Способ определения радиационно-индуцированного атеросклеротического поражения сосудов у работников, занятых во вредных для здоровья условиях труда на радиационно-опасном предприятии Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/92 G01N33/573 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения маркеров атеросклероза у работников, занятых во вредных для здоровья условиях труда на радиационно-опасном предприятии.

Атеросклеротическое поражение эндотелия сосудов - это патология, лежащая в основе ишемической болезни сердца и цереброваскулярных заболеваний, включая острый инфаркт миокарда и мозговой инсульт, а также облитерирующих заболеваний периферических артерий. Образование и рост атеросклеротических бляшек в субэндотелиальном слое интимы вследствие нарушения белкового и липидного обмена приводит к постепенному локальному стенозу коронарных, мозговых и других артерий. В настоящее время атеросклероз считают хроническим воспалительным заболеванием с аутоиммунным компонентом (Kobiyama K., Ley K. Atherosclerosis // Circ Res. - 2018. - Vol. 123. - Р. 1118-1120). Развитию атеросклероза способствуют дисфункция эндотелия, локальные спазмы артерий, нарушение микроциркуляции и воспаление сосудистой стенки (Аронов Д.М., Лупанов В.П. Некоторые аспекты патогенеза атеросклероза // Атеросклероз и дислипидемии. - 2011. - №1. - С. 48-65).

Известны многочисленные факторы (генетические, биологические, образ жизни, факторы окружающей среды), увеличивающие риск развития атеросклероза. В когортах лиц, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения, повышен риск сердечно сосудистых заболеваний (UNSCEAR. United Nations Scientific Committee on the effects of atomic Radiation. Report. V. I. Annex B. Epidemiological evaluation of cardiovascular disease and other non-cancer diseases. - New York: United Nations, 2006. - P. 325-383; Azizova T.V., Grigoryeva E.S, Batistatou E., Wakeford R., et al. An Assessment of Radiation-Associated Risk of Mortality from Circulatory Disease in the Cohorts of Mayak and Sellafield Nuclear Workers // Radiat Res. - 2018. - V. 189(4). - P. 371-388; Tanga F. R., Loganovsky K. Low dose or low dose rate ionizing radiation-induced health effect in the human // J. Env. Rad. - №192. - 2018. - P. 32-47; Little M.P., Azizova T.V., Bazyka D. et al. Systematic review and meta_analysis of circulatory disease from exposure to low_level ionizing radiation and estimates of potential population mortality risks // Environ. Health Perspect. - 2012. - V. 120. - №11. - P. 1503-1511). Ионизирующее излучение модифицирует практически все звенья патогенеза атеросклероза и может инициировать раннее начало или усиливать развитие этого заболевания, поскольку вызывает оксидативный стресс, эндотелиальную дисфункцию, воспаление и дислипидемию, а также нарушения в системе свертывания крови, повреждения ДНК и апоптоз (Azimzadeh O, Azizova T, Merl-Pham J, Subramanian V, Bakshi M, Moseeva M, Zubkova O, Hauk SM, Anastason N, Atkinson MJ, Tapio S. A dose-dependent perturbation in cardiac energy metabolism is linked to radiation-induced ischemic heart disease in Mayak nuclear workers // Oncotarget. - 2017. - V. 8(6). - P. 9067-9078; Borghini A., Gianicolo E.A., Picano E., Andreassi M.G. Ionizing radiation and atherosclerosis: current knowledge and future challenges // Atherosclerosis. - 2013. - V. 230. - №1. - P. 40-47).

