Способ криоконсервации аутологичных вагинальных лактобацилл Российский патент 2023 года по МПК C12N1/04 C12N1/20 C12R1/225 

Изобретение относится к области медицины, а именно к биотехнологии, микробиологии, акушерству и гинекологии и предназначено для криоконсервации аутологичных вагинальных лактобацилл.

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано при изучении микрофлоры человека, микробиологической диагностики дисбиотических нарушений (бактериального вагиноза) и инфекционных заболеваний влагалища, а также с целью сохранения бактерий в рабочей коллекции для проведения микробиологических исследований.

Изобретение можно также отнести к области биотехнологии, в частности, к способам сохранения бактерий во влагалищной жидкости человека и бактерий в условиях низких температур, в том числе в условиях криоконсервации.

Изобретение можно также отнести к области акушерства и гинекологии, в частности, к способам сохранения микробиоты влагалища с целью последующего создания аутопробиотиков для лечения инфекционных заболеваний и дисбиотических нарушений женского репродуктивного тракта; также криоконсервированная нормальная вагинальная микробиота может использоваться для трансплантации с целью лечения инфекционных заболеваний и дисбиотических нарушений женского репродуктивного тракта.

Микробиоценоз влагалища женщин – сложная динамично развивающаяся гормонально зависимая экосистема, которая претерпевает изменения в течение всей жизни женщины [1]. Отличительной особенностью вагинальной микробиоты репродуктивного периода является многокомпонентность состава, определяемого ее резидентной и транзиторной составляющими. К облигатным резидентным микроорганизмам влагалища здоровой женщины относятся лактобациллы, которые абсолютно доминируют, составляя 95-98% микробного пула. Основными биологическими свойствами представителей рода Lactobacillus, обеспечивающими колонизационную резистентность вагинального биотопа, являются адгезивная и антагонистическая активность, а также устойчивость к повышенной кислотности (рН) среды. Антагонистические свойства лактобацилл связаны с продукцией органических кислот (молочной), перекиси водорода и антимикробных субстанций белковой природы, подобных антибиотикам (бактериоцинов) [2,3]. Транзиторная составляющая микробиоты здоровых женщин, представленная условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), в силу конкурентного сдерживания колонизирует влагалище в низких титрах и ее присутствие рассматривается как вариант нормы. Под влиянием эндогенных и экзогенных воздействий на организм женщины может происходить нарушение состояния гармоничного равновесия между лактобациллами и УПМ, что приводит к дисбалансу микрофлоры и развитию инфекционного процесса. Наиболее значимыми инфекциями влагалища, вызванными УПМ, считают бактериальный вагиноз, аэробный вагинит, кандидозный вульвовагинит, а также их сочетание. Оппортунистические инфекции влагалища характеризуются полиэтиологичностью и частым рецидивированием. В настоящее время существует значительное разнообразие методов лечения оппортунистических инфекций влагалища и вульвы. Однако вопрос безопасной и эффективной профилактики остается открытым. Широкое распространение получило использование пробиотических препаратов для лечения и профилактики оппортунистических вагинальных инфекций, однако большинство существующих пробиотиков создано на основе лактобацилл кишечного происхождения, которые не приживаются в вагинальном биотопе, а лишь временно создают условия для поддержки собственной лактофлоры. В настоящее время все более актуальным становится возможность использования собственной протективной микрофлоры для восстановления нормобиоты влагалища [4, 5]. Однако технология получения, длительного хранения и оценки сохранности функциональных свойств аутологичных лактобацилл отработаны недостаточно.

Предлагаемое техническое решение позволяет сохранять бактерии в вагинальной жидкости женщины в естественных условиях и бактериальные культуры (протективные лактобациллы), выделенные из микробиоты влагалища, в условиях низких температур, в том числе в условиях криоконсервации. Методика отвечает критериям высокой выживаемости бактерий, а также сохранения исходного соотношения различных групп микроорганизмов после размораживания.

Изобретение относится к области медицины, а именно производственной и клинической микробиологии, акушерству и гинекологии и может быть использовано для заготовки полезных микроорганизмов для длительного хранения, пригодных к трансплантации, а также созданию аутопробиотиков.

Проблема сохранения микробиоты влагалища человека охватывает как медицинские, так и микроэкологические аспекты сохранения биоразнообразия микроорганизмов для последующего использования в промышленных и биомедицинских технологиях.

В настоящее время самым надежным во многих отношениях способом сохранения микробиоты влагалища человека является замораживание и сохранение симбиотических микробных сообществ в условиях низких температур, в том числе в жидком азоте.

Однако, несмотря на значительные достижения криомикробиологии, проблема замораживания и сохранения при низких (минус 80°–95°С) и экстремально низких (в жидком азоте минус 196°С) температурах сложных микробиоценозов до сих пор не решена. Отсутствие общепринятого универсального способа криоконсервации для широкого спектра микроорганизмов, населяющих женский репродуктивный тракт, делает проблему криоконсервации чрезвычайно актуальной в плане сохранения микроэкологических ресурсов человека. Уже сейчас можно однозначно сказать, что низкотемпературная консервация сложных симбиотических сообществ влагалища возможна, несмотря на индивидуальную вариабельность по количеству и соотношению микроорганизмов в составе микробиома в зависимости от возраста, локализации, образа жизни и состояния здоровья женщины.

