Способ прогнозирования продолжительности жизни больных с метастатическими формами опухолей Российский патент 2024 года по МПК G01N33/52 C12Q1/6886 G16H50/30 

Изобретение относится к медицине, точнее, к онкологии, и может найти применение при разработке оптимальных алгоритмов тактики лечения онкологических больных с метастатическими формами опухолей.

Предсказательные факторы в онкологии в настоящее время подразделяются на прогностические, позволяющие предсказать непосредственные и отдаленные результаты лечения, и предиктивные, предсказывающие эффективность какого-либо варианта лечения (Eur. J. Cancer. 2008; 44(7):946 – 953).

Для прогноза отдаленных результатов лечения (средняя продолжительность жизни, медиана выживаемости, общая и безрецидивная выживаемость) больных с диссеминированными формами опухолей в настоящее время используются следующие группы прогностических факторов:

1. Клинические: cтатус по шкале ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group), ВОЗ или Карновского, кахексия, наличие или отсутствие местных симптомов, время от диагностики первичной опухоли до появления отдаленных метастазов.

2. Анатомические: TNM, размеры опухоли, вовлечение сосудов, поражение лимфатических узлов, локализация отдаленных метастазов.

3. Гистологические: гистологический тип опухоли и степень дифференцировки, некроз, микрометастазы в лимфатических узлах.

4. Показатели крови: альбумин, щелочная фосфатаза, лактатдегидрогеназа, С-реактивный белок, скорректированный кальций, компоненты клинического анализа крови.

5. Иммунологические компоненты периферической крови: лимфоциты и их субпопуляции: Т-регуляторные клетки, αβ/γδ – Т-лимфоциты, опухоль-ассоциированные макрофаги, супрессорные клетки миелоидного происхождения, цитокины (IL-1, 2, 4, 6, 8, 10, 12; TNF-α, TGF-β).

6. Опухолевые компоненты, циркулирующие в крови: циркулирующие опухолевые клетки, циркулирующие нуклеиновые кислоты.

7. Биомаркеры, экспрессирующиеся на поверхности зрелых и стволовых опухолевых клеток (GPNMB, Trop-2, Liv-1); маркеры протеомных исследований.

8. Изменения, связанные с передачей генетической информации: мутации определенных генов, мутационная нагрузка, микросателлитная нестабильность, паттерны экспрессии генов (генетические подписи).

9. Компоненты микроокружения: лимфоидная инфильтрация, субпопуляционный состав, паттерны экспрессии генов, связанных с иммунным ответом, цитокины, протеазы (MMP, uPA), факторы роста (TGF-β, VEGF, EGF, FGF, PDGF), хемокины (CXCL12, CXCR4), третичные лимфоидные структуры.

Для оценки влияния нескольких факторов на отдаленные результаты лечения разработана математическая модель пропорциональных интенсивностей Кокса (J. Royal. Stat. Soc. Ser. B. 1972; 34(2):187 – 220).

Большинство разработанных к настоящему времени прогностических систем созданы на основе клинических, анатомических, гистологических и гуморальных факторов. Достоинством их является простота использования. Общий недостаток связан с низкой точностью прогнозирования.

В настоящее время наиболее перспективными являются методы прогнозирования отдаленных результатов, основанные на оценке генетических изменений и компонентов микроокружения опухоли (Nat. Rew. Cancer. 2020; 20(11):662 – 680).

Известен способ прогнозирования отдаленных результатов лечения путем оценки мутационной нагрузки. Мутационная нагрузка (TMB, tumor mutational burden) рассчитывается как отношение общего числа мутаций на единицу генома. Потенциально мутационная нагрузка приводит к образованию новых антигенов и активации иммунного ответа. Для некоторых опухолей, таких как меланома, колоректальный рак, рак легкого, мутационная нагрузка, определяемая методами сиквенса следующего поколения (NGS) является предсказательным фактором в отношении отдаленных результатов лечения. Мутационная нагрузка коррелирует с частотой лимфоидной инфильтрации опухоли. Прогностическое значение мутационной нагрузки продемонстрировано у больных с разными нозологическими формами в рамках исследований эффективности иммуноонкологических препаратов (BMC Cancer. 2022; 22(1): 1185. Int. J. Mol. Sci. 2023; 24(4): 3441).

Известен способ прогнозирования отдаленных результатов путем оценки микросателлитной нестабильности. Микросателлитная нестабильность (MSI, microsatellite instability) – фенотип, обусловленный дефицитом механизмов репарации ДНК (dMMR, deficient mismatch repair). MSI ассоциирована с высокой частотой образования неоантигенов, и, как следствие, чувствительностью к иммуноонкологическим препаратам и хорошими отдаленными результатами. Некоторые варианты опухолей (колоректальный рак, рак эндометрия) характеризуются высокой частотой MSI (MSI –H: 20% - 30%) (N. Engl. J. Med. 2015; 372 (26): 2509 – 2520. Dig. Liver. Dis. 2022; 54 (10):1335 – 1341).

Известен способ прогнозирования отдаленных результатов лечения путем оценки паттерна экспрессии генов («генетической подписи»). Оценка экспрессии матричной РНК и метилирования ДНК позволяет классифицировать опухоли в соответствии с медианой выживаемости независимо от нозологической формы (J. Mol. Diagn. 2017; 19 (6): 881 – 891. PLoS One. 2023; 18 (1): e0280364).

Общий недостаток методов прогнозирования отдаленных результатов за счет оценки мутационной нагрузки, микросателлитной нестабильности, «генетических подписей», является низкая точность, связанная с генетической гетерогенностью опухолевых клеток и влиянием других компонентов опухоли и ее микроокружения, имеющих более существенное влияние на исходы заболевания.

Известна группа методов прогнозирования отдаленных результатов лечения, связанная с оценкой баланса проканцерогенных и антиканцерогенных компонентов микроокружения на разных этапах взаимодействия. Согласно концепции «иммуноредактирования», предложенной Dunn G. с соавторами, существует три фазы взаимодействия иммунной системы и опухоли: элиминация, равновесие и ускользание. Фаза элиминации представляет собой аналог «иммунологического надзора», описанного ранее. В этот период происходит распознавание и элиминация опухолевых клеток факторами врожденного и адаптивного иммунитета. Для фазы равновесия характерно наличие сформировавшихся опухолевых масс. Длительность ее составляет от нескольких месяцев до десятков лет. В этот период факторы адаптивного иммунитета уничтожают часть опухолевых клеток, в результате чего клиническое течение приобретает характер длительной стабилизации, появляются изменения сывороточной концентрации и функции периферических иммунологических компонентов. Фаза ускользания – финальный этап взаимодействия опухоли и иммунной системы. Она самая короткая и необратимая. В этот период реализуются все варианты иммуносупрессивных воздействий, включая продукцию гуморальных факторов (цитокины, хемокины, матриксные металлопротеиназы (MMP), галектины, ганглиозиды), повышение концентрации Тreg, TAM (опухоль – ассоциированные макрофаги), клеток с высокой активностью IDO (индоламин-2,3 - диоксигеназа), а также потеря ζ-цепи TCR (Т-клеточный рецептор), снижение экспрессии MHC I и эффекторных цитокинов (Nat. Immun. 2002; 3 (11): 991 – 998).

Изучение микроокружения опухоли является важным компонентом оценки прогноза заболевания. С клинической точки зрения микроокружение можно оценивать количественно, качественно, с учетом субпопуляционного состава, по наличию «иммунологической подписи», отражающей экспрессию группы генов, отвечающих за генерацию иммунного ответа, а также по присутствию третичных лимфоидных структур. Кроме того, в настоящее время имеется возможность оценивать концентрацию и продукцию цитокинов лимфоидными элементами крови и микроокружения.

Наличие лимфоидной инфильтрации, составляющей 50-60% от объема стромы, как правило, говорит о хорошем прогнозе заболевания. В 2014 году Adams S. с соавторами опубликовали данные исследования о влиянии плотности стромальных и интраэпителиальных опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (sTIL, iTIL) на отдаленные результаты лечения ТНРМЖ. В работе были проанализированы образцы 506 больных, которые получали лечение в рамках протоколов ECOG E2197 (191 человек) и E1199 (291 человек). В 481 образце были выявлены TIL (sTIL – 80%, iTIL – 15%). В результате многомерного анализа выявлено, что плотность sTIL является независимым прогностическим фактором безрецидивной, общей выживаемости и времени до появления отдаленных метастазов. Повышение плотности sTIL на каждые 10% приводит к уменьшению риска локального рецидива на 14% (p=0,02), риска отдаленных метастазов на 18% (p=0,04) и риска смерти на 19% (p=0,01) (J. Clin. Oncol. 2014; 32 (27): 2959 – 2967).

Оценка субпопуляций клеток миелоидного и лимфоидного ряда как в периферической крови, так и в микроокружении является более точным методом оценки прогноза. Среди клеток лимфоидного ряда изучалась роль лимфоцитов (CTL, Treg, В-лимфоциты), миелоидного – моноцитов/макрофагов (M1,2), дендритных клеток (DC), супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC). Прогностическое значение, кроме того, имеют компоненты врожденного иммунитета: натуральные киллеры (NK), нейтрофилы, эозинофилы (BMJ Cancer. 2018; 18 (1): 556).

К настоящему времени показано, что моноциты и клетки моноцитарной линии связаны с канцерогенезом, а также с прогнозом заболевания. В микроокружении опухоли и периферической крови существует две субпопуляции МФ (макрофаги) – М1 и М2. М1 – классически активируемые МФ, поляризация которых из предшественников происходит под действием липополисахарида, IFN-γ и TNF-α. М2 – сборное название группы клеток макрофагального ряда, индицирующихся под влиянием IL-4, IL-13, IL-10, TGF-β, Fc-рецепторов, комплемента и глюкокортикоидов. М2 образуются из моноцитов периферической крови, рекрутированных в очаг хемокиновыми лигандами (CCL-2, MCP-1), колоние-стимулирующими факторами (M-CSF, CSF-1) и сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF), концентрация которых повышена в зонах с низким давлением кислорода. В зонах хронический гипоксии в макрофагах синтезируются гипоксия – индуцированные факторы (HIF-1 и HIF-2). Они дерепрессируют синтез ряда белков, повышающих ангиогенный потенциал опухоли (VEGF, bFGF, PDGF), инвазивный потенциал, метастазирование и ЕМТ (MMP, CCL2, CCL18). Кроме того, в них отмечается избыточная экспрессия аргиназы (Arg) и индоламин – 2,3 – диоксигеназы (IDO), снижающих концентрацию аргинина и триптофана, необходимых для нормального функционирования Т – лимфоцитов и NK (BMC Cancer. 2018; 18). В периферической крови больных концентрация М2 существенно выше по сравнению с М1, что коррелирует с коротким безрецидивным периодом. М2 макрофаги чаще встречаются в крови больных с отдаленными метастазами.

