Способ определения тактики лечения больных с метастатическими формами и рецидивами трижды негативного рака молочной железы Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/577 A61K31/502 A61K31/5025 A61K31/337 A61K39/395 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, точнее, к онкологии, и может найти применение при лечении злокачественных новообразований.

Рак молочной железы (РМЖ) – гетерогенное заболевание с вариабельными биологическими характеристиками и различным клиническим течением. Он занимает первое место в мире (около 25%) по заболеваемости и смертности среди других опухолей у женщин. Согласно информации глобальной базы данных по онкологическим заболеваниям (GLOBOCAN), в 2020 году в мире выявлен 34650951 случай, и 11210413 человек умерли от этого заболевания (Pharmacol. Ther. 2019, 199: 30-57). В Российской Федерации в 2019 году выявлено 66990 новых случаев РМЖ. Распространенность составила 489,6 случаев на 100000 человек.

Основными биомаркерами, отражающими свойства РМЖ, являются: 1) рецепторы эстрогенов (α-субъединица, ERα); 2) рецепторы прогестерона (PR); 3) рецепторов эпидермального фактора роста второго типа (HER2/new); 4) рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR); 5) сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF); 5) цитокератины (CK5/6, CK14, CK17); 6) ядерный белок, отражающий уровень пролиферативной активности (Ki-67). В 2000 году С. Perou, использую технологию ДНК – микрочипа, выявил четыре молекулярных подтипа РМЖ, отличавшихся друг от друга экспрессией первых трех биомаркеров, выявляемой методами иммуногистохимии: люминальный А (PR+, ER+, Her-2-), люминальный В (PR±, ER+, Her-2+), с гиперэкспрессией Her-2 (PR-, ER-, гиперэкспрессия Her-2), базально-подобный или трижды негативный (PR-, ER-, Her-2-, а также CK5/6+, CK14+, CK17+, EGFR+). Позднее, в работах других исследователей, а также самого С. Perou с соавторами, позволили выделить еще несколько молекулярных вариантов РМЖ. Один из них по профилю экспрессии сходен с нормальной тканью (PR-и/или ER-, Her-2-, CK5/6-, CK14-, CK17-, EGFR-), второй характеризуется низкой экспрессией генов клаудина, обеспечивающего взаимодействие между эпителиальными клетками (Mol. Oncol. 2011; 5: 5-23). Последний вариант относится к трижды негативному раку. Он характеризуется низкой экспрессией Е – кадгерина, наличием маркеров эпителиально-мезенхимального перехода (EMT, epithelial–mesenchymal transition) и стволовых опухолевых клеток (CSC, cancer stem cells), выраженной лимфоидной инфильтрацией, плохим прогнозом и высокой вероятностью появления отдаленных метастазов.

Базально-подобный трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ) в разных странах составляет 12 – 20% среди других гистологических типов, и имеет ряд клинико-патологических и молекулярных особенностей, которые влияют на тактику лечения. Он встречается у женщин младше 50 лет и характеризуется высокой частотой рецидивирования, а также высоким риском метастазирования в паренхиматозные органы и головной мозг. По сравнению с другими вариантами опухоли чаще выявляется лимфоидная инфильтрация, центральные некрозы и фиброз. Опухоли, как правило, низкодифференцированные. ТНРМЖ по профилю экспрессии генов представляет собой гетерогенную группу новообразований, причем некоторые варианты сходны с раком яичников. Молекулярные дефекты часто представлены наследственными BRCA (Breast cancer gene) мутациями, приводящими к нарушениям в системе репарации ДНК, что создает условия для использования в лечении ДНК-повреждающих агентов, таких как препараты платины и PARP (Poly-ADP-ribose polymerase, Поли-АДФ-рибозы полимераза) ингибиторы.

Стандартов лечения больных метастатическим и рецидивным ТНРМЖ в настоящее время не существует. Разработанные схемы терапии имеют лишь рекомендательный характер во всех странах, включая Российскую Федерацию. При использовании современных методов лечения медиана общей выживаемости в группах больных с распространенными формами составляет 10,2 месяца. Пятилетняя выживаемость составляет около 65% при регионарном распространении опухоли и 11% - при наличии отдаленных метастазов (Oncologist. 2014; 19 (6): 608-615).

В настоящее время для лечения больных с метастатическими формами и рецидивами ТНРМЖ используются химиопрепараты, относящиеся к разным группам, иммуноонкологические препараты и PARP ингибиторы. На разных фазах клинических исследований находятся еще около 100 препаратов с различным механизмом действия.

Химиотерапия исторически была первым методом лекарственной терапии, вошедшим в стандарты лечения больных. В состав химиотерапевтических режимов входят антрациклиновые антибиотики (доксорубицин), алкилирующие агенты (циклофосфамид), блокаторы формирования микротрубочек (таксаны: доцетаксел, паклитаксел; эрибулин), антиметаболиты (5-фторурацил, капецитабин, гемцитабин). Медиана выживаемости без прогрессирования при использовании различных стандартных химиотерапевтических режимов составляет от 1,7 до 3,7 месяцев, общей – от 10 до 13 месяцев. Медиана выживаемости без прогрессирования по итогам II фазы клинических исследований экспериментальных химиотерапевтических средств составляет от 4 до 6 месяцев, общей – от 11 до 17 месяцев (JNCI Cancer Spectr. 2018; 2 (4): pky062).

С 2010 года в клинической практике стали применяться препараты из группы ингибиторов ангиогенеза. Сочетание бевацизумаба (ингибитор VEGF) с химиотерапией в нескольких исследованиях в рамках III фазы (AVADO, E2100, RIBBON-1) продемонстрировало достоверное увеличение медианы выживаемости без прогрессирования. Режим терапии, включающий доцетаксел в дозе 75 мг/м² в сочетании с бевацизумабом в дозе 15 мг/кг в первый день трехнедельного цикла рекомендован различными профессиональными ассоциациями и Минздравом России в первой линии лечения метастатического и рецидивного ТНРМЖ (J. Clin. Oncol. 2010; 28 (20): 3239-3247; таблица 1).

Иммунотерапия в настоящее время многими исследователями рассматривается как наиболее перспективный метод лечения. В реальной клинической практике нашли применение ингибиторы PD-1/PD-L1. PD-1 – ко-ингибирующая молекула, регулирующая функции компонентов врожденного и адаптивного иммунного ответа. Она экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов, В – лимфоцитов, макрофагов, моноцитов, дендритных клеток. В физиологических условиях она способствует формировании толерантности к аутоантигенам, в микроокружении опухоли – опухолевой иммунологической толерантности (Blood. 2009; 114 (8): 1537-1544). PD-L1 (лиганд PD-1) – трансмембранный белок, экспрессирующийся как на опухолевых, так и на иммунокопетентных клетках. Взаимодействие PD-1/PD-L1 приводит к деактивации Т-лимфоцитов, активации Т-регуляторных и персистированию злокачественных клеток (Immunogenetics. 2018; 70 (2): 73-86). PD-L1 экспрессируется в 20% случаев ТНРМЖ. PD-L1 на опухолевых клетках и в микроокружении является маркером чувствительности к химиотерапии и PD-1/PD-L1 ингибиторам (Breast Cancer Res. 2019; 21 (1): 28).

Атезолизумаб (анти-PD-L1) был первым одобренным для лечения метастатических форм препаратом из этой группы. В завершенном исследование Impassion130, где оценивалась эффективность и безопасность атезолизумаба, проводимом в рамках III фазы, приняли участие 902 человека. Медиана общей выживаемости в группе, где экспрессия PD-L1 ≥ 1% на клетках лимфоидного инфильтрата, была достоверно выше в группе, где больные получали атезолизумаб в сочетании наб-паклитакселом (21,3 и 17,6 месяцев). Для оценки экспрессии PD-L1 в исследовании использовалась тест-система VENTATA (Expert. Rev. Precis. Med. Drug. Rev. 2020; 5 (2): 59-65). Это режим лечения в настоящее время одобрен Минздравом России.

Оценка эффективности и безопасности пембролизумаба (анти-PD-1) у ранее не леченых больных в рамках III фазы поводится в протоколах KEYNOTE-119 и KEYNOTE-355. В обоих исследованиях в настоящее время проводится наблюдение за пациентами, получившими терапию. В исследовании KEYNOTE-355 приняли участие 847 человек, получавших различные режимы химиотерапии (паклитаксел, наб-паклитаксел, препараты платины и гемцитабин) в сочетании с плацебо или пембролизумабом (рандомизация 2:1). Оценка экспрессии PD-L1 в баллах осуществлялась тест-системой 22С3 (DAKO PharmaDx), в которой учитывалось отношение PD-L1 на опухолевых клетках, лимфоцитах и макрофагах к общему числу детектируемых опухолевых клеток, помноженное на 100 (CPS, combined positive score). Достоверные различия в показателях медианы общей выживаемости к настоящему времени были выявлены лишь при CPS ≥ 10 (23 мес. в группе пембролизумаба и 16,1 мес. в группе плацебо. N. Engl. J. Med. 2022; 387 (3): 217-226). В исследовании KEYNOTE-119 приняли участие 622 человека, получавших различные режимы химиотерапии (паклитаксел, наб-паклитаксел, препараты платины и гемцитабин) или Пембролизумабом (рандомизация 1:1). Оценка экспрессии PD-L1 в баллах осуществлялась тест-системой 22С3. В этом исследовании продемонстрировано, что применение Пембролизумаба в монорежиме не приводит к улучшению отдаленных результатов лечения по сравнению с химиотерапией (таблица 1. Lancet. Oncol. 2021; 22 (4): 499-511).

В рамках I – III фаз проводятся исследования по оценке эффективности различных комбинаций ингибиторов PD-1/PD-L1 с PARP – ингибиторами (пембролизумаб + нирапариб, пембролизумаб + олапариб, дюрвалюмаб + олапариб), вакцинами (атезолизумаб + вакцина на основе неоантигенов, дюрвалюмаб + ДНК вакцина, пембролизумаб + PVX-410) и препаратами клеточной терапии (Front. Oncol. 2022; 12: 919072).

Для лечения больных ТНРМЖ в последние несколько лет в ряде стран используются конъюгаты моноклональных антител с цитотоксическими агентами. Конъюгаты, применяемые у больных ТНРМЖ, относятся к первому поколению, отличительной чертой которых является необходимость интернализации внутрь клетки молекулы - мишени при взаимодействии с лигандом. В клетках ТНРМЖ выявлено несколько молекул, обладающих такими свойствами: 1) не метастатический гликопротеин b (GPNMB); 2) поверхностный трофобластический антиген-2 (Trop-2); 3) цинксодержащий транспортный белок (LIV-1); 4) сиалогликомуцин (CA6).

Trop-2 – трансмембранный гликопротеин, участвующий в процессах миграции, пролиферации, являющийся мишенью для сацитузумаба говитекана (IMMU-132), содержащего в качестве активного агента ингибитор топоизомеразы I SN-38. В завершенном исследование ASCENT, где оценивалась эффективность и безопасность сацитузумаба говитекана в сравнении с химиотерапией (рандомизация 1:1), проводимом в рамках III фазы, приняли участие 468 человек. Медиана общей и выживаемости без прогрессирования в группе, где больные получали сацитузумаб говитекан (12,1; 5,6 мес. соответственно) была достоверно выше по сравнению с группой, в которой больные получали различные варианты химиотерапии (6,7; 1,7 мес. соответственно; таблица 1; N. Engl. J. Med. 2021; 384 (16): 1529-1541).

