Уровень техники
[0001] Область изобретения:
[0002] Настоящее изобретение относится к предотвращению или задержке дегенерации межпозвоночного диска. Настоящая заявка также относится к лечению дегенерации диска путем предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска. Настоящее изобретение также относится к способам использования хондроцитов для введения в поврежденную область межпозвоночного диска и предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска. Настоящее изобретение также относится к способу введения по меньшей мере одного гена, кодирующего члена суперсемейства трансформирующего фактора роста β, по меньшей мере в одну клетку млекопитающего для использования в предотвращении или задержке дегенерации межпозвоночного диска у млекопитающего-хозяина. Настоящее изобретение также относится к способу применения смеси хондроцитов и клеток млекопитающих, содержащих ген, кодирующий члена суперсемейства трансформирующего фактора роста β, в травмированную область межпозвоночного диска и предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска, который включает введение клетки соединительной ткани млекопитающего в место дефекта межпозвоночного диска. В процессе предпочтительно не используются подложка или какая-либо поддерживающая структура для клеток. Предпочтительно используется нетрансфицированный хондроцит или фибробласт, а субъектом предпочтительно является человек. Если используется хондроцит, то предпочтительно использовать недисковый хондроцит или ювенильный хондроцит, то есть когда клетки выделены от ребенка, которому менее двух лет. В других аспектах хондроциты могут быть примированными хондроцитами. В частности, клетка соединительной ткани может быть аллогенной по отношению к субъекту-млекопитающему, которого предполагается лечить.
[0004] Трансфицированные клетки млекопитающих, как обсуждалось выше, могут включать эпителиальные клетки, предпочтительно эпителиальные клетки человека, или клетки 293 эмбриональной почки человека, также называемые клетки HEK 293, HEK-293, или клетки 293.
[0005] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам использования аллогенных ювенильных хондроцитов или аллогенных недисковых хондроцитов для введения в поврежденную область межпозвоночного диска и предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска.
[0006] В одном аспекте настоящее изобретение используется для предотвращения или задержки дальнейшей дегенерации области межпозвоночного диска после ее травмы, разрыва или выпячивания.
[0007] В другом аспекте изобретение направлено на способ предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска у млекопитающего, который включает: а) вставку гена, кодирующего белок с функцией регенерации межпозвоночного диска, в клетку млекопитающего и b) трансплантацию клетки млекопитающего в место дефекта межпозвоночного диска. В процессе предпочтительно не используются подложка или какая-либо поддерживающая структура для клеток. В этом способе ген может принадлежать к суперсемейству TGF-β, например, TGF-β, и предпочтительно TGF-β1.
[0008] Трансфицированные клетки млекопитающих, как обсуждалось выше, могут включать эпителиальные клетки, предпочтительно эпителиальные клетки человека, или клетки 293 эмбриональной почки человека, также называемые клетки HEK 293, HEK-293, или клетки 293.
[0009] Еще в одном аспекте изобретение направлено на способ предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска у млекопитающего, который включает: а) вставку гена, кодирующего белок с функцией регенерации межпозвоночного диска, в первую клетку млекопитающего и b) трансплантацию смеси клетки млекопитающего из пункта а) и немодифицированной второй клетки соединительной ткани млекопитающего в место дефекта межпозвоночного диска. В процессе предпочтительно не используются подложка или какая-либо поддерживающая структура для клеток. В этом способе ген может принадлежать к суперсемейству TGF-β, например, TGF-β, и предпочтительно TGF-β1.
[0010] Первые трансфицированные клетки млекопитающих, как обсуждалось выше, могут включать эпителиальные клетки, предпочтительно эпителиальные клетки человека, или клетки 293 эмбриональной почки человека, также называемые клетки HEK 293, HEK-293, или клетки 293.
[0011] Второй клеткой соединительной ткани млекопитающих может быть хондроцит или фибробласт. В случае хондроцита, хондроцит может быть недисковым хондроцитом или ювенильным хондроцитом. В частности, хондроцит второй клетки соединительной ткани млекопитающего может быть примированным хондроцитом. В другом аспекте первая или вторая клетка соединительной ткани или обе могут быть аллогенными по отношению к субъекту-млекопитающему или друг к другу.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0012] На ФИГ. 1A-1F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) в области L2/3 позвоночника не видно пункции и никакого лечения, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, при которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и была введена смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение смесью клеток, в частности, оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0013] На ФИГ. 2A-2F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) в области L2/3 позвоночника не видно пункции и никакого лечения, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, при которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и была введена смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение смесью клеток, в частности, оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0014] На ФИГ. 3A-3D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) в области L2/3 позвоночника не видно пункции и никакого лечения, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение смесью клеток, в частности, оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0015] На ФИГ. 4A-4D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован, и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. В частности, TGF-β1-продуцирующие клетки 293 оказывают антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0016] На ФИГ. 5A-5D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован, и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение TGF-β1-продуцирующими клетками 293 и, в частности, лечение смесью клеток оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0017] На ФИГ. 6A-6D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через четыре (4) недели после операции, в которой (i) был поврежден диск L1/2 и введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе позвоночника L2/3, и (iii) был поврежден диск L3/4 и введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение нетрансдуцированными хондроцитами оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0018] На ФИГ. 7A-7F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через четыре (4) недели после операции, в которой (i) был поврежден диск L1/2 и введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе позвоночника L2/3, и (iii) был поврежден диск L3/4 и введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, в которой (i) был травмирован диск в L1/2 и введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) был травмирован диск в L3/4 и введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение нетрансдуцированными хондроцитами оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0019] На ФИГ. 8A-8F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в T12/L1 был поврежден путем пункции иглой и без инъекции, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L1/2 позвоночника, и (iii) диск в L2/3 был поврежден и были введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков T12/L1 и L2/3. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, в которой (i) диск в T12/L1 был травмирован путем пункции иглой и без инъекции, (ii) без пункции и контроля лечения в позвоночном локусе L1/2, и (iii) диск в L2/3 был травмирован и были введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков T12/L1 и L2/3. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение нетрансдуцированными хондроцитами оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
[0020] На ФИГ. 9A-9D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 8 (восемь) недель после операции, в которой (i) диск в L2/3 был травмирован и в него была введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе L3/4 позвоночника, и (iii) диск в L4/5 был травмирован и в него были введены примированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L2/3 и L4/5. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. Лечение примированными хондроцитами оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0021] Как используется в настоящем документе, термин "биологически активный" в отношении нуклеиновой кислоты, белка, фрагмента белка или их производного определяется как способность нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности имитировать известную биологическую функцию, вызываемую формой нуклеиновой кислоты или белка дикого типа.