MDSC (супрессорные клетки миелоидного происхождения) представляют собой гетерогенную группу клеток, образующихся из кроветворного предшественника – не зрелых миелоидных клеток (IMC, CD31+CD11b+CD15+). В норме созревание происходит в костном мозге и селезенке. В микроокружении опухоли под действием гуморальных факторов (VEGF, IL-3, IL-4, IL-6) и лигандов хемокинов (CXCL2, 5 ,12; CCL2, 5) блокируется их дальнейшая дифференцировка, и они накапливаются в первичных и метастатических очагах. У человека выявляется две субпопуляции MDSC: гранулоцитарные MDSC (gMDSC, CD11b+CD14-CD15+CD33+) и моноцитарные MDSC (mMDSC, CD11b+CD14+CD15-CD33+HLADR-/low). MDSC – ключевые компоненты в индукции иммуносупрессии на фоне хронического воспаления. За счет активных метаболитов кислорода и азота они индуцируют анергию эффекторных клеток, способствуя рекрутингу T-регуляторных клеток в опухоль и поляризации предшественников МФ в сторону М2. Кроме того, они стимулируют ангиогенез и способствуют поддержанию популяции CSC (стволовые опухолевые клетки). Высокая концентрация MDSC коррелирует с объемом опухолевой массы. MDSC обладают предиктивной значимостью в плане эффективности химиотерапии и иммунотерапии. Вероятность положительного эффекта связана с увеличением соотношения gMDSC/mMDSC. Вместе с другими показателями (CTL (CD8+)) mMDSC являются положительным прогностическим фактором в отношении отдаленных результатов (Oncotarget. 2017; 8(2):3649 – 3665).

DC (дендритные клетки) - это высокоспециализированная субпопуляция, основной функцией которой является поглощение, процессинг и презентация антигенов в составе главного комплекса гистосовместимости I и II типа (MHC I и II) в комбинации с ко-стимулирующими молекулами Th (CD4+) непосредственно, и опосредованно – CTL (цитотоксические лимфоциты). Их активация происходит под действием «сигналов опасности», исходящих от опухолевых клеток, включающих хемокины и неоантигены. «Созревание» DC, помимо презентации антигенов, включает экспрессию ко-стимулирующих молекул (CD40, ICAM I, CD80/86, СD83), секрецию широкого спектра цитокинов (IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13) и миграцию в лимфатические узлы, где происходит запуск программы активации Тh. У человека морфологически и функционально различают две субпопуляции DC: миелоидные (mDC) и плазмацитоидные (pDC). mDC – классические DC, имеющие фенотип CD11c+CD4+CD45RO+, экспрессирующие MHC I, II и запускающие иммунный ответ при контакте с растворимыми антигенами. pDC с фенотипом CD11c-CD4+CD45RA+CD123+ и экспрессией MHC I поглощают клеточно-ассоциированные антигены. Данные о прогностической и предсказательной роли DC у больных онкологических больных противоречивы. По данным ряда исследователей, их высокий уровень в крови является благоприятным прогностическим фактором в отношении общей выживаемости (Cancer Microenviron. Off J. Int. Cancer Microenviron. Soc. 2019; 12(23):119 – 132).

Трег (Т-регуляторные клетки) – субпопуляция, составляющая примерно 5 – 10 % от общего числа периферических лимфоцитов здорового человека и примерно 50% от популяции лимфоцитов с маркерами CD4+CD25+. Впервые описаны Sakaguchi et all. в 1995 году. В настоящее время им отводят ключевую роль в предотвращении развития аутоиммунных реакций и иммуносупрессии в процессе канцерогенеза. Среди CD4+CD25+ FoxP3 выделяются две субпопуляции. Одна из них имеет фенотип CD4+CD25^hiCTLA^hiFoxP3 и образуется в тимусе из недифференцированных лимфоцитов, другая, с фенотипом CD4+CD25^variable CTLA^hi FoxP3, возникает из периферических Т-хелперов под действием избыточной концентрации глюкокортикоидов, эстрогенов, IL–2 и TGF-β. Однако по функциям они идентичны. Механизм действия их связан с контактным ингибированием, секрецией супрессорных цитокинов (IL–10, IL-35, TGF-β), а также прямым лизисом иммунокомпетентных клеток (Cancer Microenviron. Off J. Int. Cancer Microenviron. Soc. 2019; 12(23):119 – 132).

NK (натуральные киллеры) образуются из общего лимфоидного предшественника в костном мозге, откуда в дальнейшем распространяются в первичные и вторичные лимфоидные органы, а также в легкие печень, кровь. У человека выявляются две субпопуляции NK: CD56^bright CD16- (цитокин-продуцирующая) и CD56^dimCD16+ (цитотоксическая). Кроме того, выделяют несколько групп NK в зависимости от степени зрелости, определяемой экспрессией маркеров CD27 и CD11b. Не зрелые NK их не экспрессируют. В процессе созревания сначала появляется CD27, затем CD11b. NK с фенотипом CD27+ обладают наилучшей способностью к секреции цитокинов, с фенотипом CD11b+ CD27- максимальной цитолитической активностью. NK могут элиминировать клетки, не экспрессирующие MHC I, а этот механизм используют зрелые опухоли клетки и CSC для предотвращения атаки со стороны CTL. Потенциально NK являются наиболее эффективными клетками в борьбе с опухолью, но под действием факторов микроокружения (TGF-β, аденозин) они приобретают фенотип CD56^bright CD16- и начинают экспрессировать проангиогенные факторы (MMP9, VEGF), что повышает инвазивный потенциал и приводит к истощению Т-клеток. Под влиянием опухолевых клеток на мембране NK снижается экспрессия активирующих рецепторов (NKp30, NKG2D, DNAM1) и повышается экспрессия ингибирующих (NKG2A, CD85j). Экспрессия CD 163 и CXCR4 в NK микроокружения является маркером раннего рецидива (Front. Immunol. 2019;10:1205).

Прогностическая значимость субпопуляций Т-лимфоцитов (Th, CD4+; CTL, CD8+) при разных опухолях отражена во многих публикациях. Преобладание в периферической крови зрелых форм по сравнению с недифференцированными (CD45RA⁺CD95-CD27⁺CD28⁺) и клетками памяти у больных с отдаленными метастазами является благоприятным фактором прогноза в отношении общей выживаемости и предиктором эффективности иммунотерапии (Int. J. Cancer. 2011; 131 (7): 1611 – 1620).

Существует еще одна популяция лимфоидных клеток, влияющих на канцерогенез и формирование иммуносупрессивного микроокружения – врожденные лимфоидные клетки (ILCs). ILCs возникают из общего лимфоидного предшественника с другими лимфоцитами. К настоящему времени выделяют три типа ILCs: ILC1s, ILC2s, ILC3s. Под действием IL-12, IL-15 и IL-18 ILC1s секретируют IFN-γ, стимулируя МФ и DC; ILC2s секретируют IL-5, IL-9, IL-13 и амфирегулин, усиливая секреторную активность Treg; ILC3s стимулируют стромальные клетки. ILC1s обладают противоопухолевой активностью. ILC3s вместе со стромальными клетками стимулируют формирование лимфогенных метастазов (Cancer Res. 2017; 77(5):1083 – 1096).

В классическом варианте генерация эффективного адаптивного иммунного ответа, включающая все этапы созревания DC и презентацию антигенов в составе MHC (главного комплекса совместимости) эффекторным клеткам, происходит во вторичных лимфоидных органах (селезенка, лимфатические узлы). Детальное изучение микроокружения позволило выявить, что непосредственно в опухоли образуются третичные лимфоидные органы (TLO), в которых дублируются эти процессы. TLO состоят из Т-зон, содержащих в большом количестве DC и В – герминогенных центров. В них происходит активация, пролиферация и дифференцировка Т и В клетки, в результате чего происходит образование CTL, эффекторных Th и В-клеток, продуцирующих антитела, а также клеток памяти. Структурно TLO схожи с лимфатическими узлами. Помимо зон созревания, они включают стромальные клетки и венулы с высоким эндотелием (HEV). TLO чаще локализуются по периферии опухоли (Front. Immunol. 2019; 10: 1398).

В большинстве поведенных исследований авторы приходят к выводу о том, что формирование TLO является благоприятным прогностическим фактором в отношении отдаленных результатов лечения при разных опухолях. Но методология исследования до настоящего времени не является универсальной. Поэтому в публикациях оцениваются разные компоненты TLO: плотность HEV, количество TLO в биоптате, субпопуляционный состав, профиль экспрессии генов. Это является существенным недостатком этого метода, не позволяющим широко внедрять его в практику.

Анализ паттерна экспрессии генов в микроокружении – один современных методов анализа, позволяющий предсказывать эффективность иммуно- и химиотерапии. В 2016 году Miller L.D. с соавторами провели анализ 22268 проб 314 больных. Они классифицировали опухоли на потенциально иммунологически активные (immune benefit-enabled, IBE, 179 человек) и иммунологически не активные (immune benefit-disabled, IBD, 135 человек). IBE характеризуются экспрессией генов, связанных с Th1 (Т-хелперы) поляризацией (IFNG, IRF1, STAT1), клеточно-опосредованной цитотоксичностью (GZMB, GNLY, PRF1, GZMH), хемоаттракцией (CXCL9, CXCL10, CX3CL1, CCL5), регуляцией активации CTL (CTLA-4, CD80, CD86) и адгезии (ICAM1); IBD – гиперэкспрессией TGFB1. Проанализировав профиль экспрессии генов, авторы выявили ключевые сигнальные пути, активированные в обоих подтипах: TNF-α и IFN-γ в IBE; TGF-β – в IBD. IBE является благоприятным, а IBD – не благоприятны фактором прогноза в отношении безрецидивной выживаемости. IBE – предиктор хорошего ответа на иммунотерапию, IBD - плохого (Cancer Immunol. Res. 2016; 4 (7): 600 – 610).

В предложенном подходе существует два серьезных недостатка. Во-первых, на современном этапе анализ множественных мутаций в практической деятельности представляет собой сложную и дорогую задачу, что ограничивает его внедрение. Во-вторых, наличие мутаций в компонентах различных путей создает лишь условия для формирования иммуносупрессивного фенотипа, а реализуются они или нет, зависит от массы эпигенетических факторов и других компонентов микроокружения.

Еще одним вариантом прогнозирования отдаленных результатов лечения является оценка концентрации, спонтанной и индуцированной продукции цитокинов в микроокружении опухоли и периферической крови.

Цитокины в настоящее время рассматриваются как универсальные регуляторы, контролирующие гомеостаз многих клеток. Интенсивное изучение цитокиновой сети и ее роли в патогенезе онкологических заболеваний началось в 90-х годах XX века. В то время цитокины рассматривались как медиаторы, регулирующие функции иммунной системы. Клинические и экспериментальные данные показали, что наиболее существенная роль в регуляции противоопухолевого иммунитета принадлежит IFN-α, IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, GM-CSF. В процессы канцерогенеза вовлечены TGF-β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-23.

Интерфероны играют ключевую роль в противоопухолевой защите. Большинство известных работ посвящено роли IFN II типа (IFN-γ) в модуляции функций иммунокомпетентных клеток. IFN-γ является основным цитокином, влияющим на Th1 (Т-хелперы I типа). На ранних этапах иммунного ответа источником его являются NK (натуральные киллеры), NKT (натуральные киллеры с Т-клеточным рецептором), γδ–T (гамма/дельта Т-лимфоциты). При включении адаптивных механизмов он продуцируется Th1 и CTL (цитотоксические лимфоциты). Противоопухолевая активность IFN-γ связана с несколькими механизмами: ингибирование ангиогенеза, активация фагоцитоза и стимуляция продукции IL-12 DC, что, в свою очередь, приводит к дифференцировке наивных Т-хелперов (Th0) в Th1. IFN I типа – семейство цитокинов, проявляющих противовирусные и антипролиферативные свойства. У человека к нему относятся IFN-α, IFN-β, IFN-ω, IFN-κ, IFN-λ. В противоопухолевой защите принимают участие IFN-α/β. Их продуцентами являются фибробласты, МФ, NK, DC, плазмацитоидные моноциты. IFN I типа осуществляют кооперацию между компонентами врожденного и адаптивного иммунитета, активируют DC, стимулируют TRAIL-опосредованный лизис клеток-мишеней, индуцируют продукцию IL-15, формируя клетки памяти (Nat. Immunol. 2005; 6: 722 – 729).

