СПОСОБ ОЦЕНКИ СОХРАНЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЛАКТОБАКТЕРИЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ АНТИСЕПТИКА Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 G01N33/48 C12R1/225 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и гинекологии, и может быть использовано для оценки жизнеспособности лактобактерий при использовании антисептиков местного применения для профилактики и лечения воспалительных заболеваний в гинекологии.

Уровень техники

Известен способ оценки эффективности антимикробного воздействия антисептиков на бактерии, существующие в форме биопленки, заключающийся в создании модели бактериальной биопленки из любых бактериальных культур, выделенных из клинического материала пациента, подборе доз воздействия антисептиков. Регистрацию воздействия антисептиков на биопленку проводят дополнительно по изменению цвета питательной среды и ее помутнению с помощью микропланшетного фотометра, дополнительно проводят высев содержимого лунок на питательный агар. Оценка антимикробного эффекта рассчитывается как отношение рабочей концентрации антисептика к его минимальной подавляющей концентрации, и при величине индекса 2-4 считают антисептик активным. Изобретение повышает достоверность наличия воздействия антисептика, позволяет определить бактерицидный или бактериостатический тип действия антисептика на биопленочные формы бактерий, а оценка эффективности по индексу активности антисептика повышает точность оценки результатов [Патент РФ на изобретение №2603100, заявка 201514630/10, 29.10.2015, опубликовано: 20.11.2016. Бюл. №32].

Недостатками данного способа является использование микропланшетного фотометра для иммуноферментного анализа или биохимических исследований, что технически возможно не во всех бактериологических лабораториях.

Известен способ оценки эффективности средств местного антисептического воздействия, заключающийся в определении чувствительности планктонных и диспергированных ультразвуком биопленочных форм микроорганизмов к антисептикам, смешанным с питательным бульоном в соотношении один к четырем. Регистрацию воздействия антисептика на микроорганизмы проводят путем определения наличия роста в опытной и контрольной (без антисептика) пробирках: при наличии роста в контрольной и отсутствии в опытной - культуру относят к клинически чувствительной, при наличии роста в обеих пробирках - к клинически устойчивой к изучаемому антисептику. При этом в качестве модели бактериальной биопленки используют биопленку из любых бактериальных культур и их ассоциаций, выделенных из клинического материала пациентов, которую выращивают на дренажных полимерах [Теплякова О.В., Соседова Е.В и др. материалы 2-й научно-практической школы-семинара молодых ученых по мероприятию «Поддержка развития внутрироссийской мобильности научных и научно-педагогических кадров путем выполнения научных исследований молодыми учеными и преподавателями в научно-образовательных центрах» Тольятти 18-21 декабря 2012 г.].

Недостатками данного способа является субъективная визуальная оценка эффективности антисептика, применяемого только в одной концентрации, что не позволяет выявить штаммы микроорганизмов, устойчивых к низким концентрациям антисептика.

За прототип принимается способ оценки антибактериального действия антисептиков на микробные биопленки заключающийся в том, что оценивают влияние антисептического препарата на микробную биопленку, образованную смешанной культурой бактерий, представленной возбудителями инфекционных осложнений. Для этого полимикробные микробные биопленки, сформированные in vitro, подвергают 60-минутному воздействию антисептика, после чего оценивают и сравнивают с контролем (без воздействия антисептика) два показателя: массивность биопленки (в Ед ОП) и жизнеспособность (по числу КОЕ), входящих в ее состав бактерий. Если Ед ОП снизился на 70% и КОЕ не обнаружены, антисептик считают высокоэффективным; если Ед ОП снизился от 30 до 70% и число КОЕ снизилось на 4 порядка и более, антисептик считают среднеэффективным; при снижении Ед ОП менее 30% и снижении числа КОЕ менее чем на 4 порядка антисептик оценивают как низкоэффективный. Изобретение обеспечивает повышение точности и объективности способа за счет оценки антибактериального действия антисептика на полимикробные биопленки [Патент РФ на изобретение №2621306, заявка 2016122539, 07.06.2016, опубликовано: 01.06.2017 Бюл. №16].