LIV-1 представляет собой трансмембранный белок с металлопротеиназной активностью, экпсрессирующийся в 90 % опухолей молочной железы. Он участвует в регуляции экспрессии активатора транскрипции STAT-3, клеточной адгезии, EMT, а также является мишенью для ладиратузумаба ведотина (LV). В рамках I фазы в группе больных с метастатическим ТНРМЖ была достигнута частота объективных ответов 25%. Медиана выживаемости без прогрессирования составила 11 недель при умеренной токсичности и хорошей переносимости лечения (Cancer Res. 2018; 78). В фазе Ib/II при использовании комбинации LV и пембролизумаба частота объективного ответа составила 35 % при контролируемой токсичности, что продемонстрировало клиническую перспективность комбинации (J. Clin. Oncol. 2019; 37 (suppl. 15): TPS 1110).

Несмотря на перспективность этой группы препаратов и наличие результатов III фазы клинических исследований (сацитузумаб говитекан), в настоящее время они отсутствуют в клинических рекомендациях Минздрава России.

Еще одна группа препаратов, вошедших в клиническую практику - PARP – ингибиторы. Эти препараты назначаются при наличии мутаций в генах BRCA. Выявление взаимосвязи герминогенных мутаций BRCA1/2 с наследственными опухолями яичников и молочной железы явилось ключевым открытием в опухолевой генетике, открывшим новые возможности скрининга и профилактики. BRCA 1 и BRCA2 – аутосомно-доминантные гены, имеющие критическое значение в репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации (homologus recombination repair, HRR). BRCA1 локализуется на хромосоме 17q21. Он контролирует различные компоненты сигнальной трансдукции, вовлеченные в репарацию ДНК, включая распознавание геномных повреждений, активацию белков, связывающих ДНК, и оценку двойных разрывов, требующих репарации. Кроме того, он принимает участие в ремоделировании хроматина и контроле транскрипции. BRCA2 локализуется на хромосоме 13 и играет ключевую роль в активации рекомбиназы RAD 51 и выявлении локализации повреждения ДНК. Наследственные мутации BRCA 1 и BRCA2 (gBRCAm) встречаются в небольшой популяции (примерно 1 на 400 тыс. или 0,25%), в то время как у женщин с ТНРМЖ их частота составляет, по разным данным, от 11% до 31%. Риск развития РМЖ с наследственными дефектами BRCA1 и BRCA2 составляет 65% и 45% соответственно (J. Med. Genet. 2011; 48 (8): 520-522). При наличии мутаций в генах BRCA 1/2 запускается альтернативный механизм репарации ДНК – негомологичное соединение концов (non-homologus end joining, NHEJ). В отличие от гомологичной рекомбинации, поврежденные концы соединяются лигазой напрямую, не нуждаясь в гомологичном шаблоне. Этот процесс зависит от активности фермента поли-АДФ-рибоза (PARP) полимеразы 1/2 (PARP1/2). Инактивация этого фермента приводит к гибели клеток. PARP представляет собой семейство из 17 белков. Только 4 из них принимают участие в формировании фермента поли-АДФ-рибоза полимеразы: PARP 1, 2, 5a, 5b (Nat. Commun. 2014; 5: 4426).

В 2015 году Domogala P. с соавторами изучили распределение 36 мутаций в генах, участвующих в гомологичной рекомбинации. Было выявлено, что они есть у 22 % (35 из 158) больных ТНРМЖ (Breast Cancer Res. 2005;12 (1): 189‑195). Эти данные были подтверждены в другом исследовании, где продемонстрировано, что дефицит гомологичной рекомбинации (homologus recombination deficiency, HRD) встречается также и при мутациях в ряде других генов, включая PALB2, BARD1, BRIP1, RAD51, RAD51C, RAD51D, ATM, FAAP20, CHECK2, FAM1, FANCE, FANCM, POLQ. Это делает целесообразным использование PARP –ингибиторов и других ДНК повреждающих агентов и при дефектах других генов, ассоциированных с HRD (Oncotarget. 2018; 14(9): 37080-37096).

По своей структуре PARP ингибиторы сходны с никотинамидом. При их применении реализуется несколько механизмов: игибирование АДФ-рибоза полимеразы и связывание фермента с участками поврежденной ДНК, не сопровождающееся восстановлением структуры (Cancer Res. 2012; 72(1): 5589-5599).

В настоящее время разработан ряд препаратов, блокирующих PARP: Олапариб, Талазопариб, Нирапариб, Рукапариб, Велипариб, Рамипариб, Флузопариб. У больных ТНРМЖ прошли исследования в рамках III фазы и одобрены профессиональными онкологическими ассоциациями, а также Минздравом России два препарата: Олапариб и Тлазопариб.

Олапариб был первым препаратом из группы, одобренным для лечения метастатических форм ТНРМЖ. В завершенном исследование OlympiAD, где оценивалась его эффективность и безопасность, проводимом в рамках III фазы, приняли участие 302 человека, получавшие олапариб в режиме монотерапии или химиотерапию по выбору врача (рандомизация 2:1). Медиана общей выживаемости достоверно не различалась в группах с химиотерапией и олапарибом (17,1 и 19,3 мес.), в то же время, использование олапариба приводило к достоверному увеличению медианы выживаемости без прогрессирования (7 и 4,2 мес.; таблица 1; Ann. Oncol. 2019; 30(4): 558-566).

Оценка эффективности и безопасности талазопариба проведена в рамках III фазы в исследовании EMBRACA, в котором принял участие 431 человек с метастатическим ТНРМЖ. Больные получали талазопариб в режиме монотерапии или стандартную химиотерапию по выбору врача (рандомизация 2:1). В группе терапии талазопарибом медиана выживаемости без прогрессирования была достоверно выше по сравнению с химиотерапией (8,6 мес. и 5,6 мес.). В то же время, достоверных различий в медиане общей выживаемости в двух группах е было получено (19,3 мес., 19.5 мес.; таблица 1; Ann. Oncol. 2020; 31(11): 1526-1535).

В настоящее время по результатам завершенных исследований, профессиональными онкологическими ассоциациями и Минздравом России рекомендовано три варианта лечения больных с ТНРМЖ: 1) химиотерапия (доцетаксел) в сочетании с бевацизумабом; 2) иммунохимиотерапия (атезолизумаб в сочетании с наб-паклитакселом); 3) PARP ингибиторы (олапариб, талазопариб) в режиме монотерапии (таблица 1).

Таблица 1. Клинические исследования в рамках III фазы с завершенным набором пациентом с метастатическими формами и рецидивами трижды негативного рака молочной железы

Терапия Исследование Этап Терапия Основные результаты МЗ РФ Б + ХТ AVADO (J. Clin. Oncol. 2010; 28 (20): 3239-3247) З Доцетаксел + бевацизумаб 7,5 мг/кг каждые 3 недели ВБП – 9 мес., 1-летняя выживаемость – 81% - З Доцетаксел + бевацизумаб 15 мг/кг каждые 3 недели ВБП – 10 мес., 1-летняя выживаемость – 84% + E2100 (J. Clin. Oncol. 2009; 27 (30): 4966-4972) З Паклитаксел + бевацизумаб 10 мг/кг каждые 2 недели ВБП – 11,3 мес., 1-летняя выживаемость – 81,4% - RIBBON-1 (J. Clin. Oncol. 2011; 27 (30): 4966-4972) З Бевацизумаб 5 мг/кг еженедельно + таксаны или антрациклины в разных режимах Медиана длительности ответа – 8,3 мес. - ИТ в монорежиме KEYNOTE-119 (Lancet. Oncol. 2021; 22 (4): 499-511) Н Пембролизумаб – 200 мг каждые 3 недели в сравнении с ХТ по выбору врача (капецитабин, эрибулин, гемцитабин, винорельбин) ОВ: Пембролизумаб – 9,9 мес., ХТ– 10,8 мес. ОВ CPS ≥ 1: Пембролизумаб – 10,7 мес., ХТ – 10,2 мес. ОВ CPS ≥ 10: Пембролизумаб – 12,7 мес., ХТ – 11,6 мес. - ИХТ KEYNOTE-355 (N. Engl. J. Med. 2022; 387 (3): 217-226) Н Пембролизумаб – 200 мг каждые 3 недели + ХТ по выбору врача (наб-паклитаксел, паклитаксел, гемцитабин-карбоплатин) в сравнении с плацебо + ХТ ОВ: Пембролизумаб + ХТ – 17,2 мес., ХТ + П – 15,5 мес. ОВ CPS ≥ 1: Пембролизумаб + ХТ – 17,6 мес., ХТ + П – 16 мес. ОВ CPS ≥ 10: Пембролизумаб + ХТ – 23 мес., ХТ + П – 16,1 мес. - IMpassion 130 (Expert. Rev. Precis. Med. Drug. Rev. 2020; 5 (2): 59-65) З Наб-паклитаксел 100 мг/м² в 1, 8, 15 дни 28 дневного цикла + Атезолизумаб 840 мг каждые две недели в сравнении с наб-паклитаксел + плацебо ВБП: Наб-паклитаксел + Атезолизумаб – 7,2 мес., Наб-паклитаксел + П – 5,5 мес. ВБП PD-L1+: наб-паклитаксел + Атезолизумаб – 7,5 мес., Наб-паклитаксел + П – 5 мес. ОВ: Наб-паклитаксел + Атезолизумаб – 21,3 мес., Наб-паклитаксел + П – 17,6 мес. + Конъюгаты ASCENT (N. Engl. J. Med. 2021; 384 (16): 1529-1541) З Сацитузумаб говитекан 10 мг/кг в 1 и 8 дни 21 дневного цикла в сравнении с ХТ по выбору врача (эрибулин, винорельбин, гемцитабин, капецитабин) ВБП: Сацитузумаб говитекан – 5,6 мес., ХТ – 1,7 мес. ОВ Сацитузумаб говитекан – 12,1 мес., ХТ – 6,7 мес. - PARP ингибиторы OlimpiAD (Ann. Oncol. 2019; 30(4): 558-566) З Олапариб 300 мг два раза в сутки в сравнении с ХТ по выбору врача (капецитабин, винорельбин или эрибулин) ВБП: Олапариб – 7 мес.; ХТ – 4,2 мес. ОВ: Олапариб – 19,3 мес.; ХТ – 17,1 мес. + EMBRACA (Ann. Oncol. 2020; 31(11): 1526-1535) З Талазопариб 1 мг в сутки в сравнении с ХТ по выбору врача (капецитабин, винорельбин или эрибулин) ВБП: Талазопариб – 8,6 мес.; ХТ – 5,6 мес. Медиана времени до клинически значимого ухудшения: Талазопариб – 24,3 мес.; ХТ – 6,3 мес. +

Б – Бевацизумаб; ИТ – иммунотерапия; ХТ – химиотерапия; ИХТ – иммунохимиотерапия; PARP – поли-АДФ-рибоза полимераза; З – исследование завершено, Н – набор пациентов завершен, этап наблюдения; ОВ – общая выживаемость; ВБП – выживаемость без прогрессирования; МЗ РФ – схема рекомендована Минздравом России.

