РАСТИТЕЛЬНЫЕ ЭКСТРАКТЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ГЕРОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И СРЕДСТВО НА ИХ ОСНОВЕ Российский патент 2005 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в пищевых или фармацевтических композициях с комплексным геропротекторным действием, а именно, обладающих антиоксидантной, нейропротекторной активностями и способностью регулировать кальциевый гомеостаз в клетке.

Согласно современным представлениям старение человека является результатом целого комплекса изменений в биохимическом статусе организма человека. Особое значение при этом придается процессам свободно-радикального окисления и дисрегуляции кальциевого гомеостаза в клетках, инициирующим развитие дегенеративных процессов, которые протекают в стареющем организме на фоне резкого ослабления естественных защитных систем, снижение уровня ростовых факторов и гормонов [Increasing healthy life span: convential measures and slowing the innate aging. Ann. N Y Acad. Sci. 2002, v. 959]. В настоящее время в мире ведется активная работа по поиску и внедрению в практику новых фармакологических препаратов, биологически активных веществ и просто пищевых добавок, действие которых направлено на компенсацию возникающего с возрастом дефицита эндогенных протекторных факторов.

Известно применение биологически активной пищевой добавки «Глутапирон», на основе динатриевой соли 2-(2,6-диметил-3,5-диэтоксикарбонил-1,4-дигидропиридин-4-карбоксамидо) глутаровой кислоты, обладающей антиканцерогенным и геропротекторным действием (RU, №2112512, С1, кл. А 61 К 31/44, 10.06.98, бюл. №16). Однако наиболее выраженно оно проявляется при ликвидации радиационного воздействия на организм.

В последние годы особое значение и спрос приобретают геропротекторные препараты на основе растительных компонентов, обладающих более мягким действием на организм, по сравнению с синтетическими препаратами. В частности, экстракты из растения Ginkgo biloba активно используются в качестве активного компонента лекарственных средств и многочисленных пищевых добавок, рекомендуемых для улучшения когнитивных функций и сопротивляемости организма в условиях нормального старения [McKenna DJ, Jones К, Hughes К. Efficacy, safety, and use of ginkgo biloba in clinical and preclinical applications. Altern Ther Health Med. 2001, 7:70-86]. По общему объему продаж растительных препаратов в США в 1998 препараты Ginkgo занимали первое место [Agriculture Business Profile, Jun. 2001. (web.site:http//www.agric.gov.ab.ca/agdex/200/263_830-2.html)].

Однако это растение не произрастает на территории России и является продуктом импорта, что обуславливает достаточно высокую стоимость подобных препаратов и резко ограничивают возможности широкого их использования в отечественной профилактической и лечебной практике. Кроме того получение эффективного экстракта из листьев Ginkgo biloba представляет собой сложный, высокотехнологический и дорогой процесс.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала средств, которые могут быть использованы в качестве биологически активных добавок в пищевых и фармацевтических композициях, обладающих широким геропротекторным действием.

Техническим результатом, который может быть получен при осуществлении изобретения, является расширенный спектр биологического действия на организм заявляемых нами веществ, а именно профилактика и защита организма человека от преждевременного старения и повышения его устойчивости к развитию нейродегенеративных заболеваний старческого возраста, в основе которых лежит комплексное нейропротекторное действие, а также антиоксидантной активности и способности регулировать кальциевый гомеостаз клетки. Кроме того надо отметить относительную дешевизну получаемых препаратов благодаря широкому распространению в нашей климатической зоне растений, составляющих их основу.

Согласно изобретению заявляется применение концентрата по крайней мере одного из ряда растений: поручейник - Sium latifolium, щавель - Rumex confertus, кровохлебка - Sanguisorba officinalis, репешок - Agrimonia asiatica, таволга вязолистная - Filipendula ulmaria, фаллопия - Fallopia convolvulus и/или их смеси в качестве средства с геропротекторной активностью.

