Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Ссылка на родственные заявки
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с заявкой на патент Кореи № 10-2020-0089148, поданной 17 июля 2020 г., полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.
Настоящее изобретение относится к композиции для лечения артрита или к способу лечения с ее применением, и более конкретно, к фармацевтической композиции для лечения остеоартрита, содержащей мезенхимальные стволовые клетки (MSC), экспрессирующие ген 6, индуцируемый фактором некроза опухоли, (TSG-6), и/или к способу лечения с применением указанной композиции.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Остеоартрит также известен как дегенеративный артрит и является одним из заболеваний суставов, которое возникает в случае, когда изнашивается хрящ, который служит для защиты кости на ее конце. Это наиболее распространенный тип артрита, проявляющийся такими симптомами, в частности в утреннее время, как боль, отек и скованность в суставах. Хрящ представляет собой волокнистую соединительную ткань, расположенную на поверхности сустава, которая соединяет две кости друг с другом, и состоит из хондроцитов и хондробластов. Основным компонентом хряща является коллаген, в частности, коллаген II (коллаген типа 2, коллаген типа II).
В настоящее время лечение остеоартрита сосредоточено на сохранении гибкости сустава при одновременном облегчении боли, и обычно применяются лекарственные средства и упражнения, физиотерапия и т.п., причем когда сустав серьезно поврежден, оперативные вмешательства, такие как замена сустава на искусственный сустав, выполняются ограниченно.
TSG-6 представляет собой белок, содержащий два домена LINK и CUBE, а также известно, что он индуцируется воспалительными стимулами, такими как TNF, и в основном продуцируется в клетках, таких как фибробласты и клетки соединительной ткани.
Известно, что TSG-6 обладает противовоспалительным действием, однако известно, что при введении в суставную полость он диспергируется за пределами суставной полости в течение короткого периода времени. Согласно отчету 2016 г., период полувыведения введенного внутрисуставно TSG-6 составлял меньше, чем 0,5 ч (Kim D-K, et al., 2016, PLoS ONE 11(1)), и соответственно, несмотря на противовоспалительное действия TSG-6, существует ограничение в том, что трудно ожидать непрерывного терапевтического эффекта во время инъекции.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Техническая задача
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция для регенерации хряща, содержащая в качестве активного ингредиента мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие белок TSG-6.
Согласно другому варианту осуществления предусмотрен способ регенерации хряща, включающий введение фармацевтически эффективного количества мезенхимальных стволовых клеток, экспрессирующих белок TSG-6, субъекту, нуждающемуся в регенерации хряща.
Согласно другому варианту осуществления предусмотрено применение мезенхимальных стволовых клеток, экспрессирующих белок TSG-6, для регенерации хряща, или применение мезенхимальных стволовых клеток, экспрессирующих белок TSG-6, в получении фармацевтической композиции для регенерации хряща.
Эффект регенерации хряща мезенхимальных стволовых клеток, экспрессирующих белок TSG-6, как указано выше, может быть обусловлен повышением экспрессии и/или секреции белка коллагена II. Согласно одному варианту осуществления субъект, которому вводят и/или в отношении которого применяют фармацевтическую композицию, способ для регенерации хряща, может представлять собой пациента с низкой экспрессией и/или секрецией белка коллагена II (например, ниже, чем у нормального человека), и/или пациента, нуждающегося в повышении экспрессии и/или секреции белка коллагена II. Кроме того, способ регенерации хряща может дополнительно включать идентификацию субъекта, нуждающегося в регенерации хряща и/или нуждающегося в повышении экспрессии и/или секреции белка коллагена II (например, с более низкой экспрессией и/или секрецией белка коллагена II, чем у нормального человека), до стадии введения.
Согласно другому варианту осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения остеоартрита, содержащая в качестве активного ингредиента мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие белок TSG-6.
Согласно другому варианту осуществления предусмотрен способ профилактики и/или лечения остеоартрита, включающий введение фармацевтически эффективного количества мезенхимальных стволовых клеток, экспрессирующих белок TSG-6, субъекту, нуждающемуся в профилактике и/или лечении остеоартрита.
Согласно другому варианту осуществления предусмотрено применение мезенхимальных стволовых клеток, экспрессирующих белок TSG-6, для профилактики и/или лечения остеоартрита, или применение мезенхимальных стволовых клеток, экспрессирующих белок TSG-6, в получении фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения остеоартрита.
Эффект профилактики и/или лечения остеоартрита мезенхимальными стволовыми клетками, экспрессирующими белок TSG-6, как указано выше, может быть обусловлен регенерацией хряща и/или повышением экспрессии и/или секреции белка коллагена II. Согласно одному варианту осуществления субъект, которому вводят и/или в отношении которого применяют фармацевтическую композицию, способ для профилактики и/или лечения остеоартрита, может представлять собой пациента с низкой экспрессией и/или секрецией белка коллагена II (например, с более низкой, чем у нормального человека) и/или пациента, нуждающегося в повышении экспрессии и/или секреции белка коллагена II и/или регенерации хряща. Кроме того, способ профилактики и/или лечения остеоартрита может дополнительно включать идентификацию субъекта, нуждающегося в профилактике и/или лечении остеоартрита, и/или нуждающегося в регенерации хряща, и/или нуждающегося в повышении экспрессии и/или секреции белка коллагена II (например, имеющего более низкую экспрессию и/или секрецию белка коллагена II, чем у нормального человека) перед стадией введения.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция для экспрессии и/или секреции белка коллагена II или для повышения экспрессии и/или секреции белка коллагена II, содержащая мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие белок TSG-6, в качестве активного ингредиента.
Согласно другому варианту осуществления предусмотрен способ экспрессии и/или секреции белка коллагена II, или способ повышения экспрессии и/или секреции белка коллагена II, включающий введение фармацевтически эффективного количества мезенхимальных стволовых клеток, экспрессирующих белок TSG-6, субъекту, нуждающемуся в повышении экспрессии и/или секреции белка коллагена II.
Согласно другому варианту осуществления предусмотрено применение мезенхимальных стволовых клеток, экспрессирующих белок TSG-6, в экспрессии и/или секреции белка коллагена II, или повышение экспрессии и/или секреции белка коллагена II, или применение мезенхимальных стволовых клеток, экспрессирующих белок TSG-6 в получении композиции для повышения экспрессии и/или секреции белка коллагена II.
Решение технической задачи
В настоящем изобретении предусмотрена композиция для регенерации хряща и/или фармацевтическая композиция для профилактики или лечения остеоартрита и/или композиция для повышения экспрессии и/или секреции белка коллагена II, содержащая мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие белок TSG-6, в качестве активного ингредиента, и/или способ применения указанной композиции.
Здесь “белок TSG-6” означает белок гена 6, индуцируемый фактором некроза опухоли (TNF) (ген 6, индуцируемый TNF).
Используемый в настоящем документе термин “мезенхимальная стволовая клетка” (MSC) может означать плюрипотентную или мультипотентную клетку, которая может дифференцироваться в различные клетки, например, в адипоциты, хондроциты или хондробласты, остеоциты или остеобласты, миоциты и т.п. Мезенхимальные стволовые клетки не ограничены своим происхождением в диапазоне сохранения плюрипотентности или мультипотентности. Например, мезенхимальные стволовые клетки могут быть выбраны, но ими не ограничиваясь, из мультипотентных клеток, полученных из крови, кориума, пуповинной крови, пупочного канатика, жировой ткани, плаценты, взрослой мышцы, стромы роговицы, пульпы молочного зуба и/или тканей, не относящихся к костному мозгу, таких как надкостная плева, или тканей костного мозга, предпочтительно тканей, не относящихся к костному мозгу. В настоящем документе мезенхимальные стволовые клетки могут использоваться взаимозаменяемо с “MSC”.
Мезенхимальные стволовые клетки могут представлять собой мезенхимальные стволовые клетки, полученные от млекопитающего, причем млекопитающее может включать, но ими не ограничиваясь, человека, собаку, кошку, лошадь, мышь, крысу и т.п. Мезенхимальные стволовые клетки могут быть получены от пациента с остеоартритом или получены от донора, отличного от пациента с остеоартритом.