Выбор варианта лечения в клинической практике осуществляется путем оценки мутаций в генах BRCA 1/2 (показания к назначению PARP ингибиторов), экспрессии PD-L1 (показания к назначению атезолизумаба). В научных исследованиях предложен ряд способов определения тактики лечения: оценка подтипа опухоли в соответствии с молекулярной классификацией, оценка мутационной нагрузки, микросателлитной нестабильности, лимфоидной инфильтрации. Прогностическое и предсказательное значение имеют также клетки в микроокружении опухоли и в крови.

В последнее десятилетие предложено несколько классификаций ТНРМЖ. В основу их положены паттерны мутаций или экспрессия РНК (таблица 2).

В 2014 году Lehmann B.D. с соавторами проанализировали профили экспрессии 2188 генов 587 больных и выявили 6 типов опухолей, различающихся по биологическим свойствам: базально-подобный 1, 2 (BL1, BL2); мезенхимальный (М), мезенхимально-стволовой (MSL), иммуномодуляторнпторныый (IM), андрогенорецепторный (LAR) (J. Pathol. 2014; 232 (2): 142‑150).

В 2015 году Burstein M.D. с соавторами провели исследование, целью которого было модификация критериев и уточнение числа молекулярных подтипов ТНРМЖ в соответствии с профилями экспрессии 80 генов (Clin. Cancer Res. 2015; 21(7): 1688‑1698). В работе проводился анализ мутаций ДНК и экспрессии РНК. Всего было проанализировано 198 образцов (84 для разработки метода и 114 для валидации). В результате анализа было выделено 4 молекулярных подгруппы, определяемых гиперэкспрессией или амплификацией ряда генов, а также обозначены специфические биомаркеры для каждой из них: 1) люминальный (LAR): андрогеновые рецепторы, муцин (MUC 1); 2) мезенхимальный (MES): IGF-1, ADRB2, EDBRB, PTGER 3/4, PTGFR, PTGFRA; 3) базально-подобный иммуносупрессивный (BLIS): VTCN1; 4) базально-подобный иммуноактивированный (BLIA): CTLA-4. Подгруппы обладают прогностической значимостью в отношении эффективности различных вариантов лечения (p=0,006).

В 2016 году Liu Y.R. с соавторами провели интегральный траскрипционный анализ матричных (mRNA) и длинных не кодирующих РНК (IncRNA) 165 образцов ткани, и предложили классификацию, основанную на превалирующих нарушениях в ключевых процессах канцерогенеза. Иммуномодулирующий подтип (IM, кластер А) ассоциирован с процессами иммуногенеза: экспрессия цитокинов, компонентов Т- и В-клеточного рецепторы, хемокинов, элементов трансдукции сигнала внутрь клетки. Люминальный – AR подтип (LAR, кластер В) связан с активацией биосинтеза андрогенов и эстрогенов. Мезенхимальный подтип (MES, кластер С) ассоциирован с активацией компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Базально-подобный иммуносупрессивный подтип (BLIS, кластер D) в отличие от мезенхимального, связан с гиперактивацией процессов пролиферации клеток, что обусловлено гиперэкспрессией ряда регуляторных генов: CENPF, BUB1, PRC1. При этом процессы регуляции иммунного ответа в этом подтипе резко подавлены. (Breast Cancer Res. 2016; 18(1): 33).

Таблица 2. Молекулярные классификации трижды негативного рака молочной железы

Первый автор, год, ссылка Классификация, молекулярный подтип Молекулярные дефекты Lehmann B.D., 2014 (J. Pathol. 2014; 232 (2): 142‑150) Базально-подобный 1 Клеточный цикл, репарация ДНК, РНК-полимераза. Мутации генов BRCA1,2; TP53; STAT4; RB1; SMAD 4; MAPK13. Базально-подобный-2 Экспрессия факторов роста ряда сигнальных путей: EGF, NGF, MET, IGF-1R. Гликолиз. Гюконеогенез. Экспрессия миоэпителиальных маркеров. Мутации генов BRCA1; TP53; PTEN; RB1; UTX. Мезенхимально-подобный Клеточная адгезия, дифференцировка, эпителиально-мезенхимальный переход. Мутации генов TP53; PTEN; RB1; PIK3CA. Мезенхимально-стволовой Похож на мезенхимально-подобный. Клеточная адгезия, дифференцировка. Гиперэкспрессия EGFR, PDGF, активация метаболизма инозитол-фосфата, низкий пролиферативный индекс, гиперэкспрессия генов ангиогенеа. Мутации генов BRCA1; TP53; BRAF; HRAS; KRAS; PIK3CA; NF1,2; PDGFRA; CDKN2A. Иммуномодуляторный Активация сигнальных путей, связанных с генерацией иммунного ответа (CTLA-4, IL-2, IL-7), процессингом и презентацией антигена. Мутации генов TP53; RB1; BRAF; APC; HUWE1; NFKB1A. Андрогенорецепторный Активация синтеза андрогеновых рецепторов, метаболизма порфирина, синтеза стероидов. Мутации генов PIK3CA; TP53; PTEN; RB1. Burstein M.D., 2015 (Clin. Cancer Res. 2015; 21(7): 1688‑1698) Люминальный – АР (LAR) Активация экспрессии рецепторов андрогенов, эстрогенов, пролактина, ERBB4. Мезенхимальный (MES) Активация экспрессии генов клеточного цикла. Базально-подобный иммуносупрессивный (BLIS) Подавление экспрессии генов Т-, В-лимфоцитов, натуральных киллеров. Базально-подобный иммуноактивированный (BLIA) Активация экспрессии генов Т-, В-лимфоцитов, натуральных киллеров. Liu Y.R., 2016 (Breast Cancer Res. 2016; 18(1): 33) Иммуномодуляторный (IM) Увеличение экспрессии компонентов, обеспечивающих цитокин –рецепторное взаимодействие в T-, B- лимфоцитах. Увеличение экспрессии хемокинов и х рецепторов, а также NF-kB. Активация экспресии мРНК: LOC100653210, LOC100653245, IGHV3-20, IGHV4-31, IGHJ1, IGKV3-7. Люминальный – AR (LAR) Активация биосинтеза стероидных гормонов, порфиринов и PPAR (рецепторов пероксисом). Активация экспресcии мРНК: TRIM2, SDR16C5, C1QTNF3, KRT17, SERPINBS, TFAP2B, FAR2, CYP39A1, KIAA1467, EDDM3B. Мезенхимальный (MES) Активация эпителиально-мезенхимального перехода, экстрацеллюлярных матрикс-рецепторных взаимодействий. Активация экспрессии компонентов TGF-β сигнального пути, адипоцитокиновых сигнальных путей, а также сигнальных путей, ассоциированных с факторами роста. Активация экспресcии мРНК: SELP, CNN1, ADH1B. Базально-подобный иммуносупрессивный (BLIS) Множественные митозы, активация репликации и репарации ДНК. Понижена эффективность компонентов врожденного и адаптивного иммунитета. Дефекты Т-клеточного рецептора.

В настоящее время продолжаются работы по выявлению и описанию молекулярных подтипов ТНРМЖ. Большинство исследований базируются на оценке уровня мРНК различных генов. Недостаток подобного подхода связан с тем, что этот показатель далеко не всегда коррелирует со спектром и количеством белков, структура которых закодирована в мРНК. Связано это с многоуровневой регуляцией пептидного синтеза. Кроме того, методы оценки мРНК дороги и трудоемки, что затрудняет их внедрение в клиническую практику. Отнесение опухоли к молекулярному подтипу не может точно предсказать необходимость проведения какого-либо варианта лечения. Описание чувствительности к различным вариантам терапии носит обобщенный характер.

Общий недостаток стандартных способов определения показаний к терапии (мутации BRCA 1,2; экспрессия PD-1/L1) заключается в том, что они демонстрируют лишь целесообразность проведения лечения, но не предсказывают его эффективность.

Мутационная нагрузка, микросателлитная нестабильность, лимфоидная инфильтрация, а также лимфоидные и миелоидные элементы периферической крови и микроокружения в настоящее время рассматриваются как предикторы эффективности иммуноонкологических препаратов.

Мутационная нагрузка (TMB, tumor mutational burden) рассчитывается как отношение общего числа мутаций на единицу генома. Потенциально мутационная нагрузка приводит к образованию новых антигенов и активации Т-клеточного ответа. Для некоторых опухолей, таких как меланома, колоректальный рак, рак легкого, мутационная нагрузка, определяемая методами сиквенса следующего поколения (NGS) является предиктивным маркером для иммуноонкологических препаратов, не связанным с PD-L1 статусом. Мутационная нагрузка коррелирует с частотой лимфоидной инфильтрации опухоли. Вопрос о предиктивной роли мутационной нагрузки у больных ТНРМЖ остается дискутабельным. Частота высокой мутационной нагрузки при ТНРМЖ составляет 3,1 – 5% (J. Clin. Oncol. 2018; 36: 1010).

Микросателлитная нестабильность (MSI, microsatellite instability) – фенотип, обусловленный дефицитом механизмов репарации ДНК (dMMR, deficient mismatch repair). MSI ассоциирована с высокой частотой образования неоантигенов, и, как следствие, чувствительностью к иммуноонкологическим препаратам. Частота MSI-H/dMMR при ТНРМЖ очень низка (0%-1,5%), и ее прогностическая и предиктивная значимость продолжает изучаться (Cancer Res. 2018; 78, PD6-03).

Высокая мутационная нагрузка микросателлитная нестабильность не имеет большого значения для больных ТНРМЖ вследствие низкой частоты этих феноменов.

В первых работах, связанных с изучением прогностического потенциала иммунологических компонентов у больных ТНРМЖ, проводилась оценка лимфоцитов или мононуклеаров периферической крови, а также соотношений разных субпопуляций лейкоцитов. В 2016 году He J. с соавторами на группе из 230 больных с ТНРМЖ выявили, что благоприятными прогностическими факторами в отношении общей и безрецидивной выживаемости являются лимфоцитоз (p<0,005), моноцитоз (p<0,005), а также соотношение лимфоцитов и моноцитов (LMR ≥ 4,7; p<0,001). Кроме того, LMR коррелировало с размером опухоли (p<0,005) и числом метастатических очагов (p=0,013). Сходные данные получены в исследовании Jia W. с соавторами (Tumor Biol. 2016; 37 (7): 9037-9043. PLOS. 2015; 10 (11): 1371). В то же время, в работе Losada B. с соавторами, оценивая абсолютное количество лимфоцитов (ALC), NLR, LMR и PLR (тромбоцитарно-лимфоцитарное соотношение) на группе больных ≥ 65 лет (104 человека), при проведении одномерного анализа продемонстрировали, что только PLR является независимым предсказательным фактором в отношении раннего рецидива (p=0,04) и общей трехлетней выживаемости (p=0,03), а при многофакторном анализе в подгруппе, пережившей трехлетний период (69 человек), из иммунологических факторов предиктивные свойства есть лишь у ALC (p=0,04) (Clin. Transl. Oncol. 2019; 21 (1): 855-863).