[0022] Как используется в настоящем документе, термин "клетки млекопитающих" в отношении трансфицированных или трансдуцированных клеток включает все типы клеток млекопитающих, в частности клетки человека, включая, но не ограничиваясь этим, клетки соединительной ткани, такие как фибробласты или хондроциты, или стволовые клетки, в частности клетки эмбриональной почки человека, и далее, в частности, клетки 293 эмбриональной почки человека, или эпителиальные клетки.
[0023] Как используется в настоящем документе, термин "соединительная ткань" представляет собой любую ткань, которая соединяет и поддерживает другие ткани или органы, и включает, но не ограничивается этим, связку, хрящ, сухожилие, кость и синовиальную оболочку млекопитающего-хозяина.
[0024] Как используется в настоящем документе, термин "соединительно-тканная клетка" или "клетка соединительной ткани" включает клетки, которые находятся в соединительной ткани, такие как фибробласты, клетки хряща (хондроциты) и костные клетки (остеобласты/остеоциты), которые выделяют коллагеновый внеклеточный матрикс, а также жировые клетки (адипоциты) и гладкомышечные клетки. Предпочтительно, клетки соединительной ткани представляют собой фибробласты, хондроциты или костные клетки. Предпочтительно, клетки соединительной ткани представляют собой клетки хондроцитов. Следует понимать, что изобретение может быть реализовано как со смешанной культурой клеток соединительной ткани, так и с клетками одного типа. Предпочтительно, клетка соединительной ткани не вызывает негативной иммунной реакции при введении в организм хозяина. Понятно, что в этом отношении могут быть использованы аллогенные клетки, а также аутологичные клетки для клеточно-опосредованной генной терапии или терапии соматическими клетками.
[0025] Как используется в настоящем документе, "линия клеток соединительной ткани" включает в себя множество клеток соединительной ткани, происходящих от общей родительской клетки.
[0026] Как используется в настоящем документе, "гиалиновый хрящ" относится к соединительной ткани, покрывающей поверхность сустава. Только в качестве примера, гиалиновый хрящ включает, но не ограничивается этим, суставной хрящ, реберный хрящ и носовой хрящ.
[0027] В частности, известно, что гиалиновый хрящ самообновляется, реагирует на изменения и обеспечивает стабильное движение с меньшим трением. Гиалиновый хрящ, встречающийся даже в пределах одного сустава или между суставами, различается по толщине, плотности клеток, составу матрикса и механическим свойствам, но при этом сохраняет одну и ту же общую структуру и функцию. Некоторые из функций гиалинового хряща включают удивительную способность противостоять сжатию, упругость и исключительную способность распределять весовые нагрузки, способность минимизировать пиковую нагрузку на субхондральную кость и большую долговечность.
[0028] Визуально и гистологически гиалиновый хрящ выглядит как гладкая, твердая поверхность, которая сопротивляется деформации. Внеклеточный матрикс хряща состоит из хондроцитов, но в нем отсутствуют кровеносные, лимфатические сосуды и нервы. Сложная, высокоупорядоченная структура, поддерживающая взаимодействие между хондроцитами и матриксом, служит для поддержания структуры и функции гиалинового хряща, сохраняя при этом низкий уровень метаболической активности. Ссылка O’Driscoll, J. Bone Joint Surg., 80A: 1795-1812, 1998 подробно описывает структуру и функцию гиалинового хряща, которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[0029] Как используется в настоящем документе, "инъецируемая" композиция относится к композиции, которая исключает различные трехмерные подложки, каркасы, сетки или волокнистые структуры, которые могут быть изготовлены из любого материала или формы, которые позволяют клеткам прикрепляться к ним и позволяют клеткам расти более чем в одном слое, и которые обычно имплантируются, а не вводятся путем инъекции. В одном варианте реализации изобретения способ введения обычно осуществляется с помощью шприца. Однако может быть использован любой способ введения интересующей композиции. Например, могут быть использованы катетеры, распылители или термозависимые полимерные гели.
[0030] Как используется в настоящем документе, "ювенильный хондроцит" относится к хондроциту, полученному от человека, которому менее двух лет. Как правило, хондроцит получают предпочтительно из области гиалинового хряща конечности тела, например, пальца, носа, мочки уха и так далее. Ювенильные хондроциты могут быть использованы в качестве донорских хондроцитов для аллогенного лечения дефектного или поврежденного межпозвоночного диска.
[0031] Как используется в настоящем документе, термин "млекопитающее-хозяин" включает представителей животного царства, включая человека, но не ограничиваясь этим.
[0032] Как используется в настоящем документе, "смесь клеток" или "смешанные клетки" относится к комбинации множества клеток, включающих первую популяцию клеток, которые трансфицированы или трансдуцированы представляющим интерес геном, и вторую популяцию клеток, которые не трансдуцированы.
[0033] В одном варианте реализации изобретения смесь клеток может относиться к комбинации множества клеток, включающих клетки, которые были трансфицированы или трансдуцированы геном или ДНК, кодирующей члена суперсемейства β трансформирующих факторов роста, и клетки, которые не были трансфицированы или трансдуцированы геном, кодирующим члена суперсемейства β трансформирующих факторов роста. Обычно соотношение клеток, которые не были трансфицированы или трансдуцированы геном, кодирующим члена суперсемейства β трансформирующего фактора роста, к клеткам, которые были трансфицированы или трансдуцированы геном суперсемейства TGF, может находиться в диапазоне от 3-20 к 1. Диапазон может включать соотношение от 3-10 к 1, в частности, диапазон может составлять от 10 к 1 в пересчете на количество клеток. Однако понятно, что соотношение этих клеток не обязательно должно быть фиксированным в каком-либо определенном диапазоне до тех пор, пока комбинация этих клеток является эффективной для лечения поврежденного межпозвоночного диска путем замедления или задержки дегенерации поврежденного межпозвоночного диска.
[0034] Как используется в настоящем документе, "недисковый хондроцит" относится к хондроцитам, выделенным из любой части тела, кроме хрящевой ткани межпозвоночного диска. Недисковые хондроциты по настоящему изобретению могут быть использованы для аллогенной трансплантации или инъекции пациенту для лечения дефекта или повреждения межпозвоночного диска.
[0035] Как используется в настоящем документе, термин "пациент" включает представителей животного царства, включая человека, но не ограничиваясь этим.
[0036] Как используется в настоящем документе, термин "примированные" клетки относится к клеткам, которые были активированы или изменены для экспрессии определенных генов.
