СПОСОБ ПЕРВИЧНОГО ПОСЕВА ОТДЕЛЯЕМОГО ИЗ ПАРОДОНТАЛЬНЫХ КАРМАНОВ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/06 C12Q1/24 C12N1/20 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и стоматологии, и может быть использовано для первичного посева биоматериала, выделенного из полости рта пациентов с болезнями пародонта при стоматологическом обследовании.

Уровень техники

Известен способ экспресс-диагностики Escherichia coli и бактерий группы кишечной палочки в ротовой полости, осуществляемый следующим образом: у пациента проводят забор биологического материала из ротовой полости: ротовую и десневую жидкости с помощью микропипетки, мазок-отпечаток со слизистой оболочки рта - стерильным ватным тампоном, зубную биопленку с помощью экскаватора (Экрадент, Россия). Биоматериалы помещают в питательную среду Кода (peг. удостоверение РЗН 2013/699, ТУ 20.59.52-222-19862939-2018), разлитую по микропробиркам типа Эппендорф, в объеме 1,8 мл. Микропробирки инкубируют в термостате ТС-80 (Анкар, Россия) в течение 24 ч при температуре 37°С. После этого оценивают изменение цвета и мутности питательной среды Кода. В случае сохранения исходного зеленого цвета и прозрачности среды Е. coli и БГКП в пробе отсутствуют. Изменение цвета на интенсивный желтый с образованием пузырьков газа и помутнения среды в пробе свидетельствуют о присутствии Е. coli и БГКП [Патент РФ на изобретение № 2732412, Заявка 2020108748, 27.02.2020, Опубликовано: 16.09.2020 Бюл.№26].

Недостатками данного способа являются низкая чувствительность и специфичность метода, а также отсутствие условий для культивирования специфичной для полости рта микрофлоры, в том числе анаэробных микроорганизмов.

Известен способ культивирования бактерий рода Leptotrichia - резидентов микрофлоры полости рта, осуществляемый следующим образом: после забора клинического материала из полости рта пациента в кабинете стоматолога его помещают в транспортную среду для анаэробов и в течение 1-2 часов доставляют в бактериологическую лабораторию. Из полученного материала делают разведения 10^-3-10^-5стерильным 0,85% раствором NaCl. Первичный посев материала из приготовленных разведений осуществляют калиброванной бактериологической петлей (0,2 мм, емкость 0,005 мл) на поверхность пластинчатой среды «Уриселект» методом секторных посевов на четыре сектора, каждый раз обжигая петлю, в 90 мм чашки Петри и далее инкубируют первичные посевы в анаэробных и микроаэрофильных (5%-10% СО₂) условиях, t_opt=+35+37°С в течение 48-72 часов. В случае отсутствия роста чашки повторно выдерживались еще 24 часа для исключения ложноотрицательных результатов, вызванных недостаточной инкубацией [Патент РФ на изобретение № 2441908, Заявка 2010110394/10, 18.03.2010, Опубликовано: 10.02.2012 Бюл.№4].

Недостатками данного способа являются отсутствие в предлагаемой схеме питательных сред для культивирования анаэробов, что ограничивает возможности их выделения из биоматериала.

Известен способ прогнозирования негативных последствий в полости рта при ортодонтическом лечении зубочелюстных аномалий несъемной техникой, осуществляемый следующим образом: проводят забор зубной бляшки пациента до чистки зубов и помещают в тиогликолевую питательную транспортную среду для последующей транспортировки. Готовят серию двукратных разведений исходного материала 10^-2-10^-12 для посева микроорганизмов на соответствующие питательные среды на 5% кровяной агар с азидом натрия, на 5% кровяной гемин-агар для выявления стрептококков. Культивирование проводят при температуре 37°C. После термостатирования осуществляют количественный подсчет колоний каждого вида с учетом посевной дозы и степени разведения биосубстрата. Видовую идентификацию выделенных чистых культур микроорганизмов осуществляют на основании изучения их морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и антигенных свойств в соответствии с определителем Берджи (Дж. Хоулт, 1997). Проводят оценку количественной и качественной характеристики стрептококков полости рта. Количественное содержание оральных стрептококков S. mutans и S. sanguis определяют бактериологическим методом микробиологического исследования, концентрацию выражают через десятичный логарифм величины выросших колоний (lg КОЕ/мл). Интерпретацию полученных данных проводят в соответствии с методическими рекомендациями по бактериологической диагностике (РФ отраслевой стандарт ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника») [Патент РФ на изобретение № 2639476, Заявка 2014124674, 17.06.2014, Опубликовано: 21.12.2017 Бюл.№36].

