МАРКЕРЫ АТЕРОСКЛЕРОЗА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/68 

МАРКЕРЫ АТЕРОСКЛЕРОЗА

Изобретение относится к маркерам атеросклероза. Более конкретно, настоящее изобретение относится к идентификации ряда маркеров, обнаруживаемых в крови, и к их применению для упрощения диагностики и определения прогноза атеросклероза или для выявления предрасположенности к атеросклерозу и, особенно, восприимчивости к развитию атеросклеротических бляшек и/или обструкции сосудов.

Атеросклероз представляет собой патологическое ремоделирование артерий, которое является основной причиной заболеваемости и смертности в развитых странах; эта патология лежит в основе инфаркта миокарда, инсульта и заболевания периферических артерий. Атеросклероз можно рассматривать как особую форму хронического воспаления, происходящего в стенке артерии. Ряд данных подтверждает патогенную или патогенетическую роль воспаления в этиологии атеросклероза; воспаление представляет собой иммунологическое явление. Один из наиболее убедительных элементов доказательства этого утверждения обусловлен наблюдением, что жировые полоски, самое раннее обнаруживаемое повреждение при атеросклерозе, содержат пенистые клетки, которые происходят из макрофагов, которые происходят из циркулирующих моноцитов. T-лимфоциты также обнаруживаются в атеросклеротических бляшках, и большинство из них представляют собой CD3+CD4+альфа/бета T-клетки. Такие клетки составляют приблизительно 2/3 от всех CD3+T-клеток в развившихся человеческих очагах повреждения и они секретируют IFN-гамма, IL-2, TNF-альфа и -бета, которые приводят к сосудистой активации макрофагов, сосудистой активации и воспалению. Полагают, что IFN-гамма ответственен за дестабилизацию бляшки посредством уменьшения фиброзного утолщения. CD8+T-клетки также обнаруживаются в очагах повреждения, но их роль в развитии атеросклероза менее ясна.

Скольжение, адгезия и инфильтрация иммунных клеток (моноцитов и CD4 T-лимфоцитов), которые циркулируют в периферической крови, в эндотелий регулируется двумя основными семействами белков, экспрессируемых на поверхности иммунных клеток и на поверхности эндотелиальных клеток: этими семействами белков являются селектины и интегрины. Хемокины, или хемотаксические цитокины, также чрезвычайно важны для контроля клеточной миграции и для привлечения иммунных клеток в очаги воспаления. Некоторые хемокины, которые могут выступать в качестве возможных медиаторов миграции моноцитов и дифференцировки макрофагов, экспрессируются в человеческих атеросклеротических очагах повреждения. В частности, твердо полагают, что хемотаксический для макрофагов белок-1 (MCP-1) и специфичный ему рецептор CCR2 вовлечены в начальные стадии атерогенеза.

Дополнительное подтверждение патогенной или патогенетической роли воспаления в развитии атеросклеротических бляшек обусловлено наблюдением, сделанным авторами настоящего изобретения, что развитие атеросклеротических бляшек, главным образом, запускают различные цитокины (например, TH1-подобные цитокины являются "вредными цитокинами" в этой биологической последовательности действий, а именно, они запускают или они вовлечены в запуск развития атеросклеротических бляшек). Это становится более понятным, если учитывать, что TH1-цитокины являются основными воспалительными цитокинами. Цитокины и другие иммунологические белки, обнаруживаемые в атеросклеротических очагах повреждения, продуцируются не только CD4 T-лимфоцитами; в действительности, факторы роста фибробластов (FGF) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF) являются факторами роста, продуцируемыми макрофагами, которые, как было обнаружено, обладают значительным влиянием на атеросклеротическую патологию и которые являются белками, продуцируемыми макрофагами. Несмотря на то что научное знание о составе атеросклеротической бляшки и о вкладе клеток, обнаруживаемых в очаге повреждения, продолжает расти, простая и достоверная диагностика атеросклероза, в частности, в отсутствие клинических симптомов, остается проблемой, поскольку измерение и определение изменений в клеточных популяциях в области очага повреждения неосуществимо в клинической практике. Следовательно, существует необходимость в прогностических и легко доступных маркерах, которые могут быть определены в образцах периферической крови.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что иммунопатология атеросклеротических бляшек и изменения описанных выше факторов и специфичных им рецепторов приводят к изменению параметров разнообразных клеточных популяций, которые могут быть определены в образцах крови и в сосудистых биоптатах периферической крови. Параметры могут представлять собой: концентрации клеток (в процентах), экспрессию маркеров на поверхности клеток, внутриклеточные концентрации цитокинов, хемокинов или интегринов, которые по отдельности или совместно с другими параметрами являются пригодными для упрощения диагностики или определения прогноза, или для идентификации предрасположенности к атеросклерозу и, особенно, восприимчивости к развитию атеросклеротических бляшек и/или обструкции сосудов.

