с 85–95°C до температуры ниже 5°C в течение периода по меньшей мере 30 минут,
e. выдерживания раствора стадии d) при температуре ниже 5°C в течение по меньшей мере 15 минут.
2. Способ по п. 1, который представляет собой способ получения коацерватов белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, с казеином.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором стадию кондиционирования раствора со стадии a) при температуре денатурации белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, в течение по меньшей мере 2 минут проводят перед линейным повышением температуры на стадии b).
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором белок имеет изоэлектрическую точку по меньшей мере 8.
5. Способ по п. 4, в котором белок имеет изоэлектрическую точку по меньшей мере 8,5.
6. Способ по п. 5, в котором белок имеет изоэлектрическую точку по меньшей мере 8,9.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором казеин представляет собой α-казеин или β-казеин.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором раствор, полученный на стадии a), содержит белок, имеющий изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, и казеин в массовом соотношении от 1 : 5 до 5 : 1.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором раствор, полученный на стадии a), имеет pH от 6,6 до 7,4.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором на стадии е) выдерживают раствор стадии d) при температуре от 2 до 5°C после линейного снижения температуры.
11. Способ по п. 1, в котором белок, имеющий изоэлектрическую точку по меньшей мере 7, представляет собой лактоферрин.
12. Комплекс белка, имеющего изоэлектрическую точку по меньшей мере 7 с β-казеином, получаемый или полученный способом по любому из пп. 1–11.
13. Комплекс по п. 12, который представляет собой коацерват.
14. Пищевой продукт, содержащий комплекс по п. 12 или 13.
15. Применение комплекса по п. 12 или 13 для производства лекарственного средства.
16. Применение по п. 15, где лекарственное средство предназначено для:
a) предотвращения, уменьшения и/или лечения инфекций;
b) модулирования, стимуляции и/или поддержания иммунного ответа;
c) стимуляции и/или поддержания роста полезной кишечной флоры;
d) стимуляции и/или поддержания когнитивной функции;
е) стимуляции и/или поддержания здорового роста младенца или ребенка младшего возраста; или
f) стимуляции мягкого стула у младенца.
17. Применение продукта, содержащего комплекс по п. 12 или 13, для производства лекарственного средства.
18. Применение по п. 17, где лекарственное средство предназначено для:
a) предотвращения, уменьшения и/или лечения инфекций;
b) модулирования, стимуляции и/или поддержания иммунного ответа;
c) стимуляции и/или поддержания роста полезной кишечной флоры;
d) стимуляции и/или поддержания когнитивной функции;
е) стимуляции и/или поддержания здорового роста младенца или ребенка младшего возраста; или
f) стимуляции мягкого стула у младенца.
| WO 2012045801 A1, 12.04.2012 | |||
| LI QUANYANG et al | |||
| Formation of lactoferrin/sodium caseinate complexes and their adsorption behaviour at the air/water interface, FOOD CHEMISTRY, ELSEVIER LTD, NL, (20170413), vol | |||
| Крутильно-намоточный аппарат | 1922 |
|
SU232A1 |
| Пароперегреватель для паровозов | 1925 |
|
SU697A1 |
| Skelte G Anema et al | |||
| Protein composition of different sized casein micelles in milk after the binding of lactoferrin | |||