Недостатками данного способа являются отсутствие в предлагаемой схеме питательных сред для культивирования анаэробов, что ограничивает возможности их выделения из биоматериала.

За прототип принимается способ первичного посева биоматериала, выделенного из полости рта пациентов с муковисцидозом при стоматологическом обследовании. Суть метода заключается в следующем: на поверхность двух чашек с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью, двух чашек с универсальной хромогенной средой, по одной чашке с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом, Veilonella-агаром, агаром для анаэробов, Clostridium-агаром, агаром для лактобактерий, агаром для бифидобактерий производится посев биоматериала из ротовой полости пациентов с муковисцидозом, взятого при стоматологическом обследовании, с использованием техники посева «штрихом»; на поверхность чашек с агаром Сабуро с хлорамфениколом производится посев гомогенизированного материала методом бляшек с последующей инкубацией при 28°С до 14 суток с ежедневными просмотрами посевов; затем по одной засеянной чашке с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью и с универсальной хромогенной средой инкубируются в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 часов с ежедневным просмотром посевов; чашки с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом инкубируются в аэробных условиях 24-48 часов при температуре 37°С, далее инкубируются до 14 суток при температуре 28°С с ежедневным просмотром посевов; по одной засеянной чашке с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью и с универсальной хромогенной средой, а также чашки с Veilonella-агаром, агаром для анаэробов, Clostridium-агаром, агаром для лактобактерий, агаром для бифидобактерий инкубируются в анаэробных условиях 120 часов при температуре 37°С с просмотром после окончания срока инкубирования [Патент РФ на изобретение № 2779641, Заявка 2022105520, 01.03.2022, Опубликовано: 12.09.2022 Бюл.№26].

Недостатками данного способа являются посева методом «штриха», что исключает выделение микроорганизмов в титрах менее 10³, а также затрудняет выделение микроорганизмов в случае большой микробной нагрузки в биологическом материале; набор предложенных сред не предусмотрен для выделения большого видового разнообразия облигатно анаэробных микроорганизмов, имеющих наибольшее клиническое значение при пародонтопатогенных процессах.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является улучшение диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний пародонта бактериальной этиологии путем получения в первичном посеве отделяемого из полости рта от пациентов с пародонтитом максимального количества видов клинически значимых микроорганизмов.

Это достигается тем, что в отличие от известных способов первичного посева отделяемого из полости рта одноразовым стоматологическим зондом проводится взятие биоматериала из пародонтального кармана пациента с пародонтитом. Далее одноразовый зонд с биоматериалом помещается в пробирку с 2 мл тиогликолиевой питательной транспортной среды, что позволяет сохранить жизнеспособность аэробных и анаэробных микроорганизмов и в течение 2 часов доставляется в бактериологическую лабораторию, где проводится посев на 7 питательных сред: 5% кровяной агар с дефибринированной бараньей кровью [Atlas, Ronald M., 1946-. Handbook of microbiological media. - Taylor & Francis, 2010-01-01.], универсальную хромогенную среду [1. Pezzlo M (1998), Clinical Microbiology Reviews 1:268-280; 2.Wilkie M.E.,Almond M.K.,Marsh F.P.(1992),British Medical Journal 305:1137-1141; 3.Friedman M.P. et al (1991), Journal of Clinical Microbiology, 29:2385-2389; 4.Murray P., Traynor P. Hopson D., (1992), Journal of Clinical Microbiology 30:1600-1601; 5.Soriano F., Ponte C., (1992), Journal of Clinical Microbiology 30:3033-3034; 6.Merlino et al (1995) Abstr. Austr. Microbiol. 16(4):17-3.], Veilonella-агар [Регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2009/03709], агар для анаэробов [Регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2009/03707], Clostridium-агар [Регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2009/03707], агар для лактобактерий [Регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2009/03709], Brucella-агар с добавлением 7% дефибринированной бараньей крови [Регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2009/03709]. Дополнительно на чашки Петри с питательными средами помещают диски с антибактериальными препаратами: ампициллин 10 мкг, ципрофлоксацин 5 мкг, эритромицин 15 мкг; далее засеянные чашки с дисками с антибактериальными препаратами инкубируются в анаэробных условиях в течение 120 часов при температуре 37°С.

Технический результат изобретения заключается в том, что заявленный способ первичного посева позволяет одномоментно выделить максимальное количество микроорганизмов, имеющих клиническое значение в развитии стоматологических заболеваний, в частности кариеса и заболеваний пародонта: бактерии родов Capnocytophaga spp., Eikenella spp., Veilonella spp., Actinomyces spp., Aggregatibacter spp, Streptococcus spp., Porphyromonas spp., Campylobacter spp., Fusobacterium spp., Eubacterium spp., Prevotella spp., большинство из которых является трудно культивируемыми облигатными анаэробами.