Целью настоящего изобретения является обеспечение способа диагностики, определения прогноза или идентификации предрасположенности к атеросклерозу, который устраняет или снижает необходимость в инвазивных способах, таких как удаление бляшки для идентификации, или необходимость в использовании инвазивных способов оптического изображения.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики, определения прогноза или идентификации предрасположенности к атеросклерозу и восприимчивости к развитию атеросклеротических бляшек и/или обструкции сосудов, где способ включает анализ образца для определения процентной частоты разнообразных субпопуляций T-лимфоцитов и сравнение полученных данных со сравнительными и/или контрольными данными.

Как используется здесь, "разнообразный" означает по меньшей мере два.

Предпочтительно, определяют процентные содержания или соотношения конкретных клеточных популяций.

Удобно, чтобы образец представлял собой образец крови или биоптат.

В предпочтительном варианте осуществления способ включает анализ образца для определения процентной частоты одной или нескольких субпопуляций конкретных T-лимфоцитов и сравнение полученных данных со сравнительными и/или контрольными данными.

Предпочтительно способ включает определение процентной частоты одной или нескольких субпопуляций T-лимфоцитов, выбранных из субпопуляций (фенотипов), перечисленных в описанных здесь экспериментах 1 и 2.

В частности, способ включает определение маркеров адгезии, активации и скольжения, экспрессируемых на поверхности CD8+T-лимфоцитов. Вследствие того, что эти клетки представляют собой эффекторные клетки клеточной ветви иммунитета, и вследствие того, что известно, что их активация может оказывать отрицательное влияние на развитие заболевания посредством разрушения клеток-мишеней (например, разрушение клетки печени, которая инфицирована вирусом гепатита, опосредуется CD8 T-клетками, и оно ассоциировано с ухудшением течения заболевания) или посредством индукции хронического воспалительного состояния, авторы этого изобретения полагают, что сосредоточение внимания на этих клетках сделает возможным более точное определение предрасположенности к атеросклерозу и восприимчивости к развитию атеросклеротических бляшек и/или обструкции сосудов.

Кроме того, способ включает одновременное определение процентной частоты разнообразных субпопуляций лимфоцитов. Это предположение основано на том факте, что предрасположенность к атеросклерозу и восприимчивость к развитию атеросклеротических бляшек и/или к обструкции сосудов является мультифакториальной, и, таким образом, невозможно точно предсказать наличие такой предрасположенности с помощью анализа одного единственного маркера.

Таким образом, в одном варианте осуществления способ включает определение процентной частоты различных субпопуляций T-лимфоцитов, где по меньшей мере одна из указанных субпопуляций представляет собой субпопуляцию CD8+T-лимфоцитов, выбранную из субпопуляций (фенотипов): CD8+/CD11L+/CD45RA+, CD8+/CD11L+/CD45RO+, CD8+CD11a+, CD8+CD62L+ и CD8+CD38+RO+.

В другом варианте осуществления способ включает определение процентной частоты различных субпопуляций T-лимфоцитов, где по меньшей мере одна из указанных субпопуляций представляет собой субпопуляцию CD4+T-лимфоцитов, выбранную из следующих фенотипов: CD4+CD25+, CD4+DRII+, CD4+CD44+, CD4+CD62L+ и CD4+CD49d+.

В предпочтительном варианте осуществления способ включает определение процентной частоты различных субпопуляций T-лимфоцитов, где по меньшей мере одна из указанных субпопуляций представляет собой субпопуляцию CD8+T-лимфоцитов и по меньшей мере одна другая из указанных субпопуляций представляет собой субпопуляцию CD4+T-лимфоцитов. Предпочтительно, субпопуляции CD8+ и CD4+ выбраны из фенотипов, перечисленных выше.

Особенно предпочтительными субпопуляциями CD8+ являются: CD8+/CD11L+/CD45RA+ и CD8+/CD11L+/CD45RO+. Особенно предпочтительными субпопуляциями CD4+ являются: CD4+CD62L+ и CD4+CD49d+. В идеальном случае, одну или несколько из всех упомянутых выше субпопуляций CD8+ и CD4+ определяют совместно.