Оценка субпопуляций клеток миелоидного и лимфоидного ряда как в периферической крови, так и в микроокружении является более точным методом оценки прогноза и определения тактики. Среди клеток лимфоидного ряда изучалась роль лимфоцитов (цитотоксические лимфоциты (CTL), T-регуляторные клетки (Treg), В-лимфоциты), моноцитов/макрофагов (M1, 2), дендритных клеток (DC), супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC). Прогностическое значение, кроме того, имеют компоненты врожденного иммунитета: натуральные киллеры (NK), нейтрофилы, эозинофилы (Cancers. 2021; 13 (6): 1305).

К настоящему времени показано, что моноциты и клетки моноцитарной линии связаны с канцерогенезом РМЖ, а также с прогнозом и эффективностью различных вариантов лечения. В микроокружении опухоли и периферической крови существует две субпопуляции макрофагов – М1 и М2. М1 – классически активируемые макрофаги, поляризация которых из предшественников происходит под действием липополисахарида, IFN-γ и TNF-α. М2 – сборное название группы клеток макрофагального ряда, индуцирующихся под влиянием IL-4, IL-13, IL-10, TGF-β, Fc-рецепторов, комплемента и глюкокортикоидов. М2 образуются из моноцитов периферической крови, рекрутированных в очаг хемокиновыми лигандами (CCL-2, MCP-1), колоние-стимулирующими факторами (M-CSF, CSF-1) и сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF), концентрация которых повышена в зонах с низким давлением кислорода. В зонах хронический гипоксии в макрофагах синтезируются гипоксия – индуцированные факторы (HIF-1 и HIF-2). Они дерепрессируют синтез ряда белков, повышающих ангиогенный потенциал опухоли (VEGF, bFGF, PDGF), инвазивный потенциал, метастазирование и EMT (MMP, CCL2, CCL18). Кроме того, в них отмечается избыточная экспрессия аргиназы (Arg) и индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), снижающих концентрацию аргинина и триптофана, необходимых для нормального функционирования Т – лимфоцитов и NK (BMC Cancer. 2018; 18 (1): 366).

В периферической крови больных ТНРМЖ концентрация М2 существенно выше по сравнению с М1, что коррелирует с коротким безрецидивным периодом. М2 макрофаги чаще встречаются в крови больных с отдаленными метастазами (Front. Immunol. 2019; 10: 1767).

MDSC представляют собой гетерогенную группу клеток, образующихся из кроветворного предшественника – не зрелых миелоидных клеток (IMC, CD31+CD11b+CD15+). В норме созревание происходит в костном мозге и селезенке. В микроокружении опухоли под действием гуморальных факторов (VEGF, IL-3, IL-4, IL-6) и лигандов хемокинов (CXCL2, 5 ,12; CCL2, 5) блокируется их дальнейшая дифференцировка, и они накапливаются в первичных и метастатических очагах. У человека выявляется две субпопуляции MDSC: гранулоцитарные MDSC (gMDSC, CD11b+CD14-CD15+CD33+) и моноцитарные MDSC (mMDSC, CD11b+CD14+CD15-CD33+HLADR-/low). MDSC – ключевые компоненты в индукции иммуносупрессии на фоне хронического воспаления. За счет активных метаболитов кислорода и азота они индуцируют анергию эффекторных клеток, способствуя рекрутингу Treg в опухоль и поляризации предшественников макрофагов в сторону М2. Кроме того, они стимулируют ангиогенез и способствуют поддержанию популяции CSC (Oncotarget. 2017; 8(2):3649–65).

Высокое содержание MDSC коррелирует с объемом опухолевой массы. У больных ТНРМЖ их концентрация значительно выше по сравнению с другими молекулярными вариантами РМЖ. MDSC обладают предиктивной значимостью в плане эффективности химиотерапии. Вероятность положительного эффекта связана с увеличением соотношения gMDSC/mMDSC (Cancer Immunol. Immunother. 2020; 69(3):435-448).

DC - это высокоспециализированная субпопуляция, основной функцией которой является поглощение, процессинг и презентация антигенов в составе главного комплекса гистосовместимости. Их активация происходит под действием «сигналов опасности», исходящих от опухолевых клеток, включающих хемокины и неоантигены. «Созревание» DC, помимо презентации антигенов, включает экспрессию ко-стимулирующих молекул (CD40, ICAM I, CD80/86, СD83), секрецию широкого спектра цитокинов (IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13) и миграцию в лимфатические узлы, где происходит запуск программы активации Т-хелперов. У человека морфологически и функционально различают две субпопуляции DC: миелоидные (mDC) и плазмацитоидные (pDC). mDC – классические DC, имеющие фенотип CD11c+CD4+CD45RO+, экспрессирующие MHC I, II и запускающие иммунный ответ при контакте с растворимыми антигенами. pDC с фенотипом CD11c-CD4+CD45RA+CD123+ и экспрессией MHC I поглощают клеточно-ассоциированные антигены. У больных ТНРМЖ под влиянием IL-10 и TGF-β в DC снижается экспрессия цитокинов (IL-12), ко-стимулирующих молекул (CD80, CD86), активационных маркеров (HLA-DR) и способность к презентации антигенов (Nat. Rev. Immunol. 2020; 20(1):7-24.).

Treg – субпопуляция, составляющая примерно 5 – 10 % от общего числа периферических лимфоцитов здорового человека и примерно 50% от популяции лимфоцитов с маркерами CD4+CD25+. В настоящее время им отводят ключевую роль в предотвращении развития аутоиммунных реакций и иммуносупрессии в процессе канцерогенеза. Тreg имеют фенотип CD4+CD25+FoxP3. Среди CD4+CD25+ FoxP3 выделяются две субпопуляции. Одна из них имеет фенотип CD4+CD25^hiCTLA^hiFoxP3 и образуется в тимусе из недифференцированных лимфоцитов, другая, с фенотипом CD4+CD25^variable CTLA^hi FoxP3, возникает из периферических Т-хелперов под действием избыточной концентрации глюкокортикоидов, эстрогенов, IL-2 и TGF-β. Однако по функциям они идентичны. Механизм действия их связан с контактным ингибированием, секрецией супрессорных цитокинов (IL-10, IL-35, TGF-β), а также прямым лизисом иммунокомпетентных клеток (Cancer Microenviron. Off J. Int. Cancer Microenviron. Soc. 2019; 12(23):119-132).

Изучение микроокружения опухоли при ТНРМЖ является важным компонентом оценки прогноза заболевания и определения тактики лечения.

Наличие лимфоидной инфильтрации, составляющей 50-60% от объема стромы при всех молекулярных подтипах ТНРМЖ, как правило, говорит о хорошем прогнозе, низкой вероятности рецидивирования и потенциальной чувствительности к иммуноонкологическим препаратам (BMJ Cancer. 2018; 18 (1): 556).

В 2014 году Adams S. с соавторами опубликовали данные исследования о влиянии плотности стромальных и интраэпителиальных опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (sTIL, iTIL) на отдаленные результаты лечения ТНРМЖ. В работе были проанализированы образцы 506 больных, которые получали лечение в рамках протоколов ECOG E2197 (191 человек) и E1199 (291 человек). В 481 образце были выявлены TIL (sTIL – 80%, iTIL – 15%). В результате многомерного анализа выявлено, что плотность sTIL является независимым прогностическим фактором ранних рецидивов, общей выживаемости и времени до появления отдаленных метастазов. Повышение плотности sTIL на каждые 10% приводит к уменьшению риска локального рецидива на 14% (p=0,02), риска отдаленных метастазов на 18% (p=0,04) и риска смерти на 19% (p=0,01). Высокая плотность sTIL является предиктором эффективности иммуноонкологических препаратов (J. Clin. Oncol. 2014; 32 (27): 2959- 2967).

В 2016 году Yu X. c соавторами провели метаанализ 17 публикаций с участием 12968 больных РМЖ, включая ТНРМЖ. В отличие от исследований Adams S. и He L., критерием отбора было наличие анализа субпопуляционного состава, включавший лимфоциты с маркерами CD8+ (CTL), PD-1+, Foxp3+ (Treg). Авторы пришли к заключению, что наличие TIL является благоприятным прогностическим фактором в отношении безрецидивной выживаемости и предиктором ответа на неоадьювантную терапию (Clin. Transl. Oncol. 2016; 18(5): 497-506).

Цитокины в настоящее время рассматриваются как универсальные регуляторы, контролирующие гомеостаз многих клеток. При ТНРМЖ они участвуют в регуляции ангиогенеза, формирования иммуносупрессивной сети, метастазировании, а также в интеграции метаболических процессов, связанных с ожирением, хроническим воспалением и канцерогенезом. Вовлеченность в процессы канцерогенеза делает возможным использование цитокинов в качестве прогностических факторов. Цитокины могут оцениваться в крови или микроокружении опухоли. В обоих случаях может оцениваться их концентрация (в микроокружении - экспрессия), а также спонтанная и индуцированная продукция. В канцерогенез ТНРМЖ вовлечены IL-1, 6, 8, 10, 11, 17, 19, 20, 23; TNF-α. Многие из них обладают прогностическим потенциалом.

Наиболее изученными цитокинами, связанными с канцерогенезом и прогнозом ТНРМЖ являются: IL- 6, 8, 10, TNF-α и TGF-β. IL-6 – цитокин с широким спектром биологических активностей, осуществляющий «интеграцию» иммунной и нейроэндокринной системы. Основными его источниками являются Т-лимфоциты, макрофаги, миоциты, эндотелиоциты, фибробласты и опухолевые клетки. В физиологических условиях он играет центральную роль в гемопоэзе, а также в регуляции роста и дифференцировки эндотелиоцитов, кератиноцитов, остеобластов и нейронов. В иммунной системе IL-6 активирует пролиферацию и синтез антител В-лимфоцитами, пролиферацию CTL, стимулирует гранулоцитарный росток кроветворения, а также индуцирует экспрессию острофазных белков в печени. IL-6 является проангиогенным фактором и стимулирует экспрессию гена множественной лекарственной устойчивости. Гиперэкспрессия IL-6 в опухоли и повышение концентрации в периферической крови является не благоприятным прогностическим фактором в отношении общей выживаемости и эффективности иммунотерапии (J. Immunol. Res. 2020; 2020: 5618786).

IL-8 относится к семейству хемокинов. Главные продуценты – макрофаги и эндотелиальные клетки, дополнительные – лимфоциты, нейтрофилы, фибробласты. Индукторы синтеза – провоспалительные цитокины. Основная биологическая функция связана с регуляцией миграции клеток. В процессе канцерогенеза IL-8 может выступать как аутокринный фактор роста, а также стимулировать ангиогенез. IL-8 в сыворотке - не благоприятный прогностический фактор в отношении общей выживаемости, раннего рецидива и эффективности иммуноонкологических препаратов (Acta Histochemika. 2012; 114 (6): 571-576. Breast Cancer Res. 2013; 15 (4): 210).