Недостатками данного способа является использование микропланшетного ридера и ультразвуковой ванны, что технически возможно не во всех бактериологических лабораториях. Также данный способ предназначен для контроля пленкообразования патогенных микроорганизмов, таких как Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, что может не подходить для оценки жизнеспособности нормальной и условно-патогенной микрофлоры.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является определение оптимальной концентрации антисептиков местного применения для профилактики и лечения воспалительных заболеваний в гинекологии с целью сохранения максимально возможного количества представителей нормальной микрофлоры влагалища.

Это достигается тем, что в отличие от известных способов оценки антибактериального действия антисептиков штаммы лактобактерий вносятся в пробирку с жидкой питательной средой (бульоном), объемом 5 мл для приготовления инокулюма (бактериальной суспензии). Плотность инокулюма должна соответствовать 0,5 по стандарту МакФарланда, что эквивалентно количеству бактериальных клеток 10⁸ КОЕ/мл. Для приготовления инокулюма используется жидкая питательная среда (бульон) Rogosa SL broth для выделения лактобактерий, определение оптической плотности бактериальных суспензий проводится с помощью денситометра. Далее в пробирку вносится антисептик в объеме, необходимом для создания конечной тестируемой концентрации. Пробирки помещаются в термостат, где инкубируются в аэробных условиях в течение 48 часов при температуре 37°С. Далее проводится посев содержимого пробирок на чашки Петри агаром для лактобактерий. Засеянные чашки Петри помещаются в термостат, где инкубируются в микроаэрофильных условиях в течение 72 часов при температуре 37°С. После этого оценивается видимой рост колоний лактобактерий с подсчетом колониеобразующих единиц (КОЕ), выраженный в процентах.

Осуществление изобретения

Сущность предложенного метода заключается в следующем: штаммы лактобактерий вносятся в пробирку с жидкой питательной средой (бульоном), объемом 5 мл для приготовления инокулюма (бактериальной суспензии). Плотность инокулюма должна соответствовать 0,5 по стандарту МакФарланда, что эквивалентно количеству бактериальных клеток 10⁸ КОЕ/мл. Для приготовления инокулюма используется жидкая питательная среда (бульон) Rogosa SL broth для выделения лактобактерий, определение оптической плотности бактериальных суспензий проводится с помощью денситометра. Далее в пробирку вносится антисептик в объеме, необходимом для создания конечной тестируемой концентрации. Пробирки помещаются в термостат, где инкубируются в аэробных условиях в течение 48 часов при температуре 37°С. Далее содержимое пробирок засевается с использованием техники посева «газоном» на чашки Петри с агаром для лактобактерий. Засеянные чашки Петри помещаются в термостат, где инкубируются в микроаэрофильных условиях в течение 72 часов при температуре 37°С. После этого оценивается видимой рост колоний лактобактерий с подсчетом колониеобразующих единиц (КОЕ), выраженный в процентах.

В предложенном способе оценки сохранения жизнеспособности лактобактерий концентрации тестируемых антисептиков создаются в инокулюме (бактериальной суспензии), приготовленном с использованием жидкой питательной среды Rogosa SL broth, что создает оптимальные условия для выделения лактобактерий.

Осуществление предлагаемого способа можно продемонстрировать на следующем примере:

Оценено влияние различных концентраций бензилдиметил [3(миристоиламино)пропил] аммония хлорида моногидрата на сохранение жизнеспособности лактобактерий с использованием штаммов L.crispatus и L.jensenii. Бактериальные суспензии были приготовлены на основе бульона Мюллера-Хинтона, плотность суспензии соответствовала 0,5 по стандарту МакФарланда. Для моделирования возможных физиологических и патологических значений pH влагалища добавлялись различные объемы 90% раствора молочной кислоты, было смоделировано 3 значения: 3,0; 4,2; 5,6. Контроль значений pH проводился pH-метром. Положительный контроль включал бульон Мюллера-Хинтона с взвесью микроорганизмов и молочную кислоту в необходимом объеме для соответствующего рН, отрицательный контроль включал бульон Мюллера-Хинтона с взвесью микроорганизмов и раствор бензилдиметил [3(миристоиламино)пропил] аммония хлорида моногидрата в концентрации 0,01%. Каждый вид лактобактерий тестировался в 10 повторах при каждом значении pH. Сохранение жизнеспособности лактобактерий оценивалось при следующих концентрациях бензилдиметил [3(миристоиламино)пропил] аммония хлорида моногидрата: 0,04%, 0,02%, 0,01%, 0,005%, 0,0025%, 0,00125%.