[0037] Как используется в настоящем документе, "замедление" или "предотвращение" дегенерации межпозвоночного диска относится к сохранению объема межпозвоночного диска или высоты диска с течением времени по сравнению с объемом или уровнем высоты, которые обычно наблюдаются в месте повреждения, обычно приводящего к дегенерации в течение определенного времени. Это может означать увеличение в процентах объема или высоты, например, около 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% по сравнению с нормальным ожидаемым уровнем дегенерации в определенное время, или может означать уменьшение повреждения или уменьшение объема или высоты межпозвоночного диска в данном месте.
[0038] Как используется в настоящем документе, "суперсемейство трансформирующих факторов роста β (TGF-β)" охватывает группу структурно родственных белков, которые влияют на широкий спектр процессов дифференцировки во время эмбрионального развития. Семейство включает в себя: ингибирующее вещество Мюллера (MIS), которое необходимо для нормального развития мужского пола (Behringer, et al., Nature, 345:167, 1990), продукт гена Drosophila decapentaplegic (DPP), который необходим для формирования дорсально-вентральной оси и морфогенеза имагинальных дисков (Padgett, et al., Nature, 325:81-84, 1987), продукт гена Xenopus Vg-1, который локализуется на вегетативном полюсе яйца (Weeks, et al., Cell, 51:861-867, 1987), активины (Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986), которые могут индуцировать формирование мезодермы и передних структур у эмбрионов Xenopus (Thomsen, et al., Cell, 63:485, 1990), и костные морфогенетические белки (BMP, такие как BMP-2, 3, 4, 5, 6 и 7, остеогенин, OP-1), которые могут индуцировать образование хряща и кости de novo (Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265:13198, 1990). Продукты гена TGF-β могут влиять на различные процессы дифференцировки, включая адипогенез, миогенез, хондрогенез, кроветворение и дифференцировку эпителиальных клеток (обзор см. в статье Massague, Cell 49:437, 1987), которая включена в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки.
[0039] Белки семейства TGF-β изначально синтезируются в виде большого белка-предшественника, который впоследствии подвергается протеолитическому расщеплению в кластер основных остатков около 110-140 аминокислот от С-конца. С-концевые области всех белков структурно родственны, и различные члены семейства могут быть классифицированы в отдельные подгруппы на основе степени их гомологии. Хотя гомологии внутри конкретных подгрупп составляют от 70% до 90% идентичности аминокислотной последовательности, гомологии между подгруппами значительно ниже, обычно от 20% до 50%. В каждом случае активный вид представляет собой димер С-концевых фрагментов, связанных дисульфидной связью. Для большинства изученных членов семейства биологически активными оказались гомодимерные виды, но для других членов семейства, таких как ингибины (Ung, et al., Nature, 321:779, 1986) и TGF-β(Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987), также были обнаружены гетеродимеры, которые, по-видимому, обладают иными биологическими свойствами, чем соответствующие гомодимеры.
[0040] Члены суперсемейства генов TGF-β включают TGF-β3, TGF-β2, TGF-β4 (куры), TGF-β1, TGF-β5 (Xenopus), BMP-2, BMP-4, Drosophila DPP, BMP-5, BMP-6, Vgr1, OP-1/BMP-7, Drosophila 60A, GDF-1, Xenopus Vgf, BMP-3, Inhibin-βA, Inhibin-βB, Inhibin-α и MIS. Эти гены обсуждаются в Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998, который полностью включен сюда посредством ссылки во всей своей полноте.
[0041] Предпочтительно, члены генов суперсемейства TGF-β представляют собой TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 или BMP-7.
[0042] Межпозвоночный диск
[0043] Межпозвоночные диски составляют одну четвертую часть длины позвоночного столба. Между атлантом (C1), шейным позвонком (C2) и копчиком нет дисков. Диски не имеют сосудов и поэтому зависят от концевых пластинок для диффузии необходимых питательных веществ. Хрящевые слои концевых пластин закрепляют диски на месте.
[0044] Межпозвоночные диски - это фиброхрящевые подушки, служащие амортизационной системой позвоночника, которые защищают позвонки, мозг и другие структуры (например, нервы). Диски обеспечивают некоторое движение позвонков: разгибание и сгибание. Движение отдельных дисков очень ограничено - однако значительное движение возможно, когда несколько дисков объединяют усилия.
[0045] Межпозвоночные диски состоят из фиброзного кольца (annulus fibrosus) и пульпозного ядра (nucleus pulposus). Фиброзное кольцо представляет собой прочную радиальную шиноподобную структуру, состоящую из ламелей; концентрических листов коллагеновых волокон, соединенных с концевыми пластинами позвонков. Листы ориентированы под разными углами. Фиброзное кольцо окружает пульпозное ядро.
[0046] Хотя и фиброзное кольцо, и пульпозное ядро состоят из воды, коллагена и протеогликанов (ПГ), больше всего количества жидкости (воды и ПГ) находится в пульпозном ядре. Молекулы ПГ важны, поскольку они притягивают и удерживают воду. Пульпозное ядро содержит гидратированное гелеобразное вещество, которое сопротивляется сжатию. Количество воды в ядре меняется в течение дня в зависимости от активности. С возрастом пульпозное ядро начинает обезвоживаться, что ограничивает его способность поглощать удар. С возрастом фиброзное кольцо ослабевает и начинает рваться. Хотя у некоторых людей это может не вызывать боли, у других один или оба этих признака могут стать причиной хронической боли.
[0047] Боль, вызванная неспособностью обезвоживающегося пульпозного ядра поглощать удар, называется осевой болью или болью в дисковом пространстве. Постепенное обезвоживание пульпозного ядра обычно называют дегенеративным заболеванием диска. Когда фиброзное кольцо разрывается из-за травмы или процесса старения, пульпозное ядро может начать выдавливаться через разрыв. Это называется выпячиванием диска. Рядом с задней стороной каждого диска, вдоль всего позвоночника, проходят основные спинномозговые нервы, идущие к различным органам, тканям, конечностям и т.д. Очень часто выпяченный диск давит на эти нервы (защемление нерва), вызывая иррадиирующую боль, онемение, покалывание, снижение силы и/или амплитуды движений. Кроме того, контакт внутреннего ядерного геля, который содержит воспалительные белки, с нервом также может вызвать сильную боль. Боль, связанная с нервами, называется корешковой болью.
[0048] Выпяченные диски имеют много названий, и для разных медицинских специалистов они могут означать разные вещи. Скользящий диск, разрыв диска или выпячивание диска могут относиться к одному и тому же медицинскому состоянию. Протрузии диска в соседний позвонок известны как узлы Шморля.
[0049] Лечение примированными клетками
[0050] Настоящее изобретение охватывает введение примированных клеток в область межпозвоночного диска млекопитающего для лечения поврежденного межпозвоночного диска путем предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска. Примированные клетки обычно являются клетками соединительной ткани и включают хондроциты или фибробласты.