Применение вышеперечисленных растений в медицине известно. Так, отвар корневища и корня кровохлебки - Sanguisorba officinalis применяют как вяжущее и кровоостанавливающее средство [Ботанико-фармакогностический словарь. Под ред. К.Ф.Блиновой, Г.П.Яковлевой. - М., Высш. Шк., 1990, стр.200; Фармакогнозия. Под ред. Н.И.Гринкевич, Е.Я.Ладыгиной. - М., Медицина, 1989, стр.452-453], отвар цветков, корневища и корня таволги вязолистной - Filipendula ulmaria используют как противовоспалительное, противоязвенное [Ботанико-фармакогностический словарь. Под ред. К.Ф.Блиновой, Г.П.Яковлевой. - М., Высш. Шк., 1990, стр.202], отвар из корней щавеля - Rumex confertus в больших дозах применяется как слабительное, в малых - как вяжущее средство при поносах [Ботанико-фармакогностический словарь. Под ред. К.Ф.Блиновой, Г.П.Яковлевой. - М., Высш. Шк., 1990, стр.260; Фармакогнозия. Под ред. Н.И.Гринкевич, Е.Я.Ладыгиной. - М., Медицина, 1989, стр.358-360].

Однако использование их в качестве средств, обладающих геропротекторной активностью, нами не обнаружено.

При создании настоящего изобретения было установлено, что концентраты поручейника, щавеля, кровохлебки, репешка, таволги вязолистной, фаллопии и/или их смеси содержат флавоноидные компоненты и благодаря этому обладают широким спектром активного геропротекторного действия на организм, в частности воздействию на процессы свободно-радикального окисления, способность стабилизировать кальциевый гомеостаз в клетках и нормализовать функционирование клеточных протекторных систем с действием на рецепторы эстрогенов, функциональная активность которых снижается с возрастом.

Наибольшую эффективность указанные концентраты проявляют при общем содержании флавоноидных компонентов, превышающем 5%.

Понятие «концентрат», используемое в данной заявке, подразумевает (от латинского con... (cum) - вместе и centrum - средоточие, центр) продукт с высоким содержанием необходимых (в зависимости от его назначения) веществ (Украинский Советский Энциклопедический словарь в 3 т./ Редкол.: А.В.Кудринский и др., К., Глав. ред. УСЭ, 1988, Т.2, стр.127). Концентраты указанных в заявке растений могут быть в жидкой форме или в твердой форме, например, гранулированной или порошкообразной.

Пригодные растительные концентраты получают, например, термической сушкой или сушкой вымораживанием свежесрезанных растений с последующим размалыванием и/или грануляцией высушенного материала, или путем отжима свежесрезанных растений и сбора жидкой фракции, а также различными способами экстракции. Понятие «экстракт», используемое в данной заявке, подразумевает (от латинского extractum - извлечение) сгущенную вытяжку из растительного материала (Украинский Советский Энциклопедический словарь в 3 т./ Редкол.: А.В.Кудринский и др., К., Глав. ред. УСЭ, 1988, Т.3, стр.703). Различают сухие экстракты (остаточная влажность не выше 5%, сгущенные экстракты - остаточная влажность 25% (Большая медицинская энцклопедия, гл. ред. А.Н.Бакулев, М., «Советская энциклопедия», 1964, том 35, стр.60). Получают с помощью растворителей (экстрагентов) - водных, спиртовых и т.д., например, экстрагированием свежесрезанных или высушенных растений водой либо одним или несколькими растворителями с пригодной для включения в пищу чистотой, или смесью воды с одним или несколькими растворителями с пригодной для включения в пищу чистотой. К пригодным растворителям с пригодной для включения в пищу чистотой относятся пропан, бутан, бутилацетат, этилацетат, этанол, диоксид углерода, ацетон, закись азота и пропан-2-ол или их смеси. Предпочтительными из них являются вода, этанол, диоксид углерода или их смеси. После стадии экстракции жидкую фазу необязательно концентрируют или сушат упариванием или сушат вымораживанием. Кроме того концентраты могут быть получены введением свежесрезанного или высушенного материала перечисленных растений в воду и отгонкой этой смеси водяным паром. Дистиллят собирают и предпочтительно концентрируют упариванием досуха.