В настоящее время существует необходимость в доступных прогностических маркерах, которые могут быть обнаружены в образцах периферической крови, отражают различные стадии атеросклеротического процесса и дают возможность выявить атеросклеротическое поражение сосудов у лиц, подвергшихся профессиональному хроническому облучению:

Существует способ (патент РФ №2384847 С2, опубликован 20.03.2010) идентификации предрасположенности к атеросклерозу и восприимчивости к развитию атеросклеротических бляшек и/или обструкции сосудов, который включает анализ образца для определения процентной частоты по меньшей мере двух субпопуляций Т-лимфоцитов и сравнение данных со сравнительными и/или контрольными данными, где по меньшей мере одна из указанных субпопуляций Т-лимфоцитов представляет собой популяцию CD8 Т-клеток, выбранную из списка, состоящего из CD8+/CD11L+/CD45RA+, CD8+/CD11L+/CD45RO+, CD8+CD11a+, CD8+CD62L+, CD8+CD11highRO+ и CD8+CD38+RO+, и по меньшей мере одна другая из указанных субпопуляций Т-лимфоцитов представляет собой популяцию CD4 Т-клеток, выбранную из списка, состоящего из CD4+/62L+, CD4+CD49d+, CD4+CD25+, CD4+DRII+, CD4+CD44+ и CD4+CD3+RO+. Также дополнительно определяют концентрации одного или нескольких растворимых факторов, выбранных из группы, состоящей из цитокинов, хемокинов, интегринов и селектинов, внутриклеточно в плазме или сыворотке (например, интерлейкин-1 (α или β), интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-6, интерлейкин-7, интерлейкин-8, интерлейкин-9, интерлейкин-10, интерлейкин-11, интерлейкин-12, интерлейкин-13, интерлейкин-14, интерлейкин-15, интерлейкин-16 или интерлейкин-17), и сравнивают полученные данные со сравнительными и контрольными данными. Недостатки данного способа заключаются в том, что в нем не указано какие именно показатели из множества перечисленных и в каком сочетании дают возможность судить о предрасположенности к атеросклерозу.

Способ ранней диагностики атеросклероза (патент UA 29360 (Донецкий государственный университет им. М. Горького, UF), 10.01.2008), включает определение содержания общего холестерина, ЛПНП, ЛПВП, триглицеридов, а также проведение -ультразвукового дуплексного сканирования брахиоцефальных сосудов с измерением толщины комплекса интима-медиа общих сонных артерий для диагностики атеросклероза. В другом способе (патент РФ №2498307, опубл. 10.11.2013) предлагается определять содержание окисленных липопротеидов низкой плотности (оЛПНП) в сыворотке крови; при концентрации оЛПНП более 400 нг/мл устанавливают повышенную степень риска формирования клинических осложнений атеросклероза.

Известен способ диагностики предрасположенности к прогрессированию атеросклероза у больных с хронической ишемической болезнью сердца по отношению концентраций интерлейкина-10 (ИЛ-10) и интерлейкина-17 (ИЛ-17) в периферической крови, позволяющего в краткосрочной перспективе выявлять пациентов с высоким риском прогрессирования атеросклероза коронарных и сонных артерий (Патент РФ №2566288, опубл. 20.10.2015). Другой способ (патент РФ №2704960, опубл. 31.10.2019) состоит в том, что производят измерение окружности талии в сантиметрах в положении стоя (измерение проводится сантиметровой лентой на уровне середины расстояния между реберными дугами и гребнями подвздошных костей), а также, с помощью иммуноферментного анализа определяют уровень интрелейкина-6 в сыворотке крови. При наличии совокупности признаков: окружность талии 98 см и более, и концентрация интерлейкина-6 в сыворотке крови 17,4 пг/мл и выше - диагностируют высокий риск атеросклероза.

Перечисленные способы, несмотря на простоту и удобство, не учитывают особенности развития атеросклероза у лиц, подвергшихся профессиональному хроническому облучению.

Прототипом изобретения является способ индивидуальной количественной оценки риска развития клинических проявлений атеросклероза (заявка на изобретение РФ №2007131472, опубл. 20.02.2009), который заключается в том, что на предварительном этапе проводят массовое обследование пациентов, входящих в интересующую популяцию на различных известных стадиях развития патологии, с определением значений биохимических, иммунологических, физиологических и клинических показателей. На этом же этапе проводят дискриминантами анализ полученных значений показателей, в результате которого получают весовые коэффициенты для каждого показателя и константу смещения. Далее определяют значения интегрального показателя состояния здоровья для каждого обследованного пациента как взвешенную сумму значений всех полученных показателей, умноженных на соответствующий им весовой коэффициент, и прибавленную к ней константу смещения. Затем по частоте заболеваемости определяют оценку риска развития клинических проявлений атеросклероза. В этом способе предлагается использовать 25 биохимических, иммунологических и физиологических показателей, что делает его трудоемким, длительным, а также экономически затратным. Указанный способ мало применим для выявления радиационно-индуцированного атеросклероза.