Композиция для регенерации хряща и/или фармацевтическая композиция для профилактики или лечения остеоартрита, и/или композиция для повышения экспрессии и/или секреции белка коллагена II, и/или способ ее применения, предусмотренные настоящим изобретением, содержат или применяют (вводятся) мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие белок TSG-6.
Мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие белок TSG-6, могут представлять собой мезенхимальные стволовые клетки, содержащие ген, кодирующий белок TSG-6, рекомбинантный вектор, содержащий ген, кодирующий белок TSG-6, или указанный ген и вектор одновременно. Мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие белок TSG-6, предусмотренные в настоящем изобретении, характеризуются экспрессией белка TSG-6 посредством включения чужеродного гена, кодирующего белок TSG-6, и/или рекомбинантного вектора (экспрессионного вектора), содержащего указанный ген, и могут отличать от клеток, в которых экспрессия повышена на генном уровне и/или уровне белка TSG-6 посредством стимулирующего фактора, такого как TNF-α.
Согласно одному варианту осуществления рекомбинантный вектор, содержащий ген, кодирующий белок TSG-6, может представлять собой вектор, в котором, но этим не ограничиваясь, промотор конститутивной экспрессии и ген, кодирующий белок TSG-6, функционально связаны для конститутивной экспрессии белка TSG-6.
Белок TSG-6 может представлять собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID №: 1, или белок, кодируемый геном, состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID №: 2.
Уровень экспрессии гена TSG-6 (например, мРНК) и/или белка в мезенхимальных стволовых клетках, экспрессирующих белок TSG-6 (в которые трансдуцирован вектор экспрессии гена TSG-6), может быть, но этим не ограничиваясь, приблизительно в 2 раза или больше, приблизительно в 5 раз или больше, приблизительно в 10 раз или больше, приблизительно в 20 раз или больше, приблизительно в 50 раз или больше, приблизительно в 70 раз или больше, приблизительно в 100 раз или больше, приблизительно в 200 раз или больше или приблизительно в 300 раз или больше, по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками аналогичного типа (например, наивными мезенхимальными стволовыми клетками аналогичного типа, мезенхимальными стволовыми клетками, индуцированными TNF-α, и т.д.), в которых вектор экспрессии гена белка TSG-6 не трансдуцирован.
Уровень экспрессии белка TSG-6 в мезенхимальных стволовых клетках, экспрессирующих белок TSG-6, может составлять, но этим не ограничиваясь, от приблизительно 10 до приблизительно 200 нг/100000 клеток/24 ч (далее аналогичные единицы), от приблизительно 10 до приблизительно 100, от приблизительно 10 до приблизительно 80 , от приблизительно 10 до приблизительно 70, от приблизительно 10 до приблизительно 65, от приблизительно 30 до приблизительно 200, от приблизительно 30 до приблизительно 100, от приблизительно 30 до приблизительно 80, от приблизительно 30 до приблизительно 70, от приблизительно 30 до приблизительно 65, от приблизительно 50 до приблизительно 200, приблизительно от 50 до 100, от 50 до 80, от 50 до 70 или от 50 до 65 нг/100000 клеток/24 ч. В настоящем документе термин “приблизительно” представляет собой выражение, включающее все числовые значения в диапазоне значений, аналогичных или близких к числовому значению, которое следует, и может включать, но этим не ограничиваясь, диапазон, увеличенный или уменьшенный приблизительно на 10%, приблизительно на 8%, приблизительно 5%, приблизительно 3%, приблизительно 2%, приблизительно 1%, приблизительно 0,5% или приблизительно 0,1% от описанного числового значения (в остальных случаях далее в настоящем документе может интерпретироваться аналогичным образом).
Уровень экспрессии TSG-6 в композиции для регенерации хряща и/или фармацевтической композиции для профилактики или лечения остеоартрита по настоящему изобретению может составлять, но этим не ограничиваясь, от приблизительно 10 до приблизительно 50000 нг/мл/24 ч (далее в аналогичных единицах), от приблизительно 10 до приблизительно 30000; от приблизительно 10 до приблизительно 10000; от приблизительно 10 до приблизительно 5000, от приблизительно 50 до приблизительно 50000, от приблизительно 50 до приблизительно 30000, от приблизительно 50 до приблизительно 10000, от приблизительно 50 до приблизительно 5000, от приблизительно 100 до приблизительно 50000, от приблизительно 100 до приблизительно 30000, от приблизительно 100 до приблизительно 10000, от приблизительно 100 до приблизительно 5000, от приблизительно 100 до приблизительно 5000, от приблизительно 500 до приблизительно 50000, от приблизительно 500 до приблизительно 30000, от приблизительно 500 до приблизительно 10000, от приблизительно 500 до приблизительно 5000, от приблизительно 1000 до приблизительно 50000, от приблизительно 1000 до приблизительно 30000, от приблизительно 1000 до приблизительно 10000 или от приблизительно 1000 до приблизительно 5000 нг/мл/24 ч.
Мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие белок TSG-6 по настоящему изобретению, могут непрерывно экспрессировать белок TSG-6, и, таким образом, может быть преодолен короткий период полужизни TSG-6 в полости сустава, и соответственно клетки подходит для восстановления (регенерации) хряща и/или профилактики или лечения остеоартрита. Кроме того, мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие белок TSG-6, согласно настоящему описанию, обладают эффектом ослабления воспаления и/или симптомов остеоартрита путем ингибирования индексов воспаления, таких как TNF-a, IL-1b и т.п., и кроме того, повышает уровень экспрессии и/или уровень секреции белка коллагена II и регенерирует хрящ и/или восстанавливает (излечивает) поврежденный хрящ, тем самым обеспечивая более существенное лечение остеоартрита, в частности, дегенеративного остеоартрита.
Композиция и/или способ для регенерации хряща, и/или фармацевтическая композиция и/или способ для профилактики или лечения остеоартрита, и/или композиция и/или способ для повышения экспрессии и/или секреции белка коллагена II, предусмотренные настоящим изобретением, (в остальных случаях далее в настоящем документе обычно называемые “композиция и/или способ, представленные в настоящем изобретении”) могут повышать уровень экспрессии и/или внеклеточную секрецию на генном уровне (мРНК) и/или на уровне белка коллагена II в хондроцитах и/или в хрящевой ткани. Согласно одному варианту осуществления уровень экспрессии и/или уровень секреции белка коллагена II в хондроцитах и/или хрящевой ткани, в отношении которых применяют композицию по настоящему изобретению, могут быть повышены по сравнению с контрольной группой, в отношении которых применяют композицию, и/или группой, обработанной аллогенными мезенхимальными стволовыми клетками, не обработанными TNF-α или обработанными (активированные) TNF-α, (например, повышены приблизительно в 1,2 раза или больше, приблизительно в 1,3 раза или больше, приблизительно в 1,4 раза или больше, приблизительно в 1,5 раза или больше, приблизительно в 1,6 раза или больше, приблизительно в 1,7 раза или больше, приблизительно в 1,8 раза или больше или приблизительно в 1,9 раза или больше по сравнению с уровнем экспрессии белка коллагена II (например, уровнем мРНК и/или уровнем белка) и/или уровнем секреции (например, концентрацией белка коллагена II в среде) в контрольной группе, не получавшей лечение, и/или в группе обработанной аллогенными клетками, не обработанными TNF-α или обработанными TNF-α; верхний предел степени повышения конкретно не ограничен и, например, может соответствовать, но этим не ограничиваясь, приблизительно 20-ти кратному, приблизительно 15-ти кратному, приблизительно 10-ти кратному, приблизительно 5-ти кратному или приблизительно 2-ух кратному повышению).