IL-2, IL-15, IL-21 относятся к группе регуляторов функций Th1. Основные клетки-продуценты IL-2 – Th1. Как было показано во многих работах 90-х годов, их мишенями являются Т, В-лимфоциты, NK, МФ. Взаимодействие IL-2 с рецепторным комплексом (IL-2αβγ или IL-2βγ) приводит к активации JAK – киназ (JAK1, JAK3), и, как следствие, фосфорилированию активаторов траскрипции (STAT1, STAT3, STAT5A, STAT5B) и запуска сигнального пути PI3-AKT. Эти сигнальные пути приводят к синтезу факторов, обеспечивающих пролиферацию, дифференцировку, активацию и продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками (J. Clin. Invest. 2014; 21(1): 99 – 110).

IL-15 был открыт в 1994 году. По своей биологической активности он похож на IL-2, но обладает другой структурой. IL-15 продуцируется различными типами клеток, включая эпителий, МФ, строму костного мозга. Экспрессия IL-15 активируется IFN I и II типов. Основными биологическими свойствами, отличающими его от IL-2, являются способность стимулировать дифференцировку NK и пролиферацию Т-клеток памяти. Кроме того, он блокирует апоптоз и стимулирует деление активированных Т, В-лимфоцитов, NK и фибробластов. В эксперименте показана возможность преодоления иммунологической толерантности при использовании IL-15 в сочетании с адоптивной терапией (Exp. Ther. Med. 2021; 21 (1): 675).

IL-21, так же, как и IL-15, структурно и функционально сходен с IL-2. Основные продуценты цитокина – Th. Биологические функции IL-21 связаны, в основном, с двумя типами клеток – NK и наивными CD8+ лимфоцитами. Он стимулирует пролиферацию предшественников NK, их созревание и дифференцировку. Синнергично с IL-15 и IL-7 IL-21 ускоряет созревание наивных CD8+–лимфоцитов и CD8 Т-клеток памяти (J. Exp. Med. 2020; 217(1): e20191638).

IL-12 впервые был выделен в 1989 году. В процессе иммунного ответа основными продуцентами IL-12 являются DC различного происхождения. Кроме них, источниками этого цитокина могут выступать моноциты, МФ, НФ и эндотелиоциты. IL-12 – ключевой гуморальный фактор, запускающий каскад иммунного ответа по клеточному типу. Под действием IL-12 происходит поляризация Th0 в Th1, пролиферация Th1 и индукция синтеза IFN-γ. Помимо основных функций, IL-12 в сочетании с низкими дозами IL-2 поддерживает пролиферацию, экспансию и выживание CD4+, CD8+ Т-клеточных клонов, тумор-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL), лимфокин-активированных киллеров (LAK), а также усиливает противоопухолевую активность NK и NKT за счет интенсификации NKG2D и перфорин-зависимых механизмов (Immunity. 2019; 50(4): 851 – 870).

Семейство IL-17 включает в себя 6 структурно сходных молекул (IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F). В индукции иммунологической толерантности у онкологических больных основная роль принадлежит IL-17A, который продуцируется различными субпопуляциями Т-лимфоцитов (Th17, γδ-T, активированные CD4+CD45+R0+, NKT), а также эозинофилами, нейтрофилами и моноцитами. Основным индуктором синтеза IL-17 является IL-23, ингибитором – IL-12. Воздействуя на клетки микроокружения опухоли, IL-17 стимулирует продукцию цитокинов (IL-6, G-CSF), хемокинов (IL-8) и низкомолекулярных регуляторов (PGE2), вовлеченных в канцерогенез. В МФ он усиливает продукцию TNF-α, IL-1β, PGE2, G-CSF, IL-6, IL-10, IL-12. Таким образом, суммарное влияние IL-17 на цитокиновую сеть выражается в увеличении продукции компонентов, способствующих опухолевой прогрессии (Immune Netw. 2020; 20 (1): e6).

IL-10 является ключевым регулятором противоопухолевого иммунного ответа. Семейство IL-10 включает, помимо самого цитокина, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26. Несмотря на длительную историю изучения, функции его до конца не ясны, а экспериментальные данные противоречивы. Он был выделен и охарактеризован в 1989 году. Первоначально его назвали «фактор, ингибирующий синтез цитокинов» (CSIF, cytokine synthesis inhibitory factor), однако в дальнейшем стало очевидно, что он обладает также иммуностимулирующими свойствами. У человека основными продуцентами IL-10 являются: Treg, Th0, Th1, Th2, CTL, моноциты, МФ, опухолевые клетки, ТАМ и NK. Свойства IL-10 зависят от фазы взаимодействия опухоли и иммунной системы, концентрации цитокина, а также от локализации его клеток мишеней. В лимфоидных органах реализуются его имуносупрессорные эффекты, а в микроокружении опухоли также иммуностимулирующие. IL-10 подавляет созревание DC путем редукции экспрессии MHC II, молекул адгезии и цитокинов (IL-12), а также снижая чувствительность рецепторов, реагирующих на «сигналы опасности». DC в микроокружении опухоли сами могут стать источником IL-10, генерируя при этом Т – регуляторные клетки. IL-10 ингибирует пролиферативную активность и продукцию цитокинов Th1, Т-зависимую активацию CTL и CD19+, а также токсических интермедиатов кислорода и азота МФ. При высокой концентрации IL-10 в микроокружении опухоли увеличивается цитотоксическая активность NK за счет снижения экспрессии MHC I, увеличения продукции хемокинов, синтеза гранзима – А и катепсинов (J. Exp.Med. 2020; 217(1): e20190418).

IL-6 – цитокин с широким спектром биологических активностей, осуществляющий «интеграцию» иммунной и нейроэндокринной системы. Основными его источниками являются Т-лимфоциты, МФ, миоциты, эндотелиоциты, фибробласты и опухолевые клетки. В физиологических условиях он играет центральную роль в гемопоэзе, а также в регуляции роста и дифференцировки эндотелиоцитов, кератиноцитов, остеобластов и нейронов. В иммунной системе IL-6 активирует пролиферацию и синтез антител В-лимфоцитами, пролиферацию CTL, стимулирует гранулоцитарный росток кроветворения, а также индуцирует экспрессию острофазных белков в печени. IL-6 является проангиогенным фактором и стимулирует экспрессию гена множественной лекарственной устойчивости. Высокая сывороточная концентрация его способствует гиперактивации гипофизарно-надпочечниковой системы и формированию комплекса патологических реакций, включая депрессию, сопровождающую онкологические заболевания. Гиперэкспрессия IL-6 в опухоли и повышение концентрации в периферической крови является не благоприятным прогностическим фактором в отношении общей и безрецидивной выживаемости (Int. Immunol. 2021: 33 (3): 127 – 148).

IL-8 относится к семейству хемокинов. Главные продуценты – МФ и эндотелиальные клетки, дополнительные – лимфоциты, нейтрофилы, фибробласты. Индукторы синтеза – провоспалительные цитокины. Основная биологическая функция связана с регуляцией миграции клеток. В процессе канцерогенеза IL-8 может выступать как аутокринный фактор роста, а также стимулировать ангиогенез. IL-8 в микроокружении опухоли - не благоприятным прогностическим фактором в отношении общей и безрецидивной выживаемости (J. Immunol. Res. 2019; 2019: 6252138).

TNF-α относится к семейству фактора некроза опухолей, сформированному на основании сходства строения лигандов и рецепторов. Основные биологические эффекты TNF-α в канцерогенезе связаны с поддержанием перитуморальной воспалительной реакции, усилением проницаемости капилляров и стимуляцией ангиогенеза. В фазе надзора он способствует повышению содержания эффекторных клеток и химиопрепаратов в очаге, а в фазах равновесия и ускользания – прогрессии за счет образования новых сосудов и запуска каскадных реакций хронического воспаления (Cytokine. 2018;101:14 – 18).

Использование нескольких цитокинов повышает прогностическую силу модели. Оценка экспрессии цитокинов в микроокружении и концентрации в крови в сочетании с оценкой динамики проканцерогенных и антиканцерогенных клеточных популяций является наиболее перспективными направлениями исследования в области прогнозирования отдаленных результатов лечения (Nat. Rew. Cancer. 2020; 20(11):662 – 680).

Наиболее близким к предлагаемому является способ, предложенный группой авторов, которые анализировали взаимосвязь уровня экспрессии маркеров иммунокомпетентных клеток в микроокружении опухоли (CD3, CD8, GZMB, CD45RO) с отдаленными результатами лечения больных локальными и местно-распространенными формами колоректального рака. Способ разработан в 2006, а в 2018 году после валидации на больших группах в рамках многоцентрового международного исследования он вошел в рекомендации по определению тактики лечения больных колоректальным раком (Galon G., Costes A., Sanchez-Gabo F. et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome // Science. – 2006. – Vol. 313, №5795 – P. 1960 – 1964. Pages F., Mlecnik B., Marliot F. International validation of the consensus immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study // Lancet. – 2018. – Vol. 391, №10135 – P. 2128 – 2139).

Сущность предложенного авторами способа состоит в оценке и сравнении плотности иммунокомпетентых клеток, экспрессирующих ряд маркеров (CD3, CD8, GZMB, CD45RO) в центре опухоли и в инвазивном крае.

В процессе разработки способа использованы данные трех групп пациентов, у которых была произведена первичная резекция опухоли. 415 пациентов лечились в клинике Lannec-HEGP c 1990 по 2003 годы. У 119 пациентов из клиники Авиценны, проходивших лечение в период с 1996 по 2001 годы, анализировались гистологические образцы, полученные из парафиновых блоков. Эта группа использовалась для первичной валидации. У 75 пациентов из клиники Lannec-HEGP проводился анализ экспрессии генов. У 69 из них были доступны биопсийные образцы для анализа. Эта группа использовалась для вторичной валидации. Больные находились под наблюдением с момента постановки диагноза до последнего контакта или зафиксированной смерти. Среднее время наблюдения составило 45,3 месяца и варьировало от 0 до 166 месяцев. Адъювантная химиотерапия с использованием схем на основе 5 – фторурацила использовалась у пациентов со стадией III и стадией II с высоким риском. Паллиативная химиотерапия использовалась у пациентов со стадией IV, а также при не полной резекции. Характеристика клинической группы отражена в таблице 1.