[0051] В качестве примера, когда популяцию первичных хондроцитов пассируют около 3 или 4 раз, их морфология обычно меняется на фибробластные хондроциты. По мере пассирования первичных хондроцитов они начинают терять некоторые из своих хондроцитарных характеристик и начинают приобретать характеристики фибробластных хондроцитов. Когда эти фибробластные хондроциты инкубируются или "примируются" с цитокином, таким как белок из суперсемейства TGF-β, клетки восстанавливают свои хондроцитарные характеристики, которые включают производство коллагена.
[0052] К таким примированным клеткам относятся фибробластные хондроциты, которые были инкубированы с TGFβ1 и в результате превратились в хондроциты, продуцирующие коллаген. Преимуществом использования примированных клеток для задержки дегенерации межпозвоночного диска является простота создания хондроцитов, пригодных для введения в межпозвоночный диск для производства коллагена и поддержания хрящевого матрикса.
[0053] Клетки могут включать, без ограничения, первичные клетки или клетки, прошедшие от одного до двадцати пассажей. Клетки могут быть клетками соединительной ткани. Клетки могут включать клетки, подвергшиеся морфогенному изменению, при этом примирование вызывает возврат к характеристикам исходной клетки. Клетки могут включать, без ограничения, хондроциты, фибробласты или фибробластные хондроциты. Примирование может происходить путем инкубации клеток в течение по меньшей мере 40 часов или от 1 до 40 часов, от 2 до 30 часов, от 3 до 25 часов, от 4 до 20 часов, от 5 до 20, от 6 до 18 часов, от 7 до 17 часов, от 8 до 15 часов или от 9 до 14 часов с цитокином, а затем, необязательно, отделения цитокина от клеток и введения примированных клеток в интересующий участок хрящевого дефекта для регенерации хряща, предпочтительно гиалинового хряща. В одном аспекте цитокин может быть членом суперсемейства TGF-β. В частности, цитокином может быть TGF-β, и, в частности, TGF-β1.
[0054] Цитокин может присутствовать в инкубационной смеси для примирования в количестве, достаточном для "примирования" хондроцитов, чтобы быть полезным в способе лечения межпозвоночных дисков. В этом аспекте примирующая инкубационная смесь может содержать по меньшей мере около 1 нг/мл цитокина. В частности, смесь может содержать от около 1 до 1000 нг/мл, от около 1 до 750 нг/мл, от около 1 до 500 нг/мл, от около 1 до 400 нг/мл, от около 1 до 300 нг/мл, от около 1 до 250 нг/мл, от около 1 до 200 нг/мл, от около 1 до 150 нг/мл, от около 1 до 100 нг/мл, от около 1 до 75 нг/мл, от около 1 до 50 нг/мл, от около 10 до 500 нг/мл, от около 10 до 400 нг/мл, от около 10 до 300 нг/мл, от около 10 до 250 нг/мл, от около 10 до 200 нг/мл, от около 10 до 150 нг/мл, от около 10 до 100 нг/мл, от около 10 до 75 нг/мл, от около 10 до 50 нг/мл, от около 15 до 500 нг/мл, от около 15 до 400 нг/мл, от около 15 до 300 нг/мл, от около 15 до 250 нг/мл, от около 15 до 200 нг/мл, от около 15 до 150 нг/мл, от около 15 до 100 нг/мл, от около 15 до 75 нг/мл, от около 15 до 50 нг/мл, от около 20 до 500 нг/мл, от около 20 до 400 нг/мл, от около 20 до 300 нг/мл, от около 20 до 250 нг/мл, от около 20 до 200 нг/мл, от около 20 до 150 нг/мл, от около 20 до 100 нг/мл, от около 20 до 75 нг/мл, от около 20 до 50 нг/мл, от около 25 до 500 нг/мл, от около 25 до 400 нг/мл, от около 25 до 300 нг/мл, от около 25 до 250 нг/мл, от около 25 до 200 нг/мл, от около 25 до 150 нг/мл, от около 25 до 100 нг/мл, от около 25 до 75 нг/мл, от около 25 до 50 нг/мл, от около 30 до 500 нг/мл, от около 30 до 400 нг/мл, от около 30 до 300 нг/мл, от около 30 до 250 нг/мл, от около 30 до 200 нг/мл, от около 30 до 150 нг/мл, от около 30 до 100 нг/мл, от около 30 до 75 нг/мл, от около 30 до 50 нг/мл, от около 35 до 500 нг/мл, от около 35 до 400 нг/мл, от около 35 до 300 нг/мл, от около 35 до 250 нг/мл, от около 35 до 200 нг/мл, от около 35 до 150 нг/мл, от около 35 до 100 нг/мл, от около 35 до 75 нг/мл, от около 35 до 50 нг/мл, от около 40 до 500 нг/мл, от около 40 до 400 нг/мл, от около 40 до 300 нг/мл, от около 40 до 250 нг/мл, от около 40 до 200 нг/мл, от около 40 до 150 нг/мл, от около 40 до 100 нг/мл, от около 40 до 75 нг/мл или от около 40 до 50 нг/мл.
[0055] Один из способов осуществления изобретения может включать инкубацию клеток с цитокином в течение определенного времени для создания примированных клеток и, необязательно, отделение цитокина от клеток, и введение примированных клеток в межпозвоночный диск или интересующий участок рядом с ним. В качестве альтернативы, клетки можно инкубировать с интересующим цитокином в течение определенного времени и вводить комбинацию в место дефекта без отделения цитокина.
[0056] Следует понимать, что хотя возможно, что такие вещества, как подложка или каркас, а также различные посторонние ткани могут быть имплантированы вместе в протоколе примированной клеточной терапии настоящего изобретения, также возможно, что такие подложки или ткани не будут включены в инъекционную систему изобретения. В предпочтительном варианте реализации изобретения в соматической клеточной терапии изобретение направлено на простой способ введения популяции примированных клеток соединительной ткани в пространство межпозвоночного диска.
[0057] Обычному специалисту в данной области будет понятно, что источником клеток для лечения пациента могут быть собственные клетки пациента, но также могут быть использованы аллогенные и ксеногенные клетки без учета гистосовместимости клеток. Альтернативно, в одном варианте реализации изобретения могут быть использованы аллогенные клетки, имеющие соответствующую гистосовместимость с млекопитающим-хозяином. Более подробное описание: гистосовместимость донора и пациента определяется таким образом, чтобы гистосовместимые клетки вводились млекопитающему-хозяину. Также ювенильные хондроциты могут быть использованы аллогенно без обязательного определения гистосовместимости донора и пациента.