Содержание флавоноидных компонентов контролируется с помощью методики количественного определения суммы флавоноидов, применяемой в фармацевтической промышленности (Химический анализ лекарственных растений, под ред. Н.И.Гринкевич, Л.Н.Сафронич. М., Высшая школа, 1983, стр.91-92). Количество используемого по изобретению концентрата и содержащих его композиций может изменяться в широких пределах в зависимости от подлежащего лечению пациента и его потребностей.

Понятие «геропротекторная активность», используемое в данной заявке, подразумевает биологически активное действие, замедляющее старение и продлевающее жизнь путем профилактики дегенеративных процессов, сопровождающих преждевременное старение, и улучшения качества жизни путем снижения количества и степени интенсивности патологий, совместимых с жизнью, характерных для пожилого и старческого возраста.

Согласно изобретению заявляется также средство, обладающее геропротекторной активностью, содержащее эффективное начало и фармацевтически приемлемый носитель, в котором в качестве эффективного начала используют концентрат по крайней мере одного из ряда растений: поручейник, щавель, кровохлебка, репешок, таволга вязолистная, фаллопия и/или их смеси.

Дополнительно оно может также содержать концентрат побегов черники, причем содержание каждого компонента составляет от 10 до 90 вес.%.

Понятие «Средство» в данной заявке подразумевает использование любой лекарственной или пищевой формы, содержащей вышеуказанный концентрат или композиции на его основе, которая могла бы найти профилактическое или лечебное применение в медицине в качестве средства с геропротекторной активностью для профилактики и предупреждения дегенеративных процессов, сопровождающих преждевременное старение.

Для получения средства, отвечающего изобретению, предлагаемый концентрат по крайней мере одного из ряда растений: поручейник, щавель, кровохлебка, репешок, таволга вязолистная, фаллопия и/или их смеси смешивается как активный ингредиент с фармацевтическим носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Средство может дополнительно включать пригодные для включения в пищу компоненты, выбранные из группы, включающей витамины, минеральные компоненты, микроэлементы, клетчатку (в том числе и микрокристаллическую целлюлозу), корригенты, консерванты, красители, эмульгаторы, крахмал, карбонат кальция (мел), подслащивающие вещества (в том числе лактоза, сахароза, фруктоза) при сохранении его эффективной дозы.

Понятие «эффективная доза», используемое в данной заявке, подразумевает использование того количества концентратов вышеуказанных растений или их смесей, которое в соединение с показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Вышеуказанное средство может быть в жидкой форме или твердой форме, в частности, в форме пилюль, таблеток, капсул и гранулятов.

Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения и получением технического результата подтверждается, но не исчерпывается следующими примерами.

На фото 1-4 представлены типичные фотографии культуры нервных клеток при действии на них исследуемых концентратов растений, где фото 1 - контроль культуры нервных клеток, фото 2 - предварительное добавление концентрата репешка (0,025 мг/мл) в культуру нервных клеток, фото 3 - дифференцированные астроциты в культуре нервных клеток, фото 4 - контроль астроцитов.

Пример 1. Получение концентратов растений.