Таблица 1. Клинико-патологическая характеристика клинической группы, включенной в исследование

Параметр Описание Клиника Lannec-HEGP, группа 1 Клиника Авиценны Клиника Lannec-HEGP, группа 2 Категория Т (первичная опухоль) pT1 23 3 2 pT2 69 13 7 pT3 218 76 57 pT4 97 27 9 Категория N (регионарные лимфатические узлы) + 241 48 30 - 166 71 43 ± - - 2 Категория M (отдаленные метастазы) - 313 93 47 + 94 26 28 Стадия I 75 12 6 II 137 33 17 III 100 48 24 IV 95 26 28 Пол Мужчины 216 57 42 Женщины 191 62 33 Локализация Ободочная кишка 162 35 41 Сигмовидная кишка 114 53 25 Прямая кишка 131 31 9 Дифференцировка Высокодифференцированная 312 78 47 Низкодифференцированная 95 41 28

Для проведения количественной обратной полимеразной цепной реакции в реальном времени (Taqman RT-PCR) образцы тканей замораживались в течение 15 минут после хирургического вмешательства и сохранялись в жидком азоте. Выделение РНК проводилось с помощью специального кита (Qiagen, Valencia, CA). Процедура RT-PCR проводилась согласно мануалу (Applied-Biosytstems, Foster City, CA) на аппарате 7900 real-time PCR-system (Applied-Biosytstems). Данные анализировались с использованием программного обеспечения SDS v 2.2 (Applied-Biosytstems). В процессе исследования анализировалась экспрессия 18 генов: IL-10, IL-8, IFNG (IFN-γ), TGFB1 (TGF-β1), PTGS2 (Cox2), CEACAM1 (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1), IRF1 (interferon regulatory factor 1), MMP7 (matrix metalloproteinase 7), VEGF (vascular endothelial growth factor), GZMB (granzyme B), TBX21(T-box 21), B7H3 (B7 homolog 3), CD8A (CD8 antigen, alpha polypeptide (p32)), GNLY (granulysin), BIRC5 (baculoviral IAP repeat-containing 5), CD3Z (CD3Z antigen, zeta polypeptide CD3ξ), TNFRSF10A (tumor necrosis factor receptor superfamily, 10a), CD4 (CD4 antigen (p55)).

В процессе исследования из парафиновых блоков получали срезы 5 мкм, которые инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре с антителами к CD3 (SP7), CD8 (4B11), CD45RO (OPD4), GZMB (GrB-7), cytokeratin (AE1AE3), cytokeratin-8 (Neomarkers, Fremont, CA). В дальнейшем осуществлялась конъюгация со вторичными антителами, содержащими хромоген. Полученные изображения анализировались на рабочей станции Spot Browser (ALPHELYS). В образцах каждого пациента анализировалась экспрессия изучаемых маркеров (Hi-высокая; Lo-низкая) в центре опухоли (CT) и инвазивном крае (IM). Гетерогенность плотности иммунного инфильтрата (HiLo и LoHi) в двух участках опухоли (CT/IM) выявлялась при анализе экспрессии CD3 – в 37% случаев, CD8- 33%, CD45RO - 47 %, GZMB – 36%.

Для анализа отдаленных результатов лечения (медиана выживаемости; 75 –й перцентиль; 2-, 4- и 5- летняя общая и безрецидивная выживаемость) использовалась оценка по Каплан-Мейеру. Для сравнения общей и безрецидивной выживаемости в разных группах использовался логарифмический ранговый критерий. Медиана экспрессии маркеров в подгруппах с разным исходом заболевания использовалась для разделения подгрупп. Уровень отсечения по плотности инфильтрации клеток, экспрессирующих CD3, CD8, CD45RO, GZMB составил 370, 80, 80 и 30 клеток/мм² для центра опухоли и 640, 300, 190 и 60 клеток/мм² для инвазивного края соответственно. Поскольку в результате расчетов могла быть получена сверхточная модель, которая хорошо воспроизводилась на изучаемом массиве данных и могла не отражать закономерности генеральной совокупности, авторы использовали поправку, предложенную Altman (J. Natl. Cancer. Inst. 1994; 86(11):829–835). Достоверность логарифмического рангового критерия подтверждалась двукратной перекрестной проверкой (Stat. Med. 1996; 15(29):2203–2213). Оценка влияния параметров на отдаленные результаты осуществлялась с использованием модели пропорциональных рисков Кокса.

В результате исследования экспрессии генов в образцах выявлено три кластера: а) гены, связанные с воспалением: IL-8, PTGS2, MMP7, VEGF, BIRC5; б) гены, связанные с иммунным ответом по клеточному типу: IFNG, IRF1, GZMB, GNLY, CD8A; в) гены, связанные с иммуносупрессией: IL-10, TGFB1, B7H3, VEGF, CD4. Доминантный кластер формировали гены, связанные с иммунным ответом по клеточному типу. Экспрессия генов этого кластера достоверно коррелировала с низкой частотой рецидивов.

Высокая плотность анализируемых субпопуляций клеток также коррелировала с низкой частотой рецидивов. При анализе взаимосвязи экспрессии изучаемых маркеров в группе в целом с показателями безрецидивной выживаемости авторы пришли к выводу, что наибольшей дискриминантной способностью обладают соотношения экспрессии CD3 и CD8 в центре и инвазивном крае опухоли, а в отношении общей выживаемости – CD3 и CD45RO.

Таблица 2. Взаимосвязь отдаленных результатов лечения с соотношением экспрессии изучаемых маркеров в группе в целом

Параметр Число больных Медиана, мес. 5-летняя выживаемость, % p Безрецидивная выживаемость во всей группе GZMB_CT/IM Lo/Lo 91 23 40,9 5,07 х 10^-6 Het 93 НД 59,2 Hi/Hi 86 НД 77 CD45RO_CT/IM Lo/Lo 92 35,8 49,5 7,6 х 10^-4 Het 119 100,2 54,4 Hi/Hi 89 НД 75,8 CD8_CT/IM Lo/Lo 98 20,8 37,3 7,75 х 10^-7 Het 92 НД 61,1 Hi/Hi 93 НД 73,8 CD3_CT/IM Lo/Lo 98 18,2 39,7 3,52 х 10^-9 Het 119 68,7 53,2 Hi/Hi 101 НД 82,5 Общая выживаемость во всей группе GZMB_CT/IM Lo/Lo 92 46,9 45,4 2,88 х 10^-3 Het 92 51,3 39,3 Hi/Hi 86 115,1 69,9 CD45RO_CT/IM Lo/Lo 92 40,3 41 7,43 х 10^-5 Het 119 52,9 45,3 Hi/Hi 89 НД 75,4 CD8_CT/IM Lo/Lo 98 36,4 36,8 1,04 х 10^-4 Het 92 59,6 46,9 Hi/Hi 93 НД 70,3 CD3_CT/IM Lo/Lo 98 35,1 31 2,08 х 10^-6 Het 119 60 50,5 Hi/Hi 101 НД 73

GZMB – субпопуляция лимфоцитов, экспрессирующая гранзим В, CD45RO – маркер клеток памяти, CD8 – маркер цитотоксических лимфоцитов, CD3 – общий маркер лимфоцитов, CT/IM – соотношении экспрессии маркера в центре опухоли и инвазивном крае, Lo/Lo – низкий уровень экспрессии маркера в центре опухоли и в инвазивном крае, Hi/Hi – высокий уровень экспрессии маркера в центре опухоли и в инвазивном крае, Het – гетерогенная экспрессия маркера в центре опухоли и в инвазивном крае, НД – не достигнута.

При анализе взаимосвязи экспрессии маркеров в подгруппе, включающей пациентов с I, II и III стадией, выявлено, что предиктивными свойствами в отношении общей и безрецидивной выживаемости обладают CD3 и CD8. Эти параметры в дальнейшем были использованы авторами в валидационных исследованиях.

Таблица 3. Взаимосвязь отдаленных результатов лечения с соотношением экспрессии изучаемых маркеров в подгруппе с I, II и III стадиями

Параметр Число больных Медиана, мес. 5-летняя выживаемость, % p Безрецидивная выживаемость в подгруппе с I, II, III стадиями GZMB_CT/IM Lo/Lo 87 НД 64,3 7,81 х 10^-1 Het 69 НД 73,2 Hi/Hi 58 НД 85,9 CD45RO_CT/IM Lo/Lo 16 20,1 40,2 1,45 х 10^-2 Het 110 НД 64,8 Hi/Hi 112 НД 85,9 CD8_CT/IM Lo/Lo 61 35,8 48,9 1,94 х 10^-3 Het 76 НД 76,2 Hi/Hi 87 НД 81,6 CD3_CN/IM Lo/Lo 30 23,1 38 8,57 х 10^-7 Het 95 НД 65,6 Hi/Hi 124 НД 87,1 Общая выживаемость в подгруппе с I, II, III стадиями GZMB_CT/IM Lo/Lo 87 НД 63,3 8,29 х 10^-2 Het 69 69,3 51,8 Hi/Hi 58 НД 71,8 CD45RO_CT/IM Lo/Lo 16 43 36,5 1,02 х 10^-2 Het 110 87,3 56,3 Hi/Hi 112 НД 74,8 CD8_CT/IM Lo/Lo 61 56,2 45,3 7,02 х 10^-4 Het 76 111,4 65,1 Hi/Hi 87 НД 73,6 CD3_CN/IM Lo/Lo 30 35,5 32,6 2,9 х 10^-6 Het 95 72,1 54,8 Hi/Hi 124 НД 78,6

GZMB – субпопуляция лимфоцитов, экспрессирующая гранзим В, CD45RO – маркер клеток памяти, CD8 – маркер цитотоксических лимфоцитов, CD3 – общий маркер лимфоцитов, CT/IM – соотношении экспрессии маркера в центре опухоли и инвазивном крае, Lo/Lo – низкий уровень экспрессии маркера в центре опухоли и в инвазивном крае, Hi/Hi – высокий уровень экспрессии маркера в центре опухоли и в инвазивном крае, Het – гетерогенная экспрессия маркера в центре опухоли и в инвазивном крае, НД – не достигнута.

Второй этап исследования, проведенного ассоциацией иммунотерапии рака, включал валидацию на больших группах пациентов в рамках многоцентрового международного исследования в 14 клинических центров из 13 стран.

Гистологические срезы толщиной 4 мкм оценивались в каждом исследовательском центре и в дальнейшем аккумулировались в одном референсном центре (Европейская клиника Помпеду, Париж, Франция). Образцы инкубировались с антителами к CD8 (CD8/144B; Dako; Германия) 32 минуты при 37 ̊ С, и к CD3 (2GV6; Ventana; Tuscon; AZ; USA) 20 минут при 37 ̊ С. Для каждого образца оценивалась плотность инфильтрации CD3+ и CD8+ в центре и инвазивном крае. Плотность инфильтрации сравнивалась с полученными на первом этапе исследования данными и конвертировалась в перцентили. Медиана плотности CD3+ лимфоцитов в центре опухоли и инвазивном крае составила 693 клетки/мм² и 1169 клеток/мм²; CD8+ лимфоцитов – 241 клетка/мм² и 435 клеток/мм² соответственно. Иммунологический индекс (immunoscore) оценивался в одной из трех категорий: низкий (0-25%), промежуточный (25 – 70%), высокий (70 – 100%). Допускалось различие между референсным и исследовательским центром не более 20%. В процессе исследования изучалась взаимосвязь иммунологического индекса со временем до рецидива, безрецидивной и общей выживаемостью.

Опухолевые образцы 3539 пациентов были аккумулированы в период с 2013 по 2015 годы (иммунологический индекс оценивался с 2013 по 2015 годы). 357 пациентов были исключены из исследования после контроля биомаркеров, 577 – из-за несоответствия клиническим критериям включения. 2681 больной был включен в исследование (700 человек – исследовательская группа; 636 человек – группа внутренней валидации; 1345 человек – группа внешней валидации). 1380 человек (52%) – мужчины. Средний возраст пациентов – 69 лет. I стадия была диагностирована у 451 (17%), II стадия – у 1434 (54%), III – у 763 (29%) пациентов. Среднее число пораженных лимфатических узлов – 18,8 на пациента. У 474 (18%) пациентов был выявлен рецидив заболевания. 930 (35%) пациентов умерли. Медиана времени наблюдения во всех группах составила 96 месяцев (95% ДИ 93-100). Медиана времени наблюдения в исследовательской группе составила 111 месяцев (95% ДИ 105-116), в группе внутренней валидации – 113 месяцев (95% ДИ 107-119) и в группе внешней валидации - 83 месяца (95% ДИ 78-88). Медиана жизни от момента хирургического вмешательства до смерти составила 158 (95% ДИ 143-171) месяцев.