[0058] Доставка генов
[0059] В одном аспекте настоящее изобретение раскрывает способы ex vivo и in vivo для доставки представляющей интерес последовательности ДНК в клетки соединительной ткани млекопитающего хозяина. Методика ex vivo включает культивирование целевых клеток млекопитающих, трансфекцию in vitro последовательности ДНК, вектора ДНК или другого средства доставки, представляющего интерес, в клетки млекопитающих с последующей трансплантацией модифицированных клеток млекопитающих в целевую область млекопитающего-хозяина для реализации экспрессии in vivo интересующего генного продукта.
[0060] Следует понимать, что хотя возможно, что такие вещества, как подложка или каркас, а также различные посторонние ткани могут быть имплантированы вместе в протоколе примированной клеточной терапии настоящего изобретения, предпочтительно, чтобы такие подложки или ткани не были включены в инъекционную систему изобретения. В одном варианте реализации изобретение направлено на простой способ введения белка суперсемейства TGF или популяции культивированных, нетрансфицированных/нетрансфицированных клеток соединительной ткани или трансфицированных/трансфицированных клеток млекопитающих или их смеси в пространство межпозвоночного диска таким образом, чтобы экзогенный белок суперсемейства TGF экспрессировался или был активен в пространстве.
[0061] Обычному специалисту в данной области будет понятно, что одним из источников клеток для лечения пациента являются собственные клетки пациента. Другой источник клеток включает аллогенные клетки без учета гистосовместимости клеток с пациентом, которого предполагается лечить.
[0062] Более конкретно, данный способ включает использование генного продукта, который является членом суперсемейства β трансформирующего фактора роста, или его биологически активного производного или фрагмента, или его биологически активного производного или фрагмента.
[0063] В другом варианте реализации настоящего изобретения для парентерального введения пациенту в терапевтически эффективном количестве предлагается соединение, содержащее белок суперсемейства TGF-β и подходящий фармацевтический носитель.
[0064] В другом варианте реализации настоящего изобретения для парентерального введения пациенту в профилактически эффективном количестве предлагается соединение, содержащее белок суперсемейства TGF-β и подходящий фармацевтический носитель.
[0065] При терапевтическом применении белок TGF-β может быть создан в виде рецептуры для местного введения. Методики и рецептуры в целом можно найти в "Remington’s Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., последнее издание. Активный ингредиент, которым является белок TGF, обычно сочетается с носителем, таким как разбавитель или вспомогательное вещество, которое может включать наполнители, экстендеры, связывающие, смачивающие агенты, дезинтегранты, поверхностно-активные агенты, разрушаемые полимеры или смазки, в зависимости от характера способа применения и лекарственных форм. Типичные лекарственные формы включают порошки, жидкие препараты, включая суспензии, эмульсии и растворы, гранулы и капсулы.
[0066] TGF белок по настоящему изобретению также может быть объединен с фармацевтически приемлемым носителем для введения субъекту. Примерами подходящих фармацевтических носителей являются различные катионные липиды, включая, но не ограничиваясь этим, N-(1-2,3-диолеилокси)пропил)-n,n,n-триметиламмоний хлорид (DOTMA) и диолеоилфотидилэтаноламин (DOPE). Липосомы также являются подходящими носителями для молекул белка TGF по изобретению. Другим подходящим носителем является гель или полимер с замедленным высвобождением, содержащий молекулы белка TGF.
[0067] Белок TGF бета может быть смешан с количеством физиологически приемлемого носителя или разбавителя, такого как физиологический раствор или другая подходящая жидкость. Молекула белка TGF также может быть объединена с другими носителями для защиты белка TGF и его биологически активных форм от деградации до достижения ими своих мишеней и/или облегчения перемещения белка TGF или его биологически активной формы через тканевые барьеры.
[0068] Еще один вариант реализации настоящего изобретения включает хранение клеток перед их переносом. Специалисты в данной области оценят, что клетки можно хранить замороженными в 10% ДМСО в жидком азоте.
[0069] В настоящей заявке предлагается способ регенерации или предотвращения дегенерации межпозвоночного диска путем введения соответствующей клетки млекопитающего, трансфицированной или трансдуцированной геном, кодирующим член суперсемейства трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β), включая, но не ограничиваясь,этим, BMP-2 и TGF-β 1, 2 и 3.
[0070] В другом варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска путем введения соответствующей клетки соединительной ткани, которая не трансфицирована или не трансдуцирована геном, кодирующим член суперсемейства трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β) или которая не трансфицирована или не трансдуцирована любым другим геном. В другом аспекте изобретение направлено на лечение поврежденного или дегенерированного межпозвоночного диска путем предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска с помощью описанного выше способа.
[0071] В другом варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска путем введения соответствующей клетки млекопитающего, которая трансфицирована или трансдуцирована геном, кодирующим член суперсемейства трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β). В другом аспекте изобретение направлено на лечение поврежденного или дегенерированного межпозвоночного диска путем предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска с помощью описанного выше способа.
[0072] В другом варианте реализации настоящего изобретения предлагается способ предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска путем инъекции комбинации или смеси введения соответствующей клетки млекопитающего, которая трансфицирована или трансдуцирована геном, кодирующим член суперсемейства трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β), и соответствующей клетки соединительной ткани, которая не трансфицирована или не трансдуцирована геном, кодирующим член суперсемейства трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β) или не трансфицирована или не трансдуцирована любым другим геном. В другом аспекте изобретение направлено на лечение поврежденного или дегенерированного межпозвоночного диска путем предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска с помощью описанного выше способа.
[0073] В одном из вариантов реализации изобретения подразумевается, что клетки могут быть введены в область, в которой необходимо предотвратить или замедлить дегенерацию межпозвоночного диска, с помощью вышеописанной композиции клеток с или без материала подложки или любого другого вспомогательного материала, такого как посторонние клетки или другие биосовместимые носители. То есть, только модифицированные клетки, только немодифицированные клетки, или их смесь или комбинация могут быть введены в область, в которой необходимо предотвратить или замедлить дегенерацию межпозвоночного диска.
[0074] Следующие примеры приведены в качестве иллюстрации настоящего изобретения, а не в качестве ограничения.
ПРИМЕРЫ
[0075] ПРИМЕР 1 - МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ
[0076] Конструкция плазмиды
[0077] Плазмиду pMTMLVβ1 генерировали путем клонирования фрагмента 1,2 т.п.н. Bgl II, содержащего кодирующую последовательность TGF-β1 и сайт poly A гормона роста на 3’-конце в сайт Bam HI pMTMLV. Вектор pMTMLV получали из ретровирусного вектора MFG путем делеции полных последовательностей gag и env, а также части последовательности упаковки ψ .