Композиция и/или способ, представленные в настоящем изобретении, могут сохранять и/или восстанавливать толщину хряща. Согласно одному варианту осуществления толщина хряща, в отношении которого применяют фармацевтическую композицию, предусмотренную настоящим изобретением, может быть увеличена, но этим не ограничиваясь, от приблизительно от 1 раза до приблизительно 10 раз или меньше, от приблизительно 1 раза до приблизительно 5 раз или меньше, от приблизительно 1 раза до приблизительно 3 раз или меньше, от приблизительно 1 раза до приблизительно 2 раз или меньше, приблизительно 1,3 до приблизительно 10 раз, от приблизительно 1,3 до приблизительно 5 раз, от приблизительно 1,3 до приблизительно 3 раз, от приблизительно 1,3 до приблизительно 2 раз, от приблизительно 1,5 до приблизительно 10 раз, от приблизительно 1,5 до приблизительно 5 раз, от приблизительно 1,5 до приблизительно 3 раз или от приблизительно 1,5 до приблизительно 2 раз. Согласно одному варианту осуществления, относительно толщины хряща модели животного с остеоартритом (ОА), в отношении которой применяли фармацевтическую композиция по настоящему изобретению, по сравнению с пациентом с ОА, в отношении которого не применяли фармацевтическую композицию, наблюдалось восстановление толщины хряща, а также, по сравнению с аналогичным количеством в группе, в отношении которого применяли неэкспрессирующие TSG-6 MSC, была показана толщина хряща, большая приблизительно в 1,5 раза или больше.
Композиция и/или способ, представленные в настоящем изобретении, могут снижать уровень экспрессии индексов воспаления в хондроцитах и/или синовиоцитах и/или в хрящевой ткани и/или синовиальной ткани. Снижение уровня экспрессии индексов воспаления соответствует снижению по сравнению с контрольной группой, в которой не вводили или в отношении которой не применяли композицию и/или способ, предусмотренные в настоящем изобретении. Индексы воспаления (например, воспалительный цитокин) могут представлять собой, например, один или несколько, два или больше, три или больше или все индексы воспаления, выбранные из группы, состоящей, но ими не ограничиваясь, из трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF-b1; TGF-β1), фактора некроза опухоли альфа (TNF-a; TNF-α), интерферона гамма (IFN-r; IFN-γ) и интерлейкина 6 (IL-6). Согласно одному варианту осуществления при введении мезенхимальных стволовых клеток, экспрессирующих белок TSG-6, уровень экспрессии индексов воспаления в синовиоцитах и хондроцитах снижался до уровня нормальной группы.
Согласно одному варианту осуществления уровень экспрессии TGF-b1 в хрящевой области (“хондроциты” и/или “хрящевая ткань” далее используются тождественно), в которую вводят или в отношении которой применяют композицию и/или способ, представленные в настоящем изобретении, может составлять, но этим не ограничиваясь, приблизительно 55% или меньше, приблизительно 50% или меньше, приблизительно 45% или меньше, приблизительно 40% или меньше, приблизительно 35% или меньше или приблизительно 30% или меньше относительно уровня экспрессии TGF-b1 в группе пациентов. Уровень экспрессии TGF-b1 может снижаться по мере повышения уровня экспрессии TSG-6.
Уровень экспрессии TNF-α в хрящевой области, в которую вводят или в отношении которой применяют композицию и/или способ, представленные в настоящем изобретении, может составлять, но этим не ограничиваясь, 55% или меньше, 50% или меньше, 45% или меньше, 40% или меньше, или 35% или меньше, по сравнению с уровнем экспрессии TNF-α в группе пациентов. Уровень экспрессии TNF-α может снижаться по мере повышения уровня экспрессии TSG-6.
Согласно одному варианту осуществления уровень экспрессии IFN-r в хрящевой области, в которую вводят или в отношении которой применяют композицию и/или способ, представленные в настоящем изобретении, может составлять, но этим не ограничиваясь, приблизительно 50% или меньше, приблизительно 45% или меньше, приблизительно 40% или меньше или приблизительно 35% или меньше относительно уровня экспрессии IFN-r в группе пациентов. Уровень экспрессии IFN-r может снижаться по мере повышения уровня экспрессии TSG-6.
Согласно одному варианту осуществления уровень экспрессии IL-6 в хрящевой области, в которую вводят или в отношении которой применяют композицию и/или способ, представленные в настоящем изобретении, может составлять, но этим не ограничиваясь, приблизительно 60% или меньше, приблизительно 55% или меньше, или приблизительно 50% или меньше относительно уровня экспрессии IL-6 в группе пациентов. Уровень экспрессии IL-6 может снижаться по мере повышения уровня экспрессии TSG-6.
Согласно одному варианту осуществления уровень экспрессии TGF-b1 в синовиальной области (синовиоциты и/или синовиальная ткань далее в настоящем документе используются тождественно), в которой вводят или применяют композицию и/или способ, представленные в настоящем изобретении, может составлять, но этим не ограничиваясь, приблизительно 50% или меньше, приблизительно на 45% или меньше, приблизительно на 40% или меньше, приблизительно на 35% или меньше или приблизительно на 30% или меньше относительно уровня экспрессии TGF-b1 в группе пациентов.
Согласно одному варианту осуществления уровень экспрессии TNF-α в синовиальной области, в которую вводят или в отношении которой применяют композицию и/или способ, представленные в настоящем изобретении, может составлять, но этим не ограничиваясь, приблизительно 45% или меньше, приблизительно 40% или меньше, приблизительно 35% или меньше, приблизительно на 30% или меньше или приблизительно 25% или меньше относительно уровня экспрессии TNF-α в группе пациентов.
Согласно одному варианту осуществления уровень экспрессии IFN-r в синовиальной области, в которую вводят или в отношении которой применяют композицию и/или способ, представленные в настоящем изобретении, может составлять, но этим не ограничиваясь, приблизительно 50% или меньше, приблизительно 45% или меньше, приблизительно 40% или меньше или приблизительно 35% или меньше относительно уровня экспрессии IFN-r в группе пациентов.
Согласно одному варианту осуществления уровень экспрессии IL-6 в синовиальной области, в которую вводят или в отношении которой применяют композицию и/или способ, представленные в настоящем изобретении, может составлять, но этим не ограничиваясь, приблизительно 45% или менее, приблизительно 40% или менее, или приблизительно 35%, или меньше относительно уровня экспрессии IL-6 в группе пациентов.
Композиция и/или способ, представленные в настоящем изобретении, могут содержать или вводить мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие фармацевтически эффективное количество TSG-6, отдельно, или дополнительно содержать или вводить один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ или разбавителей. Фармацевтически эффективное количество означает количество, которое может демонстрировать эффект регенерации хряща, профилактики, ослабления и/или лечения симптомов остеоартрита и/или повышения экспрессии и/или секреции белка коллагена II, причем общий уровень экспрессии TSG-6 мезенхимальных стволовых клеток может составлять, но этим не ограничиваясь, приблизительно 200 нг/24 ч или больше, приблизительно 500 нг/24 ч или больше, приблизительно 1000 нг/24 ч или больше, приблизительно 10000 нг/24 ч или больше, приблизительно 50000 нг/24 ч или больше, от приблизительно 200 до приблизительно 100000 нг/24 ч, от приблизительно 200 до приблизительно 50000 нг/24 ч, от приблизительно 200 до приблизительно 10000 нг/24 ч, от приблизительно 200 до приблизительно 5000 нг/24 ч, от приблизительно 200 до приблизительно 3000 нг/24 ч ч, от приблизительно 200 до приблизительно 2000 нг/24 ч, от приблизительно 500 до приблизительно 100000 нг/24 ч, от приблизительно 500 до приблизительно 50000 нг/24 ч, от приблизительно 500 до приблизительно 10000 нг/24 ч, от приблизительно 500 до приблизительно 5000 нг/24 ч, от приблизительно 500 до приблизительно 3000 нг/24 ч или от приблизительно 500 до приблизительно 2000 нг/24 ч.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтически эффективное количество мезенхимальных стволовых клеток может составлять, но этим не ограничиваясь, от приблизительно 100000 до приблизительно 25000000 клеток/мл (далее используются тождественно единице клетка/мл), от приблизительно 100000 до приблизительно 20000000, от приблизительно 100000 до приблизительно 15000000, от приблизительно 100000 до приблизительно 10000000, от приблизительно 100000 до приблизительно 5000000, от приблизительно 500000 до приблизительно 25000000, от приблизительно 500000 до приблизительно 20000000, от приблизительно 500000 до приблизительно 15000000, от приблизительно 500000 до приблизительно 10000000, от приблизительно 500000 до приблизительно 5000000, от приблизительно 1000000 до приблизительно 25000000, от приблизительно 1000000 до приблизительно 20000000, от приблизительно 1000000 до приблизительно 15000000, от приблизительно 1000000 до приблизительно 10000000 или от приблизительно 1000000 до приблизительно 5000000 клеток/мл.