Получение экстрактов проводилось на емкостном аппарате (объемом 5 л) с лопастной мешалкой, теплообменной рубашкой и встроенным фильтром. В емкостных аппаратах экстракция растительного сырья проводилась по методу мацерации. Соотношение твердой и жидкой фаз на всех стадиях экстракции равнялась 1:10, количество используемого экстрагента составило 3 л на каждую стадию экстракции. В качестве экстрагента брали воду или 40% раствор этилового спирта в количестве 3 л, который заливали в емкость экстрактора. В аппарат засыпали 300 г предварительно измельченного на роторно-ножевой мельнице растительного сырья 0,63-3 мм фракций, насыпной вес 316 кг/м³, закрывали крышкой и включали подачу теплоносителя, циркулирующего через рубашку аппарата, который подавался из предварительно разогретого до 75°С. Процесс экстракции осуществлялся при температуре 50±5°С. Далее экстракционную массу выдерживают 0,5 часа. В аппарат подают давление до 0,05 МПа и идет процесс фильтрования, при этом экстракт попадает в приемную емкость. Твердая фаза (сырье) остается на фильтрующей перегородке аппарата. Описанный процесс повторяется три раза. При проведении второй и третьей экстракций в аппарат загружается по 3 л дистиллированной воды. После третьей экстракции шрот (отработанное сырье) выгружается из аппарата.

Полученный экстракт объединялся, фильтровался и далее подвергался концентрированию под вакуумом. Экстракт из емкости последовательно порциями подают в испаритель вакуум-выпарной установки. Концентрирование экстрактов вели под вакуумом при температуре 45±2°С и при остаточном давлении 76-38 мм рт. ст. примерно до 1/13 первоначального объема. По окончании упарки получают водный концентрированный экстракт и отгон воды. Отгон воды используется в дальнейшем на стадии экстракции, транспортируется из сборника конденсата на стадию экстракции насосом. Концентрированный экстракт направляют в мерник и далее на сепарацию и сушку.

Определение суммы флавоноидов проводили согласно методике, применяемой в фармацевтической промышленности (Химический анализ лекарственных растений, под ред. Н.И.Гринкевич, Л.Н.Сафронич. М., Высшая школа, 1983, стр.91-92). 1 г исследуемого экстракта помещают в пакетик из фильтровальной бумаги и экстрагируют в аппарате Сокслета (вместимостью 100 мл) хлороформом в течение 3 ч. Хлороформное извлечение отбрасывают, а пакетик с навеской высушивают и экстрагируют в круглодонной колбе с обратным холодильником на водяной бане 30 мл метилового спирта в течение 3 ч, периодически перемешивая. Берут 20 мл извлечения и метиловый спирт отгоняют досуха. Сухой остаток растворяют в 20 мл дистиллированной воды, количественно переносят в делительную воронку вместимостью 50 мл и очищают дважды по 15 мл четыреххлористым углеродом. Очищенный водный экстракт пятикратно обрабатывают 20 мл этилацетата, дожидаясь каждый раз полного расслоения фаз. Объединенный этилацетатный экстракт упаривают в вакууме досуха и сушат остаток в течение 1 ч в сушильном шкафу при t=65°С. Высушенный остаток растворяют в небольшом объеме этилового спирта и переносят количественно в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем до метки этиловым спиртом (раствор А), 0,5 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и объем доводят этиловым спиртом до метки (раствор Б).

Определяют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при λ=330 нм.

Процентное содержание суммы флавоноидов Х вычисляют по формуле

Где D - оптическая плотность испытуемого раствора; 25 - объем раствора А, мл; К - коэффициент разведения раствора А, равный 100; - удельный показатель поглощения, равный 560,8; m - навеска сырья в расчете на взятый аликвот, г; w - потеря в массе сырья при высушивании (в %); L - толщина слоя, см.

Выход экстрактивных веществ и содержание флавоноидов представлено в таблице 1.

Таблица 1.
Выход экстрактивных веществ и содержание флавоноидов.Название растенияВодная экстракцияЭкстракция 40% водно-спиртовым растворомВыход (%)Содержание флавоноидов (%)Выход (%)Содержание флавоноидов (%)поручейник12.115.48.812.5репешок20.224.426.823.6таволга вязолистная16,419.822,421.4фаллопия15.223.120.121.2щавель16.228.216.627.9кровохлебка21,122.124,223.6

Пример 2. Получение экстрактов растений.