IL-10 является ключевым регулятором противоопухолевого иммунного ответа. Семейство IL-10 включает, помимо самого цитокина, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26. Свойства IL-10 зависят от фазы взаимодействия опухоли и иммунной системы, концентрации цитокина, а также от локализации его клеток мишеней. В лимфоидных органах реализуются его имуносупрессорные эффекты, а в микроокружении опухоли также и иммуностимулирующие. IL-10 подавляет созревание DC путем редукции экспрессии MHC II, молекул адгезии и цитокинов (IL-12), а также снижая чувствительность рецепторов, реагирующих на «сигналы опасности». DC в микроокружении опухоли сами могут стать источником IL-10, генерируя при этом Тreg. IL-10 ингибирует пролиферативную активность и продукцию цитокинов T-хелперов 1. Высокая сывороточная концентрация IL-10 и высокий уровень экспрессии в ткани - предиктор низкой эффективности иммунотерапии (Tzu. Chi. Med. J. 2021; 33 (3): 203-211).

TNF-α относится к семейству фактора некроза опухолей, сформированному на основании сходства строения лигандов и рецепторов. Основные биологические эффекты TNF-α в канцерогенезе связаны с поддержанием перитуморальной воспалительной реакции, усилением проницаемости капилляров и стимуляцией ангиогенеза. В фазе надзора он способствует повышению содержания эффекторных клеток и химиопрепаратов в очаге, а в фазах равновесия и ускользания – прогрессии за счет образования новых сосудов и запуска каскадных реакций хронического воспаления. Роль TNF-α в ТНРМЖ двояка. С одной стороны, он способствует EMT, с другой – активирует противоопухолевые CTL. TNF-α по данным некоторых авторов – предиктор раннего рецидива и низкой эффективности химиотерапии при ТНРМЖ (BMC Cancer. 2011; 11: 130).

Общий недостаток методов определения тактики с использованием субпопуляций лимфоцитов, лимфоидной инфильтрации и концентрации цитокинов связан с тем, что большинство из них связано лишь с оценкой одного из методов лечения – иммунотерапии. Исключения составляют MDSC и TNF-α, уровень которых, согласно данным нескольких авторов, ассоциирован с эффективностью неоадъювантной химиотерапии. Но даже в этом случае выбор тактики не представлен четким алгоритмом, а имеет лишь описательный характер.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, предложенный группой авторов, которые анализировали взаимосвязь уровня экспрессии РНК, связанной с субпопуляций иммунокомпетентных клеток, и эффективностью неоадъювантной терапии с использованием препаратов патины и таксанов (паклитаксел, карбоплатин), а также PARP ингибиторов (велипариб). В работе проведен повторный анализ результатов 3 фазы двойного слепого исследования (BrighTness), посвященного оценке эффективности неоадъювантной терапии у больных с ТНРМЖ, в котором приняли участие 635 женщин со II и III клиническими стадиями из 145 исследовательских центров, локализованных в 15 странах. Пациентки получали лечение в период с апреля 2014 года по март 2016 года. Анализ полученных данных был проведен с января 2018 года по март 2019 года (Filho O. M., Stover D.G., Asad S. et al. Association of immunophenotype with pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy for triple-negative breast cancer. A secondary analysis of the BrighTness 3 randomized clinical trial // JAMA Oncol. – 2021. – Vol. 7, № 4 – P. 603 – 608).

В исследование на первом этапе были включены 634 пациентки. Из них 152 в дальнейшем были исключены (у 146 отсутствовали данные биопсии до начала лечения, у 6 в процессе исследования выяснилось, что РНК не пригодна для анализа). Данные 482 пациенток были включены в анализ. Пациентки первой группы (237 человек) в неоадъювантном режиме получали лечение: паклитаксел + карбоплатин + велипариб; второй группы (122 человека): паклитаксел + карбоплатин; третьей группы (123 человека): паклитаксел. На втором этапе до хирургического лечения пациентки всех групп получали четыре цикла доксорубицина в сочетании с циклофосфамидом.

Биопсийный материал сохранялся в растворе, предотвращающем деградацию РНК. Сиквенс РНК осуществлялся на аппарате Illumina HiSeq 3000. Оценка экспрессии генов проводилась по описанным в ранних публикациях алгоритмам с целью определения молекулярного подтипа опухоли (PAM 50, молекулярные подтипы ТНРМЖ) и характеристики субпопуляций опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (GeparSixto, CIBERSORT, TIMER).

PAM 50 (prediction analysis of microarray, микрочип для прогноза) – совокупность 50 генов, позволяющая классифицировать РМЖ и выделить 4 подтипа: люминальный А, люминальный В, с гиперэкспрессией маркера Her-2 и базально- подобный. Трижды негативный фенотип относится к базально-подобному подтипу при стратификации с использованием PAM 50 (J. Clin. Oncol. 2023; 41 (26): 4192‑4199).

Для выделения подтипов ТНРМЖ железы авторы использовали классификацию, предложенную Lehmann B.D. с соавторами в 2014 году. Согласно этой классификации, имеется 6 типов опухолей, различающихся по биологическим свойствам: базально-подобный 1, 2 (BL1, BL2); мезенхимальный (М), мезенхимально-стволовой (MSL), иммуномодуляторный (IM), андрогенорецепторный (LAR). Остальные варианты относятся к нестабильному типу (UNS). BL является наиболее распространенным молекулярным подтипом (BL1 – 22%, BL2 – 12%). BL1 характеризуется нарушением экспрессии генов, регулирующих клеточный цикл и репарацию ДНК: амплификация MYC, PIK3CA, CDK6, KRAS, FGFR1, IGF1R, CCNE1, CDKN2A/B; делеции BRCA2, PTEN, MDM2, RB1, TP53. M (21%) характеризуется дезорганизацией сигнальных путей, регулирующих клеточную миграцию, взаимодействие рецепторов с экстрацеллюляным матриксом, а также дифференцировку (Wnt/β-катенин, TGF-β; transforming growth factor beta). MSL (10%) связан с низкой экспрессией генов, регулирующих пролиферацию, и высокой – генов, ассоциированных со стволовыми клетками (ABCA8, PROCR, ENG, ALDHA1, PER1, ABCB1, BCL2, BMP2). Кроме того, клетки часто экспрессируют маркеры стволовых клеток (BMP2, ENG, KDR, NGFR, NTSE, PDGFR, VCAM1). IM (18 %) характеризуется гиперэкспрессией генов, связанных с реализацией иммунного ответа: метаболические пути натуральных киллеров, Т-хелперов, В –клеток, дендритных клеток, а также сигнальных путей, связанных с IL-7 и IL-12. LAR (9%) существенно отличается от других вариантов опухолей. Он отличается высоким уровнем экспрессии андрогеновых рецепторов (в 10 раз выше по сравнению с другими подтипами) и гиперэкспрессией генов, ассоциированных с биосинтезом стероидных гормонов (J. Pathol. 2014; 232 (2): 142‑150).

GeparSixto – клиническое исследование, в котором оценивалась эффективность неоадъювантной химиотерапии у больных с ТНРМЖ. В процессе исследования было выявлено 13 генов, уровень мРНК которых ассоциирован с преобладанием иммуноактивирующих (CXCL9, CCL5, CD8A, CD80, CXCL13, IGKC, CD21) или иммуносупрессивных (IDO1, PD-1, PD-L1, CTLA-4, FOXP3) маркеров на опухоль-инфильтрирующих лимфоцитах (J. Clin. Oncol. 2015; 33 (9): 983 ‑ 991).

CIBERSORT (cell type identification by estimating samples of RNA transcripts, идентификация клеточных субпопуляций путем оценки транскрипции РНК) – алгоритм и пакет прикладных программ на основе компьютерного обучения, позволяющий выявить преобладающие субпопуляции в микроокружении опухоли. Алгоритм предполагает сравнение уровня экспрессии 561 гена с референсным интервалом с целью идентификации одной из 22 субпопуляций клеток: В клетки не дифференцированные, В клетки памяти, плазматические клетки, CD8+ клетки, CD4+ не дифференцированные, CD4+ клетки памяти, CD4+ активированные клетки, фолликулярные Т-хелперы, Т-регуляторные клетки, гамма/дельта Т-клетки, натуральные киллеры покоящиеся, натуральные киллеры активированные, моноциты, макрофаги не дифференцированные, М1-макрофаги, М2-макрофаги, дендритные клетки покоящиеся, дендритные клетки активированные, базофилы покоящиеся, базофилы активированные, эозинфилы, нейтрофилы (Nat. Methods. 2015; 12 (5): 453 ‑ 457. Methods. Mol. Biol. 2018; 1711: 243 ‑ 259).

TIMER (tumor immune estimation resource, ресурс по оценке опухолевого иммунитета) – база данных и веб ресурс, включающий более 10000 образцов, относящихся к 23 типам опухолей, позволяющий оценить взаимосвязь субпопуляций иммунокомпетентных клеток с различными маркерами канцерогенеза и эффективностью различных вариантов лечения (Genome. Biol. 2016; 17: 174).

Характеристика групп пациентов, включенных в исследование, отражена в таблице 3.

Таблица 3. Клинико-биологическая характеристика групп пациентов, включенных в исследование

Параметр Группа в целом (N=482) Группа А (N=237) Группа В (N=122) Группа С (N=123) N % N % N % N % BRCA1/2 мутации + 75 15,6 39 16,5 18 14,8 18 14,6 - 407 84,4 198 83,5 104 85,3 105 85,4 ЛУ N0 274 56,9 133 56,1 67 54,9 74 60,2 N1-2 208 43,2 104 43,9 55 45,1 49 39,8 ECOG PS 0 427 88,6 205 86,5 107 87,7 115 93,5 1 55 11,4 32 13,5 15 12,3 8 6,5 ОО ЧО 246 51 110 46,4 53 43,4 83 67,5 ПО 236 49 127 53,6 69 56,6 40 32,5 PAM50 Базальный 386 80,1 191 80,6 98 80,3 97 78,9 Не базальный 96 19,9 46 19,4 24 19,7 26 21,1 Подтип ТНРМЖ BL1 79 16,4 42 17,7 20 16,4 17 13,8 BL2 33 6,9 21 8,9 5 4,1 7 5,7 IM 108 22,4 53 22,4 28 23 27 22 LAR 29 6 12 5,1 8 6,6 9 7,3 M 102 21,2 48 20,3 25 20,5 29 23,6 MSL 51 10,6 26 11 11 9 14 11,4 UNS 80 16,6 35 14,8 25 20,5 20 16,3

BRCA – breast cancer gene; ЛУ – лимфатические узлы; ОО – объективный ответ; PAM50 – микрочип для анализа 50 генов; ТНРМЖ – трижды негативный рак молочной железы; ЧО – частичный ответ, ПО – полный ответ; BL – базально-подобный подтип; IM – иммуномодуляторный подтип; LAR – андрогенорецепторный подтип; M – мезенхимальный подтип; MSL – мезенхимально-стволовой подтип; UNS – не стабильный подтип; А – паклитаксел + кабоплатин + велипариб ; В – паклитаксел + кабоплатин ; С – паклитаксел.