“Фармацевтически приемлемые” включает композиции, которые являются физиологически приемлемыми и обычно не вызывают желудочно-кишечных расстройств, аллергических реакций, таких как головокружение, или подобных реакций при введении человеку без ограничения. Пример носителя, вспомогательного вещества и разбавителя может представлять собой одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей, но ими не ограничиваясь, из лактозы, декстрозы, сахарозы, сорбита, маннита, ксилита, эритрита, мальтита, крахмала, аравийской камеди, альгината, желатина, фосфата кальция, силикат кальция, целлюлозы, метилцеллюлозы, поливинилпирролидона, воды, метилгидроксибензоата, пропилгидроксибензоата, талька, стеарата магния и минерального масла,. Кроме того, фармацевтическая композиция может дополнительно содержать наполнитель, антикоагулянт, смазывающее вещество, смачивающее вещество, ароматизатор и консервант и т.п.
Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения остеоартрита, представленная в настоящем изобретении, может быть получена с применением известного в данной области способа, обеспечивающего быстрое, непрерывное или отсроченное высвобождение активного ингредиента. Препарат может быть в форме порошка, гранул, таблеток, эмульсии, сиропа, аэрозоля, мягких или твердых желатиновых капсул, стерильного раствора для инъекций или стерильного порошка. Согласно одному варианту осуществления композиция может быть получена в виде раствора для инъекций.
Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция для профилактики или лечения остеоартрита, представленная в настоящем изобретении, может быть введена различными способами, включая пероральный, кожный, подкожный, внутривенный или внутримышечный, с целью лечения остеоартрита, и, например, указанную композицию можно вводить внутрисуставно.
Субъектом для применения (введения) композиции и/или способа по настоящему изобретению могут быть млекопитающие, включая приматов, включая людей, обезьян и т.п., грызунов, включая мышей, крыс и т.п., или полученные от указанных животных клетки, ткани или их культуры. Согласно одному конкретному примеру субъектом могут быть млекопитающие, включая приматов, включая людей, обезьян и т.п., грызунов, включая мышей, крыс и т.п., или полученные от указанных животных клетки, ткани или их культуры, нуждающиеся в регенерации хряща и/или профилактике и/или лечении остеоартрита и/или повышении экспрессии белка коллагена II.
Настоящее изобретение также может относится к способу получения композиции для регенерации хряща и/или композиции для профилактики или лечения остеоартрита и/или композиции для повышения экспрессии белка коллагена II, включающий трансдукцию гена TSG-6 и/или вектора, содержащего ген TSG-6, в мезенхимальную стволовую клетку.
Трансдукция может осуществляться путем свободного выбора способа трансдукции, известного в данной области техники, в рамках задачи трансдукции мезенхимальной стволовой клетки.
Ген TSG-6 и/или содержащий его вектор являются такими, как описано выше.
Положительные эффекты от изобретения
Композиция для регенерации хряща и/или фармацевтическая композиция, и/или способ профилактики или лечения остеоартрита, представленные в настоящем изобретении, обладают превосходной способностью регенерации хряща и/или противовоспалительным действием.
Композиция и/или способ, представленные в настоящем изобретении, могут решить проблему персистенции, вызванную коротким периодом полужизни белка TSG-6 в суставе.
Кроме того, композиция и/или способ, представленные в настоящем изобретении, оказывают существенное и благоприятное воздействие на регенерацию хряща и профилактику и/или лечение остеоартрита благодаря превосходному эффекту повышения уровня экспрессии белка коллагена II.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлен график результатов осуществления иммуноферментного анализа (ELISA) для измерения уровня экспрессии в выбранных двух видах TSG-6 MSC и в контрольной группе (группа без трансдуцированного TSG-6).
На фиг. 2а представлена блок-схема плана эксперимента по совместному культивированию для подтверждения уровня экспрессии коллагена для хондроцитов in vitro.
На фиг. 2b представлен график, показывающий количественные значения (уровень экспрессии белка коллагена II/уровень экспрессии GAPDH) результатов вестерн-блоттинга, подтверждающих уровень экспрессии коллагена II и контрольной группы (GADPH) в каждой группе.
На фиг. 3а представлена фотография под микроскопом, подтверждающая степень восстановления хрящевой ткани по каждой группе в модели кролика с остеоартритом посредством окрашивания сафранином О (масштабный отрезок: 160 мкм, стрелками в -В-: отмечены клоны).
На фиг. 3b представлены графики измерения толщины хряща по каждой группе в направлении бедренной кости и большеберцовой кости, соответственно, в модели кролика с остеоартритом, а также результаты, демонстрирующие статистическую значимость. n.s.: незначимый; *: р<0,05; **: Р<0,01; ***: р<0,001; ****: P<0,0001 (далее аналогично).
На фиг. 4а представлена фотография результата иммуногистохимического окрашивания (IHC) для TGF-b1 по каждой группе в хряще модели кролика с остеоартритом.
На фиг. 4b представлены графики измерения иммунореактивности TGF-b1 по каждой группе в модели кролика с остеоартритом, а также результат, показывающий статистическую значимость.
На фиг. 5a представлена фотография результата иммуногистохимического окрашивания (IHC) для TNF-a по каждой группе в хряще модели кролика с остеоартритом.
На фиг. 5b представлены графики измерения иммунореактивности TNF-a по каждой группе в модели кролика с остеоартритом, а также результат, показывающий статистическую значимость.
На фиг. 6a представлена фотография результата иммуногистохимического окрашивания (IHC) для IFN-r по каждой группе в хряще модели кролика с остеоартритом.
На фиг. 6b представлены графики измерения иммунореактивности IFN-r по каждой группе в модели кролика с остеоартритом, а также результат, показывающий статистическую значимость.
На фиг. 7a представлены фотографии результата иммуногистохимического окрашивания (IHC) для IL-6 по каждой группе в хряще модели кролика с остеоартритом.
На фиг. 7b представлены графики измерения иммунореактивности IL-6 по каждой группе в модели кролика с остеоартритом, а также результат, показывающий статистическую значимость.
На фиг. 8а представлены фотографии результата окрашивания гематоксилин-эозином для каждой группы в синовиальной мембране модели кролика с остеоартритом.
На фиг. 8b представлены графики, показывающие толщину эпителия синовиальной мембраны и количество воспалительных клеток в результате окрашивания гематоксилин-эозином для каждой группы в синовиальной мембране модели кроликов с остеоартритом, а также их статистическая значимость.
На фиг. 9а представлены фотографии под микроскопом результата иммуногистохимического окрашивания (IHC) для TGF-b1 и TNF-a для каждой группы в синовиальной мембране модели кроликов с остеоартритом.
На фиг. 9b представлены графики результата измерения иммунореактивности в отношении TGF-b1 и TNF-a для каждой группы в синовиальной мембране модели кроликов с остеоартритом и их статистическая значимость.
На фиг. 10a представлены фотографии под микроскопом результата иммуногистохимического окрашивания (IHC) для IFN-r и IL-6 для каждой группы в синовиальной мембране модели кроликов с остеоартритом.
На фиг. 10b представлены графики результата измерения иммунореактивности в отношении IFN-r и IL-6 для каждой группы в синовиальной мембране модели кроликов с остеоартритом, а также их статистическая значимость.
На фиг. 11а представлен график, показывающий уровень экспрессии мРНК TSG-6 в наивных MSC и MSC, обработанных TNF-α, и MSC, трансдуцированных вектором экспрессии TSG-6.
На фиг. 11b представлен график, показывающий уровень экспрессии белка TSG-6 в наивных MSC и MSC, обработанных TNF-α, и MSC, трансдуцированных вектором экспрессии TSG-6.