Получение концентрата аналогично примеру 1, но применяется гидроимпульсный аппарат для экстракции. Время экстракции 1 час. Гидромодуль 1:7. Амплитуда пульсации - 10 мм. Частота пульсации - 0,4 Гц. Процесс экстракции осуществлялся при температуре 50±5°С.

Выход экстрактов и содержание флавоноидов представлено в таблице 2.

Таблица 2.
Выход экстрактивных веществ и содержание флавоноидов.Название растенияВодная экстракцияЭкстракция 40% водно-спиртовым растворомВыход (%)Содержание флавоноидов (%)Выход (%)Содержание флавоноидов (%)поручейник1417.48.514.2репешок21.426.527.824.1таволга вязолистная18.720.523.522.3фаллопия17.024.421.022.2щавель18.229.217.926.4кровохлебка21,124.325.823.2

Пример 3. Получение экстрактов растений.

а) 300 г предварительно измельченного на роторно-ножевой мельнице растительного сырья 0,63-3 мм фракций, насыпной вес 316 кг/м³, засыпали в сушильный шкаф с принудительной вентиляцией. Сушку и концентрирование проводили при 45°С при постоянном обдуве воздухом той же температуры.

б) 300 г предварительно измельченного на роторно-ножевой мельнице растительного сырья 0,63-3 мм фракций, насыпной вес 316 кг/м³, засыпали в лиофильную сушку. Сырье замораживали до температуры -25°С, затем включали форвакуумный насос. При достижении вакуума 10^-5 МПа включали подогрев тарелок лиофильной сушки, температура 30°С. Сушку и концентрирование вели до достижения температуры образца 30°С (см. табл. 3).

Таблица 3.
Содержание флавоноидов (%) в высушенном и вымороженном концентрате растений.Название растенияВысушенный концентратВымороженный концентратпоручейник7.88.8репешок6.47.2таволга вязолистная7.48.3фаллопия7.78.1щавель8.19.2кровохлебка6.26.8

Пример 4. Получение экстрактов растений.

Получение экстрактов растений: поручейник, щавель, кровохлебка, репешок, таволга вязолистная, фаллопия - проводились, как описано в примере 1, но в качестве экстрагента применяется ацетон, этилацетат или пропан-2-ол.

Выход экстрактов представлен в таблице 4.

Таблица 4.
Выход экстрактивных веществ.Название растенияВыход экстрактивных веществ (%)экстракция ацетономэкстракция этилацетатомэкстракция пропаноломSium latifolium11.27.99.9Agrimonia eupatoria18.425.124.7Filipendula ulmaria17.319.723.4Fallopia convolvulus16.121.219.1Rumex acetosa18.415.917.8Sanguisorba officinalis22.223,125,6

Определение суммы флавоноидов проводили, как описано в примере 1а), согласно методике, применяемой в фармацевтической промышленности (Химический анализ лекарственных растений, под ред. Н.И.Гринкевич, Л.Н.Сафронич. М., Высшая школа, 1983, стр.91-92).

Содержание флавоноидных компонентов представлено в таблице 5.

Таблица 5.
Содержание флавоноидных компонентов в экстрактах растений.Название растенияСодержание флавоноидных компонентов (%)экстракция ацетономэкстракция этилацетатомэкстракция пропаноломSium latifolium13.513.413.6Agrimonia eupatoria22.121.922.9Filipendula ulmaria17.920.121.1Fallopia convolvulus22.522.220.2Rumex acetosa27.429.128.8Sanguisorba officinalis20.720.122.8

Пример 5. Антиоксидантная активность экстрактов растений.

Исследование первичной антиоксидантной активности проводили с использованием так называемого FRAP assay, основанного на восстановлении ионов железа Fe³⁺ в Fe²⁺. В качестве стандарта использовали тимол. Измерения проводили при 505 нм. Для калибровки использовали водный раствор 1000 мкм/л Fe₂SO₄×7H₂O. Полученные данные приведены в таблицах 6, 7.