Уровень техники

Известен способ замораживания бактерий, предусматривающий отделение бактерий центрифугированием, смешивание суспензии бактериальных клеток с защитной средой в соотношении 1:1, содержащей глицерин, сахарозу, лимоннокислый натрий и замораживание полученной смеси в жидком азоте в виде гранул. Бактериальный концентрат, полученный таким способом, сохраняет свою активность в течение 6 месяцев при температуре не выше -18°С (авторское свидетельство СССР №457727, 25.01.1975). Недостаток этого изобретения заключается в том, что при оттаивании бактерий необходимо использовать центрифугирование для отделения бактериальных клеток от криозащитной среды. Однако при использовании этого способа криозаморозки в процессе хранения происходит слипание гранул, что затрудняет процесс получения исходного титра бактериальных культур.

Известен Способ длительного хранения естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных путем замораживания бактерий в гранулах с применением стерильного расплавленного 10%-ного раствора желатина в 0,9% физиологическом растворе (NaCl). Суспензию содержимого толстой кишки смешивают с 10%-ным раствором желатина в отношении 1:1 для формирования при замораживании желатиновых шариков с достаточным количеством бактериальных клеток. Для создания анаэробных условий азот продувают через подготовленный раствор с клетками. Суспензию бактериальных клеток при помощи дозатора по 50 и/или 100 мкл наносят на охлажденную в парах жидкого азота фторопластовую пластину. Получившиеся замороженные гранулы "сбрасывают" в жидкий азот, собирают в находящиеся в азоте промаркированные пластиковые пробирки с завинчивающимися крышками и переносят на сохранение в сосуды Дьюара с жидким азотом (криохранилище) (RU 2123044, 10.12.1998).

Недостатком данного способа является необходимость создания анаэробных условий путем продувания клеток через пары жидкого азота; хранение должно осуществляться только в жидком азоте, и, следовательно, требует наличия криохранилищ; при оттаивании бактериальные клетки должны быть освобождены от желатина.

Известен способ замораживания молочнокислых бактерий, предусматривающий смешивание в соотношении 1:1 молочнокислых бактерий с защитной средой, содержащей глицерин и лимоннокислый натрий и замораживания полученной смеси в жидком азоте в виде гранул, отличием которого от предыдущего изобретения является то, что защитную среду готовят на основе фосфатного буфера с рН 7,2. При этом дополнительно в защитную среду вводят лактозу и желатин, обеспечивающие исключение слипания гранул молочнокислых бактерий после оттаивания (RU 2427624, 28.08.2011). Недостаток способа заключается в том, что при оттаивании необходимо использовать центрифугирование для отделения бактериальных клеток от криозащитной среды, что затрудняет процесс получения исходного титра бактериальных культур.

Известен способ консервирования молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii (RU 2475527, 20.02.2013).

Изобретение относится к микробиологии, в частности к консервированию молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii. Способ предусматривает получение суспензии бактерий в жидкой питательной среде, отделение бактерий от суспензии центрифугированием с получением биомассы, смешивание полученной биомассы с защитной средой, содержащей сахарозу и глицерин, и замораживание полученной смеси при температуре (-18- - 20°С). Жидкая питательная среда содержит компоненты в следующем соотношении, мас.%: (10-12) - сахароза, (3-5) - солодовые ростки и (4-6) - мел. Смесь биомассы с защитной средой перед замораживанием охлаждают при температуре 4-6°С, выдерживают при данной температуре в течение 1 ч. Способ обеспечивает повышение биосинтетической активности молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii при консервировании замораживанием и последующем хранении.

Известен способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте и бактериальных культур, выделенных из фекальной микробиоты, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах. Способ включает смешивание 0,1 г пробы в криопробирке на 2 мл в соотношении 1:2 с криозащитной средой, состоящей из дистиллированной воды 500 мл, бактериологического сухого Европейского агара 2 г, NaCl 2,5 г, дрожжевого экстракта 1 г, L-цистеина 0,2 мг, панкреатического гидролизата казеина 8,5 мг, декстрозы 5 г с добавлением 10% глицерина, перемешивание на вортексе в течение 2-5 мин. Завинченные крышкой криопробирки помещают в соответствующее хранилище. Оттаивание криопробирок производят непосредственно перед проведением исследований. Способ обеспечивает сохранение титра и жизнеспособности бактерий при хранении в условиях низких температур (RU 2737321, 27.11.2020).

Недостататок этого способа заключается в том, что он используется для криоконсервирования вида Lactobacillus delbrueckii - вида лактобацилл, обитающего в кишечном биотопе и редко встречающегося в составе вагинальной микробиоты (сопутствующий вид, выделяемый всегда в низких титрах), не пригодно для длительного криохранения вагинальных лактобацилл и их консорциумов из-за относительно высоких температур хранения (-18 – -20°С). Кроме того, используемая криозащитная среда не обеспечивает хранение культур специфического вагинального вида Lactobacillus iners.