На фиг. 11c представлен график, показывающий уровень экспрессии мРНК Col II в хондроцитах, совместно культивируемых с наивными MSC и MSC, обработанными TNF-α, или MSC, трансдуцированными вектором экспрессии TSG-6.
Вариант осуществления настоящего изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно посредством примеров. Однако следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, причем объем настоящего раскрытия не ограничивается следующими примерами.
Если в настоящем документе не указано иное, “АС” соответствует аббревиатуре хряща, выстилающего суставную поверхность, а “ОА” соответствует аббревиатуре остеоартрита.
Пример 1. Получение мезенхимальных стволовых клеток, трансдуцированных геном TSG-6
1-1. Получение лентивируса
После предварительной кодон-оптимизации последовательности кДНК TSG-6 (номер доступа GenBank NM_007115; SEQ ID №: 3) получали лентивирусный вектор, содержащий последовательность кДНК (SEQ ID №: 4), завершающую кодон-оптимизацию по предписанию SIRION-Biotech.
1-2. Трансдукция гена TSG-6 в мезенхимальные стволовые клетки
В качестве мезенхимальных стволовых клеток (MSC), полученные из пуповинной крови мезенхимальные стволовые клетки культивировали в среде для культивирования MSC в атмосфере 5% (об./об.) CO2 при температуре 37 градусов Цельсия. К культивируемым 50000 клеткам MSC или 100000 клеткам добавляли лентивирус, в который трансдуцировали кДНК TSG-6, и указанные клетки снова культивировали в атмосфере 5% (об./об.) CO2, при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. MSC, содержащие последовательность кДНК гена TSG-6, (TSG-6 MSC) отбирали методом ELISA.
Пример 2. Подтверждение уровня секреции белка TSG-6 в MSC TSG-6
Для подтверждения уровня секреции белка TSG-6 в MSC TSG-6, полученных в примере 1, уровень секреции белка TSG-6 подтверждали методом ELISA. В частности, в качестве контрольной группы применяли MSC, не инфицированные лентивирусом, содержащим кДНК TSG-6, и все MSC культивировали в бессывороточной среде в атмосфере для культивирования 5% CO2 при температуре 37°С в течение 24 часов с определением общего количества белка TSG-6, экспрессируемого в течение 24 часов.
На фиг. 1 показан график результата измерения уровня экспрессии TSG-6 в MSC TSG-6 и контрольной группе. В результате измерения было подтверждено, что мезенхимальные стволовые клетки, трансдуцированные TSG-6, секретировали приблизительно от 10 до 100 нг/100000 клеток/24 ч белка TSG-6.
Пример 3. Подтверждение эффекта лечения остеоартрита MSC TSG-6 в модели совместного культивирования клеток хрящевой ткани и синовиоцитов
Для подтверждения терапевтического эффекта TSG-6 MSC в отношении остеоартрита на уровне in vitro подтверждали уровень экспрессии коллагена II в зависимости от добавления TSG-6 MSC, полученного в примере 1, в условиях совместного культивирования клеток хрящевой ткани и синовиоцитов.
На фиг. 2а показана блок-схема плана исследования. В частности, хондроциты инокулировали в 96-луночный планшет с U-образным дном отдельно и культивировали в среде для дифференцировки клеток хрящевой ткани в атмосфере 5% (об./об.) CO2, при температуре 37ºС в течение 3 недель (21 день) с образованием хрящевого агрегата, и этот хрящевой агрегат совместно культивировали с синовиоцитами в атмосфере 5% CO2, при температуре 37°С в течение 2 дней, а затем индуцировали воспаление путем добавления TNF-альфа (TNF-a) 10 нг/мл и интерлейкина 1-бета (IL1b) 10 нг/мл.
Через 2 дня совместного культивирования (индукция воспаления) добавляли очищенный белок TSG-6 в концентрации 200 нг/мл и культивировали в течение 1 дня, затем удаляли синовиоциты и добавляли очищенный белок TSG-6 в концентрации 200 нг/мл, в той же концентрации, которую добавляли ранее, и снова культивировали в течение 7 дней. В экспериментальной группе, для подтверждения терапевтического эффекта TSG-6MSC при остеоартрите, синовиоциты удаляли через 3 дня совместного культивирования и для экспрессии белка TSG-6 на уровне 10 нг/мл/24 часа или для экспрессии белка TSG-6 на уровне 30 нг/мл/24 часа их снова совместно культивировали в течение 7 дней при различных количествах TSG-6 MSC.
В качестве нормальной группы использовали группу без индуцированного воспаления (контроль без воспаления, NIC), а в качестве группы отрицательного контроля использовали группу без добавления TSG-6 после индукции воспаления (контроль с воспалением, IC). Затем посредством вестерн-блоттинга определяли уровень экспрессии белка коллагена II в каждой группе, при этом, в качестве контрольной группы, подтверждали уровень экспрессии белка GAPDH.
В приведенной ниже таблице 1 упорядочена и представлена каждая группа.
Таблица 1
(5×104, трансдуцированные TSG-6 MSC)
(1,5×105, трансдуцированные TSG-6 MSC)
На фиг. 2b показаны значения (уровень экспрессии белка коллагена II/уровень экспрессии GAPDH) количественной оценки результатов вестерн-блоттинга для каждой группы.
Как показано на фиг. 2b белок коллагена II незначительно продуцировался в хондроцитах с индуцированным воспалением (столбец 2), однако при добавлении в форме, в которой белок TSG-6 экспрессирован в очищенном белке или TSG-6 MSC, уровень экспрессии белка коллагена II повышался в обоих случаях. Кроме того, в обоих случаях, когда белок TSG-6 добавлен в форме очищенного белка, а также добавлен в форме MSC, в которую вводили вектор экспрессии TSG-6, уровень экспрессии белка коллагена II повышался в зависимости от концентрация белка TSG-6, однако, в частности, в случае, когда белок TSG-6 добавлен в форме MSC, в которую введен вектор экспрессии TSG-6 (то есть форму, в которой белок TSG-6 экспрессирован в MSC), по сравнению со случаем добавления очищенного белка TSG-6, уровень экспрессии белка коллагена II был выше, причем при совместном культивировании с TSG-6 MSC, экспрессирующими белок TSG-6 на уровне 30 нг/мл/24 ч, был показан уровень экспрессии белка коллагена II на уровне, аналогичном уровню в группе NIC.
Другими словами, было подтверждено, что уровень экспрессии белка коллагена II повышался в зависимости от концентрации белка TSG-6, при этом TSG-6 MSC, экспрессирующие белок TSG-6, согласно настоящему изобретению, обеспечивали эффект восстановления белка коллагена II на уровне, аналогичном или более высоком, чем очищенный TSG-6.
На основании соответствующего результата можно подтвердить, что TSG-6 MSC, представленные в настоящем изобретении, обладают эффектом регенерации и/или восстановления хряща, и, соответственно, можно видеть, что его можно успешно применять для лечения артрита.
Пример 4. Подтверждение терапевтического эффекта TSG-6 MSC на модели кроликов с дегенеративным остеоартритом
Для подтверждения терапевтического эффекта TSG-6 MSC на уровне in vivo осуществляли эксперимент на модели кроликов с дегенеративным остеоартритом.
В частности, в качестве модели кроликов с дегенеративным остеоартритом использовали самок новозеландских белых кроликов категории SPF (Kangda) (возраст приблизительно 10 месяцев), и при введении TSG-6 MSC и т.д. масса тела составляла около 3,9 кг. Модель кроликов разделяли всего на 6 групп. Краткое описание для каждой группы представлено в таблице 2 ниже.
Таблица 2
Группам C - F в числе 6 групп, представленных в таблице 2, соответственно инъецировали соответствующие MSC посредством шприца. Через 16 недель после инъекции у каждого кролика отбирали коленный сустав, и хрящевую ткань подвергали окрашиванию гематоксилин-эозином (H&E), иммуногистохимическому окрашиванию (IHC) или окрашиванию сафранином O, а также осуществляли микроскопирование и определение каждой иммунореактивности, измерение толщины эпителия или анализ количества воспалительных клеток.