13Тимол 56,8

Как видно из приведенных таблиц, исследуемые концентраты растений обладают выраженной антиоксидантной активностью, превосходящей активность стандарта - тимола. Причем, при содержании флавоноидов менее 5% в концентрате, активность становится хуже активности стандартного соединения - тимола.

Влияние экстрактов растений на перекисное окисление липидов в митохондриях.

Опыты проводились на препаратах изолированных митохондрий печени крыс в соответствии с методами, описанными в статье: «Шевцова Е.Ф., Киреева Е.Г., Бачурин С.О. Влияние фрагмента β-амилоидного пептида 25-35 на неселективную проницаемость митохондрий. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2001, Т. 132 (12), Стр.652-656» (см. табл. 8).

Табл. 8.
Влияние экстрактов растений на перекисное окисление липидов в митохондриях.№Название растенияIC50, мкг/мл1экстракт поручейника282экстракт репешка обыкновенного25.83экстракт таволги вязолистной384экстракт фаллопии44.75экстракт щавеля конского706экстракт кровохлебки>507Кверцитин178Ginkgo biloba15

Как видно из приведенной таблицы, исследуемые концентрированные экстракты обладают выраженной антиоксидантной активностью. Достоверно показано, что экстракты исследуемых растений снижают образование веществ, взаимодействующих с тиобарбитуровой кислотой (что является показателем перекисного окисления липидов) в митохондриях печени крыс при инкубации их в стандартных условиях энергизации, и могут рассматриваться как активные антиоксиданты перекисного окисления липидов в митохондриях.

Пример 5. Влияние концентратов растений на кальциевый гомеостаз клетки.

Исследовали влияние концентратов растений Ginkgo biloba Egb761a качестве стандарта на захват ⁴⁵Са⁺² в синаптосомы коры мозга новорожденных крысят (9-10 дней) при стимуляции захвата 200 мМ глутаминовой кислотой. Синаптосомы выделяли по стандартной методике Хайоша (Hajos F, Brain Res.,1975, 93, №3, 485-489). Для аккумуляции радиоактивной метки Р₂-фракцию синаптосом суспендировали в инкубационном буфере А (мМ): NaCl 132, KCl 5, HEPES 5, рН7,4. Синаптосомы инкубировали с исследуемым веществом 5 минут (37°С), затем захват ⁴⁵Са⁺² останавливали фильтрованием через фильтры GF/B (Whatman, Англия), промывая три раза холодным буферным раствором Б (145 мМ KCl, 10 мМ трис, 54 мМ трилон Б) и подсчитывали количество радиоактивной метки на сцинтилляционном счетчике. Количество захваченного ⁴⁵Са⁺² в синаптосомы определяли как разницу между содержанием метки в синаптосомах при стимуляции глутаматом и без стимуляции глутаматом и выражали в процентах от контроля (контроль принимали за 100%) (см. табл. 9).

Показано влияние концентратов растений на захват ⁴⁵Са⁺² в синаптосомы коры мозга новорожденных крысят (9-10 дней) при стимуляции захвата 200 мМ глутаминовой кислотой. Показано, что экстракт репешка в концентрациях 0,5-10 мкг/мл не влияет на захват ⁴⁵Са⁺² в синаптосомы коры мозга крыс, при дальнейшем увеличении концентрации экстракта поручейника (25-200 мкг/мл) мы получили ингибирование захвата ⁴⁵Са⁺² в синаптосомы, IC₅₀=125,9 мкг/мл (таб.1). Экстракт кровохлебки в концентрациях 0,5-10 мкг/мл ингибировал захват ⁴⁵Са⁺² в синаптосомы коры мозга крыс, IC₅₀=3,2 мкг/мл. При увеличении концентрации экстракта кровохлебки (25-200 мкг/мл) мы получили стимулирование захвата ⁴⁵Са⁺² в синаптосомы.