Биологические обоснования, которые приводят к тому, чтобы определять такую выборку, подробно описаны ниже:

- CD8/CD11L/CD45RA; пост-наивные клетки, которые экспрессируют CD11 (также называемый LFA-1альфа) с низкой плотностью экспрессии, таким образом, они представляют собой клетки, которые экспрессируют низкий уровень адгезина CD11; такая низкая экспрессия приводит к тому, что они в меньшей степени прикрепляются к эндотелию. Уменьшение количества этих клеток при атеросклерозе означает, что происходит снижение количества циркулирующих клеток с низкой "способностью прикрепления" к эндотелию. Эти клетки сходны с центральными клетками памяти и мигрируют на периферию, как возможный эффект "отрицательной обратной связи" вследствие формирования бляшки;

- CD8+/CD11L+/CD45RO+; они представляют собой CD8 T-клетки, количество которых увеличивается при воспалении, сходные по фенотипу с эффекторными клетками памяти; эти клетки также обладают сниженной способностью прикрепления к эндотелию и могут представлять собой результат "отрицательной обратной связи", как следствие формирования бляшки;

- CD4/CD62L; CD62L представляет собой адгезин (также называемый L-селектином), таким образом, маркер адгезии экспрессируется на CD4 и используется этими клетками для адгезии к венулам с высоким эндотелием (HEV) и проникновения в сосудистую стенку;

- CD4/CD25 и CD8/DRII; CD25 представляет собой рецептор для IL-2, и его экспрессия коррелирует с воспалением. DRII экспрессируется CD4 и CD8 при активации, таким образом, данные авторов изобретения подтверждают воспалительный статус, ассоциированный с атеросклерозом;

- CD4/CD44 и CD4/CD49d; (CD44, также называемый M-CAM; CD49d, также называемый VLA-4альфа); CD44 и CD49d представляют собой молекулы адгезии; теоретически их количество должно повышаться при атеросклерозе; снижение может быть вторичным вследствие отрицательной обратной связи (т.е. пути, которым организм пытается остановить атерогенетический процесс).

Прогностическая значимость способа согласно изобретению может быть увеличена дополнением анализа различных субпопуляций лимфоцитов с дальнейшим анализом на другие иммунологические маркеры, вовлеченные в развитие атеросклеротических бляшек и обструкции сосудов. Использование множественных маркеров упрощает прогноз прогрессирования заболевания с более высокой прогностической значимостью и, таким образом, обеспечивает более благоприятный исход для пациента вследствие того, что соответствующее лечение может быть начато раньше. Множественные иммунные корреляты обеспечивают эффективный инструмент предсказания вследствие того, что существует взаимозависимость между маркерами, в отличие от общепринятых способов диагностики, где очень немногие результаты зависят друг от друга.

Таким образом, в другом варианте осуществления это изобретение обеспечивает способ диагностики, определения прогноза или идентификации предрасположенности к атеросклерозу и восприимчивости к развитию атеросклеротических бляшек и/или обструкции сосудов, как описано выше, который дополнительно включает определение концентрации одного или нескольких растворимых факторов внутриклеточно, в плазме или в сыворотке, и сравнение полученных данных со сравнительными и контрольными данными. Предпочтительно, указанный растворимый фактор выбран из группы, состоящей из цитокинов и хемокинов. Наиболее предпочтительно, цитокины представляют собой активирующие цитокины.

В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ диагностики, определения прогноза или идентификации предрасположенности к атеросклерозу и восприимчивости к развитию атеросклеротических бляшек и/или обструкции сосудов, как описано выше, который дополнительно включает одну или несколько дополнительных стадий (a) и (b):

(a) определение в образце процентной частоты клеток, экспрессирующих активирующие цитокины, и/или хемокины, и/или интегрины, и/или селектины;

(b) определение частоты молекул клеточной поверхности, ответственных за активацию клеток,

и сравнение полученных данных со сравнительными и контрольными данными.

Предпочтительно, чтобы вся указанная выше информация была получена из одного и того же образца крови, и, кроме того, данные для хемокинов и цитокинов могут быть получены из сыворотки или плазмы. Кроме того, информация может быть получена из биоптата. Однако предпочтительно, чтобы способ использовался с образцом крови в целях избежания забора биоптатов или снижения необходимости в нем.