Задачей изобретения является создание удобного, эффективного относительно недорогого метода индикации радиационно-индуцированного атеросклероза у работников атомной промышленности, подвергающихся хроническому облучению с низкой мощностью дозы.

В изобретении предлагается использовать супероксиддисмутазу, аполипопротеин В, моноцитарный хемотаксический фактор 1, васкулярную молекулу клеточной адгезии 1 и эндотелии 1. Критерием выбора маркеров являлись данные о вовлеченности маркера в определенный патогенетический механизм атеросклероза и наличие научно-доказательных данных о влиянии ионизирующего облучения на выбранный показатель.

Супероксиддисмутаза выполняет важнейшую функцию в защите от реактивных форм кислорода, перерабатывая супероксид анионы в пероксид водорода. Установлено, что активность супероксиддисмутазы была повышена у врачей-радиологов, подвергшихся хроническому профессиональному облучению в малых дозах (Eken A., Aydin A., Erdem O., et al. Induced antioxidant activity in hospital staff occupationally exposed to ionizing radiation // International Journal of Radiation Biology. - 2012. - V. 88(9). - Р. 648-653) и у медицинских работников из отделений диагностической радиологии, лучевой терапии, интервенционной радиологии и ядерной медицины (Gao J., Dong X., Liud T., et al. Antioxidant status and cytogenetic damage in hospital workers occupationally exposed to low dose ionizing radiation // Mutat. Res. Gen. Tox. En. - 2020. - P. 850-851: 503152 (online); Available at https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2020.503152).

Аполипопротеин В - аполипопротеин в составе липопротеинов низкой плотности, обладающий атерогенными свойствами, который вызывает накопление холестерина в стенках кровеносных сосудов и способствует формированию холестериновой бляшки (Wang J., Tan G.J., Han L.N., et al. Novel biomarkers for cardiovascular risk prediction // J. Geriatr. Cardiol. - 2017. - V. 14(2). - P. 135-150). Результаты исследования липидного обмена у лиц, подвергшихся радиационному воздействию, свидетельствуют о дислипидемии, которая сохраняется долгое время после облучения (Wong N.D. Epidemiological studies of CHD and the evolution of preventive cardiology // Nat.Rev. Cardiol. - 2014. - №.11. - P. 276-289; Hayashi T., Kusunoki Y., Hakoda M. et al. Radiation dose-dependent increases in inflammatory response markers in Atomic bomb survivors // Int. J. Radiat.Biol. - 2003. - V. 79. - №2. - P. 129-136).

Васкулярная молекула клеточной адгезии 1 участвует в адгезии лейкоцитов и эндотелиальных клеток и опосредует накопление макрофагов в интиме сосудов на ранних этапах атеросклероза. Показано, что воздействие ионизирующего излучения вызывает повышение экспрессии молекул адгезии опосредованно через реактивные формы кислорода (Baluna R., Eng T.Y., Thomas C.R., Jr. Adhesion Molecules in Radiotherapy // Radiation Research. - 2006. - V. 166(6). - Р. 819-831).

Моноцитарный хемотаксический фактор 1 является мощным фактором хемотаксиса моноцитов, и вызывает усиление миграции клеток к фокусам воспаления в стенках поврежденных сосудов (Rossi D., Zlotnik A. The biology of chemokines and their receptors // Annu. Rev. Immunol. - 2000. - V. 18. - Р. 217-242). У работников, подвергшихся профессиональному внешнему гамма-облучению, в плазме крови выявлены статистически значимо повышенные уровни этого маркера, и выявлена положительная корреляция между суммарной дозой облучения и уровнем моноцитарного хемотаксического фактора 1 (Aneva N., Zahatieva Е., Katsarska О., et al. Inflammatory profile dysregulation in nuclear workers occupationally exposed to low-dose gamma radiation // Journal of Radiation Research. - 2019. - V. 60(6). - Р. 768-779).