Пример 6. Антиоксидантная активность композиций на основе концентрата черники и экстрактов растений: поручейник, щавель, кровохлебка, репешок таволга вязолистная, фаллопия.

Исследование первичной антиоксидантной активности проводили с использованием так называемого FRAP assay, основанного на восстановлении ионов железа Fe³⁺ в Fe²⁺. В качестве стандарта использовали тимол. Измерения проводили при 505 нм. Для калибровки использовали водный раствор 1000 мкм/л Fe₂SO₄×7Н₂O (см. табл. 10).

Как видно из приведенной таблицы, сследуемые композиции на основе концентрата растений обладают выраженной антиоксидантной активностью, превосходящей активность стандарта - тимола.

Влияние композиций на основе концентратов растений на перекисное окисление липидов в митохондриях.

Опыты проводились на препаратах изолированных митохондрий печени крыс в соответствии с методами, описанными в статье: «Шевцова Е.Ф., Киреева Е.Г., Бачурин С.О. Влияние фрагмента β-амилоидного пептида 25-35 на неселективную проницаемость митохондрий. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2001, Т. 132 (12), Стр.652-656» (см. табл. 11).

Как видно из приведенной таблицы, исследуемые композиции на основе концентрата растений обладают выраженной антиоксидантной активностью. Достоверно показано, что концентраты исследуемых растений снижают образование веществ, взаимодействующих с тиобарбитуровой кислотой (что является показателем перекисного окисления липидов) в митохондриях печени крыс при инкубации их в стандартных условиях энергизации, и могут рассматриваться как активные антиоксиданты перекисного окисления липидов в митохондриях.

Пример 7. Исследование потенциального нейропротекторного действия растительных экстрактов на культуре нервных клеток.

Известно, что экстракт Гинкго билоба EG 761 обладает нейропротекторным и нейростимулирующим действием. Для исследования потенциальных нейропротекторных и нейростимулирующих свойств в качестве эталона брали вышеупомянутый экстракт и густые концентраты исследуемых растений. Исследования проводили на культуре нервных клеток мозжечка крысы, используемых в экспериментах по исследованию нейропротекторного действия различных веществ [Лермонтова Н.Н., Редкозубов А.Е., Шевцова Е.Ф., Серкова Т.П., Киреева Е.Г., Бачурин С.О. Димебон и такрин ингибируют нейротоксическое действие бета-амилоида в культуре и блокируют Са²⁺ -каналы L-типа. 2001, Бюлл. эксперимент. биологии и медицины, Т.132, №11, С.545-55].

Нейроны (клетки-зерна мозжечка - КЗМ) получали из мозга 7-8-дневных крыс способом трипсинизации с последующим пилотированием. Суспендированные в среде клетки вносили по 1 мл (2,5-5×10⁶ кл/мл) в лунки 24-луночного планшета (Nunc), поверхности покрывали полилизином. Культуральная среда состояла из смеси минимальной среды Игла и среды Дюльбекко F12 (1:1), дополненной 10% сыворотки теленка, глютамином (2 мМ), гентамицином (50 μг/мл), глюкозой (15 мМ) и KCl до 25 мМ, рН среды = 7-7,2 NaHCO₃. Все компоненты сред фирмы Sigma. Культивирование проводили в СО₂-инкубаторе при 37°С и 100% влажности. Через 48 час 80% культуральной среды заменяли на аналогичную свежую с 10 мкг/мл цитозинарабинозида и 1 мл/100 мл Supplement N1, но без сыворотки и среды Дюльбекко. Растительные экстракты растворяли в воде до 1 мг/кг и вносили в культуральную среду в необходимой концентрации, газовую фазу при культивировании меняли, перенося планшеты с культурами из CO₂-инкубатора в обычный термостат и наоборот. Состояние клеток в культуре оценивали ежедневно с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 25С с видео вводом изображения на монитор.