В исследовательской группе отмечалась сильная положительная корреляция отдаленных результатов лечения и плотности CD3+ и CD8+ лимфоцитов в центре и инвазивном крае опухоли. У 155 (22%) пациентов выявлен низкий, у 357 (51%) промежуточный и у 188 (27%) пациентов – высокий иммунологический индекс. У пациентов с высоким иммунологическим индексом риск рецидива был ниже. Рецидив в течение трех лет выявлен 10 (5%) пациентов с высоким, у 58 (17%) с промежуточным и у 42 (26%) с низким иммунологическим индексом. В подгруппах с высоким иммунологическим индексом отмечались наилучшие отдаленные результаты лечения. Пятилетняя общая выживаемость составила 82 % (155 человек) в подгруппе с высоким, 77 % (274 человека) в подгруппе с промежуточным и 62% (94 человека) с в подгруппе с низким иммунологическим индексом.

Результаты, полученные в исследовательской группе подтверждены в обоих валидационных. Рецидив в течение трех лет выявлен 10 (6%) пациентов с высоким, у 31 (10%) с промежуточным и у 33 (20%) с низким иммунологическим индексом в группе внутренней валидации. В группе внешней валидации рецидив в течение трех лет выявлен 42 (14%) пациентов с высоким, у 104 (24%) с промежуточным и у 85 (36%) с низким иммунологическим индексом.

Часть образцов (36) из пяти исследовательских центров Бельгии, Канады, Китая, Франции и США с иммунологическим индексом, варьировавшим от 25% до 90% были повторно оценены восемью патологами из различных центров. Была отмечена высокая степень воспроизводи мости для каждой оцениваемой области (r=0,97 для опухоли; r=0,97 для инвазивного края; p <0,0001).

У пациентов со II стадией (1434 человека) высокий иммунологический индекс был ассоциирован с низким риском рецидива и хорошими показателями безрецидивной и общей выживаемости. Рецидив в течение трех лет выявлен 23 (6%) пациентов с высоким, у 73 (11%) с промежуточным и у 77 (20%) с низким иммунологическим индексом. Рецидив в течение пяти лет выявлен 31 (8%) пациентов с высоким, у 95 (14%) с промежуточным и у 91 (23%) с низким иммунологическим индексом. Причем этот эффект сохранялся при наличии морфологических признаков опухолевой эмболии (венозной или лимфатической).

Для оценки влияния параметров на отдаленные результаты авторы использовали модель пропорциональных рисков Кокса. Иммунологический индекс влияет на длительность времени до рецидива, безрецидивную и общую выживаемость как при использовании в качестве параметров модели категорий Т и N, так и стадии заболевания.

Таблица 4. Влияние клинико-патологических параметров на отдаленные результаты лечения у больных с колоректальным раком

Показатель Время до прогрессирования Безрецидивная выживаемость Общая выживаемость ОР (95% ДИ) p C индекс ОР (95% ДИ) p C индекс ОР (95% ДИ) p C индекс Модель Кокса без включения стадии 0,62 - 0,58 - 0,58 IS - < 0,0001 - - < 0,0001 - - < 0,0001 - П и Н 0,488 (0,381 – 0,626) < 0,0001 - 0,622 (0,515 – 0,753) < 0,0001 - 0,654 (0,532 – 0,805) < 0,0001 - В и Н 0,328 (0,229 – 0,472) < 0,0001 - 0,511 (0,401 – 0,652) < 0,0001 - 0,558 (0,429 – 0,726) < 0,0001 - Пол - 0,0696 - - 0,0894 - - 0,1355 - Ж и М 0,811 (0,646 – 1,017) 0,0696 - 0,867 (0,735 – 1,022) 0,0894 - 0,872 (0,728 – 1,044) 0,1355 - Т < 0,0001 - - < 0,0001 - - 0,059 - Т2 и Т1 1,611 (0,551 – 4,710) 0,3839 - 1,491 (0,778 – 2,86) 0,2289 - 1,636 (0,8 – 3,345) 0,1774 - Т3 и Т1 2,707 (0,994 – 7,371) 0,0514 - 2,084 (1,133 – 3,833) 0,0182 - 2,088 (1,065 – 1,667) 0,0322 - Т4 и Т1 4,991 (1,803 – 13,818) 0,002 - 2,85 (1,518 – 5,351) 0,0011 - 2,657 (1,322 – 5,339) 0,0061 - N - < 0,0001 - < 0,0001 - - < 0,0001 - N1 и N0 1,943 (1,477 – 2,555) < 0,0001 - 1,563 (1,274 – 1,918) < 0,0001 - 1,327 (1,056 – 1,667) 0,015 N2 и N0 3,118 (2,315 – 4,2) < 0,0001 - 2,272 (1,793 – 2,879) < 0,0001 - 1,992 (1,53 – 2,594) < 0,0001 MSI - 0,0064 - - 0,6677 - - 0,6107 - dMMR и pMMR 0,608 (0,425 – 0,87) 0,0064 - 0,953 (0,767 – 1,185) 0,6677 - 1,063 (0,841 – 1,343) 0,6107 - Возраст 0,999 (0,995 – 1,003) 0,5695 - 1,001 (1 – 1,002) 0,2023 - 1,002 (1 – 1,003) 0,014 - Модель Кокса без с включением стадии 0,72 - - 0,67 - - 0,68 IS - < 0,0001 - - < 0,0001 - - < 0,0001 - П и Н 0,489 (0,382 – 0,626) < 0,0001 - 0,623 (0,516 – 0,752) < 0,0001 - 0,668 (0,544 – 0,821) < 0,0001 - В и Н 0,327 (0,228 – 0,469) < 0,0001 - 0,502 (0,394 – 0,639) < 0,0001 - 0,56 (0,431 – 0,728) < 0,0001 - Пол - 0,0286 - - 0,0118 - - 0,016 - Ж и М 0,776 (0,619 – 0,974) 0,0286 - 0,809 (0,686 – 0,954) 0,0118 - 0,8 (0,668 – 0,959) 0,016 - Стадия - < 0,0001 - - < 0,0001 - - < 0,0001 - II и I 2,21 (1,336 – 3,66) 0,002 - 1,672 (1,236 – 2,262) 0,0008 - 1,661 (1,197 – 2,305) 0,0024 - III и I 5,391 (3,292 – 8,826) < 0,0001 - 3,166 (2,336 – 4,29) < 0,0001 - 2,655 (1,905 – 3,702) < 0,0001 - MSI - 0,0118 - - 0,5907 - - 0,7999 - dMMR и pMMR 0,631 (0,441 – 0,903) 0,0118 - 0,942 (0,758 – 1,171) 0,5907 - 1,031 (0,816 – 1,302) 0,7999 - Возраст 1,002 (0,993 – 1,012) 0,6138 - 1,032 (1,025 – 1,04) < 0,0001 - 1,045 (1,036 – 1,054) < 0,0001 -

ОР – отношение рисков, В – высокий иммунологический индекс, П – промежуточный иммунологический индекс, Н – низкий иммунологический индекс, C индекс – индекс точности модели, IS – иммунологический индекс (immunoscore), MSI – микросателлитная нестабильность, pMMR – экспрессия генов системы репарации ДНК, dMMR – отсутствие экспрессии генов системы репарации ДНК, ДИ – доверительный интервал.

В настоящее время модель с использованием иммунологического индекса (immunoscore) является единственным методом прогнозирования отдаленных результатов, валидированным на больших группах пациентов. Иммунологичесий индекс имеет больший прогностический потенциал по сравнению с известными методами прогнозирования, включающими стратификацию по стадиям заболевания и оценку микросателлитной нестабильности.

По сравнению с известными аналогами предложенный авторами способ имеет ряд преимуществ (J.Pathol. 2014; 232: 199 – 209), связанных, в основном, с техническими аспектами.

1. Простота воспроизведения и стандартизация методики. В процессе клинических исследований авторы отработали стандартные операционные процедуры, позволяющие минимизировать временные и финансовые затраты на обучение персонала. Кроме того, для оценки образцов используется программное обеспечение, позволяющее практически полностью автоматизировать процесс подсчета клеток.

2. Высокая скорость подготовки проб, что обеспечивается максимальной автоматизацией всех процессов.

3. Высокая степень воспроизводи мости результатов (r=0,97 для опухоли; r=0,97 для инвазивного края; p <0,0001) при проведении исследования в разных центрах и ли разными специалистами.

4. Относительная дешевизна исследования по сравнению с иммуногистохимическими методами, включающими панель опухолевых маркеров или рецепторов опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов.

5. Валидация с использованием данных большого числа пациентов в рамках многоцентровых международных клинических исследований.

Несмотря на явные преимущества по сравнению с другими методами прогнозирования, способ также имеет ряд недостатков и ограничений.

По мнению авторов, ограничения связаны c особенностям анализа гистологических образцов, распространенностью опухоли, а также с нозологическими формами.

1. Для воспроизведения способа требуется наличие нескольких образцов, включающих срезы инвазивного опухолевого края и центральных областей опухоли. Таким образом, способ можно применить лишь при наличии резектабельной опухоли, наличии показаний к оперативному вмешательству и сохранению анатомической целостности опухолевого узла в процессе оперативного вмешательства.

2. У больных с метастатическими формами колоректального рака воспроизведение способа требует наличия резектабельных метастазов, а также наличия показаний к их резекции и/или паллиативной резекции первичной опухоли. В отличие от первичной опухоли, данные о прогностической значимости иммунологического индекса в метастатических очагах противоречивы (Cancer Cell. 2018; 34(6): 1012 – 1026. J. Natl. Cancer Inst. 2018; 110 (4): 438).

3. Оценка прогностической значимости иммунологического индекса проведена на группах больных с резектабельным колоректальным раком. В доступной литературе имеются лишь единичные сообщения об использовании иммунологического индекса у больных с другими нозологическими формами (Oncoimmunology. 2021; 10(1): 1888488. Thorac. Cancer. 2021; 12 (9): 1271 – 1278).

По нашему мнению, существенными недостатками способа прогнозирования, применяемого в прототипе, являются малое число анализируемых иммунологических параметров, не позволяющее оценить влияние вклад иммуносупрессивных компонентов, а также однократность анализа, что не позволяет оценить вклад динамики параметров в прогноз отдаленных результатов. Кроме того, существенные ограничения с точки зрения идентификации субпопуляций накладывает иммуногистохимический анализ.

1. По современным представлениям, на канцерогенез оказывают влияние как компоненты микроокружения, участвующие в генерации иммунного ответа по клеточному типу (Т-хелперы первого типа, цитотоксические лимфоциты), но и иммуносупрессивные клеточные субпопуляции (Т-регуляторные клетки, супрессорные клетки миелоидного происхождения, М2-мкрофаги, N2-нейтрофилы). Причем вклад последних в прогрессирование, и соответственно, прогноз заболевания, является более существенным (Nat. Rev. Cancer. 2020; 20 (11): 662 – 680. Cancer Cell. 2018; 34 (6): 1012 – 1026). Поэтому оценка лишь цитотоксического звена не позволяет осуществлять адекватный прогноз у больных на поздних стадиях с диссеминированными формами опухолей, когда влияние иммуносупрессорных компонентов является превалирующим.