Эндотелин-1 вызывает противоположные сосудистые реакции (вазоконстрикции либо вазодилатации) посредством рецепторов двух типов (ET_A и ET_B). В физиологических концентрациях эндотелин-1 взаимодействует со специфическими рецепторами ET_B на поверхности клеток эндотелия, что приводит к высвобождению факторов релаксации (оксида азота) и расширению сосудов. При повышении концентрации эндотелин-1 связывается с ET_A-рецепторами в гладкомышечной ткани сосудов, стимулируя стойкую вазоконстрикцию (Vatter H., Zimmermann M., Tesanovic V., et al. Cerebrovascular characterization of clazosentan, the first nonpeptide endothelin receptor antagonist clinically effective for the treatment of cerebral vasospasm. Part I: inhibitory effect on endothelin (A) receptor-mediated contaction // J. Neurosurg. - 2005. - V. 102(6). - Р. 1101-1107). Хроническое облучение в низких дозах может вызывать транзиторное увеличение эндотелина-1 в эндотелии вен (Lanza V/. Fadda P., Iannone C. et al. Low dose ionizing radiation stimulates transcription and production of endothelin by human vein endothelial cells // Radiat. Res. - 2007. - V. 168. - №2. - Р. 193-198).

В предлагаемом нами изобретении используется супероксиддисмутаза, аполипопротеин В, моноцитарный хемотаксический фактор 1, васкулярная молекула клеточной адгезии 1 и эндотелии 1, которые определяются в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА). Метод ИФА широко используется в клинической практике и отличается доступностью, дешевизной и простотой в постановке исследования. Способ позволяет использовать как свежую, так и замороженную сыворотку. Используя комплекс из вышеперечисленных белков можно получить достаточно простой, быстрый, относительно недорогой способ индикации радиационно-индуцированного атеросклероза у лиц, подвергшихся профессиональному хроническому облучению.

На фиг. 1 показано, что содержание аполипопротеина В у лиц, подвергшихся профессиональному хроническому облучению, статистически значимо выше, чем у лиц контрольной группы.

На фиг. 2 показано, что содержание супероксиддисмутазы у лиц. подвергшихся профессиональному хроническому облучению, статистически значимо выше, чем у лиц контрольной группы.

На фиг. 3 показано, что содержание моноцитарного хемотаксического фактора-1 у лиц, подвергшихся профессиональному хроническому облучению, статистически значимо выше, чем у лиц контрольной группы.

На фиг. 4 показано, что содержание васкулярной молекулы клеточной адгезии-1 у лиц, подвергшихся профессиональному хроническому облучению, статистически значимо выше, чем у лиц контрольной группы.

На фиг. 5 показано, что содержание эндотелина-1 у лиц, подвергшихся профессиональному хроническому облучению, статистически значимо ниже, чем у лиц контрольной группы.

Способ осуществляется следующим образом.

Предварительный этап. Лаборатория формирует контрольную группу из клинически здоровых лиц, никогда не подвергавшихся профессиональному облучению, не принимавших участия в ликвидации последствий радиационных аварий, не проживавших на радиационно-загрязненных территориях и не подвергавшихся радиотерапии, для определения доверительных интервалов средних значений, в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов CLSI А28-3 (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Defining, Establishing, and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory, Approved Guideline - Third Edition CLSI document. 2008).

Далее, у участников контрольной группы определяют в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа значения концентрации аполипопротеина В, супероксиддисмутазы, моноцитарного хемотаксического фактора 1, васкулярной молекулы клеточной адгезии 1 и эндотелина 1.