У большинства пациенток (386; 80,1%) опухоль относилась к базально-подобному типу по классификации PAM50. В этой подгруппе полных клинико – патологических ответов на лечение была максимальной (202 из 386; 52,3%). Среди подтипов ТНРМЖ по классификации Lehmann B.D., у больных с иммуномодуляторным типом опухоли отмечалась наибольшая частота полных клинико-морфологических ответов (70 из 109; 64,2%), наименьшая – при андрогенорецепторном подтипе (8 из 29; 27,6%). При проведении множественного логистического регрессионного анализа, авторы выявили, что единственным параметром, влияющим на вероятность достижения полного клинико-патологического ответа и в группе в целом, и во всех подгруппах является экспрессия генов иммунного ответа согласно алгоритму GeparSixto (таблица 4).

Таблица 4. Параметры модели множественной логистической регрессии, связывающей частоту полного клинико-морфологического ответа в подгруппах с разными вариантами лечения

Параметр Группа Подгруппы А, В Подгруппа С ОР
(95% ДИ) p ОР
(95% ДИ) p ОР
(95% ДИ) p Модель 1 Режим введения Один раз в 2 недели 1 - 1 - 1 - Один раз в 3 недели 1,12
(0,77-1,63) 0,55 1,17
(0,76-1,82) 0,47 1,11
(0,49-2,49) 0,8 ЛУ N0 1 - 1 - 1 - N1-2 1,68
(1,16-2,44) 0,006 1,91
(1,24-2,95) 0,003 1,5
(0,66-3,42) 0,33 ECOG PS 0 1 - 1 - 1 - 1 1,24
(0,69-2,23) 0,47 1,64
(0,87-3,12) 0,13 0,58
(0,12-2,75) 0,49 BRCA 1/2 мутации - 1 - 1 - 1 - + 0,69
(0,41-1,14) 0,14 0,79
(0,44-1,43) 0,44 0,41
(0,15-1,16) 0,09 PAM50 Базальный 1 - 1 - 1 - Не базальный 1,97
(1,23-3,16) 0,005 2,11
(1,23-3,64) 0,007 1,9
(0,67-5,39) 0,23 Модель 2 Режим введения Один раз в 2 недели 1 - 1 - 1 - Один раз в 3 недели 1,21
(0,82-1,78) 0,35 1,3
(0,83-2,05) 0,26 1,14
(0,5-2,62) 0,76 ЛУ N0 1 - 1 - 1 - N1-2 1,8
(1,22-2,65) 0,003 2,14
(1,36-3,36) 0,001 1,57
(0,66-3,75) 0,31 ECOG PS 0 1 - 1 - 1 - 1 1,3
(0,71-2,37) 0,39 1,79
(0,92-3,48) 0,09 0,53
(0,11-2,59) 0,44 BRCA 1/2 мутации - 1 - 1 - 1 - + 0,65
(0,38-1,09) 0,1 0,76
(0,41-1,41) 0,38 0,34
(0,12-1,01) 0,05 Индекс GeparSixto 0,62
(0,49-0,79) < 0,01 0,6
(0,45-0,8) < 0,01 0,59
(0,36-0,99) 0,04 Пролиферативный индекс 0,36
(0,21-0,61) < 0,01 0,31
(0,17-0,58) < 0,01 0,38
(0,11-1,31) 0,13

BRCA – breast cancer gene; ЛУ – лимфатические узлы; ОР – относительный риск; ДИ – доверительный интервал; PAM50 – микрочип для анализа 50 генов; А – паклитаксел + кабоплатин + велипариб ; В – паклитаксел + кабоплатин ; С – паклитаксел.

При анализе влияния субпопуляций лимфоцитов крови пациентов, определяемых согласно алгоритмам TIMER и CIBERSORT, авторами выявлено, что преобладание цитотоксических лимфоцитов в общем лимфоцитарном пуле ассоциировано со снижением риска не достижения полного клинико-морфологического ответа в подгруппах, где пациентки) в неоадъювантном режиме получали паклитаксел в сочетании с карбоплатином и велипарибом или паклитаксел в сочетании с карбоплатином (относительный риск – 0,8). В то же время, в подгруппе, где пациентки получали только паклитаксел риск не достижения полного клинико-морфологического ответа на фоне неоадъювантной химиотерапии связан с высокой концентрацией макрофагов (TIMER, относительный риск – 1,4; CIBERSORT – 1,05), и особенно субпопуляции M2-макрофагов (CIBERSORT, относительный риск – 1,3).

По сравнению с другими известными аналогами, способ определения тактики лечения больных с ТНРМЖ, предложенный в прототипе способ имеет несколько преимуществ.

1. Авторы показали, что иммунологические параметры могут быть использованы не только для предсказания эффективности различных вариантов иммунотерапии, что было продемонстрировано также и в других работах (Cancers. 2021; 13 (6): 1305. Front. Immunol. 2019; 10: 1767), но также могут быть применены и для других видов лекарственной терапии: химиотерапии и PARP – ингибиторов.

2. Несмотря на то, что исследователи использовали косвенные методы оценки иммунного статуса, которые не подразумевали непосредственную оценку содержания субпопуляций лимфоцитов и их цитокин-продуцирующую способность, были применены сразу несколько алгоритмов (GeparSixto, TIMER, CIBERSORT), основанных на оценке экспрессии генов, ассоциированных с разными субпопуляциями, что повысило точность прогностической модели.

Существенными недостатками способа, предложенного в прототипе, являются использование в качестве модели неоадъювантной химиотерапии, отсутствие прямой оценки соотношения популяций и критериев эффективности PARP – ингибиторов и химиопрепаратов в режиме монотерапии.

1. Использование в качестве модели лекарственной терапии в неоадъювантном режиме подразумевает включение в исследование больных с первично операбельным РМЖ. Во множестве публикаций показано, что основные изменения в составе и функциях клеток лимфоидного и миелоидного ряда в микроокружении опухоли и крови возникают на этапе появления метастазов и рецидивов (Cancer Res. 2022; 82(24): 4497-4510). На ранних этапах канцерогенеза изменения минимальны, и, по современным представлениям о взаимодействии опухоли и иммунной системы на разных этапах эволюции опухоли, соответствуют фазе равновесия (J. Hemathol. Oncol. 2023; 16(1): 38). Таким образом, на той стадии, которая изучалась авторами, изменения были минимальны, что не позволило создать точный алгоритм, определяющий тактику лечения.

2. В проведенном исследовании отсутствовала группа, в которой больные получали бы ингибиторы PD-1/PD-L1, что также связано с не корректным выбором клинической модели. Авторы оценивали эффективность комбинации химиопрепаратов с PARP – ингибиторами (велипариб). В то же время, в многоцентровом исследовании продемонстрировано существенное повышение эффективности лечения при использовании комбинации классической химиотерапии и ингибитора PD-L1 атезолизумаба (Ann. Oncol. 2022; 33 (5): 534 - 543). А при лечении метастатических форм и рецидивов этот вариант терапии входит в стандарты лечения.

3. Предложенная авторами модель не позволяет четко дифференцировать подгруппу, в которой наилучший эффект можно получить при использовании PARP – ингибиторов в монорежиме.

4. Как было отмечено ранее, авторы использовали косвенные методы оценки иммунного статуса, основанные на анализе мРНК, ассоциированной с генами, вовлеченными в процессы иммуногенеза. Подобный подход не является корректным, так как одни и те же гены могут гиперэкспрессироваться в клетках различных субпопуляций, обладающих, в ряде случаев, разными и даже взаимоисключающими свойствами. Таким образом, выбор РНК в качестве модели оценки иммунного статуса не позволил авторам создать адекватный алгоритм определения тактики лечения.

Технический результат настоящего изобретения состоит в создании алгоритма определения тактики лечения больных с метастатическими формами и рецидивами ТНРМЖ.

Этот результат достигается тем, что у больных с метастатическими формами и рецидивами ТНРМЖ методом проточной цитометрии в микроокружении опухоли определяют концентрацию клеток, экспрессирующих маркеры CD36+CD163+CD206+ (Х1, М2-макрофаги), LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (Х2, супрессорные клетки миелоидного происхождения), в крови – концентрацию гамма/дельта Т-лимфоцитов (X3), в культуре лимфоцитов – уровень спонтанной продукции TNF-α (X4) и TGF-β (Х5). По полученным значениям рассчитывают дискриминантные функции:

F1=0,2366 х Х1 + 0,0669 х Х2 + 0,0071 х Х3 + 0,0841 х Х4 + 0,0003 х Х5 – 35,8285;

F2=0,1464 х Х1 - 0,0116 х Х2 + 0,016 х Х3 + 0,3361 х Х4 + 0,0161 х Х5 – 49,959;

F3= 0,3663 х Х1 + 0,0569 х Х2 + 0,0247 х Х3 + 0,0221 х Х4 - 0,0201 х Х5 – 52,5154,

и определяют тактику лечения по наибольшему значению одной из функций: при наибольшем значении F1, больному вводят олапариб в дозе 300 мг два раза в сутки перорально или талазопариб в дозе 1 мг один раз в сутки перорально;

при наибольшем значении F2 - наб-паклитаксел в дозе 100 мг/м² внутривенно капельно в первый, восьмой и пятнадцатый дни и атезолизумабом в дозе 1680 мг в первый день четырехнедельного цикла;

при наибольшем значении F3 – доцетаксел в дозе 75 мг/м² внутривенно капельно в первый день и бевацизумаб в дозе 15 мг/м² внутривенно капельно в первый день трехнедельного цикла, и такое лечение проводят до прогрессирования или до появления не коррегируемых побочных эффектов.

Занимаясь профессионально в течение ряда лет лечением больных ТНРМЖ, мы изучали различные варианты лекарственной терапии, а также фундаментальные и клинические аспекты взаимодействия опухоли и иммунной системы. С 2017 года у всех больных ТНРМЖ мы изучали иммунный статус и содержание иммунокомпетентых клеток в микроокружении опухоли с целью оценки прогностической, предсказательной значимости различных параметров. У больных в крови оценивалось содержание лимфоцитов, их субпопуляций и цитокинов. Анализы проводились в иммунологической лаборатории ФГУЗ ВЦЭРМ им. А.М.Никифорова МЧС России на лазерном проточном цитометре Cytomics FC 500 (BECKMAN COULTER Inc., USA) с использованием моноклональных антител и расходных материалов компаний BECKMAN COULTER Inc. и IMMUNOTECH S.A.S. с применением стандартизованной технологии исследования субпопуляционного состава лимфоцитов (Медицинская иммунология. 2012;14(3): 255 - 268). Спектр исследуемых параметров и их референсные интервалы отражены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5. Субпопуляции лимфоцитов

Фенотип Субпопуляция лимфоцитов Референсный интервал (кровь). Относительное содержание (%) Референсный интервал (кровь). Абсолютное содержание (х 10⁹/л) CD3+CD16− Зрелые Т-лимфоциты 52 − 76 950 – 1800 CD3+CD8+ Цитотоксические лимфоциты 23 − 40 450 – 850 CD3+CD4+ Т-хелперы 31 − 46 570 – 1100 CD4+CD8+ Дубль-позитивные Т-клетки 0,1 – 1,1 5 – 15 CD3−CD16+CD56+ Натуральные киллеры 9 − 19 180 – 420 CD3-CD8+; Активированные натуральные киллеры 1,5 − 6 18 – 150 CD16+CD56+HLA DR+ 0 − 5 0 – 120 CD3+CD16+CD56+ TNK – Клетки 0,1 − 8 5 – 200 CD3 -CD19+ В-лимфоциты 6 − 18 150 – 450 CD4+CD25+CD127-FOXP3 Т- регуляторные клетки (Treg) 0,3 − 10 0 – 110 CD3+ HLA DR+ Активированные Т-клетки 0 − 5 0 – 120 HLA DR+ Активированные антиген-презентирующие клетки 6 − 22 150 – 550 αβ –Т Альфа/бета Т - клетки 60 − 80 925 – 1965 γδ – Т Гамма/дельта Т – клетки 2 − 7 1 – 115 LIN-HLADR-CD33+CD66b−CD14+ CD15− Супрессорные клетки миелоидного происхождения 0,2 - 11 0 – 120 CD36+CD163+CD206+ М2-макрофаги 0 - 5 0 - 25