2. По нашим многолетним наблюдениям, а также по данным других авторов, на прогноз заболевания оказывают влияние не только абсолютные значения концентрации иммунокомпетентных клеток, цитокинов, а также продукции цитокинов, но и оценка их динамики во времени. Поэтому наиболее адекватными являются прогностические системы, учитывающие временной фактор (Clin. Cancer Res. 2016; 22(8):1865 – 1874).

3. Существенным недостатком способа прогнозирования, применяемого в прототипе является использование иммуногистохимического метода анализа. Иммунокомпетентные клетки экспрессируют несколько маркеров. Только их сочетание позволяет точно идентифицировать тип клеток. CD3 является общим маркером лимфоцитов и экспрессируется практически на всех субпопуляциях. CD8 экспрессируются на цитотоксических лимфоцитах и на дубль-позитивных клетках. Все эти субпопуляции обладают разными свойствами, и, иногда реализуют антагонистические программы в процессе иммунного ответа. Кроме того, иммуногистохимический метод не позволяет оценить цитокин-продуцирующую функцию иммунокомпетентных клеток и выявить их анергию.

Технический результат настоящего изобретения состоит в создании нового способа прогнозирования продолжительности жизни у больных с диссеминированными формами опухолей.

Этот результат достигается тем, что в известном способе, включающем оценку содержания лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD3 и CD8, в микроокружении опухоли однократно и в культуре лимфоцитов крови (пациента) дважды с интервалом не менее одной недели (дополнительно, методом проточной цитометрии) оценивается абсолютная концентрация клеток с фенотипами: CD3+CD16- (X1), CD3+CD8+ (X2), CD3−CD16+CD56+ (X3), CD3+CD16+CD56+ (X4), CD4+CD25+CD127-FOXP3 (X6), LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (X7), CD4+CD8+ (X8), а также спонтанная продукция цитокинов: IFN-γ (X5), IL-4 (X9), IL-8 (X10), IL-12 (X11), TNF-α (X12); по полученным значениям рассчитываются коэффициенты:

K1 =;

K2 =;

где Xi (1) – концентрация клеток и спонтанная продукция цитокинов в культуре лимфоцитов крови при первом определении, Xi (2) – концентрация клеток и спонтанная продукция цитокинов в культуре лимфоцитов крови при повторном определении, Xi (M) – концентрация клеток и спонтанная продукция цитокинов в микроокружении опухоли, n – число недель между первичным и повторным определением, рассчитывают значения функций:

F1=;

F2=;

и если K1 ≥ 0, K2 < 0, F1 ≥ 1,55 при любом значении F2, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет более 22 месяцев;

если K1 ≥ 0, K2 < 0, F1 < 1,55 при любом значении F2 или K1 ≥ 0, K2 ≥ 0 и F2 ≥ 1 при любом значении F1, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет не менее 16, но не более 22 месяцев;

если K1 ≥ 0, K2 ≥ 0, F2 < 1 при любом значении F1, или K1 < 0, K2 ≥ 0 и F1 < 1,81 при любом значении F2, или K1 <0 , K2 < 0 и F2 ≥ 1 при любом значении F1, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет не менее 8, но не более 16 месяцев;

если K1 <0, K2 ≥ 0, F1 ≥ 1,81 при любом значении F2 или K1 < 0, K2 < 0 и F2 < 1 при любом значении F1, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет менее 8 месяцев.

Занимаясь профессионально в течение ряда лет лечением больных с диссеминированными формами опухолей, мы изучали различные варианты лекарственной терапии, а также фундаментальные и клинические аспекты взаимодействия опухоли и иммунной системы. С 2017 года у больных мы изучали иммунный статус и содержание иммунокомпетентых клеток в микроокружении опухоли с целью оценки прогностической, предсказательной значимости различных параметров. У больных в крови оценивалось содержание лимфоцитов, их субпопуляций и цитокинов. Анализы проводились в иммунологической лаборатории ФГУЗ ВЦЭРМ им. А.М.Никифорова МЧС России на лазерном проточном цитометре Cytomics FC 500 (BECKMAN COULTER Inc., USA) с использованием моноклональных антител и расходных материалов компаний BECKMAN COULTER Inc., IMMUNOTECH S.A.S. и ООО «Цитокин». Спектр исследуемых параметров и их референсные интервалы отражены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5. Субпопуляции лимфоцитов

Фенотип Субпопуляция лимфоцитов Референсный интервал (кровь). Относительное содержание (%) Референсный интервал (кровь). Абсолютное содержание (х 10⁹/л) CD3+CD16− Зрелые Т-лимфоциты 52 − 76 950 – 1800 CD3+CD8+ Цитотоксические лимфоциты 23 − 40 450 – 850 CD3+CD4+ Т-хелперы 31 − 46 570 – 1100 CD4+CD8+ Дубль-позитивные Т-клетки 0,1 – 1,1 5 – 15 CD3−CD16+CD56+ Натуральные киллеры 9 − 19 180 – 420 CD3-CD8+; Активированные натуральные киллеры 1,5 − 6 18 – 150 CD16+CD56+HLA DR+ 0 − 5 0 – 120 CD3+CD16+CD56+ TNK – Клетки 0,1 − 8 5 – 200 CD3 -CD19+ В-лимфоциты 6 − 18 150 – 450 CD4+CD25+CD127-FOXP3 Т- регуляторные клетки (Treg) 0,3 − 10 0 – 110 CD3+ HLA DR+ Активированные Т-клетки 0 − 5 0 – 120 HLA DR+ Активированные антиген-презентирующие клетки 6 − 22 150 – 550 αβ –Т Альфа/бета Т - клетки 60 − 80 925 – 1965 γδ – Т Гамма/дельта Т – клетки 2 − 7 1 – 115 LIN-HLADR-CD33⁺CD66b⁻CD14⁺ CD15⁻ Супрессорные клетки миелоидного происхождения 0,2 - 11 0 – 120

Таблица 6. Параметры цитокинового профиля

Цитокин Референсный интервал Спонтанная продукция Индуцированная продукция Концентрация в сыворотке Интерлейкин-1β (IL-1, пг/мл) 0 − 50 1000 − 5000 0 − 50 Интерлейкин-2 (IL-2, пг/мл) 0 − 5 10 − 100 0 Интерлейкин-4 (IL-4, пг/мл) 0 − 50 100 − 400 0 − 50 Интерлейкин-6 (IL-6, пг/мл) 0 − 50 1000 − 3000 0 − 50 Интерлейкин-8 (IL-8, пг/мл) 0 − 100 1000 − 5000 0 − 50 Интерлейкин-10 (IL-10, пг/мл) 0 − 50 100 −400 0 − 50 Интерлейкин-12(IL-12, пг/мл) 0 − 50 100 − 600 0 − 50 Интерферон-α (IFN-α, пг/мл) 0 − 50 100 − 500 0 − 50 Интерферон-γ (IFN-γ, пг/мл) 0 − 50 1000 − 5000 0 − 50 Фактор некроза опухолей-α
(TNF-α, пг/мл) 0 − 50 500 − 1500 0 − 50 Трансформирующий фактор роста-β (TGF-β, пг/мл) 0 - 50 1 − 1000 0 − 20 Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF, пг/мл) 0 - 20 500 − 1500 0 − 50

Уровень лимфоцитов и их субпопуляций оценивался в периферической крови. Анализ цитокинового профиля проводился в два этапа. На первом этапе определялась сывороточная концентрация. На втором проводилось исследование в культуре клеток, где определялся их потенциал путем оценки спонтанной и индуцированной продукции цитокинов. Оценка лимфоцитов, их субпопуляций и цитокинового профиля проводилась в одно и то же время суток, чтобы избежать влияния циркадных колебаний.

В микроокружении опухоли иммунологический профиль оценивался однократно, что связано с доступностью материала для анализа. Референсных интервалов для определения концентрации иммунокомпетентных клеток, а также концентрации, спонтанной и индуцированной продукции цитокинов в микроокружении в настоящее время не существует.

Опухолевый материал объемом около 10 мм3 помещался в два флакона, в одном из которых находилась питательная среда DMEM-F12 для определения спонтанной продукции, а в другом – та же питательная среда с комплексом поликлональных активаторов (фитогемагглютинин 4 мкг/мл, конканавалин А 4 мкг/мл, липополисахарид 2 мкг/мл). Далее происходило инкубирование при 37°С в течение 72 часов. Клетки опухоли осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 мин. После осаждения клеток иммуноферментным методом определяли концентрацию цитокинов и факторов роста.

Алгоритм разработки способа прогнозирования продолжительности жизни больных с диссеминированными формами опухолей включал три этапа. На первом этапе проводился однофакторный анализ, где в качестве переменных были включены все иммунологические параметры, которые оценивались в микроокружении опухоли, а также минимум два раза в периферической крови (таблицы 5, 6). На втором этапе проводился многофакторный анализ, в котором исключались взаимовлияющие компоненты. Далее разрабатывались формулы для расчёта коэффициентов, отражающие динамику прироста/убыли иммуносупрессивных и способствующих опухолевой деструкции иммунологических параметров, а также экспоненциальных коэффициентов, отражающих суммарное влияние иммунологических коэффициентов на отдаленные результаты лечения. Значения коэффициентов определялись заданной точностью модели. На третьем этапе в многофакторный анализ были включены рассчитанные ранее коэффициенты.

Для разработки способа были использованы данные 189 пациентов (104 – исследовательская группа; 85 – группа валидации). В исследовании приняли участие больные с метастатическими формами почечно-клеточного рака, инвазивного рака мочевого пузыря, трижды негативного рака молочной железы и меланомы. Клинические характеристики групп отражены в таблицах 7 и 8.

Таблица 7: клиническая характеристика исследовательской группы

Нозологическая
форма Параметр Значение Число больных % в подгруппе ПКР (n=29) Возраст ≥ 50 лет 22 75,9 < 50 лет 7 24,1 Индекс Карновского, % 100 19 72,7 90 10 27,3 Локализация метастазов Легкие 22 75,9 Кости 6 13,6 Лимфатические узлы 25 56,8 Прогноз по IMDC Хороший 8 31,8 Промежуточный 16 52,3 Плохой 5 15,9 РМП (n=18) Возраст ≥ 50 лет 15 91,2 < 50 лет 3 8,8 Индекс Карновского, % 100 14 77,8 90 2 11,1 80 2 11,1 Гистопатологическая дифференцировка G2 12 67,6 G3 6 32,4 Локализация метастазов Легкие 8 32,4 Кости 2 11,1 Лимфатические узлы 12 67,6 Предшествующее лечение Трансуретральная резекция 8 32,4 Неоадъювантная химиотерапия 12 67,6 ТНРМЖ (n=22) Возраст ≥ 50 лет 15 68,2 < 50 лет 7 31,8 Стадия IIA 8 36,4 IIB 9 40,9 IIIA 5 22,7 BRCA статус + 16 72,7 - 6 27,3 Ki-67 ≤ 15% 11 50 > 15 % 11 50 Индекс Карновского, % 100 11 50 90 7 31,8 80 4 18,2 Локализация метастазов Легкие 6 27,3 Печень 9 40,9 Лимфатические узлы 14 63,6 Хирургическое лечение Мастэктомия 12 54,6 Органосохраняющее 10 45,4 Лекарственное лечение Неоадъювантная химиотерапия 8 36,4 Иммунотерапия 3 13,6 Нет 11 50 Меланома (n=16) Возраст ≥ 50 лет 11 68,7 < 50 лет 5 31,3 Индекс Карновского, % 100 12 75 90 4 25 Локализация метастазов Лимфатические узлы 8 50 Печень 4 25 Легкие 8 50 BRAF мутации Да 4 25 Нет 8 50 Не известно 4 25 NRAS мутации Да 2 12,5 Нет 11 68,7 Не известно 3 18,8

ПКР – почечно-клеточный рак, РМП – рак мочевого пузыря, ТНРМЖ – трижды негативный рак молочной железы, IMDC – International Metastatic Renal Cancer Database Consortium (международный консорциум по изучению метастатического рака почки).