Результат: после инкубации, рассева на плотные питательные среды и повторной инкубации образцов был зафиксирован рост единичных колоний на всех типах плотных питательных сред при концентрации бензилдиметил [3(миристоиламино)пропил] аммония хлорида моногидрата 0,00125% при рН 4,2. В других концентрациях антисептика роста микроорганизмов обнаружено не было. Контрольные образцы показали видимый рост в случае положительного контроля и отсутствие роста в случае отрицательного контроля во всех случаях. Выросшие колонии были идентифицированы до вида с помощью метода MALDI-ToF масс-спектрометрии.

Предлагаемый способ позволяет оценить жизнеспособность лактобактерий, составляющих нормальную микробиоту влагалища при использовании антисептиков местного применения, что способствует оптимизации профилактики и лечения воспалительных заболеваний в гинекологии.

Оценка жизнеспособности лактобацилл при разных концентрациях бензилдиметил [3(миристоиламино)пропил] аммония хлорида моногидрата. Вид рН N Концентрация антисептика, % Положительный контроль, % случаев Отрицательный контроль, % случаев 0,04 0,02 0,01 0,005 0,0025 0,00125 L. crispatus 3,0 10 р/н р/н р/н р/н р/н р/н 100 р/н 4,2 10 р/н р/н р/н р/н р/н 33% 100 р/н 5,6 10 р/н р/н р/н р/н р/н р/н 100 р/н L. jensenii 3,0 10 р/н р/н р/н р/н р/н р/н 100 р/н 4,2 10 р/н р/н р/н р/н р/н 47% 100 р/н 5,6 10 р/н р/н р/н р/н р/н р/н 100 р/н р/н - роста нет

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и гинекологии. Предложен способ оценки сохранения жизнеспособности лактобактерий при воздействии различных концентраций антисептика, характеризующийся тем, что штаммы лактобактерий вносят в пробирку с жидкой питательной средой для приготовления инокулюма плотностью 0,5 по стандарту МакФарланда, далее вносят антисептик в объеме, необходимом для создания конечной тестируемой концентрации; пробирки помещают в термостат, инкубируют в аэробных условиях в течение 48 ч при 37°С с последующим пересевом содержимого пробирок на агар для лактобактерий и инкубацией в микроаэрофильных условиях в течение 72 ч при 37°С с последующей оценкой сохранения жизнеспособности лактобактерий по наличию роста единичных колоний лактобактерий на плотной питательной среде для каждой концентрации антисептика. Изобретение обеспечивает сохранение максимально возможного количества представителей нормальной микрофлоры влагалища при профилактике и лечении воспалительных заболеваний в гинекологии. 1 табл., 1 пр.

Способ оценки сохранения жизнеспособности лактобактерий при воздействии различных концентраций антисептика, характеризующийся тем, что штаммы лактобактерий вносят в пробирку с жидкой питательной средой объемом 5 мл для приготовления инокулюма плотностью 0,5 по стандарту МакФарланда, далее в пробирку вносят антисептик в объеме, необходимом для создания конечной тестируемой концентрации; пробирки помещают в термостат, где инкубируют в аэробных условиях в течение 48 ч при температуре 37°С с последующим пересевом содержимого пробирок на агар для лактобактерий и инкубацией в микроаэрофильных условиях в течение 72 ч при температуре 37°С с последующей оценкой сохранения жизнеспособности лактобактерий по наличию роста единичных колоний лактобактерий на плотной питательной среде для каждой концентрации антисептика.