Криопротекторы – это вещества, предназначенные предотвращать повреждения бактериальных клеток при охлаждении, замораживании, последующем хранении и оттаивании. Механизм защитного действия криопротекторов основан на создании ими более прочной связи с молекулами воды, что препятствует формированию правильной кристаллической решетки льда и задерживает начало роста кристаллов. Криопротекторы могут оказывать на клетки токсическое действие, величина которого зависит от температуры и длительности экспозиции клеток с криопротектором. Поэтому, как правило, сразу после оттаивания криопротектор удаляют из бактериальных клеток путем последовательных отмываний и центрифугирования. Имеются данные о замораживании микробиоты кишечника человека до криогенных температур -70°С, -196°С в криозащитных средах с глицерином, диметилсульфоксидом (ДМСО), природными и синтетическими полимерными веществами. Глицерин и ДМСО легко проходят через клеточную мембрану и обеспечивают как внутриклеточную, так и внеклеточную защиту от замораживания. Выбор криопротектора или их комбинации, а также выбор правильного режима заморозки и размораживания являются основой технологической разработки сохранения микроорганизмов симбиотической микробиоты человека в условиях криоконсервации при низких температурах, рассчитанной на длительное хранение микроэкологических ресурсов в криобанке.

В настоящее время в основном используют эмпирические подходы для подбора режимов замораживания и оттаивания конкретных объектов, так как выживаемость и стойкость бактерий при замораживании в жидком азоте зависит от ряда факторов, в частности, от вида бактериальных клеток и их концентрации в суспензии, чувствительности бактерий к замораживанию и оттаиванию в зависимости от их таксономической принадлежности. Важное значение имеют физико-химические свойства, количественное содержание бактерий и ряд других свойств бактериальной биомассы, подлежащей замораживанию; состав защитной среды для криозамораживания (для сохранения бактерий при замораживании существенным является выбор защитной среды, природы и химического строения присутствующего в ней криопротектора и физико-химические особенности его взаимодействия с компонентами жидкой и твердой фаз замораживаемых бактериальных клеток); режим охлаждения (при замораживании бактериальных клеток происходит образование микрокристаллов льда как внутри бактериальных клеток, так и снаружи, при этом характер их изменений зависит от свойств криопротектора, и, главным образом, от скорости охлаждения); режим хранения (при температуре минус 70°С или в жидком азоте при температуре минус 196°С). Существуют разные точки зрения на процесс замораживания живых клеток. Считается, что при медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию бактериальной клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении бактериальные клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. Наилучший эффект достигается обычно при замораживании в жидком азоте при температуре минус 196°С. Существует мнение, что лучшие результаты по выживанию и восстановлению бактериальных культур могут быть получены в случае медленного охлаждения клеток, например со скоростью 1°С/мин.

Технология медленного охлаждения, следующая:

– ампулы или криопробирки с культурой помещают в алюминиевый контейнер, который вставляют в картонную или пластиковую коробку; коробку ставят в морозильную камеру автоматического низкотемпературного холодильника и устанавливают определенную скорость охлаждения; замораживают клетки при контролируемой скорости охлаждения 1°С/мин до минус 30°С, а затем при значительно большей скорости (15–30°С/мин) – до минус 150°С; после достижения этой температуры ампулы переносят в сосуд с жидким азотом и хранят в нем при температуре минус 196°С или над ним в парах азота при температуре минус 150°С. С помощью более современного оборудования, каким, например, является автоматизированная система замораживания и хранения BioArchive, пробы консервируют следующим образом: клеточный материал, подготовленный к хранению, закладывает в специальные пластиковые контейнеры; пластиковые контейнеры помещают в программный замораживатель, где начинается процесс охлаждения по специальной программе, которую можно менять по необходимости. Если нет программируемого холодильника или автоматизированной системы охлаждения медленного охлаждения проб добиваются следующим путем: стеклянные ампулы или пластиковые криопробирки с культурой помещают на 1 час в морозильную камеру при температуре минус 60°С; затем погружают их на 5 минут в баню с жидким азотом. Скорость охлаждения при этом составляет приблизительно 1,5°С/мин; после этого пробы помещают на хранение в криохранилище с парами жидкого азота (температура минус 196°С).

Анализ известных технических решений из уровня техники показал, что на данный момент наиболее близкий аналог относительно предлагаемого технического решения не выявлен.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является создание технологии для обеспечения сохранения исходного титра микроорганизмов после замораживания и оттаивания; способ длительного сохранения бактерий для перспективных научных исследований микробиома, создания аутопробиотиков и трансплантации полезной вагинальной микробиоты.

Задачей изобретения является разработка технологии отбора образцов вагинальной жидкости, выделения чистых культур протективных лактобацилл, криоконсервирования бактерий влагалища человека и их длительного хранения с высокой сохранностью полноценных биологических свойств микроорганизмов для последующего их использования после размораживания для производства аутопробиотиков, трансплантации или проведения исследовательских работ.

Достигаемым при использовании предлагаемого изобретения техническим результатом является создание модели отбора проб вагинальной жидкости и оптимальных условий сохранения бактерий из влагалища человека или бактериальных культур, выделенных из влагалища человека, выращенных на плотных или жидких универсальных или селективных питательных средах и последующего их хранения в условиях низких температур (-80°С и -196°С), для обеспечения сохранности микроорганизмов после замораживания и оттаивания (разморозки).

Ниже представлено подробное описание заявляемого способа криоконсервирования вагинальной микробиоты с указанием в некоторых случаях конкретных значений параметров, которые не ограничивают заявляемое изобретение, а представлены лишь для лучшего понимания сущности изобретения. Поставленная задача и технический результат решаются тем, что способ криоконсервации вагинальной микробиоты включает следующие этапы:

1.Отбор проб вагинальной жидкости.