Таблица 8. Клиническая характеристика группы валидации

Нозологическая
форма Параметр Значение Число больных % в подгруппе ПКР (n=34) Возраст ≥ 50 лет 28 82,4 < 50 лет 6 17,6 Индекс Карновского, % 100 30 88,2 90 4 11,8 Локализация метастазов Легкие 28 82,4 Кости 5 14,7 Лимфатические узлы 22 64,7 Прогноз по IMDC Хороший 9 26,5 Промежуточный 22 64,7 Плохой 3 8,8 РМП (n=21) Возраст ≥ 50 лет 16 76,2 < 50 лет 5 23,8 Индекс Карновского, % 100 17 81 90 3 14,3 80 1 - Гистопатологическая дифференцировка G2 17 81 G3 4 19 Локализация метастазов Легкие 6 28,6 Кости 2 9,5 Лимфатические узлы 14 66,7 Предшествующее лечение Трансуретральная резекция 14 66,7 Неоадъювантная химиотерапия 18 85,7 ТНРМЖ (n=28) Возраст ≥ 50 лет 19 67,9 < 50 лет 9 32,1 Стадия IIA 12 42,9 IIB 10 35,7 IIIA 6 21,4 BRCA статус + 22 78,6 - 6 21,4 Ki-67 ≤ 15% 16 57,1 > 15 % 12 42,9 Индекс Карновского, % 100 15 53,6 90 8 28,6 80 5 17,8 Локализация метастазов Легкие 4 13,3 Печень 12 42,9 Лимфатические узлы 19 67,9 Хирургическое лечение Мастэктомия 18 64,3 Органосохраняющее 10 35,7 Лекарственное лечение Неоадъювантная химиотерапия 14 50 Иммунотерапия 2 7,1 Нет 12 42,9 Меланома (n=21) Возраст ≥ 50 лет 14 66,7 < 50 лет 7 33,3 Индекс Карновского, % 100 17 81 90 4 19 Локализация метастазов Лимфатические узлы 9 42,6 Печень 7 33,3 Легкие 7 33,3 BRAF мутации Да 7 33,3 Нет 6 28,7 Не известно 8 38 NRAS мутации Да 6 28,7 Нет 9 42,6 Не известно 6 28,7

ПКР – почечно-клеточный рак, РМП – рак мочевого пузыря, ТНРМЖ – трижды негативный рак молочной железы, IMDC – International Metastatic Renal Cancer Database Consortium (международный консорциум по изучению метастатического рака почки).

Для однофакторного анализа были выбраны параметры, указанные в таблицах 5 и 6, а также два номинальных параметра: статус по Карновскому и возраст. Оценка влияния различных факторов на отдаленные результаты лечения проводилась с использованием логарифмического рангового критерия и критерия Гехана – Вилкоксона.

В результате однофакторного анализа выявлены параметры, влияющие на медиану общей выживаемости:

1) клинические параметры: возраст, статус по Карновскому;

2) субпопуляции лимфоцитов: CD3+CD16-, CD3+CD8+, CD3−CD16+CD56+, CD3+CD16+CD56+, CD4+CD25+CD127-FOXP3, LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15-, CD4+CD8+;

3) спонтанная продукция цитокинов: IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α, IFN-γ, TGF- β;

4) индуцированная продукция цитокинов: IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, IFN-γ;

5) концентрация цитокинов: IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, TGF-β.

Многофакторный анализ проводился с использованием регрессионной модели пропорциональных интенсивностей Кокса, позволяющей оценить влияние совокупности параметров и вклад каждого из них в показатели выживаемости независимо от характера распределения в выборке. В изучаемой группе больных с метастатическими формами опухолей характер проводимого лечения не оказывал существенного влияния на продолжительность жизни. Результаты многофакторного анализа отражены в таблице 9.

Таблица 9. Параметры прогностической модели, связывающей медиану общей выживаемости с факторами микроокружения опухоли и крови

Параметр β k % M Me 95% ДИ p КФ Статус по
Карновскому 0,004 3,2 _ 0,045 МО СЛ CD3+CD16- 0,003 2,3 823 940 725 - 1123 0,001 CD3+CD8+ 0,001 3,9 568 493 418 - 789 0,002 CD3−CD16+CD56+ 0,002 1,8 512 610 325 - 941 0,038 CD3+CD16+CD56+ 0,001 3,9 275 232 210 - 321 0,048 CD4+CD25+CD127-FOXP3 -0,004 8,4 165 202 135 - 510 0,001 LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- -0,003 9,1 198 165 112 - 216 < 0,001 CD4+CD8+ 0,001 2,7 18 26 10 - 34 < 0,001 Ц IL-4, СП -0,002 1,2 182 165 144 - 223 0,01 IL-8, СП -0,001 6 430 312 280 - 416 0,03 IL-10, СП -0,005 8,9 102 92 87 - 242 0,047 IL-12, СП -0,003 1,7 110 82 65 - 186 < 0,001 IFN-γ, СП 0,003 2,4 325 262 290 - 512 0,001 TNF-α, СП 0,002 2,9 210 165 134 - 186 0,023 К СЛ CD3+CD16- 0,001 0,7 734 680 543 - 982 < 0,001 CD3+CD8+ 0,002 0,3 432 510 411 - 590 0,03 CD3 -CD19+ 0,001 0,8 242 211 110 - 312 0,04 γδ – Т 0,004 1,2 236 198 165 - 254 0,043 CD3−CD16+CD56+ 0,003 1,7 395 310 284 - 461 0,039 CD3+CD16+CD56+ 0,004 1,7 260 210 184 - 345 < 0,001 CD4+CD25+CD127-FOXP3 -0,005 3,7 132 110 98 - 167 < 0,001 LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- -0,007 4,8 143 112 87 - 165 < 0,001 CD4+CD8+ 0,002 2,8 12 34 11 - 39 < 0,001 Ц IL-4, СП -0,002 0,5 143 110 98 - 210 0,023 IL-6, СП -0,006 7,1 192 145 134 - 223 0,044 IL-8, СП -0,004 0,7 109 78 45 - 132 < 0,001 IL-10, СП -0,012 5,7 76 45 32 - 98 0,001 IL-12, СП -0,004 0,1 107 78 54 - 136 0,006 IFN-γ, СП 0,009 2,8 265 184 167 - 286 < 0,001 TNF-α, СП 0,006 4,1 156 132 112 - 179 < 0,001 TGF- β -0,007 2,9 84 65 43 - 102 0,012

β – коэффициент уравнения регрессии, k – коэффициент влияния параметра, M – среднее арифметическое, Ме – медиана, 95% ДИ – 95% доверительный интервал, СЛ – субпопуляции лимфоцитов, Ц – цитокины, МО – микроокружение опухоли, К – кровь.

На отдаленные результаты лечения достоверно влияли показатели спонтанной продукции цитокинов, некоторые субпопуляции клеток и статус по Карновскому.

На втором этапе производился расчет прироста/убыли показателей спонтанной продукции цитокинов, полученных в результате двух последовательных измерений, относительно первоначальных значений показателя для микроокружения в единицу времени:

,

где Xi (1) – концентрация клеток и спонтанная продукция цитокинов в культуре лимфоцитов крови при первом определении, Xi (2) – концентрация клеток и спонтанная продукция цитокинов в культуре лимфоцитов крови при повторном определении, Xi (M) – концентрация клеток и спонтанная продукция цитокинов в микроокружении опухоли, n – число недель между первичным и повторным определением. При проведении повторной оценки в первые три дня недели учитывается число полных недель. При проведении повторной оценки в последние четыре дня недели n рассчитывается как число полных недель плюс один.

Расчет проводился только в отношении тех показателей, которые и в микроокружении опухоли и в крови оказывали влияние на показатели медианы общей выживаемости: CD3+CD16-, CD3+CD8+, CD3−CD16+CD56+, CD3+CD16+CD56+, CD4+CD25+CD127-FOXP3, LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15-, CD4+CD8+, спонтанная продукция IFN-γ, IL-4, IL-8, IL-12, TNF-α (таблица 9).

На следующем этапе полученные значения суммировались и рассчитывались значения коэффициентов: а) K1 – коэффициент, отражающий суммарный относительный прирост/убыль факторов, положительно влияющих на медиану общей выживаемости (положительный коэффициент уравнения регрессии β); б) K2 – коэффициент, отражающий суммарный относительный прирост/убыль факторов, отрицательно влияющих на медиану общей выживаемости (отрицательный коэффициент уравнения регрессии β, таблица 9):

K1 =;

K2 =;

где X1 - CD3+CD16-, X2 - CD3+CD8+, X3 - CD3−CD16+CD56+, X4 - CD3+CD16+CD56+, X6 - CD4+CD25+CD127-FOXP3, X7 - LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15-, X8 - CD4+CD8+, X5 - IFN-γ (СП), X9 - IL-4 (СП), X 10 - IL-8 (СП), X11 - IL-12 (СП), X12 - TNF-α (СП).

K1 ≥ 0 и K2 < 0 расценивались как тенденции к улучшению прогноза в отношении медианы общей выживаемости (рост значений показателей, оказывающих положительное влияние и уменьшение значения показателей, оказывающих отрицательное влияние). K1 < 0 и K2 ≥ 0 расценивались как тенденции к ухудшению прогноза в отношении медианы общей выживаемости (уменьшение значений показателей, оказывающих положительное влияние и рост значения показателей, оказывающих отрицательное влияние).

Расчеты следующего этапа исследования были основаны на двух выявленных закономерностях: 1) при разнонаправленном изменении коэффициентов (K1 ≥ 0 и K2 < 0; или K1 < 0 и K2 ≥ 0) их влияние суммировалось; при однонаправленном (K1 ≥ 0 и K2 ≥ 0; или K1 < 0 и K2 < 0) необходимо было оценивать влияние каждого из параметров на конечный результат (медиана общей выживаемости); 2) взаимное влияние коэффициентов и их суммарное влияние на медиану общей выживаемости соответствовало экспоненциальном распределению.

В результате были получены две функции:

F1=,

для оценки влияния коэффициентов при их разнонаправленном изменении и

F2=,

для оценки влияния коэффициентов при их однонаправленном изменении.

Максимальная точность предсказательной модели достигалась при пороговых значениях функций F1 (1,55; 1,81) и F2 (1). Параметры прогностической модели отражены в таблице 10.

Таблица 10. Значение параметров прогностической модели, связывающей медиану общей выживаемости с клиническими факторами и функциями

Параметр Интервал, определяющий риск ОР p Статус по Карновскому < 80% (–); > 80% (+) 1,1 0,007 F1 (K1 ≥ 0, K2 < 0) < 1,55 (–); ≥ 1,55 (+) 6,5 < 0,001 F1 (K1 < 0, K2 ≥ 0) < 1,81 (+); ≥ 1,81 (–) 4,7 0,049 F2 (K1 ≥ 0, K2 ≥ 0) < 1 (–); ≥ 1 (+) 7,4 0,025 F2 (K1 < 0 , K2< 0) < 1 (–); ≥ 1 (+) 3,2 0,003

К, F – расчетные коэффициенты и функции, ОР – отношение рисков.