Осуществление изобретения

Сущность предложенного метода заключается в следующем: одноразовым стоматологическим зондом проводится взятие биоматериала из пародонтального кармана пациента с пародонтитом. Далее одноразовый зонд с биоматериалом помещается в пробирку с 2 мл тиогликолиевой питательной транспортной среды, что позволяет сохранить жизнеспособность аэробных и анаэробных микроорганизмов и в течение 2 часов доставляется в бактериологическую лабораторию. В бактериологической лаборатории отобранный материал вортексируется, отбирается по 50 мкл тиогликолиевой питательной среды и засевается на поверхность чашек Петри со всеми типами питательных сред: 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью, универсальной хромогенной средой, Veilonella-агаром, агаром для анаэробов, Clostridium-агаром, агаром для лактобактерий, Brucella-агаром с 7% дефибринированной бараньей кровью с использованием техники посева «газоном». Затем на поверхность питательных сред помещают диски с антибактериальными препаратами: ампициллин 10 мкг, ципрофлоксацин 5 мкг, эритромицин 15 мкг; далее засеянные чашки с дисками с антибактериальными препаратами инкубируются в анаэробных условиях в течение 120 часов при температуре 37°С.

В предложенном способе первичного посева биоматериала, выделенного из полости рта пациентов с болезнями пародонта при стоматологическом обследовании предусмотрены оптимальные условия для выделения клинически значимых микроорганизмов: набор из 7 питательных сред, инкубация в анаэробных условиях позволяют выявить максимальное количество видов неприхотливых и трудно культивируемых микроорганизмов; добавление 3 дисков с антибактериальными препаратами при культивировании засеянных чашек в анаэробных условиях ингибирует рост нормальной микрофлоры слизистой полости рта, способной подавить выделение клинически значимых бактерий.

Осуществление предлагаемого способа можно продемонстрировать на следующих примерах:

Пример 1.

Пациент Н., 45 лет. Диагноз: хронический пародонтит. В лабораторию поступил материал, полученный при стоматологическом исследовании - отделяемое пародонтального кармана. Произведен первичный посев двумя способами: способом, описанном в прототипе, а также предлагаемым нами способом. Были получены следующие результаты:

Способ посева, указанный в прототипе Предлагаемый нами способ 5% кровяной агар с дефибринированной бараньей кровью Streptococcus oralis 10⁴
Streptococcus parasanguinis 10³ Streptococcus oralis 10⁴
Streptococcus mitis 10⁴
Streptococcus constellatus 10⁴
Aggregatibacter aphrophilus 10⁴ Универсальная хромогенная среда Streptococcus oralis 10⁵
Streptococcus mitis 10⁴
Streptococcus parasanguinis 10³ Streptococcus oralis 10⁴
Streptococcus mitis 10³
Streptococcus parasanguinis 10⁴
Streptococcus constellatus 10⁴ Veilonella-агар Neisseria perflava 10³
Veilonella parvula 10⁴ Neisseria perflava 10³
Veilonella parvula 10⁴
Lactobacillus salivarius 10⁴ Агар для анаэробов Streptococcus anginosus 10³
Streptococcus oralis 10³
Actinomyces odontolyticus 10³ Capnocytophaga ochracea 10⁴
Eikenella corrodens 10⁴
Streptococcus anginosus 10⁴
Streptococcus oralis 10⁴
Actinomyces odontolyticus 10³ Clostridium-агар Streptococcus anginosus 10⁴
Streptococcus constellatus 10⁴ Streptococcus anginosus 10⁴
Capnocytophaga ochracea 10⁴
Streptococcus constellatus 10³
Actinomyces odontolyticus 10⁴ Агар для лактобактерий Lactobacillus salivarius 10⁴ Streptococcus gordonii 10⁴
Eikenella corrodens 10⁴
Lactobacillus salivarius 10⁴ - Brucella-агар с 7% дефибринированной бараньей кровью - Eikenella corrodens 10⁵
Aggregatibacter aphrophilus 10⁵
Leptotrichia hofstadii 10⁴
Prevotella intermedia 10⁴

Таким образом, благодаря применению предлагаемого нами способа был получен рост 15 видов микроорганизмов на питательных средах, в то время как при использовании способа, указанного в прототипе, был получен рост 10 видов микроорганизмов. При использовании предлагаемого нами способа посева был получен рост клинически значимой анаэробной парадонтопатогенной флоры - Aggregatibacter aphrophilus, Capnocytophaga ochracea, Prevotella intermedia, Streptococcus gordonii, что было бы невозможно получить при использовании только перечня питательных сред, указанного в прототипе, а также без применения дисков с антибактериальными препаратами ввиду метаболических особенностей, указанных микроорганизмов.