4-1. Подтверждение индекса хрящевой структуры (окрашивание сафранином О)
Фотография результата окрашивания сафранином О показана на фиг. 3а, и график результата измерения толщины выстилающего суставную поверхность хряща (АС) по каждой группе на стороне бедренной кости и большой берцовой кости, соответственно, а также статистическая значимость показаны на фиг. 3b.
Средние значения измеренной толщины суставного хряща (АС) представлены, соответственно, в таблице 3 ниже. “Бедренная кость” соответствует толщине суставного хряща, измеренной со стороны бедренной кости, и “большая берцовая кость” соответствует толщине суставного хряща, измеренной со стороны большой берцовой кости.
Таблица 3
По сравнению с нормальной группой, во всех группах с остеоартритом (ОА) толщина хряща значительно уменьшилась, при этом в группах TSG-6 I и TSG-6 II толщина хряща значительно восстановилась, соответственно, и, в частности, по мере увеличения концентрации белка TSG-6, имелась тенденция к увеличению толщины хряща. Эта зависимость от концентрации проявлялась более заметно в хряще на стороне бедренной кости. В частности, в TSG-6 II группе подтверждалось улучшение структуры хряща до степени, при которой отсутствовала существенная разница (n.s.: незначимая) по сравнению с нормальной группой. С другой стороны, в группах “Наивные” не наблюдалось существенной разницы между группами “Наивные I” и “Наивные II”.
4-2. Подтверждение индекса воспаления посредством иммуногистохимического окрашивания хрящевой ткани (IHC)
В хрящевой ткани каждой группы таблицы 2 проводили иммуногистохимическое окрашивание (иммуногистохимическое окрашивание (IHC)) на TGF-b1, TNF-a, IFN-r и IL-6 соответственно для подтверждения уровня экспрессии каждого индекса воспаления соответственно.
Результат иммуногистохимического окрашивания (IHC) и иммунореактивность каждого индекса, измеренного на стороне бедренной кости и большой берцовой кости, показаны на фиг. 4а - 4b для TGF-b1, на фиг. 5а - 5b для TNF-a, на фиг. 6а - 6b для IFN-r и на фиг. 7а - 7b для IL-6, а также значения измерений каждой иммунореактивности показаны в таблице 4 ниже. В таблице 4 ниже не указана числовая единица (%/мм2) каждого уровня экспрессии индекса воспаления.
Таблица 4
В группе с ОА была продемонстрирована высокая иммунореактивность TGF-b1, TNF-a, IFN-r и IL-6, однако во всех группах лечения TSG-6 MSC по сравнению с группой с ОА была показана низкая иммунореактивность. В частности, в отношении TGF-b1, IFN-r и IL-6 иммунореактивность была снижена до степени, аналогичной нормальной группе (n.s.), и поэтому было подтверждено, что TSG-6 MSC, представленные в настоящем описании, продемонстрировали превосходный противовоспалительный эффект.
Кроме того, в группах, получавших TSG-6 MSC согласно настоящему изобретению, по мере увеличения лечебной дозы все численные значения иммунореактивности индекса воспаления снижались по сравнению наивными группами, демонстрирующими аналогичное численное значение индекса воспаления независимо от дозы введения, и, таким образом, подтверждалась превосходная противовоспалительная активность.
4-3. Подтверждение индекса воспаления посредством окрашивания гематоксилин-эозином (H&E) синовиальных мембран
Выделяли синовиальные мембраны каждой группы из таблицы 2, окрашивали гематоксилин-эозином, и результат представляли на фиг. 8а - 8b. На фиг. 8а представлен график, показывающий толщину эпителия синовиальной мембраны, и таблица, показывающая ее статистическую значимость, при этом на фиг. 8b представлен график, показывающий количество воспалительных клеток на единицу площади и таблица, показывающая его статистическую значимость. В таблице 5 ниже представлена толщина эпителия, измеренная в синовиальной мембране, и количество воспалительных клеток (IF клеток), соответственно.
Таблица 5
Как может быть подтверждено на фиг. 8b, толщина эпителия синовиальной мембраны была снижена в той же степени, что и в интактной группе из группы TSG-6 II, и количество воспалительных клеток также было уменьшено в той же степени, что и в интактной группе.
4-4. Подтверждение индекса воспаления посредством иммуногистохимического окрашивания (IHC) синовиальной ткани
Образцы синовиальной ткани каждой группы из таблицы 2 подвергали иммуногистохимическому окрашиванию (IHC окрашивание) на TGF-b1, TNF-a, IFN-r и IL-6 соответственно для подтверждения уровня экспрессии каждого индекса воспаления соответственно.
Результаты иммуногистохимического окрашивания (IHC) для TGF-b1 и TNF-a по каждой группе показаны на фиг. 9а, а результат измерения иммунореактивности TGF-b1 и TNF-a по каждой группе, а также статистическая значимость показаны на фиг. 9b, при этом график результата измерения иммунореактивности IFN-r и IL-6 по каждой группе и статистическая значимость показаны на фиг. 10 b. В таблице 6 ниже показан результат измерения уровня экспрессии индексов воспаления по каждой группе.
Таблица 6
В результате иммуногистохимического окрашивания (IHC) синовиальных клеток в группе ОА каждый индекс воспаления был значительно повышен по сравнению с интактной группой, однако в группах введения TSG-6 MSC (TSG-6 I и TSG-6 II) все индексы воспаления были снижены. В частности, в группе TSG-6 II иммунореактивность в отношении TGF-b1, IFN-r и IL-6 была снижена в той же степени, что и в нормальной группе, и, таким образом, было подтверждено, что противовоспалительная активность TSG- 6 MSC была превосходной.
Пример 5. Сравнение вектора экспрессии MSC, трансдуцированных геном TSG-6, и MSC, обработанных TNF-a
5-1. Получение MSC, обработанных TNF-a
Полученные из пуповинной крови MSC активировали посредством TNF-α. Вкратце полученные из пуповинной крови MSC высевали в количестве 1×105 клеток в 6-луночный планшет, содержащий 2 мл среды Advanced MEM (минимальная поддерживающая среда) (Thermofisher, MA, США), содержащей 10% (об./об.) ФБС на каждую лунку, и культивировали в течение 24 часов. Затем среду заменяли средой Advanced MEM, содержащей 1% (об./об.) ФБС и 10 нг/мл TNF-α (Peptrotech, NY, USA), и культивировали в течение 24 часов. Клетки обрабатывали 0,25% (масса/об.) трипсином вместе с 1 мМ ЭДТА (Gibco) при температуре 37°С в течение 2 минут для трипсинизации. Собранные клетки использовали для следующего примера.
5-2. Сравнение уровня мРНК TSG-6 (количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени: RT-qPCR)
В течение 24 часов посредством RT-QPCR определяли уровень экспрессии TSG-6 (уровень мРНК) наивных полученных из пуповинной крови MSC, (или “MSC”; контрольная группа), полученных из пуповинной крови трансдуцированных вектором экспрессии TSG-6 MSC, полученных в примере 1.2, (или “трансдуцированные TSG-6 MSC”; исследуемая группа) и полученных из пуповинной крови активированных TNF-α MSC, полученных в примере 5-1, (или “обработанные TNF-α MSC”; сравнительная группа). В соответствии с инструкциями производителя посредством набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN) из клеток выделяли тотальную РНК, и после синтеза кДНК посредством SuperScript™ III First-Strand Synthesis System (Thermofisher) осуществляли RT-qPCR на системе ПЦР в реальном времени QuantStudio™ 6 Flex (Applied Biosystem) с использованием смеси Fast SYBR™ Green Master Mix (Thermofisher). В качестве эндогенного контрольного гена использовали GAPDH. Применяемые праймеры представлены в таблице 7 ниже.