Осуществляют отбор исходных (нативных) образцов вагинальной жидкости в количестве 1-3 мл с помощью ватного (дакронового) микробиологического тампона (пипетки, аппликатора, ложки Фолькмана) с предполагаемой концентрацией общей бактериальной массы не менее 10⁷ КОЕ/мл (ГЭ/мл) по данным предварительного культурального исследования или ПЦР в режиме реального времени, содержащих 50-90% биологически активных видов Lactobacillus spp в количестве 10^7-8 КОЕ/мл (ГЭ/мл). Полученную вагинальную жидкость в соотношении 1:2-5 суспендируют в специальной комбинированной криопротективной среде, состоящей из триптиказо-соевого бульона (BBL, USA) (на 1 литр дистиллированной воды: панкреатический гидролизат казеина – 17,0 г; папаиновый гидролизат соевой муки – 3,0 г; натрия хлорид – 5,0 г; дикалий фосфат – 2,5 г; декстроза – 2,5 г) или МРС бульон (MRS Broth) (HIMEDIA, Индия) (на 1 литр дистиллированной воды: протеозопептон - 10 г, мясной экстракт - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, глюкоза - 20 г, твин 80 - 1 г, аммония цитрат - 2 г, натрия ацетат - 5 г, магния сульфат - 0,1 г, марганца сульфат - 0,05 г, натрия гидрофосфат -2 г) с добавлением 10% глицерина в качестве криопротектора.

2. Фракционирование нативного материала. Можно сделать зависимый пункт

В случае недостаточного количества вагинального отделяемого готовят смыв посредством введения во влагалище 2-4-мл стерильного 0,9% физиологического раствора (0,9% NaCl). Пробирку, содержащую смывную вагинальную жидкость, центрифугируют со скоростью 5000 об/мин. в течение 10 минут, удаляют супернатант, осадок ресуспендируют в 1-2 мл криозащитной среды того же состава.

3. Приготовление криозащитной среды.

В стерильную ростовую среду добавляют стерильный глицерин (криопротектор) в объеме 10%. Для приготовления 100 мл криозащитной среды используют 90 мл стерильной ростовой среды (триптиказо-соевый бульон или жидкая среда МРС) добавляют 10 мл стерильного глицерина. Глицерин стерилизуют автоклавированием в течение 15 мин при давлении 10⁴ Па.

1. Подготовка бактериальной массы к замораживанию и ее хранение.

Полученные вагинальные образцы в криозащитной среде тшательно перемешивают с помощью лабораторного вихревого смесителя «Вортекс» (2-3 минуты), разливают по 1 мл в криопробирки и замораживают при минус 80°С в условиях низкотемпературного холодильника без использования специальных условий (скорости) замораживания или при - 196°С в жидком азоте с использованием техники медленного охлаждения.

При хранении образцов при - 196°С в жидком азоте для получения хороших результатов по выживанию и восстановлению бактериальных культур используют медленное охлаждение клеток, например со скоростью 1°С/мин. Технология медленного охлаждения следующая: криопробирки с вагинальными биообразцами в криозащитной среде помещают пластиковый контейнер и переносят в морозильную камеру автоматического низкотемпературного холодильника и устанавливают определенную скорость охлаждения; замораживают клетки при контролируемой скорости охлаждения 1°С/мин до минус 30°С, а затем при значительно большей скорости (15–30°С/мин) – до минус 150°С; после достижения этой температуры криопробирки переносят в хранилище с жидким азотом и хранят в нем при температуре минус 196°С. При наличии более современного оборудования, например, автоматизированной системы замораживания и хранения BioArchive, пробы консервируют следующим образом: клеточный материал, подготовленный к хранению, закладывают в специальные пластиковые контейнеры, помещают в программный замораживатель, где начинается процесс охлаждения по специальной программе, которую можно менять по необходимости. Если нет программируемого холодильника медленного охлаждения проб добиваются следующим путем: криопробирки с культурой в лотке из нержавеющей стали помещают на 1 ч в морозильник при температуре минус 60°С; затем погружают их на 5 мин в баню с жидким азотом. Скорость охлаждения при этом составляет приблизительно 1,5°С/мин; после этого пробы на хранение погружают непосредственно в криохранилище с жидким азотом (температура минус 196°С).

2. Замораживание и хранение чистых культур протективных лактобацилл.

Часть нативного материала - вагинальной жидкости засевают на селективные для большинства лактобацилл плотные (лактобакагар, ФБУН «ГНЦ ПМБ», Оболенск, Россия) питательные среды или, например, колумбийский агар (Oxoid, Великобритания) (для выделения лактобацилл вида Lactobacillus iners) и культивируют в условиях пониженного содержания кислорода в СО₂ инкубаторе или в анаэробном боксе в атмосфере трёхкомпонентной газовой смеси (N₂ – 80%; СО₂ – 10%; Н₂ – 10%) с последующим выделением чистых культур лактобацилл. Чистые культуры аутоштаммов лактобацилл, выделенные на плотных питательных средах и идентифицированные до вида методом матрично-активированной лазерной деcорбционно/ионизационной времяпролётной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS), смывают с помощью 0,9% физиологического раствора или жидкой ростовой среды, готовят инокулюм с концентрацией 4 единицы по МакФарланд (1,2×10⁹КОЕ/мл), центрифугируют при 5000 об/мин., супенатант удаляют и осадок ресуспендируют в криозащитной среде (триптиказо-соевый бульон или жидкая среда МРС с добавлением 10% глицерина). Полученную суспензию разливают по 1 мл в криопробирки, герметично закрывают и замораживают при -80°С или - 196°С, как описано выше.