Пример 2:

Пациент Т., 54 года. Диагноз: хронический пародонтит. В лабораторию поступил материал, полученный при стоматологическом исследовании - отделяемое пародонтального кармана. Произведен первичный посев двумя способами: способом, описанном в прототипе, а также предлагаемым нами способом. Были получены следующие результаты:

Способ посева, указанный в прототипе Предлагаемый нами способ 5% кровяной агар с дефибринированной бараньей кровью Streptococcus vestibularis 10⁵
Staphylococcus aureus 10⁴ Streptococcus constellatus 10⁴
Rothia dentocariosa 10⁵ Streptococcus vestibularis 10⁵
Staphylococcus aureus 10³
Streptococcus constellatus 10⁴
Rothia dentocariosa 10⁵
Fusobacterium nucleatum 10³
Porphyromonas gingivalis 10³ Универсальная хромогенная среда Streptococcus vestibularis 10⁴
Staphylococcus aureus 10³
Rothia dentocariosa 10⁴ Streptococcus vestibularis 10⁵
Staphylococcus aureus 10³
Rothia dentocariosa 10⁵ Veilonella-агар Veilonella parvula 10⁴ Veilonella parvula 10⁴
Veilonella atypica 10³ Агар для анаэробов Actinomyces odontolyticus 10³
Streptococcus constellatus 10⁴ Actinomyces odontolyticus 10³
Streptococcus constellatus 10⁴
Actinomyces oris 10³ Clostridium-агар Actinomyces odontolyticus 10³
Streptococcus constellatus 10³ Actinomyces odontolyticus 10³
Streptococcus constellatus 10⁴ Агар для лактобактерий Lactobacillus salivarius 10⁴
Lactobacillus fermentum 10³ Lactobacillus salivarius 10³
Lactobacillus fermentum 10⁴ - Brucella-агар с 7% дефибринированной бараньей кровью - Actinomyces oris 10⁴
Actinomyces odontolyticus 10⁴
Aggregatibacter aphorophilis 10³
Streptococcus intermedius 10⁵
Fusobacterium nucleatum 10⁴
Porphyromonas gingivalis 10³

Таким образом, благодаря применению предлагаемого нами способа был получен рост 14 видов микроорганизмов на питательных средах, в то время как при использовании способа, указанного в прототипе, был получен рост 10 видов микроорганизмов. При использовании предлагаемого нами способа посева был получен рост клинически значимой анаэробной парадонтопатогенной флоры - Veilonella atypica, Aggregatibacter aphrophilus, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus intermedius, Porphyromonas gingivalis что было бы невозможно получить при использовании только перечня питательных сред, указанного в прототипе, а также без применения дисков с антибактериальными препаратами ввиду метаболических особенностей, указанных микроорганизмов.

Предлагаемый способ позволяет оценить качественный и количественный состав микрофлоры слизистых оболочек ротовой полости, выявлять и дифференцировать парадонтопатогенные виды бактерий, что способствует оптимизации терапии пациентов с заболеваниями тканей пародонта.

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и стоматологии, в частности к способу первичного посева отделяемого из пародонтальных карманов. Изобретение позволяет улучшить диагностику инфекционно-воспалительных заболеваний пародонта бактериальной этиологии путем получения в первичном посеве отделяемого из пародонтальных карманов от пациентов с пародонтитом максимального количества видов клинически значимых микроорганизмов. 2 пр.

Способ первичного посева отделяемого из пародонтальных карманов, включающий взятие биоматериала из пародонтального кармана пациента с пародонтитом, отличающийся тем, что одноразовый зонд с биоматериалом помещается в пробирку с 2 мл тиогликолиевой питательной транспортной среды и в течение 2 часов доставляется в бактериологическую лабораторию, где после вортексирования проводится посев материала из тиогликолевой среды в объеме по 50 мкл на каждую из 7 питательных сред: 5% кровяной агар с дефибринированной бараньей кровью, универсальную хромогенную среду, Veilonella-агар, агар для анаэробов, Clostridium-агар, агар для лактобактерий, Brucella-агар с добавлением 7% дефибринированной бараньей крови; после посева на поверхность питательных сред помещают диски с антибактериальными препаратами: ампициллин 10 мкг, ципрофлоксацин 5 мкг, эритромицин 15 мкг; далее засеянные чашки с дисками с антибактериальными препаратами инкубируются в анаэробных условиях в течение 120 часов при температуре 37°С.