Предпочтительные цитокины включают интерлейкин-1 (α или β), интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-6, интерлейкин-7, интерлейкин-8, интерлейкин-9, интерлейкин-10, интерлейкин-11, интерлейкин-12, интерлейкин-13, интерлейкин-14, интерлейкин-15, интерлейкин-16, интерлейкин-17, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, факторы некроза опухоли, такие как TNF-α и TNF-β, факторы роста фибробластов (FGF), тромбоцитарные факторы роста (PDGF), колониестимулирующие факторы, такие как G-CSF, GM-CSF, M-LSF, и трансформирующие факторы роста, такие как TGF-β. Среди них TNF-α, IL-12, интерферон-α, FGF и PDGF являются особенно предпочтительными.

Предпочтительные хемокины включают CC- и CXC-хемокины.

Способ может включать дополнительную стадию определения концентрации хемотаксического для макрофагов белка-1 (MCP-1) в образце того же пациента.

Способ необязательно также может включать математические стадии определения статистических изменений иммунологических параметров, которые могут включать соотношения популяций лимфоцитов; например, соотношение лимфоцитов CD8+/CD11L+/CD45RA+ и лимфоцитов CD8+/CD11L+/CD45RO+, поскольку эти две популяции вероятно являются частью пути созревания лимфоцитов, и соотношения, таким образом, могут помочь в определении наличия изменений процесса созревания.

Варианты осуществления этого изобретения будут далее описаны полностью посредством неограничивающих примеров, в которых приведены ссылки на фигуры, среди которых:

Фиг.1 от a до f. Описывает изменения субпопуляций лимфоцитов в периферической крови ВИЧ-инфицированных индивидуумов, у которых развились (pl+) или не развились (pl-) атеросклеротические бляшки (сонная артерия), которые определяли оценкой с помощью доплеровской эхографии, и у здоровых индивидуумов из контрольной группы.

Фиг.2 от a до h. Описывает изменения субпопуляций T-клеток в периферической крови ВИЧ-отрицательных индивидуумов, у которых развились (pl+) или не развились (pl-) атеросклеротические бляшки (сонная артерия), которые определяли оценкой с помощью доплеровской эхографии.

Эксперимент 1: популяции T-клеток оценивали в периферической крови ВИЧ-инфицированных индивидуумов, у которых развились (pl+) или не развились (pl-) атеросклеротические бляшки (сонная артерия), которые определяли оценкой с помощью доплеровской эхографии. Также были получены данные для 10 здоровых индивидуумов из контрольной группы, подобранных по полу и возрасту. Данные представлены в таблицах I и II и на фиг.1.

Таблица I. Анализ ряда различных субпопуляций лимфоцитов способами активизированной флюоресценцией сортировки клеток (FACS) в периферической крови ВИЧ-инфицированных индивидуумов, у которых развились (pl+) или не развились (pl-) атеросклеротические бляшки (сонная артерия), которые в эксперименте 1 определялись оценкой с помощью доплеровской эхографии Фенотип t-тест Среднее значение     pl+vs pl- pl+ pl- CD8+CD25+ 0,374225892 2,36 5,80 CD4+CD25+ 0,072409562 2,91 0,56 CD8+DRII+ 0,282417879 19,83 7,11 CD4+DRII+ 0,030600648 23,09 1,55 CD4+CD44+ 0,00395716 70,60 20,36 CD8+CD44+ 0,160297549 72,80 51,30 CD4+CD11a+ 0,225448719 51,05 29,99 CD8+CD11a+ 0,074474538 87,70 52,83 CD4+CD62L+ 0,21745848 35,67 13,27 CD8+CD62L+ 0,029642338 41,87 20,42 CD8+CD38+RO+ 0,00295714 12,80 2,35 CD8+CD28-RA+ 0,245463793 36,17 52,72 CD4+CD3+R0+ 0,085958624 69,50 41,58 CD4+CD62L+RA+ 0,654853858 20,98 18,12 CD8+CD11highRA+ 0,166981489 13,57 14,80 CD8+CD11lowRA+ 0,344892909 4,93 16,08 CD8+CD11highRO+ 0,044961021 28,00 10,80 CD4+CD49d 0,034261111 39,10 12,98 CD8+CD49d ND 40,10 47,80

Пациентов (N=15/группа) сравнивали с точки зрения иммунологии in vitro и их подвергали ARV на основе Pl.