Таблица 7
Полученный результат вычисляли в виде относительных значений Ct (TSG-6/GAPDH), и представляли на фиг. 11а. Относительный уровень экспрессии вычисляли методом 2-ΔΔCt. Как показано на фиг. 11а, относительный уровень экспрессии TSG-6 (уровень мРНК) в обработанных TNF-α MSC (сравнительная группа) не показал значительных отличий от MSC контрольной группы (в 3,47 раза по сравнению с контрольной группой), тогда как относительный уровень экспрессии TSG-6 (уровень мРНК) в трансдуцированных TSG-6 MSC (исследуемая группа) был значительно выше, чем в группе сравнения, а также в контрольной группе (примерно в 1248 раз по сравнению с контрольной группой, примерно в 360 раз по сравнению с группой сравнения).
5-3. Сравнение уровня белка TSG-6 (ELISA)
Определяли уровень белка TSG-6, экспрессированного (секретируемого в среде) в наивных полученных из пуповинной крови MSC (или “MSC”; контрольная группа), трансдуцированных вектором экспрессии TSG-6 полученных из пуповинной крови MSC, полученных в примере 1.2, (или “ трансдуцированные TSG-6 MSC”; исследуемая группа) и активированных TNF-α полученных из пуповинной крови MSC, полученных в примере 5-1, (или “обработанные TNF-α MSC”; сравнительная группа) в течение 24 часов с использованием набора ELISA TSG-6 (Raybiotech, GA, US) в соответствии с инструкциями производителя.
Полученный результат (нг/105 клеток/24 ч) показан на фиг. 11 b. Как показано на фиг. 11b, MSC контрольной группы и обработанные TNF-α MSC сравнительной группы, имели слишком низкий уровень секреции белка TSG-6, чтобы его можно было измерить, в то время как трансдуцированные TSG-6 MSC, секретировали белок TSG-6 на значительно более высоком уровне (около 70 нг/105 клеток/24 ч) по сравнению с MSC контрольной группы и обработанными TNF-α MSC сравнительной группы.
5-4. Сравнение уровня мРНК коллагена II (RT-qPCR)
Получали наивные полученные из пуповинной крови MSC (или “MSC”; контрольная группа), трансдуцированные вектором экспрессии TSG-6 полученные из пуповинной крови MSC (или “трансдуцированные TSG-6 MSC”; исследуемая группа; см. пример 1.2) и полученные из пуповинной крови активированные TNF-α MSC (или “обработанные TNF-α MSC”; сравнительная группа; см. пример 5-1) соответственно. Все полученные из пуповинной крови MSC, полученные как таковые, высевали в количестве 1×105 клеток в 6-луночный трансвелл (Corning, MA, US), содержащий 2 мл среды Advanced MEM, содержащей 10% (об./об.) ФБС на каждую лунку, и культивировали в течение 24 часа. Затем среду заменяли средой Advanced MEM, содержащей 1% (об./об.) ФБС и 10 нг/мл TNF-α, и культивировали в течение 24 часов с индуцированием активированных MSC.
Хондроциты (полученные из реберного хряща; см. пример 3) высевали в количестве 1×105 клеток в 6-луночный планшет, содержащий 2 мл среды Advanced MEM, содержащей 10% (об./об.) ФБС на каждую лунку и культивировали в течение 24 часов. Затем среду заменяли средой Advanced MEM, содержащей 1% (об./об.) ФБС и 75 нг/мл IL-1b (Peptrotech, NY, US), и культивировали в течение 24 часов с индуцированием воспаления. Их совместно культивировали с MSC, активированными в 6-луночном трансвеле, в течение 24 часов. Хондроциты обрабатывали 0,25% (масса/об.) трипсином вместе с 1 мМ ЭДТА (Gibco) при температуре 37°С в течение 2 минут для трипсинизации. Собранные клетки использовали для последующего сравнения уровня мРНК коллагена II (RT-qPCR).
Определяли уровень экспрессии коллагена II (уровень мРНК) в хондроцитах, сокультивированных с наивными полученными из пуповинной крови MSC (MSC; контрольная группа), трансдуцированных вектором экспрессии TSG-6 полученных из пуповинной крови MSC (трансдуцированные TSG-6 MSC; исследуемая группа) или полученных из пуповинной крови активированных TNF-α MSC (обработанные TNF-α MSC; сравнительная группа) в течение 24 часов посредством RT-qPCR. В соответствии с инструкциями производителя с использованием набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN) из клеток экстрагировали тотальную РНК и после синтеза кДНК с использованием системы SuperScript™ III First-Strand Synthesis System (Thermofisher) осуществляли RT-qPCR на системе ПЦР в реальном времени QuantStudio™ 6 Flex (Applied Biosystem) с использованием смеси Fast SYBR™ Green Master Mix (Thermofisher). В качестве эндогенного контрольного гена использовали GAPDH. Применяемые праймеры представлены в таблице 8.
Таблица 8
Полученный результат вычисляли в виде относительных значений Ct (коллаген II/GAPDH) и представляли на фиг. 11с. Относительный уровень экспрессии вычисляли методом 2-ΔΔCt. Как показано на фиг. 11с, относительный уровень экспрессии коллагена II (уровень мРНК) обработанных TNF-α MSC (группа сравнения) не показал значительных отличий от MSC контрольной группы (в 1,03 раза по сравнению с контрольной группой), тогда как относительный уровень экспрессии коллагена II (уровень мРНК) в трансдуцированных TSG-6 MSC (исследуемая группа) был значительно выше, чем в группе сравнения, а также в контрольной группе (примерно в 1,93 раза по сравнению с контрольной группой, примерно в 1,87 раза по сравнению с группой сравнения). Этот результат подтвердил, что трансдуцированные вектором экспрессии TSG-6 MSC, обладали в значительной степени превосходящим эффектом экспрессии коллагена II в хондроцитах по сравнению с наивными MSC, а также активированными (индуцируемыми) TNF-α MSC, и данный результат демонстрирует превосходный эффект регенерации хряща и/или эффект лечения остеоартрита посредством трансдуцированных вектором экспрессии TSG-6 MSC.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> LG CHEM, LTD.