3. Размораживание вагинальной жидкости с микробиологическим консорциумом или чистых культур лактобацилл.

Для быстрого восстановления культур сохраненные в пластиковых криопробирках образцы (вагинальной жидкости или чистых культур или их консорциума) размораживают быстрым нагреванием на водяной бане при температуре плюс 37°С в течение 60-120 секунд при слабом встряхивании непосредственно перед проведением исследований. Способ обеспечивает сохранение титра и жизнеспособности лактобацилл при хранении в условиях низких температур.

Контроль качества размороженных образцов вагинальной микробиоты и чистых культур лактобацилл

Для оценки качества заготовки и хранения получаемого продукта (аутологичных лактобацилл) при использовании технологии, составляющей предмет изобретения, использовали методики, позволяющие оценить выживаемость замороженных культур и основные биологические свойства. С этой целью проводили сравнительную оценку основных биологических свойств, определяющих колонизационную резистентность вагинального биотопа (уровень кислотообразования, продукцию перекиси водорода) у 10 штаммов лактобацилл, выделенных из первичного материала (стартовые характеристики), что важно при динамической оценке обозначенных биологических свойств в процессе хранения и для оценки качества конечного продукта.

Пример 1. Тестирование хранимоспособности (выживаемости культур) лактобацилл после криохранения.

Сохраняемые культуры аутологичных штаммов лактобацилл или их консорциум в криопробирках подвергают периодическим испытаниям на жизнеспособность. Определение числа жизнеспособных лактобацилл проводили методом конечных разведений [7]. Для быстрого восстановления культур сохраненные в пластиковых криопробирках образцы (вагинальной жидкости или чистых культур или их консорциума) размораживают быстрым нагреванием на водяной бане при температуре плюс 37°С в течение 60-120 секунд при слабом встряхивании непосредственно перед проведением исследований. Для определения количества жизнеспособных лактобацилл из размороженной (восстановленной) бактериальной суспензии готовили десятикратные серийные разведения. В стерильные пробирки разливали по 4,5 мл 0,9% стерильного физиологического раствора или жидкой питательной среды МРС. В первую пробирку добавляли 0,5 мл исходной бактериальной суспензии, далее в соответствии с правилом смены пипеток переносили 0,5 мл из меньшего разведения в большее. Всего готовили 5 десятикратных разведений. Производили посев 0,1 мл инокулюма каждого разведения в чашки Петри с питательной средой для культивирования лактобацилл (лактобакагар) и растирали стерильным шпателем от большего разведения к меньшему. Чашки с посевами инкубировали при температуре 37±1°С в течение 48 ч в атмосфере СО₂ инкубатора или анаэробного бокса. Через 48 часов проводили подсчет выросших колоний. Определение количества жизнеспособных клеток в образцах проводили в двух повторах. Общее число жизнеспособных клеток высчитывали по формуле:

X = а×10 ⁿ⁺¹, где

X - число колониеобразующих единиц бактерий в 1 мл пробы;

а - число колоний в учитываемом разведении.

n - учитываемое разведение.

Результаты оценки жизнеспособности аутологичных штаммов лактобацилл после криоконсервации в зависимости от использованной криозащитной среды и температурных условий хранения представлены в таблице 1. Результаты оценки жизнеспособности аутологичных штаммов лактобацилл после 1-го месяца криохранения с использованием триптиказо-соевого бульона в качестве основы криозащитной среды; таблице 2. Результаты оценки жизнеспособности аутологичных штаммов лактобацилл после 1-го месяца криохранения с использованием жидкой среды МРС в качестве основы криозащитной среды.

Полученные результаты оценки выживаемости чистых культур лактобацилл, выделенных из вагинального отделяемого женщин, с использованием двух разных криозащитных сред для криохранения и двух различных условий замораживания и хранения показали, что существенной разницы в выживаемости этих микроорганизмов в зависимости от указанных факторов не обнаружено.

Предлагаемый способ сохранения аутологичных штаммов лактобацилл: заморозки, хранения и разморозки (восстановления), позволяет сохранить их в высоком титре и обеспечить возможность восстановления жизнеспособности бактерий после хранения в условиях низких температур.

Сравнительная оценка биологических свойств аутологичных штаммов лактобацилл до криохранения и после криохранения

Пример 2. Оценка активности кислотообразования.

Активность кислотообразования определяли методом титрования [6]. В качестве закваски использовали стандартизованную стартовую концентрацию каждого исследуемого штамма лактобацилл: Lactobacillus jensenii (3 штамма), Lactobacillus gasseri (2 штамма), Lactobacillus crisрatus (4 штамма), Lactobacillus rhamnosus (1 штамм). Для закваски использовали инокулюм, приготовленный путем смыва стерильным физиологическим раствором (0,9% NaCL) чистых культур лактобацилл, выращенных в течение 48 часов на агаризованной питательной среде лактобакагар, концентрация которого соответствовала 2 единицам стандарта МакФарланд (6х10⁸КОЕ/мл). Закваску в объеме 1% вносили в пробирки со стерильным молоком 1,5% жирности и культивировали 48 ч при 37°С. К 10 мл полученного образца добавляли 20 мл дистиллированной воды и 3 капли фенолфталеина. Измерение кислотности проводили методом титрования в градусах Тернера (Т°) (Т° - величина, определяемая количеством 0,1 N раствора щелочи, пошедшей на титрование 100 мл исследуемого образца).