[0078] Культура клеток и трансдукция - Кодирующую ДНК - TGF-β, клонированную в ретровирусных векторах индивидуально трансдуцировали в клетки 293 (293-TGF-β1). Их культивировали в среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium (GIBCO-BRL, Rockville, MD) с 10% концентрацией фетальной бычьей сыворотки.
[0079] Для отбора клеток с трансдуцированной генной последовательностью в среду добавляли неомицин (300 мкг/мл). Клетки с экспрессией TGF-β1 иногда хранили в жидком азоте и культивировали непосредственно перед инъекцией.
[0080] Рентгенографический анализ высоты диска
[0081] Рентгенограммы выполняли после введения кетамина гидрохлорида (25 мг/кг) и ромпуна (1 мг/кг) через различные недельные интервалы после пункции. Предпринимали крайнюю осторожность для поддержания постоянного уровня анестезии во время рентгенографии каждого животного и в каждый момент времени для получения одинаковой степени расслабления мышц, что могло повлиять на высоту диска. Поэтому в качестве измерения исходного уровня всегда использовали предоперационную рентгенограмму. Также прилагали усилия для поддержания позвоночника в слегка согнутом положении. Для уменьшения погрешности от осевого вращения позвоночника и расхождения луча рентгенограммы повторяли не менее двух раз на каждом животном в положении лежа на боку с центром луча на расстоянии 4 см от подвздошного гребня кролика. Рентгенограммы сканировали в цифровом формате и сохраняли в цифровом виде с помощью программного обеспечения Image Capture.
[0082] Анализ изображений
[0083] Используя оцифрованные рентгенограммы, измерения, включая высоту тела позвонка и высоту межпозвоночного диска (МПД), анализировали с помощью анализа изображений, находящемся в открытом доступе. Данные переносили в программу Excel, и высоту МПД выражали как индекс высоты диска (ИВД) по методике Lu et al. "Effects of chondroitinase ABC and chymopapain on spinal motion segment biomechanics. An in vivo biomechanical, radiologic, and histologic canine study", Spine 1997;22:1828-34. Среднюю высоту МПД (ИВД) рассчитывали путем усреднения измерений, полученных в передней, средней и задней частях МПД, и деления этого значения на среднее значение высоты тел соседних позвонков. Изменения в ИВД инъецированных дисков выражали в процентах ИВД и нормализовали к измеренной до операции высоте МПД (процент ИВД - послеоперационный ИВД/предоперационный ИВД × 100). Внутрисубъектное стандартное отклонение (СО) рассчитывали с применением уравнения:
√(∑(x1 - x2)2/2n)
[0084] Где X1 - это первое измеренное значение, X2 - второе измеренное значение, и n = 450. Процентный коэффициент дисперсии (процент CV) рассчитывали как (СО/средние всех измерений × 100). Ошибку измерения ИВД у одного исследователя оценивали как минимальную (СО: 0,001800316; процент CV: 3,13). Сообщалось также, что ошибка у разных исследователей была небольшой (СО: 0,003227; процент CV: 9,6)
[0085] Оценки МРТ
[0086] МРТ-исследования проводили всем кроликам в исследовании на 0.3-Т томографе (Airis II, версия 4.0 A; Hitachi Medical System America, Inc.) с квадратурным приемником катушки для конечностей. После умерщвления позвоночные столбы с окружающими мягкими тканями изолировали и проводили МРТ-анализ. Т2-взвешенные срезы в сагиттальной плоскости получали при следующих настройках: последовательность быстрого спинового эха с TR (время повторения) 4000 миллисекунд и TE (время появления эхо-сигнала) 120 миллисекунд; матрица 256(в) × 128 (о); поле зрения 260; и 4 возбуждения. Толщина среза составляла 2 мм с зазором 0 мм. МРТ оценивал "слепой" исследователь, использующий модифицированную классификацию Томпсона, основанную на изменениях в степени и площади интенсивности сигнала от 1 до 4 баллов (1 = норма, 2 = минимальное снижение интенсивности сигнала, но очевидное сужение области высокого сигнала, 3 = умеренное снижение интенсивности сигнала и 4 = сильное снижение интенсивности сигнала). Коэффициенты корреляции надежности градации МРТ у одного исследователя и между исследователями на основе 2 оценок были отличными (K = 0,98, 0,90, соответственно), что определяется коэффициентом корреляции Коэна каппа.
[0087] ПРИМЕР II - ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СПОСОБЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ
[0088] Предотвращение дегенерации поврежденного межпозвоночного диска
[0089] Использовали новозеландских белых кроликов-самцов. Применяли технику открытой хирургии. Три уровня межпозвоночных дисков в поясничном отделе позвоночника: L2-3, L3-4, L4-5 подвергали экспериментальному лечению или наблюдали в качестве контроля у каждого животного. Лечения сбалансированным образом распределяли по уровням с несколькими участками/дисками на одного кролика. Внутригрупповой дизайн, в качестве контролей использовали сравнение изменения на разных уровнях диска до и после операции.
[0090] ПРИМЕР III
[0091] Предотвращение дегенерации поврежденного межпозвоночного диска с помощью только инъекции кроликам неиндуцированных хондроцитов, только TGF-B1-продуцирующих клеток 293 или смеси клеток (хондроциты человека и TGF-B1-продуцирующие клетки 293)
[0092] Все хондроциты, использованные в примерах I-V, не являются дисковыми хондроцитами и представляют собой ювенильные хондроциты, полученные из части гиалинового хряща пальца ребенка в возрасте менее двух лет.
[0093] Пункцию иглой производили в межпозвоночные диски поясничного отдела позвоночника. После пункции иглой вводили TGF-β1-продуцирующие клетки 293, первичные нетрансдуцированные хондроциты человека, смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и первичных нетрансдуцированных хондроцитов человека, примированные нетрансдуцированные хондроциты человека или носитель/среду. Использовали несколько контролей. Условия эксперимента представлены в таблице 1.
(~5 × 106клеток)
Первичные нетрансдуцированные хондроциты человека
(отношение ~3 к 1, 5 × 106)
(~5 × 106)
(~5 × 106)
[0094] Вкратце, в межпозвоночных дисках поясничного отдела позвоночника кролика или свиньи производили пункцию иглой. После этого прокола кроликов оставляли на 4 недели для заживления. Затем во время второй хирургической процедуры вводили экспериментальную лечебную композицию, включающую TGF-β1-продуцирующие клетки 293 и/или первичные нетрансдуцированные хондроциты человека (~5 × 105) или соблюдали условия контроля (Таблица I).