Таблица II. Данные, полученные в эксперименте 1 для 10 подобранных по полу и возрасту здоровых индивидуумов из контрольной группы Фенотип Среднее значение sd se CD8+CD25+ 2,14 0,17591935 0,07 CD4+CD25+ 0,84 0,22154221 0,09 CD8+DRII+ 7,22 4,19724456 1,71 CD4+DRII+ 1,77 0,9772532 0,4 CD4+CD44+ 42,16 5,68561259 2,32 CD8+CD44+ 29,21 3,33288092 1,36 CD4+CDlla+ 19,60 5,92143001 2,42 CD8+CDlla+ 30,93 3,40377941 1,39 CD4+CD62L+ 32,19 5,790345 2,36 CD8+CD62L+ 20,67 3,95462357 1,61 CD8+CD38+RO+ 3,83 2,68271451 1,09 CD8+CD28-RA+ 49,40 8,18005705 3,34 CD4+CD3+RO+ 45,53 5,96984486 2,44 CD4+CD62L+RA+ 18,64 5,45858869 2,23 CD8+CD11highRA+ 18,10 5,76136558 2,35 CD8+CD11lowRA+ 4,41 3,05692033 1,25 CD8+CD11highRO+ 15,23 5,00723286 2,04 CD4+CD49d 9,57 2,21578802   CD8+CD49d NT    

Эксперимент 2: популяции T-клеток оценивали в периферической крови ВИЧ-отрицательных индивидуумов, у которых развились (pl+) или развились (pl-) атеросклеротические бляшки (сонная артерия), которые определялись оценкой с помощью доплеровской эхографии. Данные представлены в таблице III и на фигуре 2.

Изначально авторами настоящего изобретения были проведены наблюдения для ВИЧ-инфицированных пациентов. Вследствие того что ВИЧ представляет собой иммунодефицит, вероятно, что различия в популяциях лимфоцитов для ВИЧ-инфицированных пациентов могут не точно дублироваться у индивидуумов, которые не инфицированы ВИЧ. Таким образом, авторы настоящего изобретения исследовали популяции лимфоцитов у пациентов, не имеющих какого-либо другого заболевания, кроме положительного диагноза утолщения интимы, которое определяли доплеровской эхографией, и у здоровых индивидуумов из контрольной группы, что подтверждали доплеровской эхографией.

При сравнении этих данных с данными для ВИЧ-инфицированных пациентов обнаружили, что несколько из маркеров популяций лимфоцитов отличались в одном и том же направлении (т.е. возрастала или снижалась частота у пациентов, у которых развились бляшки, относительно пациентов, у которых не развились) у не ВИЧ-инфицированных пациентов, по сравнению с тем, что было обнаружено для ВИЧ-инфицированных пациентов. Пациенты ВИЧ+ в эксперименте 1 были на поздней стадии заболевания ВИЧ и их лечили ингибиторами протеаз, которые были ассоциированы со статистически значимым риском сердечно-сосудистого заболевания. Заболевание ВИЧ представляет собой иммунодефицит и можно ожидать, что резкое изменение маркеров лимфоцитов постепенно возрастает на поздней стадии заболевания. Единообразие изменений в разнообразных популяциях лимфоцитов у пациентов с атеросклерозом в обоих экспериментах, является удивительным с точки зрения ожидаемых различий между группой ВИЧ-инфицированных с иммунодефицитом и не ВИЧ-инфицированными пациентами. Таким образом, эти данные подтверждают пригодность изменений в этих популяциях лимфоцитов в качестве маркеров атеросклероза.

Между результатами эксперимента 1 (ВИЧ-инфицированные пациенты) и эксперимента 2 (не ВИЧ-инфицированные) были различия, но они были в популяциях лимфоцитов, для которых известно, что они поражаются при ВИЧ.

Популяции лимфоцитов, для которых было обнаружено, что они изменялись в одном направлении у пациентов, у которых развились бляшки, в исследованиях и для ВИЧ-инфицированных, и для не ВИЧ-инфицированных, представляют собой наиболее перспективные маркеры атеросклероза. Однако, могут быть приведены доводы, что популяции лимфоцитов, для которых было обнаружено, что они изменялись в противоположных направлениях в двух экспериментах, все еще могут быть пригодными в качестве маркеров, поскольку обнаруженное изменение в этой группе пациентов в любом направлении может быть показателем, что являются обоснованными дополнительные исследования.