Таблица 6. Параметры цитокинового профиля

Цитокин Референсный интервал Спонтанная продукция Индуцированная продукция Концентрация в сыворотке Интерлейкин-1β (IL-1, пг/мл) 0 − 50 1000 − 5000 0 − 50 Интерлейкин-2 (IL-2, пг/мл) 0 − 5 10 − 100 0 Интерлейкин-4 (IL-4, пг/мл) 0 − 50 100 − 400 0 − 50 Интерлейкин-6 (IL-6, пг/мл) 0 − 50 1000 − 3000 0 − 50 Интерлейкин-8 (IL-8, пг/мл) 0 − 100 1000 − 5000 0 − 50 Интерлейкин-10 (IL-10, пг/мл) 0 − 50 100 −400 0 − 50 Интерлейкин-12(IL-12, пг/мл) 0 − 50 100 − 600 0 − 50 Интерферон-α (IFN-α, пг/мл) 0 − 50 100 − 500 0 − 50 Интерферон-γ (IFN-γ, пг/мл) 0 − 50 1000 − 5000 0 − 50 Фактор некроза опухолей-α
(TNF-α, пг/мл) 0 − 50 500 − 1500 0 − 50 Трансформирующий фактор роста-β (TGF-β, пг/мл) 0 - 50 1 − 1000 0 − 20 Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF, пг/мл) 0 - 20 500 − 1500 0 − 50

Уровень лимфоцитов и их субпопуляций оценивался в периферической крови. Анализ цитокинового профиля проводился в два этапа. На первом этапе определялась сывороточная концентрация. На втором проводилось исследование в культуре клеток, где определялся их потенциал путем оценки спонтанной и индуцированной продукции цитокинов. Оценка лимфоцитов, их субпопуляций и цитокинового профиля проводилась в одно и то же время суток, чтобы избежать влияния циркадных колебаний.

В микроокружении опухоли иммунологический профиль оценивался однократно. Референсных интервалов для определения концентрации иммунокомпетентных клеток, а также концентрации, спонтанной и индуцированной продукции цитокинов в микроокружении в настоящее время не существует.

Опухолевый материал объемом около 10 мм³ помещался в два флакона, в одном из которых находилась питательная среда DMEM-F12 для определения спонтанной продукции, а в другом – та же питательная среда с комплексом поликлональных активаторов (фитогемагглютинин 4 мкг/мл, конканавалин А 4 мкг/мл, липополисахарид 2 мкг/мл). Далее происходило инкубирование при 37°С в течение 72 часов. Клетки опухоли осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 мин. После осаждения клеток иммуноферментным методом определяли концентрацию цитокинов и факторов роста.

Алгоритм разработки способа определения тактики лечения больных с метастазами и рецидивами ТНРМЖ включал три этапа. На первом проводился однофакторный анализ, где в качестве переменных были включены все иммунологические параметры, которые оценивались в микроокружении опухоли и крови (таблицы 5, 6). Оценивалось влияние иммунологических параметров на медиану выживаемости без прогрессирования. На втором этапе проводился многофакторный анализ, в котором исключались взаимовлияющие компоненты. На третьем этапе проводился дискриминантный анализ, где в качестве переменных были выбраны параметры, выявленные при многофакторном анализе. В расчетах были использованы только те параметры, которые оказывали влияние на медиану выживаемости без прогрессирования во всех подгруппах (химиотерапия, иммунохимиотерапия, PARP ингибиторы).

Для разработки способа были использованы данные 179 пациентов (63 пациента – исследовательская группа; 116 – группа валидации). В исследовании приняли участие больные с метастатическими формами и с рецидивами трижды негативного рака молочной железы. Клинические характеристики групп отражены в таблице 7.

Таблица 7. клиническая характеристика пациентов исследовательской группы (n=63) и группы валидации (n=116)

Параметр Значение Группа (И, В) Число больных % Возраст ≥ 50 лет И 42 61,5 В 68 <50 лет И 21 38,5 В 48 Подгруппа Метастазы И 42 72 В 87 Рецидив И 21 28 В 29 Гистологический тип опухоли Не специфический тип И 58 87,2 В 98 Другие гистологические варианты И 11 12,8 В 18 BRCA статус + И 31 59,2 В 75 - И 30 37,4 В 37 Не известно И 2 3,4 В 4 Локализация метастазов Легкие И 12 21,8 В 27 Кости И 21 26,3 В 26 Лимфатические узлы И 24 57 В 78 Головной мозг И 2 3,9 В 5 Печень И 9 31,8 В 48 Хирургическое лечение Мастэктомия И 21 49,7 В 68 Органо-
сохраняющее И 18 22,9 В 23 Метастазэктомия И 4 10,1 В 12 Системная лекарственная терапия ХТ И 23 41,9 В 52 ИХТ И 22 33 В 37 П И 18 25,1 В 27

И – исследовательская группа; В – группа валидации; ХТ – химиотерапия; ИХТ – иммунохимиотерапия; П – PARP ингибиторы.

Исследовательская группа и группа валидации были сопоставимы по основным клинико-патологическим параметрам. Больные обоих групп получали лечение в соответствии с рекомендациями Минздрава России. Основной режим химиотерапии включал доцетаксел в дозе 75 мг/м² внутривенно капельно в первый день трехнедельного цикла в сочетании с бевацизумабом в дозе 15 мг/м² внутривенно капельно в первый день трехнедельного цикла. Режим иммунохимиотерапии включал наб-паклитаксел в дозе 100 мг/м² внутривенно капельно в первый, восьмой и пятнадцатый дни четырехнедельного цикла в сочетании с атезолизумабом в дозе 1680 мг в первый день четырехнедельного цикла. PARP – ингибиторы, которые получали больные изучаемых групп, включали олапариб по 300 мг перорально два раза в сутки (37 человек) или талазопариб по 1 мг перорально один раз в сутки (8 человек). Во всех случаях терапия проводилась до прогрессирования или появления не корригируемых побочных эффектов. Химиотерапия проводилась в первой линии. Иммунохимиотерапия проводилась у больных в первой (48 человек) или во второй (11 человек) линии терапии. Во второй линии лечение проводилось на фоне прогрессирования после двух циклов химиотерапии. У большинства больных (45 человек) лечение проводилось при наличии экспрессии PD-L1 (тест Ventana SP142). У 14 человек во второй линии иммунохимиотерапия проводилась у больных при отсутствии экспрессии PD-L1 в случае отсутствие альтернативных вариантов. PARP ингибиторы применялись у больных при наличии BRCA мутаций в первой линии (37 человек) или во второй (8 человек). В первой линии PARP ингибиторы применялись в том случае, если метастазы появлялись после неоадъювантной или адъювантной химиотерапии, включающей таксаны. Во второй линии PARP ингибиторы использовались на фоне прогрессирования после двух циклов химиотерапии и отсутствии экспрессии PD-L1.

Для однофакторного анализа были выбраны параметры, указанные в таблицах 5 и 6, а также несколько номинальных: возраст, BRCA статус, гистологический тип опухоли, локализация метастазов. Оценка влияния различных факторов на отдаленные результаты лечения проводилась с использованием логарифмического рангового критерия и критерия Гехана – Вилкоксона.

В результате однофакторного анализа выявлены параметры, влияющие на медиану безрецидивной выживаемости (М – микроокружение; К - кровь):

1) подгруппа, в которой больные получали химиотерапию: возраст; субпопуляции лимфоцитов: CD3+CD8+ (М), CD3−CD16+CD56+ (М), CD3+CD16+CD56+ (М), CD4+CD25+CD127-FOXP3 (М, К), LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (М), CD4+CD8+ (М, К); CD36+CD163+CD206+ (М), гамма/дельта Т-лимфоцитов (К); спонтанная продукция цитокинов: IL-4 (М, К), IL-6 (М, К), IL-8 (М, К), IL-10 (М), IL-12 (М), TNF-α (М, К), IFN-γ (М), TGF- β (М, К); индуцированная продукция цитокинов: IL-6 (М), IL-8 (К), IL-10 (М, K), TNF-α (М), IFN-γ (М, К);

2) подгруппа, в которой больные получали иммунохимиотерапию: локализация метастазов; субпопуляции лимфоцитов: CD3+CD8+ (М), CD4+CD25+CD127-FOXP3 (М, К), LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (М), CD36+CD163+CD206+ (М), гамма/дельта Т-лимфоцитов (К); спонтанная продукция цитокинов: IL-6 (К), IL-8 (М), TNF-α (М, К), IFN-γ (М), TGF- β (М, К); индуцированная продукция цитокинов: IL-6 (М), IL-8 (К);

3) подгруппа, в которой больные получали PARP ингибиторы: гистологический тип опухоли; субпопуляции лимфоцитов: CD3+CD8+ (М), CD3−CD16+CD56+ (М), CD4+CD25+CD127-FOXP3 (М), LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (М), CD36+CD163+CD206+ (М), гамма/дельта Т-лимфоцитов (К); спонтанная продукция цитокинов: IL-8 (М), IL-10 (М), TNF-α (М), TGF- β (М, К); индуцированная продукция цитокинов: IL-6 (М), IL-10 (М), TNF-α (М).

Многофакторный анализ проводился с использованием регрессионной модели пропорциональных интенсивностей Кокса, позволяющей оценить влияние совокупности параметров и вклад каждого из них в показатели выживаемости независимо от характера распределения в выборке. Результаты многофакторного анализа отражены в таблице 8.