[0095] После эндотрахеальной интубации и достижения общей анестезии, например, путем введения кетамина гидрохлорида и Rompun®, животное помещали в положение лежа. Раствор Рингера с лактатом использовали в объеме около (5 мл/кг/час). Область разреза выбривали, подготавливали и обкладывали салфетками обычным стерильным способом с чередованием бетадиновых и спиртовых салфеток (больше трех раз). В глаза закладывали успокоительную офтальмологическую мазь. Для обнажения правой передней стороны диска от L2-L5 (у кролика имеется 6-7 поясничных позвонков) использовали левый забрюшинный подход. Использовали различные схемы подготовки, а схему лечения применяли для каждого уровня диска. Для подготовки диска к "пункции иглой" использовали иглу 18 калибра чтобы сделать пункцию в диске на глубину 5 мм (Aoki et al., "Nerve fiber ingrowth into scar tissue formed following nucleus pulposus extrusion in the rabbit anular-puncture disc degeneration model: effects of depth of puncture". Spine. 2006;31(21):E774-80). После пункции вводили исследуемые материалы, перечисленные в таблице I. Лечебную композицию наносили на любую из областей L1-2, L2-3, L3-4, L4-5 каждого кролика.
[0096] Для контроля любых изменений диска использовали ежемесячные рентгенограммы. Животных умерщвляли через 2, 8 и 24 недели после операции.
[0097] Рентгенограммы/МРТ О заживлении свидетельствовало обнаруживаемое рентгенографическое изменение увеличенной высоты диска по сравнению с тем же диском на исходном уровне (до операции) по сравнению с диском на других уровнях диска. Другие диски сравнивали до и после только пункции иглой, а также до и после без пункции иглой, что позволяет получить индекс нормальной дегенерации с течением времени.
[0098] ПЦР с обратной транскрипцией Для определения относительного количества выживших трансфицированных хондроцитов проводили ПЦР с обратной транскрипцией.
[0099] Гистология. Также применяли гистологию для подтверждения характеристики коллагена I и II типа, общего внешнего вида и оценки de novo хондроцитов.
[00100] Вестерн-блоттинг и /или ИФА. Количественная экспрессия коллагена I и II типа, а также концентрация протеогликанов, Smads 2/3, Sox-9. Кроме того, применяли ИФА для оценки TGFβ-1, BMP2, BMP7, GDF5 и других родственных факторов роста при наличии антител.
[00101] Апоптоз исследовали в других тканевых структурах межпозвоночного диска путем наблюдения за экспрессией Caspase-3.
[00102] ПРИМЕР IV
[00103] Результаты
[00104] Результаты показаны на Фигурах и в описании Фигур настоящего изобретения. Пунктированный межпозвоночный диск, обработанный нетрансдуцированными хондроцитами, трансдуцированными клетками 293, примированными хондроцитами или смесью трансдуцированных клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов, демонстрирует положительный эффект в предотвращении или задержке дегенерации диска по сравнению с контролем с помощью носителя.
[00105] Пример IV-1 - Лечение смесью клеток (трансдуцированные клетки 293 и нетрансдуцированные хондроциты) пунктированного межпозвоночного диска у кролика
[00106] Лечение смесью клеток оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски при тестировании на кроликах. Этот эффект виден в различных экспериментах на ФИГ. 1-4. На ФИГ. 1A-1F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) в области L2/3 позвоночника не видно пункции и никакого лечения, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, при которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и была введена смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00107] На ФИГ. 2A-2F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) в области L2/3 позвоночника не видно пункции и никакого лечения, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, при которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и была введена смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00108] На ФИГ. 3A-3D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293, (ii) в области L2/3 позвоночника не видно пункции и никакого лечения, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3; стрелки указывают на область диска L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00109] Пример IV-2 - Лечение пунктированного межпозвоночного диска у кролика смесью клеток (трансдуцированные клетки 293 и нетрансдуцированные хондроциты)
[00110] Лечение TGF-β1-продуцирующими клетками 293 оказывают антидегенеративное действие на межпозвоночные диски. Этот эффект виден на ФИГ. 4A-4D, где показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован, и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00111] Пример IV-3 - Лечение пунктированного межпозвоночного диска у кролика трансдуцированными клетками 293 и смесью клеток
[00112] Лечение TGF-β1-продуцирующими клетками 293 и, лечение смеcью клеток оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски. Этот эффект виден на ФИГ. 5A-5D, где показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в L1/2 был травмирован, и смесь TGF-β1-продуцирующих клеток 293 и нетрансдуцированных хондроцитов человека в соотношении 1:3, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) диск в L3/4 был травмирован и были введены TGF-β1-продуцирующие клетки 293; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00113] Пример IV-4 - Лечение пунктированного межпозвоночного диска у кролика нетрансдуцированными хондроцитами
[00114] Лечение нетрансдуцированными хондроцитами оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски. Этот эффект виден в различных экспериментах на ФИГ. 6-8. На ФИГ. 6A-6D показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через четыре (4) недели после операции, в которой (i) был поврежден диск L1/2 и введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе позвоночника L2/3, и (iii) был поврежден диск L3/4 и введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00115] На ФИГ. 7A-7F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через четыре (4) недели после операции, в которой (i) был поврежден диск L1/2 и введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе позвоночника L2/3, и (iii) был поврежден диск L3/4 и введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, в которой (i) был травмирован диск в L1/2 и введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L2/3 позвоночника, и (iii) был травмирован диск в L3/4 и введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L1/2 и L3/4. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00116] На ФИГ. 8A-8F показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 4 (четыре) недели после операции, в которой (i) диск в T12/L1 был поврежден путем пункции иглой и без инъекции, (ii) без пункции и контроля лечения в локусе L1/2 позвоночника, и (iii) диск в L2/3 был поврежден и были введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков T12/L1 и L2/3. (C) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через восемь (8) недель после операции, в которой (i) диск в T12/L1 был травмирован путем пункции иглой и без инъекции, (ii) без пункции и контроля лечения в позвоночном локусе L1/2, и (iii) диск в L2/3 был травмирован и были введены нетрансдуцированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков T12/L1 и L2/3. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (E) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска. (F) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (С), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00117] Пример IV-5 - Лечение пунктированного межпозвоночного диска у кролика нетрансдуцированными примированными хондроцитами
[00118] Лечение примированными хондроцитами оказывает антидегенеративное действие на межпозвоночные диски. Этот эффект виден на ФИГ. 9A-9D, где показано замедление, задержка или предотвращение дегенерации поврежденного диска. (A) показано МРТ-снимок позвоночника кролика до операции; (B) показано МРТ-снимок позвоночника кролика через 8 (восемь) недель после операции, в которой (i) диск в L2/3 был травмирован и в него была введена культуральная среда клеток DMEM, (ii) не было пункции и контроля лечения в локусе L3/4 позвоночника, и (iii) диск в L4/5 был травмирован и в него были введены примированные хондроциты; стрелки указывают на области дисков L2/3 и L4/5. (С) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (A), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска для измерения его морфологии, уровня дегенерации или регенерации. (D) показано рентгенограмму кролика, описанного выше в (B), которая используется для получения индекса высоты межпозвоночного диска.