Интересно, что было обнаружено, что популяции моноцитов, которые экспрессируют CD86 и CD80, снижаются у пациентов с атеросклерозом. Это снижение может быть отражением миграции моноцитов в атеросклеротические бляшки.

В таблице III a и b представлен фенотипический анализ ряда различных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови индивидуумов, у которых развились атеросклеротические бляшки (ATHERO1), и у здоровых контролей (HC) в разделе a, и уровни цитокинов в плазме в разделе b. Известно, что как и ожидалось, уровни MCP-1 были выше у пациентов с атеросклерозом по сравнению со здоровыми из контрольной группы.

Таблица IIIa: Фенотипический анализ (% клеток, экспрессирующих маркер)  
 

Таблица IIIb: Цитокины в плазме (% пг/мл)    

Таблица IV. Маркеры лимфоцитов, названные в экспериментах 1 и 2 Маркер Описание Эксперимент 1. Для пациентов ВИЧ+Pl+ относительно Pl- Эксперимент 2. Для пациентов ВИЧ+Pl+ относительно Pl- CD8+CD25+ CD25 представляет собой рецептор для IL2, и его экспрессия коррелирует с воспалением. Экспрессирующие CD25 лимфоциты являются активированными лимфоцитами (косвенный показатель воспаления) Снижение у pl+ при сравнении с ВИЧ+, но не при сравнении со здоровыми из контрольной группы Повышение у pl+ CD4+CD25+ CD25 представляет собой рецептор для IL2, и его экспрессия коррелирует с воспалением. Экспрессирующие CD25 лимфоциты являются активированными лимфоцитами (косвенный показатель воспаления) Повышение у pl+ Нет изменений у pl+ CD8+DRII+ DRII экспрессируют CD4 и CD8 при активации. Экспрессирующие DRII лимфоциты: то же значение, что и в случае CD25 Повышение у pl+ Повышение у pl+ CD4+DRII+ DRII экспрессируют CD4 и CD8 при активации. Экспрессирующие DRII лимфоциты: то же значение, что и в случае CD25 Повышение у pl+ Повышение у pl+ CD4+CD44+ CD44 (M-CAM) представляет собой молекулу адгезии: циркулирующие лимфоциты прикрепляются к клеткам эндотелия; это облегчает их проникновение через эндотелий Повышение у pl+ Снижение у pl+ CD8+CD44+ CD44 (M-CAM) представляет собой молекулу адгезии: циркулирующие лимфоциты прикрепляются к клеткам эндотелия; это облегчает их проникновение через эндотелий Повышение у pl+ Нет изменений у pl+ CD4+CD11a+ CD11a представляет собой цепь альфаL-интегрина, важную для межклеточной адгезии и костимуляторной передачи сигнала Повышение у pl+ Повышение у pl+ CD8+CD11a+ CD11a представляет собой цепь АльфаL-интегрина, важную для межклеточной адгезии и костимуляторной передачи сигнала Повышение у pl+ Повышение у pl+ CD4+CD62L+ CD62L представляет собой адгезин (L-селектин). Маркер адгезии, экспрессируемый CD4 и используемый этими клетками для прикрепления к венулам с высоким эндотелием (HEV) и для проникновения в сосудистую стенку Повышение у pl+ Повышение у pl+ CD8+CD62L+ CD62L представляет собой адгезин (L-селектин). Маркер адгезии, экспрессируемый CD4 и используемый этими клетками для прикрепления к венулам с высоким эндотелием (HEV) и для проникновения в сосудистую стенку Повышение у пациентов pl+ Не проводили CD8+CD38+CD45RO+ активированные T-лимфоциты памяти: косвенный показатель воспаления и иммунной активации Повышение у пациентов pl+ Не проводили CD8+CD28-CD45RA+ T-супрессоры, продуцирующие IL-10 клетки: чем ниже их количество, тем тяжелее воспалительное состояние без изменений Не проводили CD4+CD3+CD45RO+ активированные T-лимфоциты памяти: косвенный показатель воспаления и иммунной активации Повышение у pl+ Не проводили CD4+CD62L+CD45RA+ наивные T-лимфоциты Без изменений Не проводили CD8+CD11high+CD45RA+ CD11 представляет собой молекулу адгезии: циркулирующие лимфоциты прикрепляются к клеткам эндотелия; это облегчает их проникновение через эндотелий Без изменений Не проводили CD8+CD11low+CD45RA+ CD11 представляет собой молекулу адгезии. Клетки, которые экспрессируют низкий уровень адгезина CD11, делает их неспособными к прикреплению к эндотелию Снижение у pl+ Снижение у pl+ CD8+CD11a+CD45RA+ CD11a представляет собой цепь АльфаL-интегрина, важную для межклеточной адгезии и костимуляторной передачи сигнала Не проводили Без изменений CD8+CD11high+CD45RO+ CD11 представляет собой молекулу адгезии: циркулирующие лимфоциты прикрепляются к клеткам эндотелия; это облегчает их проникновение через эндотелий Повышение у пациентов pl+ Не проводили CD8+CD11low+CD45RO+ CD11 представляет собой молекулу адгезии; это CD8 T-клетки, которые усиливают воспаление Не проводили Повышение у pl+ CD4+CD49d+ CD49 (VLA-4альфа) представляет собой молекулу адгезии: циркулирующие лимфоциты прикрепляются к клеткам эндотелия; это облегчает их проникновение через эндотелий Повышение у пациентов pl+ Снижение у pl+ CD8+CD49d+ CD49 (VLA-4альфа) представляет собой молекулу адгезии: циркулирующие лимфоциты прикрепляются к клеткам эндотелия; это облегчает их проникновение через эндотелий Без изменений Не проводили CD14+CD86+ CD 86 также известна как B7. Связывает CD28, ответственный за костимуляцию T-клеток, как полагают, главным образом Th2 Не проводили Снижение у pl+ CD14+CD80+ CD80 также известна как B7.1; полагают, что, главным образом, TH1 Не проводили Снижение у pl+ CD14+TLR2+ TLR2=рецептор TLR Не проводили Без изменений CD14+TLR4+ TLR4=рецептор TLR Не проводили Без изменений CD14+CD36+ CD 36 представляет собой маркер активации Не проводили Без изменений