При изменении газовой фазы (то есть содержания кислорода и углекислого газа над средой культивирования) у культивируемых нейронов происходит видимое под микроскопом увеличение объема тел клеток как реакция на стрессовое воздействие. Предварительное (за 16-18 часов) введение в культуральную среду концентрата растений предохраняет нейроны от набухания (фото 1 - контроль; Фото 2 - предварительное добавление репешка (0,025 мг/мл)). Несколько концентратов вызывают стимуляцию дифференцировки астроцитов (переход во взрослую «звездчатую» форму), клеток, являющихся промежуточными по положению между капиллярами и нейронами и ответственными за их трофическое обеспечение (фото 3, 4).

Таким образом, проведенные исследования показали, что концентраты растений поручейник, щавель, кровохлебка, репешок, таволга вязолистная, фаллопия и/или их смеси обладают широким спектром активного биологического действия на организм и могут быть использованы в качестве средств с геропротекторной и нейропротекторной активностью в виде биологически активных добавок в пищевых и фармацевтических композициях, благодаря обнаруженным нами воздействию на процессы свободно-радикального окисления, способность стабилизировать кальциевый гомеостаз в клетках и нормализовать функционирование клеточных протекторных систем с действием на рецепторы эстрогенов, функциональная активность которых снижается с возрастом, активно защищая нейроны головного мозга от дегенеративных процессов.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к производству композиций с комплексным геропротекторным действием. Предложено применение концентрата по крайней мере одного из растений: поручейник - Sium latifolium, щавель - Rumex acetosa, кровохлебка - Sanguisorba officinalis, репешок - Agrimonia asiatica, таволга вязолистная - Filipendula ulmaria, фаллопия - Fallopia convolvulus и/или их смеси. В концентрате общее содержание флавоноидов концентрата составляет больше 5%. Средство, обладающее геропротекторной активностью, содержит в качестве эффективного начала концентрат по крайней мере одного из растений: поручейник - Sium latifolium, щавель - Rumex acetosa, кровохлебка - Sanguisorba officinalis, репешок - Agrimonia asiatica, таволга вязолистная - Filipendula ulmaria, фаллопия - Fallopia convolvulus и/или их смеси. Средство дополнительно содержит концентрат побегов черники, причем содержание каждого компонента составляет от 10 до 90 вес.%. Средство дополнительно включает пригодные для включения в пищу компоненты, выбранные из группы, включающей витамины, минеральные компоненты, микроэлементы, клетчатку (в том числе и микрокристаллическую целлюлозу), корригенты, консерванты, красители, эмульгаторы, крахмал, карбонат кальция (мел), подслащивающие вещества (в том числе лактоза, сахароза, фруктоза) при сохранении его эффективной дозы 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 11 табл., 4 фото.

1. Применение концентрата по крайней мере одного из растений: поручейник - Sium latifolium, щавель - Rumex acetosa, кровохлебка -Sanguisorba officinalis, репешок - Agrimonia asiatica, таволга вязолистная - Filipendula ulmaria, фаллопия - Fallopia convolvulus и/или их смеси в качестве средства с геропротекторной активностью.2. Применение концентрата по п.1, где общее содержание флавоноидов концентрата составляет больше 5%.3. Средство, обладающая геропротекторной активностью, содержащее эффективное начало и фармацевтически приемлемый носитель, отличающееся тем, что оно содержит в качестве эффективного начала концентрат по крайней мере одного из растений: поручейник - Sium latifolium, щавель - Rumex acetosa, кровохлебка - Sanguisorba officinalis, репешок - Agrimonia asiatica, таволга вязолистная - Filipendula ulmaria, фаллопия - Fallopia convolvulus и/или их смеси.4. Средство по п.2, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит концентрат побегов черники, причем содержание каждого компонента составляет 10-90 вес.%.