Для получения сыворотки у участников обследования набирают кровь из локтевой вены в объеме 5 мл в вакуумные стерильные одноразовые пробирки с активатором свертывания для выделения сыворотки. Полученные образцы крови центрифугируют в течение 20 минут, при +4 С (режим центрифугирования 2500 об/мин). Отделившуюся сыворотку разливают по стерильным микропробиркам и сохраняют до использования в ультранизкотемпературном морозильнике при -80 С.

Определение содержания аполипопротеина В, супероксиддисмутазы, моноцитарного хемотаксического фактора-1, васкулярной молекулы клеточной адгезии-1 и эндотелина-1 в сыворотке осуществляется методом стандартного иммуноферментного анализа (ИФА), согласно протоколу, предлагаемому фирмой-производителем тест-системы.

Расчет доверительных интервалов для средних значений в контрольной группе аполипопротеина В, супероксиддисмутазы, моноцитарного хемотаксического фактора-1, васкулярной молекулы клеточной адгезии-1 и эндотелина- 1 проводят по общепринятой методике по формуле

где X - среднее значение выборки, Z - коэффициент доверия, σ - стандартное отклонение, n - размер выборки (ГОСТ Р 53022.3-2008; J.H. Zar. Biostatistical analysis, 2nd ed, Prentice-Hall, Englewood Cliff, N.J., 1984).

Границы доверительных интервалов для средних значений в контрольной группе составляют: для аполипопротеина В - 1,44-1,73 мг/мл, для супероксиддисмутазы - 2,2-2,7 нг/мл, для моноцитарного хемотаксического фактора 1 - 323,6-455,8 пг/мл, для васкулярной молекулы клеточной адгезии 1 - 407,1-597,4 нг/мл, для эндотелина 1 - 5,6-6,7 нг/мл.

Этап использования способа. У работника радиационно-опасного предприятия, поступающего на обследование в рамках периодического медицинского осмотра, проводимого в соответствии с Приказом Минзрава России №29-н от 28.01.2021, получают образец сыворотки крови и определяют значения концентрации аполипопротеина В, супероксиддисмутазы, моноцитарного хемотаксического фактора-1, васкулярной молекулы клеточной адгезии-1 и эндотелина-1 методом стандартного иммуноферментного анализа (ИФА), как описано выше. Далее сравнивают полученные значения с референсными интервалами и со значениями доверительных интервалов для средних значений в контрольной группе; если полученные значения выходят за границы доверительных интервалов Для средних значений контрольной группы, это указывает на наличие радиационно-индуцированного атеросклеротического поражения сосудов.

Сущность способа поясняется примером.

Пример 1

Работница П., 60 лет, без сердечно-сосудистых заболеваний в анамнезе, ИМТ=24,7, АД 130/90 мм. рт.ст.; суммарная поглощенная в печени доза внешнего гамма-излучения 131,08 мГр; суммарная поглощенная в печени доза внутреннего альфа-излучения 1,9839 сГр; курила, но бросила, алкоголь употребляет.

Направлена на исследование маркеров атеросклероза методом ИФА. В результате проведенного исследования у работницы П. выявлено, что концентрация маркеров атеросклероза не выходит за границы референсных интервалов, однако при сравнении значений с доверительными интервалами для средних значений контрольной группы выявлено, что концентрации аполипопротеина В, моноцитарного хемотаксического фактора 1 и васкулярной молекулы клеточной адгезии выходят за верхние границы доверительных интервалов, что свидетельствует о наличии радиационно-индуцированного атеросклеротического поражения сосудов.

Через год у работницы П. установлен диагноз церебральный атеросклероз (код МКБ-9 437.0 и 437.1).

Пример 2

Работник С, 60 лет, без сердечно-сосудистых заболеваний в анамнезе, ИМТ=24, АД 150/90 мм рт.ст.; суммарная поглощенная в печени доза внешнего гамма-излучения 13,73 мГр; суммарная поглощенная в печени доза внутреннего альфа-излучения 6,55 сГр; не курит, алкоголь употребляет умеренно.