Предпочтительно, способ включает дополнительную стадию оценки толщины интимы сосудов для оценки наличия утолщения, которое может быть показателем наличия или вероятности наличия атеросклероза или атеросклеротических бляшек. В целях достижения этого предпочтительно, чтобы совместно со способами по настоящему изобретению использовались другие неинвазивные способы, такие как ультрасонография, включая доплеровские ультразвуковые способы. Кроме того, настоящее изобретение может использоваться в качестве замены общепринятых инвазивных способов или для их дополнения.

Авторы настоящего изобретения показали, что изменения описанных выше параметров, в частности изменения в популяциях T-клеток, таких как CD8+/CD11L+/CD45RA+, CD8+/CD11L+/CD45RO+, CD8+CD11a+, CD8+CD62L+, CD8+CD38+RO+, оцененных совместно с CD4+CD3+RO+, CD8+CD11highRO+, CD4+CD62L+, CD4+CD49d+, CD4+CD25+, CD4+DRII+, CD4+CD44+ являются показателями формирования бляшки. В случае если анализ в соответствии с этим изобретением показывает высокий риск того, что формируется бляшка или неизбежно возникнет, это может быть подтверждено инвазивным исследованием. Преимущественно, исследование в соответствии с этим изобретением проводят сначала через регулярные промежутки времени, а инвазивное исследование проводят только в случае, если обнаружена повышенная частота одного или нескольких показателей клеточных популяций.

Предусматривается, что данные способы согласно изобретению будут интерпретироваться с использованием компьютерного программного обеспечения и графического изображения.

Способы, используемые для определения клеток, включают внесение метки в цельную кровь в единой пробирке, лизис эритроцитов и считывание с использованием проточной цитометрии. Альтернативно меченные клетки могут быть помещены на твердую фазу, при помощи чего клетки подсчитывают с использованием анализатора изображения, и специализированное программное обеспечение используется для обеспечения автоматизированного вывода данных: вывод может быть оформлен для сравнения отдельных результатов пациентов с базой данных результатов здоровых индивидуумов и с базой данных различных стадий заболевания для упрощения точного прогноза формирования бляшки.

Предложен способ диагностики, определения прогноза или идентификации предрасположенности к атеросклерозу и восприимчивости к развитию атеросклеротических бляшек и/или обструкции сосудов. Способ включает анализ образца для определения процентной частоты разнообразных субпопуляций Т-лимфоцитов и сравнение полученных данных со сравнительными и/или контрольными данными. Использование множественных маркеров упрощает прогноз прогрессирования заболевания с более высокой прогностической значимостью. 17 з.п. ф-лы, 4 табл., 14 ил.