Таблица 8. Параметры прогностических моделей, связывающих медиану выживаемости без прогрессирования с факторами микроокружения опухоли и крови

Параметр β k % M Me 95% ДИ p Подгруппа: системная химиотерапия КФ Возраст 0,004 3,2 _ 0,045 МО СЛ CD36+CD163+CD206+ -0,006 7,9 52 69 21 - 124 0,002 CD3+CD16+CD56+ 0,001 11,9 212 242 162 - 314 0,048 CD4+CD25+CD127-FOXP3 -0,004 8,4 144 168 122 - 432 0,001 LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- -0,003 9,1 190 216 104 - 278 < 0,001 Ц IL-8, СП -0,001 8,1 430 312 280 - 416 0,03 IL-10, СП -0,002 8,9 102 92 87 - 242 0,047 К СЛ γδ – Т 0,004 9,9 247 194 162 - 258 0,043 CD4+CD25+CD127-FOXP3 -0,005 5,8 132 110 62 - 167 < 0,001 Ц IL-4, СП -0,002 3,9 143 110 98 - 210 0,023 IL-6, СП -0,003 7,1 192 145 134 - 223 0,044 TNF-α, СП 0,006 4,1 196 167 154 - 214 < 0,001 TGF- β, СП -0,007 11,7 84 65 43 - 102 0,012 Подгруппа: иммунохимиотерапия МО СЛ LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- -0,007 16,2 125 141 97 - 195 0,023 CD36+CD163+CD206+ -0,004 17,5 38 48 8 - 61 < 0,001 Ц TGF- β, СП -0,001 9,4 69 44 29 - 71 0,043 К СЛ γδ – Т 0,005 9,3 284 265 234 - 329 < 0,001 CD4+CD25+CD127-FOXP3 -0,043 11,4 95 106 72 - 149 0,032 Ц IL-8, ИП 0,024 7,5 5789 6225 4945 - 6872 0,029 TNF-α, СП 0,009 12,3 231 212 191 - 263 < 0,001 TGF- β, СП -0,078 16,4 72 81 39 - 92 0,01 Подгруппа: PARP ингибиторы КФ Гистологический тип опухоли 0,002 2,9 - 0,048 МО СЛ CD3+CD8+ 8,4 382 361 294 - 411 0,037 CD4+CD25+CD127-FOXP3 -0,002 8,7 151 189 138 - 302 0,031 LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- -0,005 12,1 241 295 232 - 385 < 0,001 CD36+CD163+CD206+ -0,002 14,9 71 94 85 - 149 < 0,001 Ц IL-8, СП -0,002 10,4 173 192 161 - 232 0,042 TGF- β, СП -0,008 9,5 132 161 105 - 192 < 0,001 К СЛ γδ – Т 0,012 11,1 172 181 147 - 226 0,011 Ц TNF-α, СП 0,022 10,6 145 131 112 - 179 0,044 TGF- β, СП -0,018 11,4 98 118 79 - 161 < 0,001

β – коэффициент уравнения регрессии, k – коэффициент влияния параметра, M – среднее арифметическое, Ме – медиана, 95% ДИ – 95% доверительный интервал, СЛ – субпопуляции лимфоцитов, Ц – цитокины, МО – микроокружение опухоли, К – кровь.

В результате многофакторного анализа выявлено, что на медиану выживаемости без прогрессирования при всех вариантах лечения оказывали влияние следующие параметры: в микроокружении опухоли - CD36+CD163+CD206+ (Х1, М2-макрофаги), LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (Х2, супрессорные клетки миелоидного происхождения); в крови – концентрация γδ – Т (Х3, гамма/дельта Т-лимфоциты); в культуре лимфоцитов – спонтанная продукция TNF-α (X4) и TGF-β (Х5). Эти параметры были использованы для дискриминантного анализа. По полученным данным были созданы линейные классификационные функции:

F1=0,2366 х Х1 + 0,0669 х Х2 + 0,0071 х Х3 + 0,0841 х Х4 + 0,0003 х Х5 – 35,8285;

F2=0,1464 х Х1 - 0,0116 х Х2 + 0,016 х Х3 + 0,3361 х Х4 + 0,0161 х Х5 – 49,959;

F3= 0,3663 х Х1 + 0,0569 х Х2 + 0,0247 х Х3 + 0,0221 х Х4 - 0,0201 х Х5 – 52,5154.

F1 включает комбинацию значений параметров, при которых достигаются наилучшие показатели выживаемости без прогрессирования на фоне применения PARP ингибиторов. F2 включает комбинацию значений параметров, при которых достигаются наилучшие показатели выживаемости без прогрессирования на фоне применения иммунохимиотерапии. F3 включает комбинацию значений параметров, при которых достигаются наилучшие показатели выживаемости без прогрессирования на фоне применения химиотерапии. Тактику определяют по наибольшему значению функций.

Для валидации у всех больных были рассчитаны дискриминантные функции и определена тактика в соответствии с разрабатываемым способом. Далее проводился расчет и сравнение медианы выживаемости без прогрессирования в подгруппах, где распределение в соответствии с разными вариантами лечения совпадало и не совпадало при использовании разрабатываемого и стандартных способов (BRCA мутации, экспрессия PD-L1). Результаты валидации разработанного способа отражены в таблице 9.

Таблица 9. Медиана выживаемости без прогрессирования в подгруппах, где стандартные критерии определения тактики и критерии в соответствии с разработанным способом совпадают или различаются

Лечение Критерии
определения тактики (С, Р) Число больных Ме 95% ДИ p ХТ С 52 8,1 5,8-10,3 < 0,005 Р 41 11,1 9,7-13,1 ИХТ С 37 5,9 4,5-7,9 < 0,001 Р 24 8,2 7,5-9,1 PARP С 27 6,4 5,1-7,2 0,038 Р 21 9,6 7,1-10,2

ХТ – химиотерапия; ИХТ – иммунохимиотерапия; PARP – поли-АДФ-рибоза полимеразы ингибиторы; С – стандартные критерии назначения терапии; Р – критерии терапии в соответствии с разработанным способом; Me – медиана выживаемости без прогрессирования; ДИ – доверительный интервал.

Во всех группах (ХТ, ИХТ, PARP-ингибиторы) медиана выживаемости без прогрессирования была достоверна выше в подгруппах, где расчет производился в соответствии с разработанным способом по сравнению с подгруппами, сформированными в соответствии со стандартными критериями (экспрессия PD-L1, мутации BRCA). Разработанный способ представляет собой точный алгоритм, позволяющий из выбрать из альтернативных вариантов потенциально наиболее эффективный метод лечения.

Сущность способа заключается в следующем.

У пациенток с метастазами или рецидивами ТНМЖ методом проточной цитометрии в микроокружении опухоли определяют концентрацию клеток, экспрессирующих маркеры CD36+CD163+CD206+ (Х1, М2-макрофаги), LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (Х2, супрессорные клетки миелоидного происхождения), в крови – концентрацию гамма/дельта Т-лимфоцитов (X3), в культуре лимфоцитов – уровень спонтанной продукции TNF-α (X4) и TGF-β (Х5). Затем по полученным значениям рассчитывают дискриминантные функции:

F1=0,2366 х Х1 + 0,0669 х Х2 + 0,0071 х Х3 + 0,0841 х Х4 + 0,0003 х Х5 – 35,8285;

F2=0,1464 х Х1 - 0,0116 х Х2 + 0,016 х Х3 + 0,3361 х Х4 + 0,0161 х Х5 – 49,959;

F3= 0,3663 х Х1 + 0,0569 х Х2 + 0,0247 х Х3 + 0,0221 х Х4 - 0,0201 х Х5 – 52,5154,

и определяют наибольшее значение функций. Если наибольшее значение имеет F1, то больному проводят лечение препаратами олапариб в дозе 300 мг два раза в сутки перорально или талазопариб в дозе 1 мг один раз в сутки перорально. Если наибольшее значение имеет F2, то больному проводят лечение препаратами наб-паклитаксел, который вводят в дозе 100 мг/м² внутривенно капельно в первый, восьмой и пятнадцатый дни и атезолизумабом, который вводят в дозе 1680 мг в первый день четырехнедельного цикла. Если наибольшее значение имеет F3, то больному проводят лечение препаратами доцетаксел, который вводят в дозе 75 мг/м² внутривенно капельно в первый день в и бевацизумабом, который вводят в дозе 15 мг/м² внутривенно капельно в первый день трехнедельного цикла. При всех вариантах лечение проводится до прогрессирования или до появления не коррегируемых побочных эффектов.

К настоящему времени предложенный способ прошел клиническую апробацию у 179 пациенток с метастазами и рецидивами трижды негативного рака молочной железы: данные 63 пациенток были использованы для разработки способа и 116 – для валидации.

Способ по сравнению с известными аналогами имеет ряд существенных преимуществ:

1. Основан на современных данных о взаимодействии опухоли и иммунной системы в процессе канцерогенеза. Включает оценку компонентов периферической крови и микроокружения опухоли.

2. Для оценки микроокружения опухоли позволяет использовать биопсийный материал, полученный из метастатических очагов, так и из рецидивов.

3. Представляет собой четкий алгоритм, позволяющий с высокой точностью прогнозировать эффективность и выбирать наиболее оптимальный из применяемых настоящее время вариантов лечения с трижды негативным раком молочной железы.

4. Позволяет повысить эффективность проводимого лечения за счет выбора адекватной тактики.

Способ определения тактики лечения больных с трижды негативным раком молочной железы разработан в группе молекулярно-биологического прогнозирования и индивидуализации лечения ФГБУ «РНЦРХТ им. акад. А.М. Гранова» Минздрава России и к настоящему времени прошел клиническую апробацию у 179 пациенток с положительным результатом.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для определения тактики лечения больных с метастатическими формами и рецидивами трижды негативного рака молочной железы (ТНРМЖ). В микроокружении опухоли определяют концентрацию клеток, экспрессирующих маркеры CD36+CD163+CD206+, LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15-. В крови определяют концентрацию гамма/дельта Т-лимфоцитов. В культуре лимфоцитов определяют уровень спонтанной продукции TNF-α и TGF-β. По полученным значениям рассчитывают дискриминантные функции F1, F2 и F3. Тактику лечения определяют по наибольшему значению одной из функций. Способ обеспечивает эффективное определение тактики лечения больных с метастатическими формами и рецидивами ТНРМЖ за счет создания алгоритма, позволяющего выбрать из альтернативных вариантов наиболее эффективный метод лечения. 9 табл.

Способ определения тактики лечения больных с метастатическими формами и рецидивами трижды негативного рака молочной железы, включающий оценку иммунологических факторов, отличающийся тем, что методом проточной цитометрии в микроокружении опухоли определяют концентрацию клеток, экспрессирующих маркеры CD36+CD163+CD206+ (Х1), LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (Х2), в крови – концентрацию гамма/дельта Т-лимфоцитов (X3), в культуре лимфоцитов – уровень спонтанной продукции TNF-α (X4) и TGF-β (Х5); затем по полученным значениям рассчитывают дискриминантные функции:

F1=0,2366 × Х1 + 0,0669 × Х2 + 0,0071 × Х3 + 0,0841 × Х4 + 0,0003 × Х5 - 35,8285;

F2=0,1464 × Х1 - 0,0116 × Х2 + 0,016 × Х3 + 0,3361 × Х4 + 0,0161 × Х5 - 49,959;

F3= 0,3663 × Х1 + 0,0569 × Х2 + 0,0247 × Х3 + 0,0221 × Х4 - 0,0201 × Х5 - 52,5154,

и определяют тактику лечения по наибольшему значению одной из функций: при наибольшем значении F1 больному вводят олапариб в дозе 300 мг два раза в сутки перорально или талазопариб в дозе 1 мг один раз в сутки перорально;

при наибольшем значении F2 - наб-паклитаксел в дозе 100 мг/м² внутривенно капельно в первый, восьмой и пятнадцатый дни и атезолизумаб в дозе 1680 мг в первый день четырехнедельного цикла;

при наибольшем значении F3 - доцетаксел в дозе 75 мг/м² внутривенно капельно в первый день и бевацизумаб в дозе 15 мг/м² внутривенно капельно в первый день трехнедельного цикла, и такое лечение проводят до прогрессирования или до появления некоррегируемых побочных эффектов.