[00119] ПРИМЕР V
[00120] Источник хондроцитов человека
Первичные хондроциты человека выращивали из хрящевой ткани, полученной при хирургическом иссечении полидактилии пальца у годовалой девочки-донора. Ткань полидактилии получали в хирургическом кабинете. Следующую процедуру выделения хондроцитов проводили в боксе для биологически опасных материалов. Пластиковый флакон, содержащий хрящевую ткань, протирали спиртом, а хрящевую ткань промывали стерильным PBS (1X) с помощью пипетки. Раствор коллагеназы готовили путем растворения 7 мг коллагеназы (Gibco BRL) в 10 мл DMEM (содержащей 10% FBS) и фильтрования через шприцевой фильтр 0,2 мкм (Corning). Промытую хрящевую ткань обрабатывали раствором коллагеназы в течение 17-18 часов в инкубаторе при встряхивании при 37°C. На следующий день бутылку дезинфицировали спиртом. Обработанный коллагеназой материал пипетировали вверх и вниз несколько раз, чтобы отделить свободные клетки от тканевой массы. После пипетирования супернатант фильтровали через 70 мкм нейлоновое клеточное сито (Falcon). Обработанные коллагеназой ткани,утратившие свою целостность (например, свободные клетки), могли пройти через фильтр. Клеточный фильтрат собирали в пробирку объемом 50 мл (Falcon) и затем центрифугирован при 1500 об/мин в течение 5 минут. Две трети супернатанта отбрасывали, а осадок промывали 10 мл стерильного PBS (1X). Ресуспендированные клетки снова центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут и, после удаления двух третей супернатанта, промывали 10 мл стерильного PBS (1X). Клетки снова центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут, а затем ресуспендировали в DMEM (содержащей 10% FBS). Затем ресуспендированные клетки переносили в четыре флакона без покрытия площадью 25 см2 и культивировали в течение четырех дней при 37°C с 5% CO2. Затем клетки переносили в два флакона без покрытия площадью 185 см2 . Клетки культивировали в течение двух недель, затем собирали, промывали и ресуспендировали в криоконсервирующей среде DMEM, эмбриональной бычьей сыворотке и ДМСО в соотношении 5:4:1. Клетки распределяли на аликвоты в криопробирки, содержащие 1 мл клеточной суспензии при концентрации 4×105 клеток/мл. Клетки хранили в парофазной среде жидкого азота.
Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены способы предотвращения или задержки дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска, которые включают введение клетки соединительной ткани млекопитающего в место дефекта межпозвоночного диска. Изобретения направлены на эффективное лечение дегенерации межпозвоночного диска у субъекта. 8 н. и 10 з.п. ф-лы, 44 ил., 1 табл., 10 пр.
1. Способ предотвращения дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска у млекопитающего, включающий:
a) вставку гена, кодирующего TGF-β1, в клетку эмбриональной почки человека, и
b) трансплантацию клетки эмбриональной почки человека в место дефекта межпозвоночного диска.
2. Способ по п. 1, в котором указанная клетка является аллогенной по отношению к млекопитающему.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором млекопитающее представляет собой человека.
4. Способ задержки дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска у млекопитающего, включающий:
a) вставку гена, кодирующего TGF-β1, в клетку эмбриональной почки человека, и
b) трансплантацию клетки эмбриональной почки человека в место дефекта межпозвоночного диска.
5. Способ по п. 4, в котором указанная клетка является аллогенной по отношению к млекопитающему.
6. Способ по п. 4 или 5, в котором млекопитающее представляет собой человека.
7. Способ предотвращения дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска у млекопитающего, включающий:
a) вставку гена, кодирующего TGF-β1, в клетку эмбриональной почки человека, и
b) трансплантацию смеси клетки эмбриональной почки человека из a) и второй, немодифицированной клетки соединительной ткани млекопитающего в место дефекта межпозвоночного диска, причем указанная вторая клетка соединительной ткани млекопитающего представляет собой хондроцит.
8. Способ по п. 7, в котором хондроцит представляет собой недисковый хондроцит или ювенильный хондроцит.
9. Способ по п. 7, в котором хондроцит, являющийся указанной второй клеткой соединительной ткани млекопитающего, представляет собой примированный хондроцит.
10. Способ по любому из пп. 7-9, в котором клетка эмбриональной почки человека или указанная вторая клетка является аллогенной по отношению к млекопитающему.
11. Способ задержки дегенерации межпозвоночного диска в месте дефекта межпозвоночного диска у млекопитающего, включающий:
a) вставку гена, кодирующего TGF-β1, в клетку эмбриональной почки человека, и
b) трансплантацию смеси клетки эмбриональной почки человека из a) и второй, немодифицированной клетки соединительной ткани млекопитающего в место дефекта межпозвоночного диска, причем указанная вторая клетка соединительной ткани млекопитающего представляет собой хондроцит.
12. Способ по п. 11, в котором хондроцит представляет собой недисковый хондроцит или ювенильный хондроцит.
13. Способ по п. 11, в котором хондроцит, являющийся указанной второй клеткой соединительной ткани млекопитающего, представляет собой примированный хондроцит.
14. Способ по любому из пп. 11-13, в котором клетка эмбриональной почки человека или указанная вторая клетка является аллогенной по отношению к млекопитающему.
15. Способ лечения дегенерации межпозвоночного диска у пациента, включающий применение способа по любому из пп. 1-6 к нуждающемуся в нем субъекту.
16. Способ лечения дегенерации межпозвоночного диска у пациента, включающий применение способа по любому из пп. 7-14 к нуждающемуся в нем субъекту.
17. Способ лечения повреждения межпозвоночного диска у пациента, включающий применение способа по любому из пп. 1-6 к нуждающемуся в нем субъекту.
18. Способ лечения повреждения межпозвоночного диска у пациента, включающий применение способа по любому из пп. 7-14 к нуждающемуся в нем субъекту.
| US 20090238806 A1, 24.09.2009 | |||
| US 20140099709 A1, 10.04.2014 | |||
| СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ВНУТРИДИСКОВОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ ПРИ ДЕГЕНЕРАТИВНО-ДИСТРОФИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЯХ ПОЗВОНОЧНИКА | 2014 |
|
RU2576447C2 |