1. Способ диагностики, определения прогноза или идентификации предрасположенности к атеросклерозу и восприимчивости к развитию атеросклеротических бляшек и/или обструкции сосудов, где способ включает анализ образца для определения процентной частоты по меньшей мере двух субпопуляций Т-лимфоцитов и сравнение данных со сравнительными и/или контрольными данными, где по меньшей мере одна из указанных субпопуляций Т-лимфоцитов представляет собой популяцию CD8 Т-клеток, выбранную из списка, состоящего из CD8+/CD11L+/CD45RA+, CD8+/CD11L+/CD45RO+, CD8+CD11а+, CD8+CD62L+, CD8+CD11highRO+ и CD8+CD38+RO+, и по меньшей мере одна другая из указанных субпопуляций Т-лимфоцитов представляет собой популяцию CD4 Т-клеток, выбранную из списка, состоящего из CD4+/62L+, CD4+CD49d+, CD4+CD25+, CD4+DRII+, CD4+CD44+ и CD4+CD3+RO+.

2. Способ по п.1, где образец представляет собой кровь или биоптат.

3. Способ по п.1, который дополнительно включает определение концентрации одного или нескольких растворимых факторов, выбранных из группы, состоящей из цитокинов, хемокинов, интегринов и селектинов, внутриклеточно в плазме или сыворотке, и сравнение полученных данных со сравнительными и контрольными данными.

4. Способ по п.3, где указанный растворимый фактор выбран из группы, состоящей из цитокинов и хемокинов.

5. Способ по п.1, который дополнительно включает одну или несколько дополнительных стадий (а) и (b):
(a) определение в образце процентной частоты клеток, экспрессирующих активирующие цитокины и/или хемокины, и/или интегрины, и/или селектины;
(b) определение частоты молекул клеточной поверхности, ответственных за активацию клеток,
и сравнение полученных данных со сравнительными и контрольными данными.

6. Способ по п.4, где цитокин представляет собой один или несколько из интерлейкина-1 (α или β), интерлейкина-2, интерлейкина-3, интерлейкина-4, интерлейкина-5, интерлейкина-6, интерлейкина-7, интерлейкина-8, интерлейкина-9, интерлейкина-10, интерлейкина-11, интерлейкина-12, интерлейкина-13, интерлейкина-14, интерлейкина-15, интерлейкина-16, интерлейкина-17, интерферона-α, интерферона-β, интерферона-γ, факторов некроза опухоли, таких как TNF-α и TNF-β, факторов роста фибробластов (FGF), тромбоцитарных факторов роста (PDGF), колониестимулирующих факторов, таких как G-CSF, GM-CSF, M-LSF, трансформирующих факторов роста, таких как TGF-β.

7. Способ по п.6, где цитокины представляют собой TNF-α, IL-12, интерферон-α, FGF и PDGF.

8. Способ по п.4, где хемокины включают СС- и СХС-хемокины.

9. Способ по п.1, где способ дополнительно включает дополнительную стадию определения концентрации хемотаксического для макрофагов белка-1 (МСР-1) в образце указанного пациента.

10. Способ по п.1, где способ дополнительно включает дополнительную стадию определения статистических изменений иммунологических параметров.

11. Способ по п.10, где иммунологический параметр представляет собой соотношения лимфоцитов.

12. Способ по п.1, где способ дополнительно включает стадию оценки толщины интимы сосудов для определения наличия утолщения, которое может быть показателем наличия или вероятности наличия атеросклероза или атеросклеротических бляшек.

13. Способ по п.12, где оценку толщины интимы сосудов проводят ультрасонографией.

14. Способ по п.1, где данные интерпретируют с использованием компьютерного программного обеспечения и графического изображения.

15. Способ по п.2, где анализ образца крови включает мечение цельной крови в единой пробирке.

16. Способ по п.15, где анализ образца крови включает дополнительные стадии лизиса эритроцитов и считывания с использованием проточной цитометрии.

17. Способ по п.15, где анализ образца крови включает дополнительные стадии добавления меченных клеток на твердую фазу и применения анализатора изображения для подсчета клеток.

18. Способ по п.16 или 17, где компьютерное программное обеспечение применяют для сравнения отдельных результатов пациентов с базой данных результатов здоровых индивидуумов и с базой данных различных стадий заболевания для упрощения точного прогноза образования бляшки.