Показатель активности кислотообразования, выраженный в градусах Тернера /°Т/, вычисляли по формуле:

° Т= А×К×10, где

А - количество миллилитров 0,1N раствора натра едкого, пошедшее на титрование;

К - поправка к титру 0,1 М раствора натра едкого;

10 - поправочный коэффициент на массу анализируемой пробы.

Среднее значение активности кислотообразования рассчитывают для двух образцов

Результаты сравнительной оценки уровня кислотообразования аутологичными штаммами лактобацилл до и после криохранения показаны в таблице 3. Активность кислотообразования вагинальных штаммов лактобацилл до и после криохранения при использовании триптиказо-соевого бульона в качестве основы криозащитной среды и температурного режима - -80°С; таблице 4. Активность кислотообразования вагинальных штаммов лактобацилл до и после криохранения при использовании триптиказо-соевого бульона в качестве основы криозащитной среды и температурного режима - -196°С

Проведенные исследования показали, что кислотообразующая функция сохраненных штаммов при -80°С и -196°С сравнима с их кислотной активностью до замораживания, что указывает на хорошую сохранность их кислотообразующей функции при использовании предлагаемого способа сохранения аутологичных штаммов вагинальных лактобацилл.

Пример 3. Оценка продукции пероксида водорода (Н₂О₂).

Оценку способности продуцировать перекись водорода проводили при культивировании бактерий на плотной питательной среде, содержащей фермент пероксидазу и индикатор на кислород [7]. Для лактобацилл использовали лактобакагар, в который предварительно вносили 5 мг тетраметилбензидина (бензидина) и 0,5 мг пероксидазы хрена (на 20 мл агара). Культуры лактобацилл выращивали в условиях пониженного содержания кислорода (СО₂ инкубатор) или в анаэробных условиях при 37°С в течение 24-48 ч. Проводили количественный посев суспензии 10 штаммов вагинальных лактобацилл: готовили инокулят лактобацилл, выросших на плотном лактобакагаре (1 ед. по McFarland - 3х10⁸ КОЕ/мл), затем делали три последовательных десятикратных разведения в физиологическом растворе и 0,1 мл суспензии соответствующего разведения наносили на поверхность агаризованной среды с пероксидазой хрена и бензидином с последующим распределением по поверхности шпателем. При учете результатов оценивали наличие колоний, образующих пероксид водорода по синему цвету; колонии, не продуцирующие Н₂О₂ - бесцветные. Результаты показаны в таблице 5. Продукция перекиси водорода вагинальными штаммами лактобацилл до и после криохранения при использовании триптиказо-соевого бульона в качестве основы криозащитной среды и температурного режима - -80°С и -196°С.

Проведенное исследование показало, что показатели продукции перекиси водорода лактобациллами до криоконсервации и после криоконсервации -80°С и -196°С не изменились.

Сравнительная оценка биологических свойств аутологичных штаммов лактобацилл до и после криохранения показали, что условия хранения не повлияли на их биологические свойства.

Таким образом, предлагаемый способ сохранения аутологичных штаммов лактобацилл (подготовки культур, заморозки, хранения и разморозки) позволяет сохранить их жизнеспособность (высокий титр) и функциональную активность (биологические свойства).

Список цитированной литературы

1. Farage М., Miller K., Sober J. Dynamics of the vaginal ecosystem - Hormonal influences. Infect. Diseases: Research and Treatment 2010, 3: 1-15.

2. Martin R., Suarez J. Biosynthesis and Degradation of H2O2 by Vaginal Lactobacilli. 2010. Appl. Environ. Microbiol 76: 400-405.

3. Eschenbach D. A., Davick P. R., Williams B. L., Klebanoff S. J., Young-Smith, K., Critchlow, C. M., Holmes K. K. (1989). Prevalence of hydrogen peroxide-producing Lactobacillus species in normal women and women with bacterial vaginosis. J Clin Microbiol 27: 251–256.

4. Ван Ликуй. Использование пробиотиков и аутоштаммов лактобактерий в комплексном лечении бактериального вагиноза: автореф. дис. … канд. мед. наук. – М., 2006. – 22 с.

5. Мельников В. А., Стулова С. В., Тюмина О.В., Денисова Н.Г., Щукин В.Ю Аутотрансплантация лактобацилл в востановлении индивидуального биоценоза влагалища. Фундаментальные исследования, 2012, № 1, с 64–67.

6. ГОСТ 3624–92 Молоко и молочные продукты Титрометрические методы определения кислотности.

7. Методические указания, по санитарно-эпидемиологической оценке, безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов. Методические указания МУ 2.3.2.2789-10, Москва, 2011.