Направлен на исследование маркеров атеросклероза методом ИФА. В результате проведенного исследования у работника С.выявлено, что концентрация, что концентрация супероксиддисмутазы превышает референсные значения для этого показателя, а концентрация аполипопротеина В, моноцитарного хемотаксического фактора 1, васкулярной молекулы клеточной адгезии 1 и эндотелина-1 не выходит за границы референсных интервалов, однако при сравнении значений с контрольной группой выявлено, что концентрации аполипопротеина В, супероксиддисмутазы, моноцитарного хемотаксического фактора 1 и васкулярной молекулы клеточной адгезии выходят за верхние границы, а концентрация эндотелина-1 выходит за нижние границы доверительных интервалов для средних значений, что свидетельствует о наличии радиационно-индуцированного атеросклеротического поражения сосудов.

Через два года у работника С. установлен диагноз коронарный атеросклероз (код МКБ-9 414.0).

Изобретение относится к медицине, а именно к радиационной медицине, и может быть использовано для определения радиационно-индуцированного атеросклеротического поражения сосудов у работников, занятых во вредных для здоровья условиях труда на радиационно-опасном предприятии. У работника радиационно-опасного предприятия определяют в сыворотке крови значения концентрации аполипопротеина В, супероксиддисмутазы, моноцитарного хемотаксического фактора 1, васкулярной молекулы клеточной адгезии 1 и эндотелина 1. Сравнивают полученные значения с доверительными интервалами, полученными в контрольной группе, сформированной из клинически здоровых лиц, никогда не подвергавшихся профессиональному облучению, не принимавших участия в ликвидации последствий радиационных аварий, не проживавших на радиационно-загрязненных территориях и не подвергавшихся радиотерапии. Если полученные значения выходят за границы доверительных интервалов для средних значений в контрольной группе: для аполипопротеина В - 1,44-1,73 мг/мл, для супероксиддисмутазы - 2,2-2,7 нг/мл, для моноцитарного хемотаксического фактора 1 - 323,6-455,8 нг/мл, для васкулярной молекулы клеточной адгезии 1 - 407,1-597,4 нг/мл, для эндотелина 1 - 5,6-6,7 нг/мл, то определяют наличие радиационно-индуцированного атеросклеротического поражения сосудов. Способ обеспечивает возможность создания удобного, эффективного, относительно недорогого метода индикации радиационно-индуцированного атеросклероза у работников атомной промышленности, подвергающихся хроническому облучению с низкой мощностью дозы, за счет определения в крови концентрации супероксидцисмутазы, аполипопротеина В, моноцитарного хемотаксического фактора 1, васкулярной молекулы клеточной адгезии 1 и эндотелина 1 – маркеров, вовлеченных в патогенетический механизм атеросклероза. 5 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ определения радиационно-индуцированного атеросклеротического поражения сосудов у работников, занятых во вредных для здоровья условиях труда на радиационно-опасном предприятии, заключающийся в том, что у работника радиационно-опасного предприятия определяют в сыворотке крови значения концентрации аполипопротеина В, супероксиддисмутазы, моноцитарного хемотаксического фактора 1, васкулярной молекулы клеточной адгезии 1 и эндотелина 1 и сравнивают полученные значения с доверительными интервалами, полученными в контрольной группе, сформированной из клинически здоровых лиц, никогда не подвергавшихся профессиональному облучению, не принимавших участия в ликвидации последствий радиационных аварий, не проживавших на радиационно-загрязненных территориях и не подвергавшихся радиотерапии; если полученные значения выходят за границы доверительных интервалов для средних значений в контрольной группе: для аполипопротеина В - 1,44-1,73 мг/мл, для супероксиддисмутазы - 2,2-2,7 нг/мл, для моноцитарного хемотаксического фактора 1 - 323,6-455,8 нг/мл, для васкулярной молекулы клеточной адгезии 1 - 407,1-597,4 нг/мл, для эндотелина 1 - 5,6-6,7 нг/мл, то определяют наличие радиационно-индуцированного атеросклеротического поражения сосудов.