Для определения границ интервалов, использованных при разработке способа прогнозирования продолжительности жизни больных с метастатическими формами опухолей, использовался квартильный анализ. Медиана общей выживаемости составила 16 мес. Это соответствовало второму квартилю. Первый и третий квартили соответствовали 8 и 22 месяцам. Соответственно прогнозирование проводилось с учетом четырех интервалов: до 8 месяцев, 8 – 16 месяцев, 16 – 22 месяца, более 22 месяцев.

Для разработки способа использованы данные 85 больных с метастатическими формами почечно-клеточного рака (29 больных), меланомы (22 больных), трижды негативного рака молочной железы (16 больных), инвазивного рака мочевого пузыря (12 больных). Для валидации использовалась группа клинически отслеженных больных (104 человека) с теми же нозологическими формами: почечно-клеточный рак (34 больных), меланому (28 больных), трижды негативный рак молочной железы (21 больная), инвазивный рак мочевого пузыря (21 больной).

В группе разработки, в подгруппах с почечно-клеточным раком и раком мочевого пузыря в 100% отмечалось совпадение прогнозируемой и наблюдаемой продолжительности жизни. В подгруппе с меланомой расхождения наблюдались в двух случаях (точность прогноза - 91%). В первом случае больной при прогнозируемой продолжительности жизни менее 8 месяцев, прожил 9. Во втором - при прогнозируемой продолжительности жизни от 16 до 22 месяцев больной прожил 24 месяца. В подгруппе с трижды негативным раком молочной железы различия в прогнозе касались одной больной (точность прогноза – 93,8%). При прогнозируемой продолжительности жизни от 8 до 16 месяцев больная прожила 4 месяца.

В группе валидации, в подгруппе с меланомой в 100% случаев отмечалось совпадение прогнозируемой и наблюдаемой продолжительности жизни. В подгруппе с почечно-клеточным раком различия касались одного больного (точность прогноза – 97,1%). При прогнозируемой продолжительности жизни менее 8 месяцев, больной прожил 10. В подгруппе с раком мочевого пузыря различия касались двоих больных (точность прогноза – 90,5%). При прогнозируемой продолжительности жизни более 22 месяцев один больной прожил 19 месяцев, другой – 22 месяца. В подгруппе с трижды негативным раком молочной железы различия в прогнозе касались троих пациенток (точность прогноза – 85,7%). В двух случаях при прогнозируемой продолжительности жизни от 8 до 16 месяцев обе пациентки прожили 6 месяцев. В третьем случае при прогнозируемой продолжительности жизни более 22 месяцев пациентка прожила 17 месяцев (таблица 11).

Таблица 11. Расхождения между прогнозируемой и наблюдаемой продолжительностью жизни при использовании разработанного способа

Группы Временной интервал, мес. Прогноз, человек Наблюдение, человек Совпадения, % Разработка, 85 человек ПКР,
29 человек < 8 4 4 100 8 - 16 12 12 16 - 22 9 9 > 22 4 4 РМП, 18 человека < 8 1 1 100 8 - 16 9 9 16 - 22 6 6 > 22 2 2 Меланома,
22 человека < 8 6 5 91 8 - 16 5 6 16 - 22 8 7 > 22 3 4 ТНРМЖ,
16 человек < 8 4 5 93,8 8 - 16 6 5 16 - 22 4 4 > 22 2 2 Валидация, 104 человека ПКР,
34 человека < 8 6 5 97,1 8 - 16 14 15 16 - 22 12 12 > 22 2 2 РМП, 21 человек < 8 2 2 90,5 8 - 16 6 6 16 - 22 8 10 > 22 5 3 Меланома,
28 человек < 8 7 7 100 8 - 16 6 6 16 - 22 5 5 > 22 4 4 ТНРМЖ,
21 человек < 8 5 7 85,7 8 - 16 9 7 16 - 22 5 6 > 22 2 1

ПКР – почечно-клеточный рак, РМП – рак мочевого пузыря, ТНРМЖ – трижды негативный рак молочной железы.

Сущность способа заключается в следующем.

Пациенту с метастатической формой опухоли методом проточной цитометрии в микроокружении опухоли (первичной или метастазов) однократно и в культуре лимфоцитов крови дважды с интервалом не менее одной недели методом проточной цитометрии оценивают абсолютную концентрацию клеток с фенотипами: CD3+CD16- (X1), CD3+CD8+ (X2), CD3−CD16+CD56+ (X3), CD3+CD16+CD56+ (X4), CD4+CD25+CD127-FOXP3 (X6), LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (X7), CD4+CD8+ (X8), а также спонтанную продукцию цитокинов: IFN-γ (X5), IL-4 (X9), IL-8 (X10), IL-12 (X11), TNF-α (X12); по полученным значениям рассчитывают коэффициенты:

K1 =;

K2 =;

где Xi (1) – концентрация клеток и спонтанная продукция цитокинов в культуре лимфоцитов крови при первом определении, Xi (2) – концентрация клеток и спонтанная продукция цитокинов в культуре лимфоцитов крови при повторном определении, Xi (M) – концентрация клеток и спонтанная продукция цитокинов в микроокружении опухоли, n – число недель между первичным и повторным определением. При проведении повторной оценки в первые три дня недели учитывается число полных недель. При проведении повторной оценки в последние четыре дня недели n рассчитывается как число полных недель плюс один. Далее рассчитывают значения функций:

F1=;

F2=;

и если K1 ≥ 0, K2 < 0, F1 ≥ 1,55 при любом значении F2, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет более 22 месяцев;

если K1 ≥ 0, K2 < 0, F1 < 1,55 при любом значении F2 или K1 ≥ 0, K2 ≥ 0 и F2 ≥ 1 при любом значении F1, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет не менее 16, но не более 22 месяцев;

если K1 ≥ 0, K2 ≥ 0, F2 < 1 при любом значении F1, или K1 < 0, K2 ≥ 0 и F1 < 1,81 при любом значении F2, или K1 <0 , K2 < 0 и F2 ≥ 1 при любом значении F1, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет не менее 8, но не более 16 месяцев;

если K1 <0, K2 ≥ 0, F1 ≥ 1,81 при любом значении F2 или K1 < 0, K2 < 0 и F2 < 1 при любом значении F1, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет менее 8 месяцев.

Далее пациент получает лечение согласно принятым стандартам. Данные, полученные при использовании предлагаемого способа, могут быть учтены при коррекции тактики наблюдения и лечения по решению врачебной комиссии.

К настоящему времени предложенный способ прошел клиническую апробацию у 189 пациентов с метастатическими формами опухолей: данные 85 больных были использованы для разработки способа и 104 – для валидации.

Способ по сравнению с известными аналогами имеет ряд существенных преимуществ:

1. Позволяет с высокой точностью прогнозировать продолжительность жизни больных с метастатическими формами опухолей.

2. Основан на оценке динамики как компонентов, способствующих иммунологической деструкции, так и иммуносупрессивных факторов.

3. Может быть использован у больных с разными нозологическими формами.

4. Не требует сложной пробоподготовки.

5. Не требует удаления первичной опухоли. Для оценки может использоваться как операционный, так и биопсийный материал.

Способ прогнозирования продолжительности жизни больных с метастатическими формами опухолей разработан в группе молекулярно-биологического прогнозирования и индивидуализации лечения ФГБУ «РНЦРХТ им. акад. А.М. Гранова» Минздрава России и к настоящему времени прошел клиническую апробацию у 189 пациентов с положительным результатом.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования продолжительности жизни больных с метастатическими формами опухолей. В микроокружении опухоли однократно и в культуре лимфоцитов крови дважды с интервалом не менее одной недели оценивают абсолютную концентрацию клеток с фенотипами CD3+CD16-, CD3+CD8+, CD3−CD16+CD56+, CD3+CD16+CD56+, CD4+CD25+CD127-FOXP3, LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15-, CD4+CD8+ и спонтанную продукцию цитокинов IFN-γ, IL-4, IL-8, IL-12, TNF-α. По полученным значениям рассчитывают коэффициенты K1 и K2. Далее рассчитывают значения функций F1= и F2=. Если K1 ≥ 0, K2 < 0, F1 ≥ 1,55 при любом значении F2, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет более 22 месяцев. Если K1 ≥ 0, K2 < 0, F1 < 1,55 при любом значении F2 или K1 ≥ 0, K2 ≥ 0 и F2 ≥ 1 при любом значении F1, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет не менее 16, но не более 22 месяцев. Если K1 ≥ 0, K2 ≥ 0, F2 < 1 при любом значении F1, или K1 < 0, K2 ≥ 0 и F1 < 1,81 при любом значении F2, или K1 < 0, K2 < 0 и F2 ≥ 1 при любом значении F1, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет не менее 8, но не более 16 месяцев. Если K1 < 0, K2 ≥ 0, F1 ≥ 1,81 при любом значении F2 или K1 < 0, K2 < 0 и F2 < 1 при любом значении F1, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет менее 8 месяцев. Способ обеспечивает возможность прогнозирования продолжительности жизни у больных с диссеминированными формами опухолей за счет анализа параметров, влияющих на медиану общей выживаемости. 11 табл.

Способ прогнозирования продолжительности жизни больных с метастатическими формами опухолей, включающий оценку содержания лимфоцитов, экспрессирующих маркеры в микроокружении опухоли, отличающийся тем, что оценку экспрессирующих маркеров выполняют методом проточной цитометрии, при этом в микроокружении опухоли однократно и в культуре лимфоцитов крови дважды с интервалом не менее одной недели оценивают абсолютную концентрацию клеток с фенотипами: CD3+CD16- (X1), CD3+CD8+ (X2), CD3−CD16+CD56+ (X3), CD3+CD16+CD56+ (X4), CD4+CD25+CD127-FOXP3 (X6), LIN-HLADR-CD33+CD66b-CD14+CD15- (X7), CD4+CD8+ (X8), а также спонтанную продукцию цитокинов: IFN-γ (X5), IL-4 (X9), IL-8 (X10), IL-12 (X11), TNF-α (X12); по полученным значениям рассчитывают коэффициенты:

K1=;

K2=;

где Xi (1) – концентрация клеток и спонтанная продукция цитокинов в культуре лимфоцитов крови при первом определении, Xi (2) – концентрация клеток и спонтанная продукция цитокинов в культуре лимфоцитов крови при повторном определении, Xi (M) – концентрация клеток и спонтанная продукция цитокинов в микроокружении опухоли, n – число недель между первичным и повторным определением; далее рассчитывают значения функций:

F1=;

F2=;

и если K1 ≥ 0, K2 < 0, F1 ≥ 1,55 при любом значении F2, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет более 22 месяцев;

если K1 ≥ 0, K2 < 0, F1 < 1,55 при любом значении F2 или K1 ≥ 0, K2 ≥ 0 и F2 ≥ 1 при любом значении F1, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет не менее 16, но не более 22 месяцев;

если K1 ≥ 0, K2 ≥ 0, F2 < 1 при любом значении F1, или K1 < 0, K2 ≥ 0 и F1 < 1,81 при любом значении F2, или K1 < 0, K2 < 0 и F2 ≥ 1 при любом значении F1, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет не менее 8, но не более 16 месяцев;

если K1 < 0, K2 ≥ 0, F1 ≥ 1,81 при любом значении F2 или K1 < 0, K2 < 0 и F2 < 1 при любом значении F1, то прогнозируемая продолжительность жизни составляет менее 8 месяцев.