Таблица 1

Культура лактобацилл Исходный инокулюм замораживаемой культуры
(КОЕ/мл) Количество выросших колоний (КОЕ/мл) после заморозки при -80°С в двух повторностях Количество выросших колоний (КОЕ/мл) после заморозки при -196°С в двух повторностях 1 2 1 2 Lactobacillus jensenii 1 1,2×10⁹КОЕ/мл 5.3*10⁸ 4.5*10⁸ 6.0*10⁸ 5.7*10⁸ Lactobacillus jensenii 2 1,2×10⁹КОЕ/мл 6.3*10⁸ 5.5*10⁸ 6.2*10⁸ 6.1*10⁸ Lactobacillus jensenii 3 1,2×10⁹КОЕ/мл 7.2*10⁸ 6.5*10⁸ 6.9*10⁸ 6.7*10⁸ Lactobacillus gasseri 1 1,2×10⁹КОЕ/мл 4.5*10⁸ 4.8*10⁸ 4.9*10⁸ 5.0*10⁸ Lactobacillus gasseri 2 1,2×10⁹КОЕ/мл 3.9*10⁸ 3.7*10⁸ 4.0*10⁸ 4.1*10⁸ Lactobacillus crisрatus 1 1,2×10⁹КОЕ/мл 3.7*10⁸ 3.9*10⁸ 4.5*10⁸ 4.2*10⁸ Lactobacillus crisрatus 2 1,2×10⁹КОЕ/мл 6.3*10⁸ 6.3*10⁸ 6.5*10⁸ 6.7*10⁸ Lactobacillus crisрatus 3 1,2×10⁹КОЕ/мл 5.4*10⁸ 5.6*10⁸ 5.6*10⁸ 5.7*10⁸ Lactobacillus crisрatus 4 1,2×10⁹КОЕ/мл 6.0*10⁸ 6.3*10⁸ 6.5*10⁸ 6.3*10⁸ Lactobacillus rhamnosus 1,2×10⁹КОЕ/мл 6.3*10⁸ 6.1*10⁸ 6.4*10⁸ 6.2*10⁸

Таблица 2

Культура лактобацилл Исходный инокулюм замораживаемой культуры
(КОЕ/мл) Количество выросших колоний (КОЕ/мл) после заморозки при -80°С в двух повторностях Количество выросших колоний (КОЕ/мл) после заморозки при -196°С в двух повторностях 1 2 1 2 Lactobacillus jensenii 1 1,2×10⁹КОЕ/мл 5.7*10⁸ 5.5*10⁸ 6.2*10⁸ 5.8*10⁸ Lactobacillus jensenii 2 1,2×10⁹КОЕ/мл 6.5*10⁸ 6.0*10⁸ 6.3*10⁸ 6.4*10⁸ Lactobacillus jensenii 3 1,2×10⁹КОЕ/мл 7.2*10⁸ 7.5*10⁸ 6.9*10⁸ 7.1*10⁸ Lactobacillus gasseri 1 1,2×10⁹КОЕ/мл 4.3*10⁸ 4.5*10⁸ 4.9*10⁸ 5.1*10⁸ Lactobacillus gasseri 2 1,2×10⁹КОЕ/мл 4.3*10⁸ 4.1*10⁸ 4.2*10⁸ 4.1*10⁸ Lactobacillus crisрatus 1 1,2×10⁹КОЕ/мл 3.8*10⁸ 3.9*10⁸ 4.4*10⁸ 4.3*10⁸ Lactobacillus crisрatus 2 1,2×10⁹КОЕ/мл 6.5*10⁸ 6.4*10⁸ 6.5*10⁸ 6.4*10⁸ Lactobacillus crisрatus 3 1,2×10⁹КОЕ/мл 5.3*10⁸ 5.6*10⁸ 5.6*10⁸ 5.8*10⁸ Lactobacillus crisрatus 4 1,2×10⁹КОЕ/мл 6.1*10⁸ 6.3*10⁸ 6.4*10⁸ 6.3*10⁸ Lactobacillus rhamnosus 1,2×10⁹КОЕ/мл 6.4*10⁸ 6.3*10⁸ 6.4*10⁸ 6.5*10⁸

Таблица 3

Культура (соотношение закваска/молоко
Объем/ Объем = 1:100) Титр бактерий в закваске, КОЕ/мл Кислотность (градус Тернера, (Т°) (48 ч) при хранении при -80°С рН молока после культивирования (48 ч)
при хранении при -80°С До заморозки После заморозки До заморозки После заморозки Lactobacillus jensenii 1 6×10⁸КОЕ/мл 44 43 4,7 4,8 Lactobacillus jensenii 2 6×10⁸КОЕ/мл 52 50 4,5 4,5 Lactobacillus jensenii 3 6×10⁸КОЕ/мл 40 39 5,0 5,0 Lactobacillus gasseri 1 6×10⁸КОЕ/мл 51 50 4,5 4,5 Lactobacillus gasseri 2 6×10⁸КОЕ/мл 48 47 4,5 4,5 Lactobacillus crisрatus 1 6×10⁸КОЕ/мл 48 50 4,5 4,5 Lactobacillus crisрatus 2 6×10⁸КОЕ/мл 38 39 5,0 5,0 Lactobacillus crisрatus 3 6×10⁸КОЕ/мл 37 37 5,0 5,0 Lactobacillus crisрatus 4 6×10⁸КОЕ/мл 39 37 5,0 5,0 Lactobacillus rhamnosus 6×10⁸КОЕ/мл 67 68 4,0 4,0