<120> Композиция для профилактики или лечения остеоартрита, содержащая мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие ген 6, индуцируемый фактором некроза опухоли
<130> OPP20212366KR
<150> KR 10-2020-0089148
<151> 2020-07-17
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 277
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность TSG-6
<400> 1
Met Ile Ile Leu Ile Tyr Leu Phe Leu Leu Leu Trp Glu Asp Thr Gln
1 5 10 15
Gly Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu
20 25 30
Arg Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys
35 40 45
Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His
50 55 60
Leu Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His
65 70 75 80
Val Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile
85 90 95
Val Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp
100 105 110
Tyr Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr
115 120 125
Asn Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Gln
130 135 140
Ile Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile
145 150 155 160
Cys Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser
165 170 175
Phe Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr
180 185 190
Val Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg
195 200 205
Tyr Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val
210 215 220
Met Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe
225 230 235 240
Gln Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys Ser Ser Gln Gly
245 250 255
Lys Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn Phe Leu Ala Gly
260 265 270
Arg Phe Ser His Leu
275
<210> 2
<211> 1422
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический ген TSG-6
<400> 2
agtcacattt cagccactgc tctgagaatt tgtgagcagc ccctaacagg ctgttacttc 60
actacaactg acgatatgat catcttaatt tacttatttc tcttgctatg ggaagacact 120
caaggatggg gattcaagga tggaattttt cataactcca tatggcttga acgagcagcc 180
ggtgtgtacc acagagaagc acggtctggc aaatacaagc tcacctacgc agaagctaag 240
gcggtgtgtg aatttgaagg cggccatctc gcaacttaca agcagctaga ggcagccaga 300
aaaattggat ttcatgtctg tgctgctgga tggatggcta agggcagagt tggatacccc 360
attgtgaagc cagggcccaa ctgtggattt ggaaaaactg gcattattga ttatggaatc 420
cgtctcaata ggagtgaaag atgggatgcc tattgctaca acccacacgc aaaggagtgt 480
ggtggcgtct ttacagatcc aaagcaaatt tttaaatctc caggcttccc aaatgagtac 540
gaagataacc aaatctgcta ctggcacatt agactcaagt atggtcagcg tattcacctg 600
agttttttag attttgacct tgaagatgac ccaggttgct tggctgatta tgttgaaata 660
tatgacagtt acgatgatgt ccatggcttt gtgggaagat actgtggaga tgagcttcca 720
gatgacatca tcagtacagg aaatgtcatg accttgaagt ttctaagtga tgcttcagtg 780
acagctggag gtttccaaat caaatatgtt gcaatggatc ctgtatccaa atccagtcaa 840
ggaaaaaata caagtactac ttctactgga aataaaaact ttttagctgg aagatttagc 900
cacttataaa aaaaaaaaaa aggatgatca aaacacacag tgtttatgtt ggaatctttt 960
ggaactcctt tgatctcact gttattatta acatttattt attatttttc taaatgtgaa 1020
agcaatacat aatttaggga aaattggaaa atataggaaa ctttaaacga gaaaatgaaa 1080
cctctcataa tcccactgca tagaaataac aagcgttaac attttcatat ttttttcttt 1140
cagtcatttt tctatttgtg gtatatgtat atatgtacct atatgtattt gcatttgaaa 1200
ttttggaatc ctgctctatg tacagttttg tattatactt tttaaatctt gaactttata 1260
aacattttct gaaatcattg attattctac aaaaacatga ttttaaacag ctgtaaaata 1320
ttctatgata tgaatgtttt atgcattatt taagcctgtc tctattgttg gaatttcagg 1380
tcattttcat aaatattgtt gcaataaata tccttgaaca ca 1422
<210> 3
<211> 834
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность синтетической кДНК TSG-6
<400> 3
atgatcatct taatttactt atttctcttg ctatgggaag acactcaagg atggggattc 60
aaggatggaa tttttcataa ctccatatgg cttgaacgag cagccggtgt gtaccacaga 120
gaagcacggt ctggcaaata caagctcacc tacgcagaag ctaaggcggt gtgtgaattt 180
gaaggcggcc atctcgcaac ttacaagcag ctagaggcag ccagaaaaat tggatttcat 240
gtctgtgctg ctggatggat ggctaagggc agagttggat accccattgt gaagccaggg 300
cccaactgtg gatttggaaa aactggcatt attgattatg gaatccgtct caataggagt 360
gaaagatggg atgcctattg ctacaaccca cacgcaaagg agtgtggtgg cgtctttaca 420
gatccaaagc aaatttttaa atctccaggc ttcccaaatg agtacgaaga taaccaaatc 480
tgctactggc acattagact caagtatggt cagcgtattc acctgagttt tttagatttt 540
gaccttgaag atgacccagg ttgcttggct gattatgttg aaatatatga cagttacgat 600
gatgtccatg gctttgtggg aagatactgt ggagatgagc ttccagatga catcatcagt 660
acaggaaatg tcatgacctt gaagtttcta agtgatgctt cagtgacagc tggaggtttc 720
caaatcaaat atgttgcaat ggatcctgta tccaaatcca gtcaaggaaa aaatacaagt 780
actacttcta ctggaaataa aaacttttta gctggaagat ttagccactt ataa 834
<210> 4
<211> 834
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Кодон-оптимизация последовательности синтетической кДНК TSG-6
<400> 4
atgattatcc tgatctacct gttcctgctg ctgtgggaag atacccaagg ctggggcttc 60
aaggacggca tcttccacaa cagcatctgg ctggaaagag ccgctggcgt ctaccacaga 120
gaagccagaa gcggcaagta caagctgacc tacgccgagg ccaaagccgt gtgcgaattt 180
gaaggcggac acctggccac ctacaagcag ctggaagccg ccagaaagat cggcttccat 240
gtgtgcgctg ccggctggat ggctaagggc agagtgggat accccatcgt gaagcccgga 300
cctaattgcg gctttggaaa gaccggcatc atcgactacg gcatccggct gaacagatcc 360
gagagatggg acgcctactg ctacaaccct cacgccaaag aatgtggcgg cgtgttcaca 420
gaccccaagc agatctttaa gagccctggc ttccccaacg agtacgagga caaccagatc 480
tgctactggc acatcagact gaagtacggc cagcggatcc acctgagctt tctggacttc 540
gacctggaag atgaccctgg ctgcctggcc gactacgtgg aaatctacga cagctacgac 600
gacgtgcacg gcttcgtggg cagatactgc ggagatgagc tgcccgacga catcatcagc 660
accggcaacg tgatgactct gaagttcctg agcgacgcct ctgtgacagc cggcggattc 720
cagatcaaat acgtggccat ggatcccgtg tccaagtcca gccagggcaa gaataccagc 780
accacctcta ccggcaacaa gaacttcctg gccggcagat tcagccacct gtaa 834
<210> 5
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический прямой праймер TSG-6
<400> 5
tggatggcta agggcagag 19
<210> 6
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический обратный праймер TSG-6
<400> 6
gcgtgtgggt tgtagca 17
<210> 7
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический прямой праймер GAPDH
<400> 7
gtctcctctg acttcaacag cg 22
<210> 8
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический обратный праймер GAPDH
<400> 8
accaccctgt tgctgtagcc aa 22
<210> 9
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический прямой праймер коллагена II
<400> 9
ctcaagtcgc tgaacaacca 20
<210> 10
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический обратный праймер коллагена II
<400> 10
gtctccgctc ttccactctg 20
<---
Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, а именно к применению мезенхимальной стволовой клетки, экспрессирующей белок TSG-6, при приготовлении фармацевтической композиции для регенерации хряща, где мезенхимальная стволовая клетка, экспрессирующая белок TSG-6, представляет собой рекомбинантную мезенхимальную стволовую клетку, содержащую одно или более, выбранное из группы, состоящей из гена, кодирующего белок TSG-6, и рекомбинантного вектора, содержащего ген, кодирующий белок TSG-6. Технический результат заключается в более высокой экспрессии белка коллагена II, улучшении структуры хряща, противовоспалительном действии, лечении остеоартрита. 3 з.п. ф-лы, 11 ил., 8 табл., 5 пр.
1. Применение мезенхимальной стволовой клетки, экспрессирующей белок TSG-6, при приготовлении фармацевтической композиции для регенерации хряща, где мезенхимальная стволовая клетка, экспрессирующая белок TSG-6, представляет собой рекомбинантную мезенхимальную стволовую клетку, содержащую одно или более, выбранное из группы, состоящей из гена, кодирующего белок TSG-6, и рекомбинантного вектора, содержащего ген, кодирующий белок TSG-6.
2. Применение мезенхимальной стволовой клетки по п.1, причем фармацевтическая композиция имеет
уровень экспрессии белка TSG-6, составляющий от 10 до 200 нг/100000 клеток/24 ч,
уровень экспрессии белка TSG-6 составляет от 10 до 50000 нг/мл/24 ч или
оба указанных уровня.
3. Применение мезенхимальной стволовой клетки по п.1, причем уровень экспрессии белка коллагена II по меньшей мере в одном, выбранном из группы, состоящей из хондроцита и хрящевой ткани, в отношении которых применялась композиция, повышен по сравнению с контрольной группой, в отношении которой не применялась фармацевтическая композиция.
4. Применение мезенхимальной стволовой клетки по п.1, причем уровень экспрессии индекса воспаления по меньшей мере в одном, выбранном из группы, состоящей из хондроцитов, хрящевой ткани, синовиоцитов и синовиальной ткани, в отношении которых применялась композиция, снижается по сравнению с контрольной группой, в отношении которой не применялась фармацевтическая композиция, и
индекс воспаления представляет собой по крайней мере один индекс воспаления, выбранный из группы, состоящей из TGF-b1, TNF-a, IFN-r и IL-6.
US 2015057229 A1, 26.02.2015 | |||
ALEXANDER P | |||
G | |||
et al | |||
Mesenchymal stem cells in musculoskeletal tissue engineering // Principles of Tissue Engineering | |||
- Academic Press, 2014 | |||
- P | |||
Вращающийся искровой разрядник с неодинаковым числом подвижных и неподвижных зубцов | 1924 |
|
SU1171A1 |
ICHISEKI T | |||
et al | |||
Intraarticularly-injected mesenchymal stem cells stimulate anti-inflammatory molecules and inhibit pain related protein and chondrolytic |
Авторы
Даты
2024-07-15—Публикация
2021-07-16—Подача