Таблица 4

Культура (соотношение закваска/молоко
Объем/ Объем = 1:100) Титр бактерий в закваске, КОЕ/мл Кислотность (градус Тернера, (Т°) (48 ч) рН молока после культивирования (48 ч) До заморозки После заморозки До заморозки После заморозки Lactobacillus jensenii 1 6×10⁸КОЕ/мл 42 43 4,7 4,8 Lactobacillus jensenii 2 6×10⁸КОЕ/мл 52 51 4,5 4,5 Lactobacillus jensenii 3 6×10⁸КОЕ/мл 39 40 5,0 5,0 Lactobacillus gasseri 1 6×10⁸КОЕ/мл 51 50 4,5 4,5 Lactobacillus gasseri 2 6×10⁸КОЕ/мл 47 47 4,5 4,5 Lactobacillus crisрatus 1 6×10⁸КОЕ/мл 47 49 4,5 4,5 Lactobacillus crisрatus 2 6×10⁸КОЕ/мл 38 39 5,0 5,0 Lactobacillus crisрatus 3 6×10⁸КОЕ/мл 38 37 5,0 5,0 Lactobacillus crisрatus 4 6×10⁸КОЕ/мл 39 38 5,0 5,0 Lactobacillus rhamnosus 6×10⁸КОЕ/мл 66 68 4,0 4,0

Таблица 5

Культура лактобацилл Исходный инокулюм (КОЕ/мл) Продукция Н₂О₂ (разведение 1,5×10⁶КОЕ/мл) при хранении при -80°С Продукция Н₂О₂ (разведениие 1,5×10⁶КОЕ/мл) при хранении при -196°С До заморозки После заморозки До заморозки После заморозки Lactobacillus jensenii 1 1,5×10⁸КОЕ/мл + + + + Lactobacillus jensenii 2 1,5×10⁸КОЕ/мл + + + + Lactobacillus jensenii 3 1,5×10⁸КОЕ/мл + + + + Lactobacillus gasseri 1 1,5×10⁸КОЕ/мл _ _ _ _ Lactobacillus gasseri 2 1,5×10⁸КОЕ/мл _ _ _ _ Lactobacillus crisрatus 1 1,5×10⁸КОЕ/мл + + + + Lactobacillus crisрatus 2 1,5×10⁸КОЕ/мл + + + + Lactobacillus crisрatus 3 1,5×10⁸КОЕ/мл - _ _ _ Lactobacillus crisрatus 4 1,5×10⁸КОЕ/мл + + + + Lactobacillus rhamnosus 1,5×10⁸КОЕ/мл - _ - _

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ сохранения аутологичных лактобацилл в образцах вагинального отделяемого и чистых культур отдельных видов аутологичных лактобацилл, выделенных из микробиоты влагалища женщин на плотных универсальных и селективных питательных средах, заключающийся в том, что суспензируют 1-3 мл вагинального отделяемого с концентрацией лактобацилл не менее 10⁷ КОЕ/мл (ГЭ/мл), в соотношении 1:2-5 в криопротективной среде заданного состава, а также чистые культуры, выделенные из вагинальной  микробиоты, смытые с поверхности плотной питательной среды с указанной криопротективной среды в конечной концентрации лактобацилл 4 единицы по МакФарланд - 1,2×10⁹ КОЕ/мл, перемешивают, разливают по 1 мл в криопробирки обьемом 2 мл, герметично закрывают и замораживают при соответствующих температурах в низкотемпературных хранилищах, используя по мере необходимости, предварительно восстановив оттаиванием нагреванием на водяной бане при температуре плюс 37°С в течение 60-120 с. Изобретение обеспечивает сохранность титра и жизнеспособность лактобацилл при хранении в условиях низких температур. 2 з.п. ф-лы, 5 табл., 3 пр.

1. Способ сохранения аутологичных лактобацилл в образцах вагинального отделяемого и чистых культур отдельных видов аутологичных лактобацилл, выделенных из микробиоты влагалища женщин на плотных универсальных и селективных питательных средах, заключающийся в том, что вагинальное отделяемое в количестве 1-3 мл с предполагаемой концентрацией лактобацилл не менее 10⁷ КОЕ/мл (ГЭ/мл) по данным культурального исследования или ПЦР в режиме реального времени, в соотношении 1:2-5 суспендируют в специальной комбинированной криопротективной среде, состоящей из 1000 мл дистиллированной воды, панкреатического гидролизата казеина – 17,0 г; папаинового гидролизата соевой муки – 3,0 г; натрия хлорида – 5,0 г; дикалий фосфата – 2,5 г; декстрозы – 2,5 г с добавлением 10% глицерина - криопротектора, а также чистые культуры, выделенные из вагинальной  микробиоты, смытые с поверхности плотной питательной среды с помощью криопротективной среды того же состава в конечной концентрации лактобацилл 4 единицы по МакФарланд - 1,2×10⁹ КОЕ/мл, перемешивают с помощью вихревого смесителя «Вортекс», разливают по 1 мл в криопробирки обьемом 2 мл, герметично закрывают и замораживают при соответствующих температурах в низкотемпературных хранилищах, используя по мере необходимости, предварительно восстановив путем оттаивания нагреванием на водяной бане при температуре плюс 37°С в течение 60-120 с.

2. Способ по п. 1, в котором для низкотемпературного хранения в качестве хранилища используют морозильную камеру с температурой -80°С.

3. Способ по п. 1, в котором в качестве хранилища для заморозки и хранения используют систему хранения в парах жидкого азота - температура минус 196°С.